Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vnTIÊU CHUẨN VIỆT NAMTCVN 10780-3:2016ISO/TR 6579-3:2014VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁCĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 10780-3:2016 ISO/TR 6579-3:2014 VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp Lời nói đầu TCVN 10780-3:2016 hồn tồn tương đương với ISO/TR 6579-3:2014; TCVN 10780-3:2016 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ tiêu chuẩn Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn ni gồm có phần sau: TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Cor 1:2004) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát Salmonella đĩa thạch Sửa đổi 1:2008 TCVN 4829:2005 (ISO 6579:2002, Amd 1:2007) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát Salmonella spp đĩa thạch - Sửa đổi 1: Phụ lục D: Phát Salmonella spp phân động vật mẫu môi trường từ giai đoạn sản xuất ban đầu; TCVN 10780-2:2015 (ISO/TS 6579-2:2012) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát hiện, định lượng xác định kiểu huyết Salmonella - Phần 2: Định lượng kĩ thuật số đếm có xác suất lớn thu nhỏ; TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) Vi sinh vật chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện, định lượng xác định typ huyết Salmonella - Phần 3: Hướng dẫn xác định typ huyết Salmonella spp VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN, ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA PHẦN 3: HƯỚNG DẪN XÁC ĐỊNH TYP HUYẾT THANH CỦA SALMONELLA SPP Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella - Part 3: Guidelines for serotyping of Salmonella spp CẢNH BÁO - Để bảo vệ sức khỏe nhân viên phịng thí nghiệm, thử nghiệm để phát Salmonella phòng thử nghiệm trang bị phù hợp, kiểm sốt người phân tích vi sinh vật có kinh nghiệm cẩn thận trình xử lý tất vật liệu ủ Người sử dụng tiêu chuẩn phải thành thạo thao tác thơng thường phịng thử nghiệm Tiêu chuẩn không đề cập đến tất vấn đề an toàn, liên quan đến việc sử dụng tiêu chuẩn Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp đảm bảo tuân thủ quy định hành Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn việc xác định typ huyết serovar Salmonella áp dụng để xác định typ huyết chủng cấy Salmonella spp khiết, phụ thuộc vào nguồn mà chúng phân lập Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật thực phẩm, thức ăn chăn nuôi nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản kiểm tra hiệu môi trường nuôi cấy ISO 6579-1, Microbiology of the food Chain - Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella -Part 1:Horizorital method for the detection of Salmonella spp Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Salmonella (Salmonella) Trực khuẩn gram âm, oxidase âm tính, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, thường tạo thành khuẩn lạc đường kính từ mm đến mm mơi trường đặc chọn lọc có đặc tính sinh hóa huyết điển hình phép thử thực theo tiêu chuẩn 3.2 Xác định typ huyết Salmonella (serotyping of