BÁO CÁO AN TOÀN THỰC PHẨM PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ KIỂM SOÁT MỐI NGUY SINH HỌC ĐỐI VỚI YERSINIA ENTEROCOLITICA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINHĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

BÁO CÁO AN TOÀN THỰC PHẨM

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ KIỂM SOÁT MỐI NGUY SINH HỌCĐỐI VỚI YERSINIA ENTEROCOLITICA

Giảng viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Lan PhiNhóm 01_L02

Sinh viên thực hiệnMã số sinh viên

Thành phố Hồ Chí Minh – 2023

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC VIẾT TẮT

QAC Quaternary ammonium compound TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay PCR Polymerase-Chain-Reaction

LAMP Loop-mediated isothermal amplification ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point GMP Good manufacturing Practice

SSOP Sanitation Standard Operating Procedures HTST Hight temperature short time pasteurization UHT Ultra High Temperature

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG1.1 Đối tượng nghiên cứu

Yersinia enterocolitica là một loại vi khuẩn Gram âm, hình trực khuẩn, thuộchọ Yersiniaceae Chuyển động ở nhiệt độ 22–29°C (72-84°F), nhưng trở nên bất độngở nhiệt độ cơ thể người bình thường Nhiễm Y enterocolitica gây ra bệnh yersiniosis,

một bệnh lây truyền từ động vật xảy ra ở người, cũng như ở nhiều loài động vật như gia súc, hươu, nai, lợn và chim.

Y enterocolitica có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi và nó có

thể dễ dàng thích nghi với môi trường bên ngoài cơ thể vật chủ Mầm bệnh có thể tồn tại trong khoảng pH từ 4,2 đến 9 và trong nước có độ mặn lên đến 7% Nó có thể tồn tại trong một phạm vi nhiệt độ rộng, đặc biệt là ở nhiệt độ thấp và nó có thể cạnh tranh

với hầu hết các mầm bệnh truyền qua thực phẩm ưa thích nhiệt độ cao hơn Y.enterocolitica có thể phát triển ở 28–29 °C và có thể sống sót trong điều kiện đóng

Hình 1.1: Yersinia enterocolitica

Mặc dù Y enterocolitica chủ yếu là mầm bệnh đường tiêu hóa, nhưng nó có thể

gây nhiễm trùng ngoài đường ruột ở vật chủ có các yếu tố ảnh hưởng tiềm ẩn Đã có

nhiều bằng chứng chứng minh Y enterocolitica là mầm bệnh truyền qua thực phẩm đã

gây ra sáu đợt bùng phát lớn ở Hoa Kỳ Chẩn đoán viêm dạ dày ruột do Y.enterocolitica đạt được tốt nhất thông qua phân lập vi khuẩn trên môi trường vi khuẩn

học thông thường hoặc chọn lọc.

Diễn biến của bệnh yersiniosis chủ yếu được xác định bởi độ tuổi của vật chủ bị nhiễm bệnh Ở người lớn, hầu hết các bệnh nhiễm trùng đều không có triệu chứng hoặc nhẹ Yersiniosis kèm theo viêm dạ dày ruột thường gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi Các triệu chứng chủ yếu ở người là sốt, đau bụng và tiêu chảy Ở người cao tuổi, ngoài các triệu chứng giống như viêm ruột thừa, các dạng viêm nhiễm nặng có thể xuất hiện, thường có tính chất mãn tính, chẳng hạn như ban đỏ nút, hoặc áp xe vi mô ở các cơ quan nội tạng Nhiễm trùng huyết nặng có thể xảy ra trong các bệnh nhiễm trùng toàn thân.

Hình 1.2 Phân bố địa lý của bệnh Yersiniosis Source: European Centre for Disease Prevention and Control, Yersiniosis, in ECDC, Annual epidemiological report for 2016, Stockholm, ECDC, 2018.

1.2 Nguồn lây nhiễm

Hình 1.3: Đường lây truyền của Y enterocolitica sang người.

Trong nhiều trường hợp, mầm bệnh thực phẩm có nguồn gốc từ nguyên liệu thô có thể gây ô nhiễm thực phẩm Ngoài ra, sự nhiễm bẩn của chúng có thể do quá trình sản xuất hoặc chế biến sản phẩm gây ra.

