phân tích phả hệ phân tử gene 16s rrna và nd5 ty thể của một số loài ong dú ở việt nam

dựa trên các vùng gene 16Sr RNA, COI được áp dụng trong việc phân tích phát sinh loài, xác định đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hóa hoặc định danh côn trùng ong ký sinh.. Trong phạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

TRƯƠNG ĐÌNH THI

PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ GENE

16S rRNA VÀ ND5 TY THỂ CỦA MỘT SỐ LOÀI

ONG DÚ Ở VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

TRƯƠNG ĐÌNH THI

PHÂN TÍCH PHẢ HỆ PHÂN TỬ GENE

16S rRNA VÀ ND5 TY THỂ CỦA MỘT SỐ LOÀI

ONG DÚ Ở VIỆT NAM

Mã số sinh viên: 1953012095 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG ThS NGUYỄN TRỌNG NGHĨA

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Trương Đình Thi

Ngày sinh: 26/07/2001 Nơi sinh: Thanh Hóa

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Y dược Mã học viên: 1953012095

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

Trương Đình Thi

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Trương Kim phượng

Học viên thực hiện: Trương Đinh Thi Lớp: DH19SH01

Ngày sinh: 26/07/2001 Nơi sinh: Thanh Hóa

Tên đề tài: Phân tích phả hệ phân tử gene 16S rRNA và ND5 ty thể của một số

loài ong Dú ở Việt Nam

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên Trương Đình Thi được bảo vệ Khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập tại trường, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô và bạn bè Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã giảng dạy tận tình, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản vững chắc

Để phần báo cáo khóa luận có thể đạt kết quả tốt, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến TS Trương Kim Phượng, người đã tận tình hướng dẫn, dạy cho em thêm nhiều kiến thức bổ ích để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm khóa luận này

Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn trân thành đến ThS Nguyễn Trọng Ngĩa vì đã dành thời gian quý báu để giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận và cho em biết thêm nhiều kiến thức chuyên môn hơn

Ngoài ra, không thể thiếu sự giúp đỡ của các bạn trong phòng sinh học phân tử Em xin cảm ơn bạn Phạm Văn Nam, bạn Hồ Bảo An, bạn Hồ Châu Quí đã quan tâm và hỗ trợ em

Trong suốt kì làm khóa luận vừa qua, em biết mình còn non nớt và có nhiều thiếu sót nhưng các thầy vẫn bỏ qua và sẵn sàng giúp đỡ em rất nhiều, vì thế em vô cùng biết ơn

Lời cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô và các bạn sức khỏe, luôn thành công trong công việc và đạt được thành tích tốt

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Trương Đình Thi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

NCBI National Center for Biotechnology Information

16S rRNA 16S ribosomal RNA

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2 1 Các công cụ tin sinh học 18

Bảng 2 2 Kết quả thiết lập chu trình nhiệt PCR khuếch đại vùng gene 16S rRNA 21 Bảng 3 1 Dữ liệu trình tự gene 16S rRNA ở một số loài ong và côn trùng 24

Bảng 3 2 Dữ liệu trình tự gene ND5 ở một số loài ong và côn trùng 25

Bảng 3 3 Trình tự mồi thiết kế của gene 16S rRNA 25

Bảng 3 4 Thông số khảo sát cặp mồi 16SF/16SR trên IDT analyzer 26

Bảng 3 5 Trình tự mồi khảo sát của gene ND5 29

Bảng 3 6 Thông số khảo sát cặp mồi 3F/3R trên IDT analyzer 30

Bảng 3 7 Giá trị OD của các mẫu ong Dú 32

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Hình thái học bên ngoài của ong Dú 8

Hình 1 2 Thông tin về gene ND5 trên Genbank 10

Hình 3 1 Kết quả BLAST của mồi 16SF 26

Hình 3 2 Kết quả BLAST của mồi 16SR 27

Hình 3 3 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi 16SF/16SR với trình tự của Lepidotrigona ventralis 27

Hình 3 4 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi 16SF/16SR với trình tự của Austroplebeia symei 28

Hình 3 5 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi 16SF/16SR với trình tự của Geniotrigona thoracica 28

Hình 3 6 Kết quả BLAST của cặp mồi 3F 30

Hình 3 7 Kết quả BLAST của cặp mồi 3R 31

Hình 3 8 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi 3F/3R với trình tự của Melipona bicolor 31

Hình 3 9 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gene 16S rRNA của DNA tách chiết từ các mẫu ong Dú 33