Salmonella) Xác định có mặt hay khơng có mặt kháng ngun-O, kháng nguyên-H kháng nguyên-Vi cụ thể chủng vi khuẩn phân lập khẳng định Salmonella (3.1) 3.3 Công thức Kháng nguyên (anligenic formula) Sự kết hợp số chữ thể kháng nguyên O-, H- Vi- chủng vi khuẩn phân lập khẳng định Salmonella (3.1) Nguyên tắc Để xác định typ huyết Salmonella spp., kháng nguyên sau xác định cho chủng vi khuẩn phân lập khẳng định sinh hóa Salmonella spp.: Kháng nguyên-O, kháng nguyên-H kháng nguyên-Vi CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng quy trình khác để khẳng định chủng vi khuẩn phân lập Salmonella spp với điều kiện phù hợp quy trình thay xác nhận [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Môi trường nuôi cấy huyết 5.1 Quy định chung Đối với thực hành phòng thử nghiệm tại, áp dụng TCVN 6404 (ISO 7218) Đối với phép thử hiệu môi trường nuôi cấy, theo TCVN 8128 (ISO 11133) 5.2 Môi trường nuôi cấy thuốc thử Xem Phụ lục A 5.3 Kháng huyết Kháng huyết thanh-O, Kháng huyết thanh-H kháng huyết thanh-Vi có bán sẵn từ nhà cung cấp khác Thông tin kháng huyết đa giá kháng huyết đơn giá nêu Phụ lục B Thiết bị, dụng cụ Có thể sử dụng dụng cụ thủy tinh dùng lần để thay cho dụng cụ dùng nhiều lần, chúng có quy định kỹ thuật tương tự Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm vi sinh cụ thể sau: 6.1 Tủ ấm, để ni cấy phân lập Salmonella, có khả trì nhiệt độ khoảng từ 34 °C đến 38 °C CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, nhiệt độ ủ thông số tới hạn Các chủng phân lập nuôi cấy để thu đầy đủ sinh khối vi khuẩn khiết, để thực phép thử Vì LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn vậy, bước nuôi cấy thực nhiệt độ phát triển tối ưu Đối với Salmonella nhiệt độ thường từ 34 °C đến 38 °C 6.2 Tủ sấy (để khử trùng khô) nồi hấp (để khử trùng ướt) Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.3 Tủ lạnh (để bảo quản môi trường nuôi cấy chuẩn bị), có khả trì nhiệt độ °C ± °C 6.4 Lam kính 6.5 Dụng cụ cấy vơ trùng, ví dụ kim cấy, que cấy vịng cấy (ví dụ µl) 6.6 Ống nghiệm bình cầu vơ trùng, có dung tích thích hợp Có thể sử dụng bình chai ống nghiệm có nắp kim loại chất dẻo (nắp vặn) không độc 6.7 Đĩa Petri vơ trùng, có đường kính khoảng 55 mm đến 90 mm 6.8 Nồi cách thủy, có khả trì nhiệt độ 47 °C đến 50 °C 6.9 Nồi cách thủy (hoặc tủ ấm), có khả trì nhiệt độ 50 °C ± °C Lấy mẫu Điều quan trọng phòng thử nghiệm làm việc với chủng cấy khiết khẳng định sinh hóa Salmonella spp Phân loại Salmonella 8.1 Tổng quan Cứ khoảng năm, Trung tâm nghiên cứu chuẩn Salmonella WHO (Viện Pasteur, Paris) công bố cập nhật “Công thức kháng nguyên serovar Salmonella”, sở để định danh tên typ huyết serovar công thức chủng vi khuẩn phân lập Salmonella spp Thời điểm công bố phiên sơ đồ White-Kauffmann-Le Minor năm 2007 (Tài liệu tham khảo [9]) CHÚ THÍCH: Những bổ sung cho sơ đồ White-Kauffmann-Le- Minor công bố Nghiên cứu Vi sinh, ấn phẩm Viện Pasteur (trước gọi Annales de I’Institut Pasteur/Microbiologie) Ví dụ, bổ sung số 47 công bố năm 2010 