Y.enterocolitica là mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm từ động vật sang người,

phổ biến rộng rãi trong môi trường và có dịch tễ học phức tạp vẫn chưa được hiểu đầy đủ Ô nhiễm vi sinh vật trên thân thịt thường xảy ra ở các lò mổ, mặc dù đã áp dụng các quy trình vệ sinh nghiêm ngặt trong quá trình giết mổ để giảm nguy cơ ô nhiễm thịt Mầm bệnh lây truyền qua việc ăn phải thực phẩm bị ô nhiễm Lợn được coi là ổ chứa chính các chủng gây bệnh cho người, nhưng nhiều loài động vật nuôi trong trang

trại, sống tự do và đồng hành dễ bị nhiễm bệnh [1] Ví dụ ở Na Uy, thịt lợn chưa nấu

chín, các sản phẩm xúc xích và nước không được xử lý có liên quan đến nhiễm trùng

Y enterocolitica.

Bọ chét chuột Xenopsylla cheopis là véc-tơ gây bệnh có nhiều loài bọ chét

động vật có thể truyền bệnh Các vật nuôi như chó hay mèo có thể bị nhiễm dịch sau khi tiếp xúc với chuột hoặc thỏ nhiễm bệnh hoặc sau khi bị bọ chét nhiễm bệnh đốt Những người nuôi hoặc nhân viên thú y có thể bị nhiễm bệnh sau khi bị bọ chét đốt hoặc sau khi hít phải giọt nước bọt trong không khí có chứa trực khuẩn dịch hạch.

Đậu phụ bị ô nhiễm và sữa tiệt trùng được phát hiện là phương tiện truyền Y.enterocolitica Ở hầu hết các động vật bị ảnh hưởng, nhiễm trùng không có triệu

chứng và mầm bệnh được bài tiết rất nhiều qua phân và làm ô nhiễm môi trường Các

sản phẩm sữa không tiệt trùng làm tăng nguy cơ nhiễm trùng Yersinia enterocolitica

có khả năng tồn tại và sinh sôi nảy nở trong điều kiện đông lạnh hoặc làm lạnh và phân bố rộng rãi trong các mẫu sữa Các sản phẩm sữa đông lạnh hoặc làm lạnh được

người tiêu dùng ưa chuộng Ở Trung Quốc, 296 chủng Y enterocolitica đã được thuthập từ người bị tiêu chảy, lợn, động vật gặm nhấm, cừu và chó Y enterocolitica đã

được phân lập từ nhiều loại thực phẩm, chủ yếu là các sản phẩm được bảo quản trong tủ lạnh.

Y enterocolitica cũng đã được phân lập từ các sản phẩm đã qua quá trình thanh

trùng, chủ yếu là sữa và phô mai Có nghĩa rằng một số chủng vi khuẩn có thể sống sót trong quá trình thanh trùng, mặc dù không thể loại trừ sự nhiễm bẩn thứ cấp Quá trình thanh trùng giết chết hầu hết vi khuẩn và trong các sản phẩm làm lạnh bị nhiễm

Y enterocolitica, mầm bệnh có thể phát triển ở nhiệt độ 4°C mà không có sự cạnh

Y enterocolitica cũng đã được xác định trong các sản phẩm đóng gói chân

không bao gồm rau diếp, rau ăn liền và nước trái cây được bảo quản ở nhiệt độ

khoảng 3°C Trong bao bì chân không, Y enterocolitica phát triển ở mọi nhiệt độ bảo

quản với tốc độ tương đương hoặc nhanh hơn so với hệ vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm Trái cây và quả mọng nhập khẩu là thực phẩm có liên quan đến việc tăng nguy cơ phát hiện.

CHƯƠNG 2: KIỂM SOÁT MỐI NGUY SINH HỌC2.1 Phương pháp phát hiện

Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN đã đưa ra tiêu chuẩn TCVN 8127:2018

quy định phương pháp phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh có trong thực phẩm

và các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm Tuy nhiên do tính đa dạng của thực phẩm nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể và một số sản phẩm khác cần sử dụng các phương pháp khác nhau.

Việc phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh bao gồm bốn giai đoạn liên tiếp :

Tăng sinh, phân lập, các phép thử sinh hóa, các phép thử về tính gây bệnh.

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình phát hiện Y enterocolitica gây bệnh trong các mẫu thực

Bước 1 : Lấy mẫu.

- Phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện, không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

- Nên sử dụng các kỹ thuật lấy mẫu được quy định trong các tiêu chuẩn cho từng mẫu cụ thể.

Bước 2 : Chuẩn bị mẫu thử.

- Trong trường hợp chung, để chuẩn bị huyền phù ban đầu, sử dụng canh thang PSB ở nhiệt độ phòng làm dịch pha loãng.

- Đồng hóa huyền phù này bằng cách sử dụng máy trộn nhu động trong 1 phút - Chuẩn bị dung dịch huyền phù ITC tăng sinh chọn lọc bằng cách chuyển 10mL

huyền phù PSB vào 90mL canh thang ITC và trộn Bước 3 : Cấy trực tiếp lên đĩa thạch chọn lọc.