Hình 3 10 Kết quả giải trình tự mẫu T3 mạch F 34

Hình 3 11 Kết quả giải trình tự mẫu T3 mạch R 34

Hình 3 12 Kết quả Blast của mẫu T3 34

Hình 3 13 Kết quả giải trình tự mẫu T4 mạch F 35

Hình 3 14 Kết quả giải trình tự mẫu T4 mạch R 35

Hình 3 15 Kết quả Blast của mẫu T4 35

Hình 3 16 Kết quả giải trình tự mẫu T6 mạch F 36

Hình 3 17 Kết quả giải trình tự mẫu T6 mạch R 36

Hình 3 18 Kết quả Blast của mẫu T6 36

Hình 3 19 Kết quả giải trình tự mẫu T7 mạch F 37

Hình 3 20 Kết quả giải trình tự mẫu T7 mạch R 37

Hình 3 21 Kết quả Blast của mẫu T7 37

Hình 3 22 Mô hình tiến hóa của gene 16S rRNA 39

Hình 3 23 Cây đơn gene 16S rRNA xây dựng trên phương pháp NJ 41

Hình 3 24 Cây đơn gene 16S rRNA xây dựng trên phương pháp ML 42

Hình 3 25 Cây đơn gene 16S rRNA xây dựng trên phương pháp MP 43

Hình 3 26 Mô hình tiến hóa của gene ND5 44

Hình 3 27 Cây đơn gene ND5 được xây dựng dựa trên phương pháp ML 45

Hình 3 28 Cây đơn gene ND5 được xây dựng dựa trên phương pháp MP 46

Hình 3 29 Cây đơn gene ND5 được xây dựng dựa trên phương pháp NJ 46

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ CÔN TRÙNG 5

1.1.1 Khái niệm về côn trùng 5

1.1.2 Cấu tạo côn trùng 5

1.2 BỘ CÁNH MÀNG (HYMENOPTERA) 6

1.3 TỔNG QUAN VỀ ONG DÚ 6

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ONG DÚ 8

1.5 CÁC GENE MỤC TIÊU ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH DANH PHÂN TỬ CÁC LOÀI ONG 9

1.2.1 Vùng gene 16S rRNA 9

1.2.2 Vùng gene ND5 10

1.6 CƠ SỞ KHOA HỌC VỀ XÂY DỰNG CÂY PHẢ HỆ PHÂN TỬ 11

1.3.1 Định danh phân tử 11

1.3.2 Phân tích phát sinh loài 11

1.4.3 Các phương pháp sinh học phân tử 14

1.4.3.1 PCR (polymerase Chain Reaction) 14

2.1.2.3 Hóa chất 17

2.1.3 Các phần mềm và trang web trực tuyến 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Khảo sát in silico 19

2.2.1.1 Thu nhận trình tự gene 19

2.2.1.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi 19

2.2.2 Tiến hành thực nghiệm 19

2.2.3 Phân tích phát sinh loài phân tử 21

III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 23

3.1 Nội dung 1 Kết quả thu thập bộ dữ liệu tham chiếu 24

3.2 Nội dung 2 Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc hiệu trên vùng trình tự gene 16S rRNA và ND5 của một số loài ong 25

3.2.1 Kết quả khảo sát bộ mồi của vùng trình tự gene 16S rRNA 25

3.2.2 Kết quả khảo sát bộ mồi của vùng trình tự gene ND5 29

3.3 Nội dung 3 Áp dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự và phân tích phả hệ phân tử để hỗ trợ định danh một số loài ong Dú 32

3.3.1 Kết quả thực nghiệm trên mẫu Ong Dú 32

3.3.1.1 Tách chiết DNA 32

3.3.1.2 Phản ứng khuếch đại DNA 32

3.3.1.3 Kết quả giải trình tự 33

3.3.2 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài 38

3.3.2.1 Phân tích phả hệ phân tử gene 16S rRNA 38

3.3.2 Phân tích phả hệ phân tử gene ND5 44

PHẦN IV: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 47

4.1 KẾT LUẬN 48

4.2 KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ong (Anthophila; Bee) là một loài côn trùng trong họ Apidae thuộc bộ cánh

màng Ong không chỉ là loài côn trùng quan trọng việc thụ phấn của thực vật mà

còn tạo ra mật ong và sản phẩm có lợi khác (Kek et al., 2017)

Phát sinh loài là lịch sử hình thành nguồn gốc của một nhóm đơn vị phân loại như các loài từ tổ tiên chung của chúng bao gồm thứ tự phân nhánh và đôi khi là thời gian phân kỳ Phát sinh loài phân tử rất quan trọng để giải quyết các câu hỏi sinh học khác nhau như mối quan hệ giữa các loài hoặc gen, nguồn gốc và sự lây lan của sự lây nhiễm vi rút cũng như những thay đổi tập tính đặc tính hình thái và

mô hình di cư của các loài (Yang et al., 2012)

Theo Mardulyn và các cộng sự (1998) thì một số kỹ thuật phân tử (PCR,

giải trình tự ) dựa trên các vùng gene (16Sr RNA, COI) được áp dụng trong việc

phân tích phát sinh loài, xác định đặc tính di truyền và nghiên cứu tiến hóa hoặc định danh côn trùng (ong ký sinh) Kết quả nghiên cứu của Whitfield và các cộng

sự (1997) cho thấy gene 16S rRNA là một chỉ thị phân tử hữu ích nhằm phân tích mối quan hệ ở mức phân họ và chi của ong ký sinh Gene 16S rRNA đã được sử

dụng rộng rãi ở các cấp độ khác nhau để xác định phát sinh loài ở côn trùng, đặc

biệt là trong bộ Hymenoptera Đồng thời, cũng theo như kết quả nghiên cứu của Whitfield và các cộng sự đã xác định được sự tiến hóa của phân họ Microgastrinae dựa vào phân tích đặc điểm phân tử trên vùng gene 16S rRNA Công bố của Min và cộng sự (2005) vùng trình tự gene 16S rRNA xác định mối quan hệ phả hệ của các phân họ: Adelinae, Cheloninae, Miracnae, Microgastrinae và Cardiochilinae bằng dữ liệu trình tự gene 16S rRNA

Trong nghiên cứu của Khan và các cộng sự (2021), trình tự gene ND5 được

thu nhận từ một số loài ong mật lưu hành ở châu Âu và châu Á, cụ thể là ở Pakistan

Kết quả nghiên cứu xác định được hai loài ong châu Á: A cerana và A Dorsata, một loài ong mật châu Âu A Mellifera từ Pakistan và 13 loài A cerana, hai loài A

Dorsata và trình tự của 22 loài ong mật A mellifera sự phân tích này dựa trên gene ND5 Nghiên cứu này cũng cho thấy gene ND5 trên ti thể có khả năng thiết lập mối

quan hệ họ hàng và đa dạng di truyền giữa các loài, cụ thể là chi Apis

Hiện nay, việc định danh các loài ong chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái của các loài ong với các phương pháp thực hiện khác nhau Tuy nhiên, công tác phân loại thường gặp khó khăn (không phân tích được các mối quan hệ ở mức dưới họ), kết quả định danh không đồng thuận với nhau giữa các công trình nghiên cứu Vì thế, trong nhiều năm trở lại đây, các nhà nghiên cứu đã áp dụng phân tích phả hệ phân tử để hỗ trợ định danh côn trùng trong đó có các loài ong Trong phạm vi

chuyên đề khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích phả hệ

phân tử trên gene 16S rRNA và ND5 ty thể của một số loài ong Dú ở Việt

- Khai thác cơ sở dữ liệu, trình tự gene mục tiêu dự kiến: 16S rRNA ty thể và ND5

của các loài công trùng cụ thể là các loài ong đã được công bố trên ngân hàng gene (GenBank, NCBI;…) và xây dựng mô hình tiến hóa trên bộ dữ liệu cục bộ đã thu thập được

- Khai thác dữ liệu khoa học từ các bài báo thực nghiệm bằng tiếng Anh hoặc tiếng Việt thuộc hướng nghiên cứu phân tích phả hệ phân tử nhằm hỗ trợ định danh các loài ong, để thu thập khảo sát các bộ mồi được sử dụng cho phương pháp PCR kết

hợp giải trình tự trên vùng gene mục tiêu: 16S rRNA ty thể

- Thiết lập phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để hỗ trợ định danh một số loài ong có dược tính và được thu thập ở một số địa phương thuộc Việt Nam