đưa serovar phát từ năm 2003 đến năm 2007 (Tài liệu tham khảo [10]) Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn xác định typ huyết serovar Salmonella 8.2 Danh pháp (cách đặt tên) Các danh pháp khác sử dụng (hoặc sử dụng) cho chủng Salmonella: - Ban đầu, Kauffmann (Tài liệu tham khảo [12]) coi serovar Salmonella loài riêng biệt; - Các kiểu loài khác sử dụng: S enterica vs.S choleraesuis, lồi có chủng khác; - Một số chủng Salmonella "quan trọng" (như Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi) coi loài khơng phải "chỉ" serovar lồi Hội đồng trọng tài Tiểu ban kỹ thuật quốc tế hệ thống tự động nghiên cứu sinh vật nhân nguyên thủy (Procaryotes) cho thấy sử dụng nhiều từ đồng nghĩa việc gọi tên Salmonella (Tài liệu tham Khảo [22]) Trong tiêu chuẩn này, tên gọi chấp nhận sử dụng rộng rãi, Trung tâm nghiên cứu chuẩn Salmonella WHO [Tài liệu tham khảo 9], Hiệp hội Vi sinh vật Mỹ (Tài liệu tham khảo [20]), Trung tâm kiểm soát ngăn ngừa bệnh tật (Tài liệu tham khảo [3]) Sổ tay Bergey's (Tài liệu tham khảo [17]) chấp nhận Theo danh pháp hành, chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae bao gồm hai loài: S enterica S bongori S enterica chia thành sáu phân loài: S enterica subsp; enterica, S enterica subsp salamae, S enterica subsp arizonae, S enterica subsp diarizonae, S enterica subsp houtenae S enterica subsp indica Các serovar Salmonella thuộc S enterica subsp enterica thường phân lập nhiều (trên 99,5 % số chủng Salmonella phân lập được) chúng đặt tên, thường liên quan đến vị trí địa lý nơi serovar phân lập lần đầu Các serovar thuộc phân loài khác S enterica S bongori đặt tên theo công thức kháng nguyên chúng Do có kết hợp phân lồi nhiều serovar, nên tên đầy đủ dài (ví dụ: Salmonella enterica subsp Enterica serovar Typhimurium) Do đó, cách gọi ngắn thường sử dụng để tên LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn serovar phân loài enterica Hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor đưa gợi ý tên gọi rút gọn sau đây: S enterica serovar Typhimurium Salmonella ser Typhimurium Theo Tài liệu tham khảo [3], trích dẫn serovar tên chi cần theo sau từ "serovar" viết tắt "ser." sau tên tên serovar Sau đó, tên viết tên chi theo sau tên serovar (ví dụ Salmonella Typhimurium) Cách gọi tên serovar Salmonella chấp nhận hầu hết tạp chí [ví dụ: Tạp chí Hiệp hội Vi sinh vật Mỹ (ASM)] sử dụng tiêu chuẩn Tóm lại, gọi tên Salmonella sau: Họ:Enterobacteriaceae (chữ viết hoa, chữ in nghiêng) Chi:Salmonella (chữ viết hoa, chữ in nghiêng) Lồi:enterica (khơng viết hoa, chữ in nghiêng) Phân lồi:enterica (khơng viết hoa, chữ in nghiêng) Serovar (typ huyết ser.): ví dụ: Typhimurium (chữ viết hoa, khơng in nghiêng) Phân lồi: salamae arizonae diarizonae houtenae indica Loài: bongori Trong phần bổ sung cho hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [10]) có 600 serovar Salmonella đề cập đến số lượng tăng đều, thống kê Bảng Bảng - Số lượng 80 serovar Salmonella qua năm Bổ sung Loài/phân loài 1998 a 2001b 