- Lấy 1mL huyền phù PSB ban đầu chưa tăng sinh thu được vào 2 đến 4 thạch đĩa CIN và dàn đều trên các đĩa, sử dụng bộ dàn mẫu.

- Lật ngược các đĩa CIN và đặt chúng vào tủ ấm ở 30°Ctrong 24h± 2h Bước 4 : Tăng sinh.

- Ủ huyền phù ban đầu trong PSB và canh thang tăng sinh chọn lọc ITC ở 25°C trong 44h ± 4h (không khuấy trộn).

Bước 5 : Cấy đĩa và ủ ấm.

- Dùng pipet vô trùng chuyển 0,5mL môi trường tăng sinh PSB vào 4,5mL dung dịch KOH trộn đều Sau 20s ± 5s bổ sung môi trường tăng sinh PSB vào dung dịch KOH, dùng vòng cấy ria cấy lên bề mặt thạch đĩa CIN sao cho thu được các khuẩn lạc riêng rẽ Lặp lại quy trình với môi trường tăng sinh ITC.

- Lật úpcác đĩa CIN và đặt chúng vào tủ ấm ở 30°Ctrong 24h± 2h Bước 6 : Nhận biết các khuẩn lạc điển hình.

- Sau khi ủ 24h ± 2h, sử dụng kính hiển vi soi nổi được trang bị đèn chiếu sáng truyền qua trường tố hoặc chếch một góc 45° soi các đĩa CIN.

- Trên thạch CIN,Y.enterocoliticagây bệnh có khuẩn lạc nhỏ (khoảng 1mm hoặc nhỏ hơn), hình tròn, bờ đều trơn nhẵn, có viền nhỏ màu đỏ đậm, sắc nét bao quanh.

Bước 7 : Xác định các loàiYersiniagây bệnh - Phát hiện urease :

+ Ria cấy các khuẩn lạc lên bề mặt nghiêng của thạch Nới lỏng nắp ống nghiệm sao cho tạo điều kiện phát triển hiếu khí.

+ Ủ ở30°Ctrong 24h± 2h.

+ Màu hồng tím hoặc đỏ hồng là phản ứng urease dương tính, màu vàng-cam là phản ứng urease âm tính.

+ Giữ lại các khuẩn lạc urease dương tính và có hình thái khuẩn lạc điển hình để khẳng định thêm.

- Thủy phân esculin.

+ Ria cấy vi khuẩn trên bề mặt thạch nghiêng + Ủ ở30°Ctrong 24h± 2h.

+ Sau khi ủ thấy có quầng đen quanh các khuẩn lạc chứng tỏ phản ứng dương tính.

- Phát hiện plasmid độc lực (pYV) bằng phép thử trên thạch CR-MOX.

+ Sử dụng vòng cấy lấy vài khuẩn lạc của chủng cấy thuần đã chọn để khẳng định tiếp Cấy vào bề mặt thạch CR-MOX sao cho thu được các khuẩn lạc riêng rẽ.

+ Ủ ấm ở 37°Ctrong khoảng từ 24h-48h.

+ Đĩa cho phản ứng dương tính có chứa các khuẩn lạc nhỏ như đầu đinh ghim sắc tố cam đỏ rõ nét và có thể là các khuẩn lạc lớn hơn không màu Đĩa cho phản ứng âm chỉ chứa các khuẩn lạc không màu.

- Phát hiện pyrazinamidase :

+ Cấy một vòng cấy đầy các khuẩn lạc lên hết mặt thạch nghiêng của môi trường Ủ ở 30°Ctrong 48h± 2h.

+ Thêm 1mL dung dịch Sắt (II) amoni sulfat 1% mới chuẩn bị.

+ Nếu phản ứng dương tính, xuất hiện màu nâu hồng trong vòng 15 phút.

=> Chủng cấy Yersinia gây bệnh nếu cho phản ứng urease dương tính, esculin

và pyrazinamidase âm tính.

Bước 8 : Khẳng định Yersinia enterocolitica gây bệnh.

- Lysine decarboxylase và arginine dihydrolase :

+ Dùng que cấy cấy vi khuẩn vào từng môi trường lỏng ở ngay dưới bề

+ Cấy vi khuẩn lên một khoảng rộng của bề mặt thạch nghiêng của môi trường.

+ Ủ ở 30°Ctrong 24h± 2h.

+ Nhỏ 2 đến 3 giọt dung dịch sắt (III) clorua 10% lên khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch nghiêng.