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

Nội dung 1: Sử dụng một số công cụ tin sinh học để thu thập bộ dữ liệu gene 16S

rRNA và ND5 (dự kiến) của một số loài ong

Nội dung 2: Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc hiệu trên vùng

trình tự gene 16S rRNA và ND5 (dự kiến) của một số loài ong

Nội dung 3: Sử dụng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự và phân tích phả hệ phân

tử để hỗ trợ định danh một số loài ong (Ong mật, ong Dú)

I TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ CÔN TRÙNG

1.1.1 Khái niệm về côn trùng

Côn trùng là một nhóm động vật thuộc lớp Côn trùng (Insecta) trong ngành

Arthropoda Chúng là nhóm sinh vật rất đa dạng và phong phú, bao gồm khoảng 1

triệu loài đã được mô tả và được tìm thấy (Eggleton, 2020)

1.1.2 Cấu tạo côn trùng

Cấu trúc cơ thể của côn trùng rõ ràng gồm ba phần chính: đầu, ngực và bụng Phần đầu bao gồm một đôi râu đầu, miệng, một đôi mắt kép và có thể có hai hoặc ba mắt đơn (một số loài không có mắt đơn) Râu đầu, mắt kép và mắt đơn là các cơ quan cảm giác, trong khi miệng là cơ quan nhận thức thức ăn Do đó, đầu của côn trùng chịu trách nhiệm cho việc cảm nhận và thu thập thức ăn Bề mặt đầu có các nếp gấp là các ổ lõm của da Các ổ lõm này tạo ra các núm lồi, được gọi là sừng nổi, trên bề mặt đầu Những sừng nổi này giúp cung cấp khả năng bám và làm cứng vỏ đầu Các ổ lõm chia đầu thành các khu vực và mảnh vỏ, bao gồm khu trán-chân môi, khu cạnh-đỉnh đầu, khu hàm, khu hàm sau, khu dưới má, và đặc biệt, môi trên và lưỡi cũng là một phần của vỏ đầu Trên đỉnh đầu của ấu trùng, có thể dễ dàng nhận thấy các ổ lõm lột xác có hình dạng của chữ Y ngược (N Đ Khiêm, 2010)

Phần ngực đóng vai trò là trung tâm vận động của cơ thể, bao gồm ba đốt Mỗi đốt ngực đi kèm với một đôi chân ngực, và trong giai đoạn trưởng thành, côn trùng có thể phát triển hai đôi cánh: một đôi cánh trước ở đốt ngực giữa và một đôi cánh sau ở đốt ngực sau Tuy nhiên, trong trường hợp chỉ có một đôi cánh như ruồi, muỗi, đôi cánh sau sẽ giảm thiểu và chuyển đổi thành một cấu trúc hình chùy, giúp duy trì sự cân bằng khi bay Ba đốt ngực của côn trùng, gồm đốt ngực trước, đốt ngực giữa và đốt ngực sau, được nối chặt với nhau Mỗi đốt ngực bao gồm bốn mảnh: mảnh lưng, mảnh bụng và hai mảnh bên, được liên kết chặt chẽ với nhau Mỗi đốt ngực cũng đi kèm với một đôi chân tương ứng, bao gồm chân trước, chân giữa và chân sau (N Đ Khiêm, 2010)

Phần bụng của côn trùng là một phần quan trọng trong cấu trúc cơ thể của chúng Đây là phần sau cùng của cơ thể côn trùng và thường chứa các cơ quan nội

phần bụng của côn trùng thường phục vụ các chức năng như tiêu hóa thức ăn, trao đổi chất, lưu trữ chất dự trữ và sinh sản Chẳng hạn, dạ dày của côn trùng được sử dụng để tiêu hóa thức ăn và hấp thụ dưỡng chất Ruột thường chứa chất thải và chất còn dư sau quá trình tiêu hóa Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn nằm ở cuối bụng (Sheikh, 2009)

1.2 BỘ CÁNH MÀNG (HYMENOPTERA)

Bộ cánh màng (bọ cánh cứng, ong bắp cày, kiến và ong) là một trong bốn bộ côn trùng siêu đa dạng, bao gồm hơn 153.000 loài được mô tả và có thể lên đến một triệu loài còn tồn tại chưa được mô tả (Peters, 2017)

Bộ cánh màng có các đặc điểm chung về cấu trúc và chức năng của cánh Cánh

của Hymenoptera có cấu trúc mỏng và mềm, được gắn kết với ngực bằng một khớp

đơn giản gọi là gối cánh (wing hinge) Điều này cho phép chúng thực hiện các chuyển động bay phức tạp và tạo độ linh hoạt khi di chuyển Bộ cánh màng thường có hai cánh phát triển đầy đủ và các loài trong bộ này thường có khả năng bay tốt Tuy nhiên, một số loài trong bộ có khả năng mất cánh và sống trên mặt đất sau khi mất cánh Cánh của Hymenoptera cũng có thể có các cấu trúc khác nhau như mô phỏng các màu sắc và hình dạng đặc biệt để tương tác với môi trường và các loài khác (Aguiar, 2013) Bộ cánh màng Hymenoptera đóng một vai trò quan trọng trong sinh thái học và hệ sinh thái Chúng có vai trò quan trọng trong việc thụ phấn, duy trì sự phát triển của côn trùng khác và có vai trò quan trọng trong việc kiềm hãm số lượng côn trùng gây hại cho cây trồng Ngoài ra, một số loài Hymenoptera có khả năng gây hại đối với con người như ong và kiến có thể châm, chích và gây đau (Aguiar, 2013)

được xác định (P Kwapong et al., 2010) Theo P Kwapong có hơn 300 loài ở Brazil,

14 loài ở Australia và có 46 loài đã được ghi nhận ở Mexico, 26 loài tại châu Phi,

tại châu Á Với 43 loài được công nhận thuộc hai chi là Lisotrigona và Trigona đã phát hiện ở Châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ, Malaysia, Lào,…(Hai

X Nguyen et al., 2017)

Ong Dú có kích thước nhỏ hơn so với những loài trong họ ong mật thông thường Chúng có chiều dài từ 2 đến 6 mm, tùy thuộc vào loại và cá thể Một số loài có kích thước lớn hơn, nhưng phần lớn đều có kích thước nhỏ và mảnh mai Ong Dú xây dựng tổ trong các khuôn viên nhỏ như hốc cây, hòn đá, tổ ong cũ hoặc khe nứt trong tường Tổ của ong Dú thường nhỏ hơn và có cấu trúc phức tạp hơn so với tổ ong mật thông thường Giống như các loài ong mật, ong Dú sống cùng nhau trong tổ với ong chúa, ong cái và ong đực (Witter, 2005) Ong Dú là một loài ong đặc biệt vì chúng không có ngòi đốt, điều này phân biệt chúng với loại ong khác trong họ như

ong mật (Apis spp.) và ong hoang dã (Bombus spp.) mà có kim đốt và có thể gây ra

cắn hoặc châm đốt khi cảm thấy bị đe dọa Sự thiếu ngòi đốt ở ong Dú là một trong những đặc điểm quan trọng của chúng, mang lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường tự nhiên như:

- An toàn: Việc thiếu kim đốt làm cho chúng trở nên an toàn hơn đối với con người và các động vật khác Chúng không có khả năng cắn hoặc châm đốt, làm giảm

nguy cơ gây chấn thương hoặc phản ứng dị ứng do vết cắn của ong (A

Reyes-González et al., 2014)

- Tương tác con người: Vì ong Dú không gây nguy hiểm cho con người nên chúng có thể được nuôi trong khu vực dân cư và trong các công viên, vườn hoa và khu vườn cá nhân Việc nuôi ong không chỉ mang lại mật ong ngon và có giá trị, mà

còn thúc đẩy sự quan tâm và bảo vệ cho các loài ong và môi trường tự nhiên (A

Reyes-González et al., 2014)

- Quá trình thụ tinh: Ong Dú đóng vai trò quan trọng trong việc thụ tinh ở hoa, cây Mặc dù không có kim đốt, chúng vẫn có khả năng thu nạp phấn hoa và chuyển tải phấn hoa từ hoa này sang hoa khác, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh

sản và duy trì sự đa dạng sinh học (A Reyes-González et al., 2014)

Các sản phẩm có giá trị từ ong Dú như mật ong, sáp ong, phấn hoa, sữa ong

thiện sức khỏe, ngăn ngừa bệnh tật Đặc biệt, keo ong Dú hiện nay cũng là sản phẩm đang rất được quan tâm, nghiên cứu bởi sự đa dạng về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nó

Hình 1 1 Hình thái học bên ngoài của ong Dú

Chú thích: Hình 1.1 được trích dẫn từ nguồn: Kwapong et al., 2010

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ONG DÚ

Ở Việt Nam, các nghiên cứu đang tập trung hầu hết đến công dụng cũng như

họp chất có trong keo ong do ong Dú sản xuất được như nghiên cứu của Hai X

Nguyen và cs., 2017 về keo ong Dú Trigona minor tại tỉnh Bến Tre, Việt Nam, dịch

chiết ethanol của keo ong Dú này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tụy PANC-1 Nghiên cứu về thành phần hóa học của dịch chiết này đã xác định được 15 loại triterpenoid-cycloartane trong đó có 5 hợp chất mới và một triterpenoid-lancostane Trong số các hợp chất được xác định, acid B 23-hydroxyisomangiferoli và acid 27-hydroxyisomangi-ferolic là hai hợp chất có khả năng chống lại độc tố với tế bào ung thư tuyến tụy ở người PANC-1

Trên thế giới, nghiên cứu của Whitfield (1997) dựa vào đặc điểm phân tử dựa

trên vùng gene 16S rRNA nhằm xác định sự tiến hóa của phân họ Microgastrinae Công trình nghiên cứu của Dowton và Austin (1998) dựa trên trình tự vùng gene 16S

rRNA và 28S rDNA cho thấy nguồn gốc tiến hóa của khu hệ phân họ Microgastroids

18S rRNA, 28S rRNA xác định mối quan hệ gần gũi của các phân họ: Adelinae, Cheloninae, Miracinae, Microgastrinae và Cardiochilinae Bên cạnh đó, công trình

nghiên cứu của Mardulyn và Whitfield (1998) sử dụng trình tự gene 16S rRNA nhằm khảo sát đặc điểm di truyền của phân họ Microgastrinae Đồng thời, trong nghiên

cứu của Rasmussen và cộng sự (2007) về việc phân tích phát sinh loài phân tử và mối

quan hệ giữu các chi trong tộc Meliponine.

1.5 CÁC GENE MỤC TIÊU ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH DANH PHÂN TỬ CÁC LOÀI ONG

Trình tự DNA ty thể có tính biến động theo loài, thường được sử dụng trong

phân tích phả hệ phân tử, sự tiến hóa của các loài (Özdil & İlhan, 2012)

1.2.1 Vùng gene 16S rRNA

Gene 16S rRNA ty thể của động vật có vú đã được sử dụng cho các nghiên cứu tiến hóa phân tử (Adoutte et al., 1999) và gần đây các kỹ thuật tương tự cũng đã được áp dụng cho côn trùng (Xiang và Kocher et al., 1991)

Trình tự nucleotide của gene RNA ribosome 16S rRNA được chứng minh là

công cụ phân tử để phân loại chính xác và hiệu quả các loài sinh vật, đặc biệt là côn

trùng và vi sinh vật Do tốc độ tiến hóa cao, 16S rRNA ty thể là một phân tử cực kỳ hữu ích để phân tích độ phân giải cao của các quá trình tiến hóa (Brown et al., 1979) Theo Misof và cộng sự (2000), thì gene 16S rRNA đã được sử dụng trong phân tích phát sinh loài của côn trùng, động vật lưỡng cư (Morita et al., 1999) và cá (Richards và Moore et al., 1996) Trình tự của các phân tử RNA ribosome đã được sử dụng rộng

rãi cho các nghiên cứu phát sinh loài và sự khác biệt về trình tự trong các vùng siêu biến phản ánh các biến thể biến dạng Vì vậy, trong những năm gần đây, kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi để phân loại và định danh các loài như muỗi, mối, ruồi và vi sinh vật Các gene ty thể là những gene khá bền vững và có kích thước nhỏ thuận tiện cho việc phân lập, giải trình tự và phân tích Vì vậy, chúng là những chỉ thị được sử dụng rộng rãi nhất trong định danh phân tử