2007c Số lượng serovar Salmonella enterica 443 502 587 subsp enterica 1454 1492 1547 subsp salamae 489 500 513 subsp arizonae 94 95 100 subsp diarizonae 324 331 341 subsp houtenae 70 71 73 subsp indica 12 13 13 Salmonella bongori 20 21 23 463 523 610 Tổng số serovar (chi Salmonella) a Tài liệu tham khảo [18] b Tài liệu tham khảo [19] c Tài liệu tham khảo [10], qua năm 2003 đến 2007 8.3 Các đặc tính sinh hóa Các lồi phân lồi Salmonella xác định dựa phép thử sinh hóa khác Trong Bảng đưa đặc tính khác Xem Tài liệu tham khảo [9] Phụ lục C để biết thêm chi tiết Bảng - Các đặc tính sinh hóa lồi phân lồi Salmonella (Tài liệu tham khảo [9]) Loài S enterica Phân loài enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica S bongori Dulcitol + + - - - d + LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Loài S enterica ONPG (2 h) - - + + - d S bongori + Malonate - + + + - - - Gelatinase - + + + + + - Sorbitol + + + + + - + - - - - + - + + - - - - - - Galacturonate - + - + + + + γGlutamyltransferase +e + - + + + + β-Glucuronidase d d - + - d - Mucate + + + - (70 %) - + + Salicin - - - - + - - Lactose - - - (75 %) + (75 %)+ - d - Dung giải pha O1 + + - + - + d a Phát triển với KCNb L(+)-tartrate c + ≥ 90 % phản ứng dương tính; - ≥ 90 % phản ứng âm tính; d phản ứng khác serovar khác nhau; a o-Nitrophenyl-β-D-galaclopyranoside (phép thử [β-galactosidase] b Kali xyanua; c = D-Tartrat, Paratyphi B:-, Paratyphi B biovar Java:+ e = Typhimurium:d Dublin:- 8.4 Đặc tính kháng nguyên 8.4.1 Yêu cầu chung Các đặc tính kháng nguyên quan trọng Salmonella phép thử huyết chia thành ba loại sau: - Kháng nguyên-O, gọi kháng nguyên thân; - Kháng ngun-H, cịn gọi kháng ngun lơng; - Kháng ngun-Vi, cịn gọi kháng ngun vỏ Các cơng thức kháng nguyên Salmonella spp gồm có ba typ kháng nguyên sau đây: kháng nguyên-O, kháng nguyên-Vi (nếu có]: kháng nguyên-H pha thứ nhất: kháng nguyên-H pha thứ hai Ví dụ: cơng thức kháng ngun Salmonella Paratyphi C là: 6,7[Vi]:c:1,5, với kháng nguyên-O:6 O:7; với kháng ngun-Vi, có mặt khơng có mặt (ký hiệu dấu ngoặc vuông), với kháng nguyên-H H:c pha thứ nhất, với kháng nguyên-H H:1 H:5 pha thứ hai 8.4.2 Kháng nguyên-O (kháng nguyên thân) Kháng nguyên bao gồm thành phần vách tế bào chất polysaccharid, protein phospholipid Kháng nguyên-O bền chịu nhiệt độ đến 100 oC 150 min, xử lý etanol 95 % thể tích axit lỗng (Tài liệu tham khảo [16]) Phản ứng kháng nguyên-O với kháng huyết làm ngưng kết hạt Trước đây, tài liệu Kauffmann-White (Tài liệu tham khảo [9]) kháng nguyên-O phân loại thành nhóm kháng nguyên-O Các nhóm đặt tên với chữ La Mã bất đầu với nhóm A, gồm có kháng nguyên O:2 đến nhóm Z có chứa kháng nguyên O:50 Vì có nhiều kháng ngun-O, nên kháng ngun cịn lại khơng đưa váo nhóm, đặt tên thành kháng nguyên-O từ O:51 đến O:67 Ngày nay, nhóm O sử dụng O-yếu tố điển hình dùng nhiều Các chữ giữ lại đưa vào dấu ngoặc đơn, ví dụ: O:4 [B] (Tài liệu LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn tham khảo [9]) Trong Bảng đưa tên gọi cũ Bảng - Các nhóm huyết Salmonella (tên gọi cũ) kháng nguyên-O có liên quan (tên gọi mới) Nhóm Kháng nguyên-O Nhóm Kháng nguyên-O Nhóm Kháng nguyên-O A G1-G2 13 Q 39 H 6,14 R 40 6,7 I 16 S 41 C2, C3 J 17 T 42 D1 K 18 U 43 D2 9,46 L 21 V 44 9,46,27 M 28 W 45 3,10 N 30 X 47 E4 1,3,19 O 35 Y 48 F 11 P 38 Z 50 B C1(C4) a D3 E1(E2, E3) b a C4 đa gộp vào C1 b E2 E3 gộp vào E1 8.4.3 Kháng nguyên-H (kháng nguyên lông) Kháng nguyên nằm sợi lông thành phần protein Kháng nguyên không bền kháng nguyên-O, dễ bị phân hủy ancol, axit nhiệt độ 60 oC, có khả chịu dung dịch formalin 0,5 % thể tích (Tài liệu tham khảo [16]) Phản ứng kháng nguyên-H với kháng huyết làm ngưng kết Nhiều Salmonella spp có hai pha kháng nguyên-H, biến thể pha ba pha chưa biết Pha gọi pha đặc hiệu pha thứ hai gọi pha không đặc hiệu Pha đầu ký hiệu chữ thường từ a đến z Tuy nhiên, từ nhận biết kháng nguyên-z, nhiều kháng nguyên-H phát đặt tên z1, z2, z3 z91 Các ví dụ serovar pha là: - Salmonella Paratyphi A: 1,2,12:a:[1,5] với H:a pha đầu tiên, dấu ngoặc vng pha thứ hai (H:1,5) có mặt khơng có mặt; - Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]:d:-; với H:d pha đầu; - Salmonella Derby: 1,4,[5], 12:f,g[1,2]; với H:f,g pha đầu tiên, pha thứ hai (H:1,2) có khơng có mặt; - Salmonella Enteritidis: 1,9,12:g,m:-; với H:g,m pha đầu Ngoài H:g,m, số chủng có H:p, H:f, H:t Các chủng đặc biệt có kháng nguyên H:1,7 pha thứ hai; - Salmonella Dublin: 1,9,12,[Vi]:g,p:-; với H:g,p pha đầu CHÚ THÍCH 1: Các yếu tố-O gạch chân xác định biến trạng thực khuẩn Chúng có mặt chủng cấy dung giải thể thực khuẩn biến trạng tương ứng (Tài liệu tham khảo [2]) CHÚ THÍCH 2: Các yếu tố-O -H ngoặc vng có mặt khơng có mặt, mà khơng liên quan đến thực khuẩn thể tiến trạng (Tài liệu tham khảo [2]) CHÚ THÍCH 3: Các chủng Salmonella Derby Salmonella Enteritidis gặp Có thể cần chuyển đổi pha đề phát chủng gặp Tuy nhiên, điều cần thiết với trường hợp định [ví dụ trường hợp sai lệch nguồn và/hoặc trường hợp có di chuyển (đặc biệt)] 8.4.4 Kháng nguyên-Vi (kháng nguyên vỏ) Kháng nguyên kháng nguyên vỏ che khuất kháng nguyên-O làm cho vi khuẩn không ngưng kết với kháng huyết thanh-O Thành phần kháng nguyên-Vi polysaccharid Các chủng Salmonella có kháng ngun-Vi độc so với chủng khơng có kháng nguyên-Vi Kháng nguyên-Vi có mặt ba Salmonella serovar: - Salmonella Typhi: 9,12, [Vi]:d:-; LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - Salmonella Paratyphi C: 6,7,[Vi]:c:1,5; - Salmonella Dublin: 1,9,12, [Vi]:g,p:- Trong dấu ngoặc vuông cho thấy có khơng có mặt kháng ngun-Vi CHÚ THÍCH: Sự có mặt kháng ngun-Vi chủng phân lập Salmonella từ mẫu thực phẩm mẫu thú y gặp Nếu có mặt kháng nguyên-Vi, che khuất kháng nguyên-O Để phát kháng nguyên-O, cần làm nóng huyền phù mẫu phân lập (ví dụ: dung dịch nước muối sinh lý) 100 oC 60 min, 120 oC 15 Quy trình xác định typ huyết Salmonella 9.1 Yêu cầu chung Trước bắt đầu xác định typ huyết thanh, cần khẳng định sinh hóa chủng phân lập thuộc chi Salmonella (như quy định ISO 6579-1) Mặc