+ Nếu thấy có màu xanh lá là phản ứng dương tính - Lên men sucrose, sorbitol, rhamnose và melibiose :

+ Cấy vi khuẩn vào từng môi trường ngay dưới bề mặt chất lỏng + Ủ ở 30°Ctrong 24h± 2h.

+ Môi trường có màu vàng sau khi ủ là phản ứng dương tính, có màu đỏ là phản ứng âm tính.

=> Chủng cấy Yersinia enterocolitica gây bệnh nếu cho phản ứng lysine

decarboxylase và phenylalanin (tryptophan) deaminase âm tính; sucrose, sorbitol dương tính và rhamnose và melibiose âm tính.

Lưu ý : Để bảo vệ sức khỏe của nhân viên phòng thử nghiệm, các phép thử

phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh chỉ được thực hiện trong các phòng thử

nghiệm được trang bị đầy đủ, dưới sự kiểm soát của nhà vi sinh vật học có kỹ năng.

Cần cẩn thận khi thải bỏ tất cả các vật liệu đã ủ [4]

Bên cạnh phương pháp nuôi cấy thì ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN cũng đã đưa ra tiêu chuẩn TCVN 11924:2017 (ISO/TS 18867:2015) quy định phương

pháp PCR phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh có trong thực phẩm Đây làphương pháp phát hiện bằng cách khuếch đại một trình tự đặc biệt với đoạn gen ali -một phần cơ chế gây bệnh của Y.enterocolitica Hệ thống phát hiện được xây dựng là

real-time PCR lặp lại kết hợp với kiểm soát khuếch đại bên trong khác loại dựa trên

plasmid PUC19 [5]

Các phương pháp nuôi cấy hiện tại được coi là không phù hợp và không đủ độ

nhạy để phát hiện Y enterocolitica gây bệnh ở mức độ thấp trong thực phẩm, nước và

các mẫu môi trường vì chúng có thời gian ủ bệnh dài, sai lệch về môi trường và thiếu tính đặc hiệu Do đó, nhiều phương pháp không phụ thuộc vào nuôi cấy đã được nghĩ

ra để phát hiện nhanh Y enterocolitica bao gồm: ELISA, lateral flow immunoassays,

immunoblotting, DNA colony hybridization, PCR, nested PCR, real-time PCR, DNA

microarrays, and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) Trong số này, các phương pháp dựa trên phân tử đã được sử dụng để điều tra sự xuất hiện của vi khuẩn

Y enterocolitica gây bệnh trong thực phẩm Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ thực

phẩm bị ô nhiễm tự nhiên khi ước tính bằng PCR cao hơn đáng kể so với phương pháp nuôi cấy từ thực phẩm có liên quan đến dịch tễ học, làm nổi bật độ nhạy thấp của

phương pháp nuôi cấy [6]

Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt các phương pháp phát hiện và nuôi cấy.

Hình 2.3: Các phương pháp phát hiện cho một số trường hợp cụ thể

2.2 Kiểm soát mối nguy sinh học

Y enterocolitica là vi khuẩn ưa lạnh do đó không thể sử dụng tủ lạnh để kiểm

soát sự phát triển của nó Vệ sinh thích hợp ở tất cả các giai đoạn xử lý và chế biến thực phẩm và xử lý nhiệt thích hợp là điều cần thiết để theo dõi sự xuất hiện của bệnh yersiniosis từ thực phẩm Nên tránh tiêu thụ sữa tươi hoặc thịt nấu chín ở nhiệt độ

thấp Y enterocolitica dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt và thanh trùng, có thể dễ dàng bị phá

hủy bởi bức xạ ion hóa, bức xạ tia cực tím và các quy trình bảo quản thực phẩm khác Một phương pháp khử dựa trên ánh sáng xung đã được sử dụng cho thịt lợn: sản phẩm được giữ trong hệ thống khử trùng để bàn để phân tích vi sinh vật Kết quả cho thấy rằng việc xử lý ánh sáng xung (20–1100 nm) làm giảm đáng kể số lượng tế bào vi khuẩn Trong một nghiên cứu khác, thể thực khuẩn độc lực Podoviridae được áp

dụng cho các mẫu thịt lợn sống để kiểm soát nhiễm Y enterocolitica

Nguyên nhân gây mất an toàn thực phẩm rất đa dạng và phức tạp nhưng chỉ có 3 tác nhân chính: tác nhân vật lý, tác nhân hóa học tác nhân sinh học Phân tích nguyên nhân qua các năm của Bộ Y tế cho thấy: Ngộ độc do thực phẩm ô nhiễm vi sinh vật luôn chiếm tỷ lệ cao nhất gần 50% Ngộ độc do vi sinh vật như ký sinh trùng,

nấm mốc, virus, vi khuẩn nói chung và đặc biệt vi khuẩn Yersinia enterocolitica nói

riêng Vì vậy cần các nguyên lý và yêu cầu trong quá trình thu hoạch, sản xuất, bảo quản thực phẩm để ức chế chúng sinh trưởng và phát triển hoặc tiêu diệt chúng trong thời kỳ đầu Nếu VSV đã phát triển thì khó tiêu diệt và ức chế chúng được, nhưng vẫn đảm bảo chất lượng và mùi vị sản phẩm Các phương pháp bảo quản thực phẩm:

Bảo quản ở nhiệt độ thấp: ức chế tốc độ của các phản ứng sinh hóa trong thực phẩm giúp ức chế sự hoạt động của chúng nhưng không tiêu diệt được hết VSV Nguyên tắc của phương pháp này là làm lạnh nhanh tùy theo đặc điểm cấu tạo của thực phẩm mà lựa chọn như ướp nước đá, sử dụng băng môi, các thiết bị tủ lạnh,

Bảo quản ở nhiệt độ cao: làm cho protein của thực phẩm lẫn VSV đều bị đông tụ Do đó hầu hết VSV sẽ chết và các enzyme sẽ bị phá hủy Nhưng muốn bảo quản lâu phải kết hợp thực phẩm kín, trong chân không để tránh nhiễm lại VSV Nói chung nhiệt độ cao diệt được VSV nhưng làm thay đổi giá trị dinh dưỡng của sản phẩm do đó tùy vào loại thực phẩm mà lựa chọn các chế độ thích hợp như sử dụng hơi nước đun sôi, hấp tiệt trùng (121oC), thanh trùng (HTST, UHT),

Làm khô: giảm độ ẩm tối thiểu, lượng nước cần thiết cho sinh sản, phát triển bị hạn chế như phơi nắng, dùng sức nóng nhân tạo, đông khô,

Ngoài ra còn có các phương pháp như điều chỉnh áp suất thẩm thấu, pH, phóng xạ,

Đặc biệt trong quá trình sản xuất cần tuân thủ các quy phạm sản xuất (GMP), quy phạm vệ sinh (SSOP), từ đó thấy được hệ thống quản lý chất lượng dựa trên cơ sở phân tích mối nguy và các điểm kiểm soát trọng yếu (HACCP) Các công ty nhà máy chế biến phải đáp ứng các yêu cầu: không đặt gần các khu vực chăn nuôi, bãi rác, khu hỏa táng, phát sinh mùi thối và là nguồn gốc sản sinh các loài VSV gây hại; đặc biệt tránh các bệnh viện có các khoa bệnh lây nhiễm Cơ cấu, vật liệu của cơ sở vật chất được xây dựng vững chắc bằng vật liệu không bị ảnh hưởng tới thực phẩm, không bị các sinh vật gây hại xâm nhập Nhà xưởng cần được bố trí phù hợp với trình tự dây chuyền công nghệ chế biến và phân thành các khu riêng biệt, đảm bảo không lây nhiễm chéo lẫn nhau giữa các nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm với vật liệu bao bì, chất tẩy rửa, phế liệu Nhà xưởng, thiết bị, dụng cụ và các phương tiện vật chất như hệ thống cấp - thoát nước, hệ thống vệ sinh, phải luôn trong tình trạng được vệ sinh sạch sẽ và hoạt động tốt; làm sạch thường xuyên và khử trùng ở những nơi yêu cầu Các chất thải, nước thải phải được xử lý thích hợp trước khi đưa ra ngoài cơ sở Phải có chương trình liên tục để kiểm soát sinh vật gây hại, kiểm tra sự xâm nhập ở trong và ngoài các khu vực sản xuất Nguyên vật liệu phải kiểm tra lấy mẫu hoặc có giấy chứng nhận chất lượng từ các nhà cung cấp nếu có cần được thanh trùng và xử lý trước khi đưa vào sản xuất Thao tác và vận chuyển trên dây chuyền sản xuất phải thực hiện theo nguyên tắc nghiêm ngặt để tránh lây nhiễm sản phẩm Đối với tất cả những người tiếp xúc với thực phẩm ( kể cả nguyên liệu, thành phẩm, thiết bị, dụng cụ, ) phải thực hiện nghiêm ngặt các quy định vệ sinh, phải kiểm tra sức khỏe định kỳ, cần có các cán bộ giám sát, kiểm tra việc thực hiện quy chế vệ sinh ở mỗi công đoạn.