Các trình tự nucleotide từ vùng 434 - bp của gene 16S rRNA đã được phân tích

cho 65 đơn vị phân loại của Bộ cánh màng (kiến, ong, ong bắp cày, ong bắp cày ký

sinh, đom đóm, …) để kiểm tra các kiểu biến đổi trong đoạn gene và mức độ phân

loại mà nó chỉ ra tiện ích tối đa trong ước tính phát sinh loài (Whitfield et al., 1998) Dựa trên sự tương đồng của chuỗi gene 16S rRNA, ta có thể phân loại và định

danh các loài côn trùng Các thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các loài côn trùng được xây dựng thành các cây phân loại phân tử, cho phép hiểu rõ hơn về quan

hệ tiến hóa và đa dạng sinh học của chúng Ngoài việc phân loại, gene 16S rRNA

cũng được sử dụng nghiên cứu về đa dạng sinh học và sinh thái học của côn trùng

Bằng cách phân tích chuỗi gene 16S rRNA từ một loạt các mẫu côn trùng, ta có thể

xác định sự đa dạng và phân bố của các loài trong một môi trường nhất định, cũng như tìm hiểu về mối tương tác giữa côn trùng và môi trường tự nhiên Một đặc điểm

đáng chú ý của gene 16S rRNA là tốc độ nhân đôi chậm so với các gene khác, dẫn

đến tính bảo tồn cao và độ ổn định trong suốt quá trình tiến hóa Điều này giúp gene

16S rRNA trở thành một dấu hiệu di truyền phổ biến giúp phân loại cho các loài côn

trùng

1.2.2 Vùng gene ND5

Hình 1 2 Thông tin về gene ND5 trên Genbank

Gene ND5 (NADH dehydrogenase subunit 5) thuộc bộ gene ty thể của sinh

vật Eukaryote, điển hình hiện diện ở các loài công trùng cũng như các loài ong Hình

1.2 mô tả sự định vị của gene của một loài ong mật phương Tây (Apis cerana) Gene

ND5 có chiều dài khoảng 1671 bp với mã số truy cập là NC 014295.1 (Genbank),

định vị ở mạch âm từ vị trí 6816 đến 8486 Bộ gene của ty thể là một phân tử hữu ích

cho các nghiên cứu di truyền quần thể của Apis mellifera Các biến thể về độ dài và

trình tự trong bộ gene của ty thể ong mật đặc biệt hữu ích trong việc phân biệt các

dòng tiến hóa và các nhóm phân loài (Özdil & İlhan, 2012)

Mặc dù gene ND5 có tính chất thông thường trong quá trình tiến hóa nhưng

nó cũng có độ biến đổi đủ để phân biệt giữa các loài côn trùng khác nhau Sự khác

biệt trong chuỗi gene ND5 có thể tạo ra thông tin về độ khác biệt di truyền và đa dạng giữa các loài Các phương pháp phân tích gene ND5 trong côn trùng thường được

thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) Việc thu thập mẫu côn trùng và trích xuất DNA từ chúng thường khá đơn giản và tiện lợi Sau đó,

PCR có thể được sử dụng để nhân bản và phân tích gene ND5 Sự khác biệt trong gene ND5 giữa các loài côn trùng có thể cung cấp thông tin về quan hệ họ hàng và

phân loại phân tử Các phương pháp phân tích di truyền học và sinh học phân tử có thể sử dụng để xác định mức độ quan hệ họ hàng giữa các loài và phân loại chúng

dựa trên sự khác biệt trong gene ND5 Đoạn gene ND5 lần đầu tiên được giải trình tự ở ong Hy Lạp và đây là nghiên cứu duy nhất về mối quan hệ phát sinh loài giữa các phân loài ong ở Đông Âu (Martimianakis et al 2011)

1.6 CƠ SỞ KHOA HỌC VỀ XÂY DỰNG CÂY PHẢ HỆ PHÂN TỬ

1.3.1 Định danh phân tử

Định danh phân tử là phương pháp so sánh sự khác biệt của trình tự nucleotide và acid amin trong di truyền phân tử để phân loại và xác định mối quan hệ của các loài ở mức độ phân tử Định danh phân tử cho kết quả là cây phả hệ phân tử Từ đó, có thể phân tích được mối quan hệ giữa các loài dựa trên giá trị bootstrap và sự phân nhóm Định danh phân tử kết hợp với định danh hình thái sẽ giúp định danh chính xác đối tượng Với những loài khó có thể định danh hình thái như ong thì định danh phân tử sẽ là một lựa chọn khá tối ưu

1.3.2 Phân tích phát sinh loài

Theo Lê huyền Ái Thúy và cộng sự (2021), phát sinh loài phân tử hay phả hệ phân tử (Molecular phylogennetics) là những nghiên cứu về mối liên hệ tiến hóa giữa các loài, cá thể, gene hoặc protein được suy luận từ dữ liệu phân tử (DNA hoặc protein) thông qua các thuật toán xác định Kết quả của các nghiên cứu phát sinh phân

tử được thể hiện thông qua một hệ thống cấp bậc dó dạng cây phân nhánh gọi là cây phát sinh loài phân tử (molecular phylogenetic tree)

Ngoài ra phân tích phát sinh loài còn là một phương pháp được sử dụng để suy ra mối quan hệ tiến hóa giữa các thành viên trong các đơn vị phân loại khác nhau Nó giúp chúng ta hiểu về sự tiến hóa của hệ gene và các gia đình gene, và phân loại chúng thành nhóm Orthologuos hoặc Paraloguos Thuật ngữ Orthologuos được sử dụng để chỉ một nhóm gene, cho thấy sự phát sinh loài của một loài trong quá trình tiến hóa theo hướng phân ly Điều này có nghĩa là trong một nhóm gene đơn ngành, mỗi loài được đại diện bởi một orthologue duy nhất Ngược lại, thuật ngữ Paraloguos ám chỉ sự tiến hóa của một gia đình gene, trong đó các gene tiến hóa theo hướng hội tụ Tức là, các gene trong cùng một gia đình gene có thể xuất phát từ một tổ tiên chung, nhưng sau đó phát triển theo các hướng khác nhau (Harison, 2006)

Phương pháp phân tích phát sinh phân tử là một quá trình gồm nhiều bước: (1) sắp gióng cột các trình tự nucleic acid hoặc amino acid giữa các loài hoặc một họ gene với nhau, (2) Phân tích khối dữ liệu và (3) trình bày kết quả dưới dạng cây phát sinh loài phân tử Từ đó, có thể thấy rằng đầu vào của phương pháp phân tích phát sinh loài phân tử chính là kết quả của quá trình sắp gióng cột và đầu ra chính là cây phát sinh phân tử