dù kháng nguyên-H đặc hiệu cho Salmonella, số kháng nguyên-O thường gặp chi khác Enterobacteriaceae (ví dụ: Salmonella, Citrobacter, Hafnia) CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng quy trình khác để khẳng định chủng phân lập thuộc chi Salmonella, với điều kiện quy trình thay xác nhận (xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Mỗi nhà cung cấp kháng huyết sản xuất kháng huyết riêng, kèm theo hướng dẫn sử dụng Do đó, khơng thể đưa hướng dẫn cho việc xác định typ huyết thanh, cần phải thực theo hướng dẫn nhà cung cấp để có kết tối ưu Một số nhà sản xuất cung cấp kháng huyết (hỗn hợp nhiều kháng huyết thanh-O kháng huyết thanh-H) hữu ích cho việc xác định typ huyết chưa biết Khi chủng ngưng kết với kháng huyết hỗn hợp, tiếp tục thử nghiệm với nhóm kháng huyết và/hoặc với loại kháng huyết hỗn hợp dương tính Khi cần nhấn mạnh serovar định khả để serovar khác theo Salmonella spp tiến hành ngưng kết với kháng huyết đơn giá cụ thể serovar có liên quan Trong Phụ lục B đưa quy trình chung việc xác định typ huyết chưa biết chủng phân lập Salmonella 9.2 Ví dụ quy trình xác định typ huyết cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng 9.2.1 Yêu cầu chung Trong ví dụ mơ tả quy trình xác định typ huyết cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (xem Phụ lục D) Trong Bảng đưa chủng với công thức kháng nguyên chúng Trong phần sau, mô tả việc ngưng kết chủng phân lập Salmonella, quy trình thường thực nhiều Tuy nhiên, có quy trình khác, ví dụ: phương pháp đĩa vi giếng (xem Phụ lục E) Bảng - Công thức kháng nguyên năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Tên Kháng nguyên-Ob Kháng nguyên-H Pha Pha 1,4,[5]12 i 1,2 1,9,12 g,m - Salmonella Infantis 6,7,14 r 1,5 Salmonella Virchow 6,7,14 r 1,2 6,8 Z10 e,n,x Salmonella Typhimurium Salmonella Enteritidis Salmonella Hadar a a Ngoài yếu tố H:g,m, số chủng có yếu tố H:p H:f H:t Trừ chủng có kháng nguyên H:1,7 pha thứ (Tài liệu tham khảo [9]) b Các yếu tố O gạch chân xác định biến trạng thực khuẩn Chúng có mặt chủng cấy dung giải thể thực khuẩn biến trạng tương ứng (Tài liệu tham khảo [9]) 9.2.2 Chọn khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella Cấy khuẩn lạc từ chủng cấy khiết nghi ngờ Salmonella theo đặc tính sinh hóa Sử dụng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn môi trường nuôi cấy phương pháp nhà sản xuất quy định kháng huyết sử dụng Nếu khơng có sẵn thơng tin, sử dụng mơi trường thạch khơng chọn lọc thạch dinh dưỡng (ví dụ: xem A.2) Ủ đĩa thạch dinh dưỡng cấy từ 34 °C đến 38 °C (6.1) "qua đêm" (khoảng 18 h) 9.2.3 Kiểm tra phản ứng tự ngưng kết Ví dụ phép thử kiểm tra phản ứng tự ngưng kết mơ tả sau Có thể sử dụng phương pháp khác Thực theo hướng dẫn nhà sản xuất - Cho giọt nước muối (có thể thay đổi lừ NaCI 8,5 g/l đến NaCI 35 g/l, nồng độ cao nhạy hơn) lam kính (6.4) - Chuyển lượng nhỏ chủng cấy vi khuẩn (ví dụ: lấy lượng µl que cấy dùng lần) sang lam kính trộn với giọt nước muối - Nghiêng nhẹ lam kính qua lại Tùy