TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA KHOA HỌC SINH HỌCCHỦ ĐỀ: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR ĐỂ NHẬN DẠNG ĐẶC HIỆU CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN GIA CẦMMôn: Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh họcGVH
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
CHỦ ĐỀ: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR ĐỂ NHẬN DẠNG ĐẶC HIỆU CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 TRÊN
GIA CẦM
Môn: Thiết bị và kỹ thuật công nghệ sinh học
GVHD: TS Huỳnh Văn Biết
Thành viên nhóm 7:
Tào Khả Nhi – 21126447 Trần Thị Hồng Phúc – 21126472
Trang 2I TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 VÀ PHƯƠNG PHÁP RT-PCR
1 Virus cúm A/H5N1
2 Phương pháp Real-time RT-PCR
II ỨNG DỤNG
1 Lấy mẫu bệnh phẩm
2 Phát hiện kháng nguyên
III.KẾT QUẢ
IV ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM RT-PCR
NỘI DUNG
Trang 3I TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 VÀ PHƯƠNG PHÁP RT-PCR
1 Virus cúm A/H5N1
Bệnh cúm gia cầm (H5N1) là bệnh do virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra
trên các loài gia cầm, thủy cầm và chim hoang dã Biến chủng virus cúm gây bệnh ở gia cầm được chia theo tính gây bệnh với mực độ độc lực khác nhau
Trang 4I TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 VÀ PHƯƠNG
PHÁP Real-time RT-PCR
2 Phương pháp Real-time RT-PCR
Kỹ thuật Real–time RT-PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng PCR Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra.
Trang 51 Lấy mẫu bệnh phẩm
1.1 Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên
Mẫu xét nghiệm kháng nguyên: lấy 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm (não,
phổi, khí quản, lách, ruột ) của gia cầm bị bệnh Trong trường hợp gia
cầm còn sống, sử dụng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp (swab), họng
hoặc lấy phân tươi sau đó cho vào dung dịch PBS, pH 7,2 đến 7,4, có bổ
sung dung dịch kháng sinh theo tỉ lệ 1:10
II ỨNG DỤNG
Trang 61.2 Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
Chỉ thực hiện đối với gia cầm chưa tiêm vắc xin cúm gia cầm: lấy máu của gia cầm nghi mắc cúm bằng cách sử dụng xy lanh 5 ml để lấy 1 ml máu, rút cán xy lanh tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt xy lanh nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 đến 30°C trong thời gian 30 min để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh Chắt huyết thanh sang ống 1,5 ml mới để dùng cho xét nghiệm
Các mẫu phải được bảo quản lạnh từ 2°C đến 8°C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h
II ỨNG DỤNG
Trang 72 Phát hiện kháng nguyên
2.1 Xử lý mẫu
2.1.1 Mẫu bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột)
Nghiền 1 gam bệnh phẩm bằng cối chày sứ với dung dịch PBS pH 7,2 theo tỉ lệ 1:10 thành huyễn dịch Bổ sung 1/10 lượng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm
Ly tâm ở tốc độ 8000 r/min trong 15s
Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào 2 ống Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR (rRT-PCR), phân lập vi rút trên tế bào, phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ -80 °C
II ỨNG DỤNG
Trang 82.2.2 Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân tươi
Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy bằng máy lắc trong 15s, ly tâm ống ở tốc độ 8000 r/min trong 15s
Dùng pipet hút dịch trong ống chuyển sang 2 ống 1,5 mL Một ống dùng cho các xét nghiệm Realtime RT-PCR, phân lập vi rút trên tế bào hoặc phân lập trên trứng, ống còn lại dùng làm mẫu lưu bảo quản ở nhiệt độ -80°
II ỨNG DỤNG
Trang 92.2 Phương pháp RT-PCR
2.2.1 Chiết tách ARN
Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN đối với các dịch bệnh phẩm bằng kit thương mại RNA tổng số được tách bằng cách sử dụng tất cả biện pháp phòng ngừa an toàn cần thiết ARN thu được sau quá trình chiết tách được hòa tan trong 20 μL nước không có L nước không có RNase
II ỨNG DỤNG
Trang 102.2.2 Tiến hành phản ứng
Sử dụng 2 µl RNA được sử dụng trong 25 µL hỗn hợp phản ứng bằng cách sử dụng Hệ thống sao chép ngược một bước (RT)-PCR với các loại mồi đặc hiệu H5N1 như sau:
Primer xuôi: 5'-ACTATGAAGAATTGAAACACCT-3' Primer ngược: 5'-GCAATGAAATTTCCATTACTCTC-3’
Chương trình PCR được cài đặt là: 60°C trong 1 phút, 42°C trong 10 phút, 50°C trong 30 phút
và 94°C trong 15 phút Sau đó là 35 chu kỳ 94°C trong 30 giây, 50°C trong 30 giây và 72°C trong 1 phút và cuối cùng là 72°C trong 10 phút Kích thước của PCR này, sản phẩm có khối lượng 456bp
và được phân giải trong agarose 1,2% gel Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp để xác nhận
II ỨNG DỤNG
Trang 112.2.3 Điện di sản phẩm RT-PCR:
Pha bột agarose với dung dịch 1xTAE , rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50°C đến 60°C), cho tiếp tidi bromua Sau đó đổ vào khay và cắm lược Để gel cứng lại trong khoảng 1 giờ, rồi rút lược ra Đổ đầy dung dịch 1xTAE vào bể điện di, đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di Pha loading dye với 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel Pha loading dye với mẫu (đối chứng âm và dương), đưa vào các giếng còn lại của miếng gel Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 phút đến 40 phút Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm để đọc
II ỨNG DỤNG
Trang 121 Thành lập bộ mồi PCR H5N1 mới:
Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5
hoặc N1 được đọc như sau: Phản ứng RT-PCR hiển thị vạch sản phẩm là
phản ứng dương tính Phản ứng RT-PCR không hiển thị vạch sản phẩm
như xác định ở trên là phản ứng âm tính
III KẾT QUẢ
Trang 132 Phát hiện cụ thể các mầm bệnh:
Hình 1 Phát hiện virus cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp RT-PCR
Trang 14 Ưu điểm
khả năng mang lại âm tính giả hơn so với các phương thức thử nghiệm khác.
Do đó hỗ trợ tốt cho bác sĩ trong việc tiên lượng tiến triển bệnh cũng như đánh giá hiệu quả điều trị.
III ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM RT-PCR
Trang 15 Nhược điểm
• Độ chính xác của kết quả RT-PCR phụ thuộc rất nhiều vào: Thời gian thu thập mẫu; loại mẫu; quá trình bảo quản, lưu trữ và xử lý mẫu.
• Kết quả âm tính giả có thể xảy ra nếu mẫu không được lấy đúng cách hoặc nếu một cá nhân được xét nghiệm quá sớm sau khi tiếp xúc với
vi rút hoặc quá muộn khi nhiễm vi rút.
• Đòi hỏi cao về kỹ thuật của người lấy mẫu, kỹ thuật viên xét nghiệm và thiết bị, máy móc hiện đại.
III ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM RT-PCR