Molecular phylogeny tree (Cây phát sinh loài phân tử) là một cây chứa các nút được kết nối bởi các nhánh Mỗi nhánh đại diện cho sự tồn tại của một dòng di truyền qua thời gian và mỗi nút đại diện cho sự ra đời của một dòng mới Nếu cây đại diện cho mối quan hệ giữa một nhóm các loài, thì các nút đại diện cho các sự kiện hình thành loài Trong các bối cảnh khác, việc giải thích có thể khác nhau Ví dụ, trong một cây gene gồm các trình tự được lấy mẫu từ một quần thể, các nút đại diện cho các sự hình thành của các cá thể là tổ tiên của mẫu, trong khi đó trong một cây có các

họ gene tương đồng, các nút có thể đại diện cho các sự kiện sao chép gene (Yang et

al., 2012)

Các phương pháp phổ biến nhất và thường được sử dụng trong dựng cây phát sinh loài:

Phương pháp khoảng cách (Distance-based method) có mô hình tiến hóa là một hàm hiện, thường sử dụng thuật toán phân rã hình ngôi sao Trong phương pháp này, mỗi cặp trình tự sẽ được so sánh thẳng hàng từng cặp đôi, và khoảng cách di truyền ứng với mỗi cặp sẽ được tính toán Vì mô hình tiến hóa là một hàm hiện nên một trong số các mô hình tiến hóa có thể được chọn để tính toán khoảng cách di truyền giữa từng cặp taxa, từ đó tạo ra một ma trận khoảng cách giữa tất cả các taxa Một phương pháp điển hình trong phương pháp khoảng cách là phương pháp neighbor-joining, mà là một trong những phương pháp nhanh nhất để tạo ra cây tiến hóa Phương pháp này thường được sử dụng để phân tích các khối dữ liệu lớn với nhiều taxa Trong phương pháp neighbor-joining, một cây tiến hóa được xây dựng bằng cách liên kết các taxa gần nhất với nhau dựa trên khoảng cách di truyền giữa chúng (Dowel, 2008)

Phương pháp Maximum Parsimony (MP) có mô hình tiến hóa là một hàm ẩn Phương pháp MP giả định rằng cây tiến hóa tốt nhất là cây mô tả các loài có ít sự thay đổi nhất, tức là có ít đột biến nhất Cây tiến hóa tốt nhất theo phương pháp MP sẽ có điểm thấp nhất, tức là có tổng số thay đổi tiến hóa (số thay thế nucleotide) ít nhất, dựa trên một tiêu chuẩn đã được định sẵn (Hall, 2011) Do vậy, thông thường phương pháp Parsimony sẽ chọn cây có tổng chiều dài khoảng cách ngắn nhất Phương pháp Parsimony thường dựa vào thuật toán heuristics (Dowel, 2008)

Phương pháp Maximum Likelihood là một phương pháp trong phân tích tiến hóa, trong đó mô hình tiến hóa được coi là một hàm hiện Đây là phương pháp mất nhiều thời gian nhất, nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất Với mỗi mô hình tiến hóa được lựa chọn, phương pháp này dựa trên một hàm toán học để tính toán xác suất của một cây tiến hóa được tạo thành từ bộ dữ liệu phân tích Hàm xác suất này cho phép tích hợp các quá trình tiến hóa của từng đặc tính để tạo thành một mô hình xác suất Cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn làm cây tiến hóa tối ưu theo phương pháp Maximum Likelihood Phương pháp Maximum Likelihood tập trung vào việc xác định mô hình tiến hóa có khả năng tạo ra dữ liệu quan sát được cao nhất Tuy phương pháp này mất nhiều thời gian tính toán, nhưng nó cung cấp kết

quả đáng tin cậy và chi tiết về các thay đổi tiến hóa và xác suất của chúng (Hall, 2011)

1.4.3 Các phương pháp sinh học phân tử

1.4.3.1 PCR (polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR được phát hiện bởi Kary Mullis năm 1980 PCR là một phản ứng khuyeesch đại nucleic acid trong điều kiện in vitro với sự tham gia của các thành phần như: DNA mạch khuôn, dNTP, mồi, enzyme polymerase và dung dịch đệm Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm các bước:

+ Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tm của phân tử, thường là 94oC-95oC trong vòng 30 giây –1 phút

+ Giai đoạn lai (mồi bắt cặp với mạch khuôn): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ Tm) cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC (nhiệt độ cần cho sự bắt cặp giữa mồi với mạch khuôn là Ta, Ta< Tm khoảng 5oC, Tm là nhiệt độ nóng chảy) trong vòng 10 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ được tăng lên 72oC để enzyme polymerase hoạt động Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

(Sách Công nghệ gene, 2016 Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, tr 133)

1.4.3.2 Điện di

Là phương pháp phân tích dựa trên hiện tượng dịch chuyển các phân tử mang điện tích dưới tác động của điện trường Kết quả điện di phân tử DNA, RNA, protein phụ thuộc vào đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích Bản gel (agarose, polyacrylamide) giữ vai trò là giá thể để phân tách các phân tử trong điện trường Kết quả điện di được xác định dựa vào tín hiệu của các thuốc nhuộm DNA, protein (Ethidium )(Sách Công nghệ gene, 2016 Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang 23)

1.4.3.3 Giải trình tự

DNA là cơ sở hóa học của gene Phân tử DNA là một chuổi xoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanine), T (thymine) Các nucleotide này nối kết liên tiếp nhau theo một thứ tự nhất định Giải trình tự tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử DNA

Có nhiều phương pháp giải trình tự khác nhau: phương pháp hóa học, phương pháp enzyme, phương pháp giải trình tự bằng máy tự động Giải trình tự bằng phương pháp enzyme được ứng dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm hiện nay Phương pháp này được phát minh bởi Sanger và cộng sự vào năm 1977

Nguyên tắc của phương pháp Sanger dựa vào nguyên tắc khuếch đại DNA mạch đôi, thành phần phản ứng gồm có: DNA polymerase, trình tự DNA mạch khuôn, bốn loại dNTP thông thường và một nhất định ddNTP Các phân tử ddNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc chất phát màu huỳnh quang khác nhau (Franca et al., 2002) Phân tử ddNTP không hình thành liên kết phosphodiester với deoxynucleotide tieeos theo, dân đến làm ngừng sự kéo dài mạch mới (Mahdieh & Rabbani, 2013)

II VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1.2.2 Thiết bị

Cân phân tích 4 số Sartorius- Đức Bể điều nhiệt Bioer, N3-8 Trung Quốc Máy ly tâm điện tử- Hettich- Đức

Máy PCR 96 giếng, Benchmark, TC 9639- Mỹ Quang phổ kế

Bàn soi UV (Major Scientific, MUV 21-254/365- Đài Loan) Hệ thống điện di (Mupid@- One- Nhật)

Tủ lạnh LG

Tủ lạnh ẩm độ Sanyo Lò vi sóng Sharp Tủ hút khí độc

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

* Chú thích: Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu của hãng Bioline và ABT

2.1.3 Các phần mềm và trang web trực tuyến

Các dữ liệu trình tự của gene 16S rRNA, gene ND5 được thu thập trên ngân

Chromas 2.6.6 Phần mềm giúp thể hiện tín hiệu huỳnh quang sau khi giải trình tự, giúp hiệu chỉnh

trên Google Scholar, PUBMED có liên quan đến đề tài với các từ khoá: Apidae, gene

16S rRNA, gene ND5, Phylogenetic analysis để tìm kiếm các thông tin như:

- Tổng quan về ong Dú

- Phương pháp định danh đã được thực hiện

- Chức năng gene 16S rRNA và ND5

- Trình tự vùng gene và các cặp mồi tương ứng

2.2.1.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi

Sau khi tiến hành thu thập các trình mồi chuyên biệt cho vùng gene 16S rRNA và gene ND5 trên ngân hàng dữ liệu NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.com), chúng tôi tiến đánh giá lại bộ mồi với trình tự gene 16S rRNA và gene ND5 bằng các

công cụ tin sinh học:

- BLAST với các thông số mặc định sẵn trên NCBI: nhằm xác định độ đặc hiệu của bộ mồi thiết kế

- IDT analyzer giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer,

- Annhyb: kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm

2.2.2 Tiến hành thực nghiệm

• Tách chiết DNA từ mẫu ong

Dự kiến áp dụng phương pháp phenol và chloroform (Chomczynski & Sacchi, 2006) hoặc bằng bộ kit thương mại Các bước chính trong phương pháp tách chiết DNA genome (Bộ gene) bằng phenol và chloroform:

-Bước 1: Từ mẫu ong ký sinh (được bảo quản trong cồn 90oC) vào eppendorf (1,5ml) vô trùng

-Bước 2: Bổ sung 500µL nước cất vô trùng, đảo nhẹ, ly tâm trong 15 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút Loại bỏ dịch nổi

-Bước 3: Bổ sung một thể tích dung dịch ly giải tế bào phù hợp (Tris HCl 1M, EDTA 0.5M, NaCl 5M, SDS 10%, ddH2O, Protein K 20 mg/ml) Sau đó tiến hành nghiền mẫu bằng kéo trong điều kiện vô trùng và ủ mẫu ở 56oC/48 giờ

-Bước 4: Sau đó tiến hành ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 5 phút Loại bỏ phần cặn, thu dịch nổi, bổ sung 500 μl phenol: chloroform với tỷ lệ1:1, lắc đều ống và ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút)

-Bước 5: Thu dịch nổi, bổ sung 1 thể tích chloroform, lắc đều, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 3 phút

-Bước 6: Thu dịch nổi, bổ sung ethanol tuyệt đối (2,5 thể tích mẫu) Ủ mẫu ở nhiệt độ 40oC qua một đêm

-Bước 7: Ly tâm ở 13.000 vòng/ phút, 10 phút Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 500 μl ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/ phút 15 phút (thực hiện lặp lại 2 lần) Loại bỏ ethanol và phơi khô mẫu qua đêm Bổ sung một thể tích nước cất hai lần vô trùng phù hợp, bảo quản ở -20oC

• PCR (Polymerase chain reaction)

- Thành phần phản ứng PCR:

Tổng thể tích phản ứng PCR là 50μl, trong đó gồm 25μl Master mix, 1 μl mồi xuôi, 1 μl mồi ngược, 1 μl DNA (10ng/ μl) và thể tích nước cất hai lần phù hợp (22μl)

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với nhiệt độ tối ưu cho bộ mồi 16SF/ 16SR theo chu trình dưới bảng 2.2:

• Điện di trên gel agarose

Chuẩn bị bảng gel (agarose 1,5%) cân 1,8 g agarose, hòa tan trong 120 ml TAE 1X, đun cho đến khi gel tan, thêm chất nhuộm (Ethidium bromide) ở nhiệt độ thích hợp và sau đó đổ vào khuôn, đợi gel khô

Hút khoảng 5 – 10 μl sản phẩm PCR cho vào eppendoft có sẵn dung dịch nạp mẫu phù hợp

Thực hiện điện di với điện thế 70V trong thời gian 40 phút Kết quả điện di được xác định dựa vào sự phát huỳnh quang dưới dia UV của chất nhuộm (Ethidium bromide) khi gắn chèn vào các phân tử DNA với sự hỗ trợ của thiết bị BioRad

• Giải trình tự bằng phương pháp Sanger

Các sản phẩm PCR khuếch đại các vùng gene mục tiêu có kết quả sản phẩm phẩm PCR và kích thước như dự kiến sẽ được gửi giải trình tự ở công ti TNHH Dịch vụ và Thương Mại Nam Khoa

2.2.3 Phân tích phát sinh loài phân tử

− Thu nhận các trình tự tương đồng của vùng gene bảo tồn của loài ong Dú bằng

công cụ BLAST trên NCBI

− Xây dựng cây phát sinh loài phân tử từ 2 gene 16S rRNA và ND5

− Sử dụng phần mềm MEGA11 để căn chỉnh trình tự trong quá trình tìm kiếm mô hình

− Xây dựng cây phát sinh loài phân tử theo phương pháp Neighbor- Joining (NJ), suy ra cây tiến hoá với thuật toán Neighbor - Joining

Bảng 2 2 Kết quả thiết lập chu trình nhiệt PCR khuếch đại vùng gene 16S rRNA

− Xây dựng cây phát sinh loài phân tử theo phương pháp Maximum Parsimony (MP)

− Xây dựng cây phát sinh loài phân tử theo phương pháp Maximum Likelihood (ML), sử dụng các thông số mô hình tiến hoá của dữ liệu được xác định bằng Modeltest

− Phương pháp Maximum Parsimony và phương pháp Maximum Likelihood thiết lập giá trị bootstrap là 1000 lần cho mỗi lần phân tích.

III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1 Kết quả thu thập bộ dữ liệu tham chiếu

Trong tiến trình xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử - cụ thể là bước đầu thiết lập

mô hình phân tích trên các trình tự gene 16S rRNA, ND5 để hỗ trợ định danh một số loài ong, Chúng tôi đã thu tập được tổng số 18 trình tự thuộc gene 16S rRNA trong đó có 2 trình tự thuộc nhóm outgroup và 10 trình tự thuộc gene ND5 trong đó có 5

trình tự thuộc nhóm outgroup thông qua bộ dữ liệu thể hiện ở bảng 3.1 dữ liệu trình

tự gene 16S rRNA ở một số loài ong và côn trùng, bảng 3.2 dữ liệu trình tự gene ND5

ở một số loài ong và côn trùng

Bảng 3 1 Dữ liệu trình tự gene 16S rRNA ở một số loài ong và côn trùng

Chú thích

12 MZ664388.1 Schwarziana mourei 565 bp NCBI

13 EU163000.1 Melipona amazonica 537 bp NCBI

Chú thích: (*): Trình tự thuộc nhóm “outgroup” (nhóm ngoại)

(**): Mã số truy cập (Accession number) phiên bản (Version)

Bảng 3 2 Dữ liệu trình tự gene ND5 ở một số loài ong và côn trùng

(**)

Nguồn gốc (Tên loài/ Chi)

Chiều

Chú thích

1 AF370441.1 Melipona bicolor 771 bp NCBI

2 AF466146.1 Melipona bicolor 1458 bp NCBI

10 HQ456998.1 Sulabanus lineatus 1176 bp NCBI (*)

Chú thích: *: Trình tự thuộc nhóm “outgroup” (nhóm ngoại)

(**): Mã số truy cập (Accession number) phiên bản (Version)

Trong khuôn khổ khóa luận này, do hạn chế về thới gian và kinh phí, nhóm

nghiên cứu chỉ khảo sát mô hình tiến hóa trên gene ND5, không tiến hành thực hiện

phản ứng PCR-giải trình tự trên gene nảy

3.2 Nội dung 2 Khảo sát trên máy tính để thiết kế bộ mồi phù hợp, đặc hiệu

trên vùng trình tự gene 16S rRNA và ND5 của một số loài ong 3.2.1 Kết quả khảo sát bộ mồi của vùng trình tự gene 16S rRNA

Trải qua quá trình thu thập và thiết kế mồi chúng tôi đã thiết kế được một cặp

mồi cho gene 16S rRNA được trình bày ở bảng 3.3 bằng công cụ Primer 3

Bảng 3 3 Trình tự mồi thiết kế của gene 16S rRNA

1 16S rRNA 16SF GGGACGATAAGACCCTATAG

Dựa vào chương trình phân tích IDT, chúng tôi đã tiến hành đánh giá các thông số vật lý của các cặp mồi 16SF - 16SR như chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ

nóng chảy, trọng lượng phân tử, năng lượng hình thành cấu trúc kẹp tóc, Seft dimer, Hetero dimer và thu được kết quả trong bảng 3.4

Bảng 3 4 Thông số khảo sát cặp mồi 16SF/16SR trên IDT analyzer

∆𝐺(𝑘𝑐𝑎𝑙 𝑚𝑜𝑙𝑒−1) Hairpin

dimer

Seft dimer

Hetero dimer

16S rRNA

-6.66

Kết quả kiểm tra cặp mồi 16SF/16SR

Sau khi thiết kế được cặp mồi cho gene 16S rRNA, chúng tôi tiến hành khảo sát độ đặc hiệu của mồi khi khuếch đại vùng gene 16S rRNA bằng cách sử dụng phần

mềm Annhyb và công cụ Blast

Hình 3 1 Kết quả BLAST của mồi 16SF

Hình 3 2 Kết quả BLAST của mồi 16SR

Theo kết quả Blast ở hình 3.1 và hình 3.2, chúng tôi nhận thấy cặp mồi 16SF/

16SR khuyếch đại đặc hiệu gene 16S rRNA của các loài: Lepidotrigona flavibasis (MN747147), Lepidotrigona terminata (MN737481), Melipona fasciculata (MH680930) thuộc họ Apidae với các điểm số tương đồng là 46.1, phần trăm tương

đồng đạt 100%

Tiếp theo chúng tôi tiếp tục xác định vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm PCR được khuếch đại bởi cặp mồi 16SF/16SR với 3 trình tự gene đại diện cho họ

Apidae bằng chương trình Annhyb

Hình 3 3 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi 16SF/16SR với trình tự của

Lepidotrigona ventralis

Hình 3 4 Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi 16SF/16SR với trình tự của

là 191-210 và điểm số tương đồng với trình tự của Lepidotrigona ventralis là 100%

Vị trí bắt cặp của mồi 16SR là 412 – 430 và điểm số tương đồng với trình tự

Lepidotrigona ventralis là 90% Dựa vào kết quả phân tích bằng công cụ Annhyb

(Hình 3.4), chúng tôi ghi nhận cặp mồi cho kết quả sản phẩm là 520 bp, với vị trí bắt

cặp của mồi 16SF là 198-217 và điểm số tương đồng với trình tự của Austroplebeia

symei là 100% Vị trí bắt cặp của mồi 16SR là 418 – 436 và điểm số tương đồng với

trình tự Austroplebeia symei là 100% Dựa vào kết quả phân tích bằng công cụ

Annhyb (Hình 3.5), chúng tôi ghi nhận cặp mồi cho kết quả sản phẩm là 504 bp, với vị trí bắt cặp của mồi 16SF là 175-194 và điểm số tương đồng với trình tự của

Geniotrigona thoracica là 100% Vị trí bắt cặp của mồi 16SR là 395 – 413 và điểm

số tương đồng với trình tự Geniotrigona thoracica là 100%

Tóm lại, sau quá trình phân tích bằng công cụ Annhyb cũng như khảo sát các thông số vật lý chúng tôi nhận thấy cặp mồi 16SF – 16SR phù hợp với tiêu chí thiết

kế mồi cho phản ứng PCR trên trình tự gene 16S rRNA nhằm thu nhận sản phẩm để giải trình tự và phân tích phả hệ phân tử của ong thuộc họ Apidae

3.2.2 Kết quả khảo sát bộ mồi của vùng trình tự gene ND5

Sau quá trình khảo sát bộ mồi trên các nghiên cứu khoa học được công bố

chúng tôi tiến hành thiết kế bộ mồi khuếch đại gene ND5 bằng phần mềm Primer 3

Bảng 3 5 Trình tự mồi khảo sát của gene ND5

STT Gene Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)

Dựa vào chương trình phân tích IDT, chúng tôi đã tiến hành đánh giá các thông số vật lý của các cặp mồi 3F/3R như chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ nóng chảy, trọng lượng phân tử, năng lượng hình thành cấu trúc kẹp tóc, Seft dimer, Hetero dimer và thu được kết quả trong bảng 3.6