thuộc vào nhà sản xuất và/hoặc nồng độ muối, thường khoảng s đến 60 s - Đánh giá huyền phù Khi có mặt hạt huyền phù chứng tỏ có tự ngưng kết Các chủng có phản ứng dương tính phép thử tự ngưng kết khó kiểm tra thêm để xác định typ huyết Đối với chủng tự ngưng kết, thực phép thử kháng nguyên-O Tuy nhiên, đơi điều tra kháng nguyên-H Nếu chủng cho thấy tự ngưng kết, thử hai cách khuẩn lạc và/hoặc khuẩn lạc khác - Hịa khuẩn lạc nước vơ trùng thay dung dịch nước muối tiến hành quy trình tự ngưng kết - Cấy chủng môi trường thạch bán đặc mối trường thạch Rappaport Vassiliadis cải biến (MSRV) (theo quy định ISO 6579-1) sử dụng khuẩn lạc từ thạch bán đặc để thực quy trình tự ngưng kết CHÚ THÍCH: Các chủng tự ngưng kết cịn gọi chủng "ráp" 9.2.4 Ngưng kết với kháng huyết thanh-O Các hướng dẫn sử dụng kháng huyết khác nhà sản xuất Do đó, điều quan trọng ln tn thủ hướng dẫn nhà sản xuất Hầu hết nhà sản xuất sử dụng phương pháp ngưng kết lam kính để phát kháng nguyênO Trong phương pháp này, trộn giọt huyết với huyền phù vi khuẩn (trực tiếp từ đĩa, ống canh thang) lam kính Nghiêng nhẹ lam kính qua lại Sau đó, quan sát ngưng kết lam kính Sự có mặt hạt chứng tỏ phản ứng dương tính Đối với nhà sản xuất khác nhau, có thay đổi cách tiến hành sau: - Kích thước giọt lam kính (ví dụ: 25 µl “giọt”]; - Cách trộn kháng huyết với vi khuẩn lam kính (vi khuẩn lấy trực tiếp từ môi trường thạch huyền phù, kháng huyết cho trực tiếp lam kính hay cho vào huyền phù vi khuẩn); - Thời gian nghiêng trượt lam kính (có thể dao động từ s đến 60 s]; - Cách quan sát ngưng kết (phóng đại hay khơng, tối ánh sáng bình thường]; - Giải thích kết (đọc thích liên quan đến hạn chế quy trình] 9.2.5 Ngưng kết với kháng huyết thanh-H Sau ngưng kết với kháng nguyên-O, tiến hành ngưng kết với kháng nguyên-H Salmonella thường có hai loại kháng nguyên-H (pha pha 2) Nếu pha-H tìm thấy âm tính với chủng hai pha, cần thực phương pháp đảo pha Pha-H bị khống chế phương pháp đảo pha Bằng cách khống chế pha-H chính, pha-H thứ hai thể xác định Phương pháp thường sử dụng để đảo pha phương pháp Sven Gard, xem 9.2.7 Đối với việc này, kháng huyết đảo pha cụ thể cho vào môi trường thạch chủng Salmonella cấy thành điểm đĩa Môi trường thạch phải đủ mềm Salmonella di chuyển dễ dàng mơi trường Nồng độ thạch mơi trường thay đổi từ 0,5 % đến % khối lượng (tùy thuộc vào nồng độ gel thạch) Ví dụ di chuyển bề mặt môi trường đưa A.3 Các ví dụ khác đảo pha đưa Phụ lục F LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Để kiểm tra ngưng kết, thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 9.2.6 Phép thử ngưng kết để xác định typ huyết năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng 9.2.6.1 Yêu cầu chung Để phát năm serovar Salmonella đề cập Bảng 4, cần đến kháng huyết thanh-O kháng huyết thanh-H sau đây: O:4, O:5, O:6 (O:61 O:6,7 O:6,14,24), O:7 O:8, O:9 O:46 H:i, H:2, H:G H:g (đơn giá), H:m, H:q, H:s, H:t, H:r, H:5, H:z10 H:x Để xác định typ huyết chủng Salmonella theo thứ tự nêu Bảng 4, thực quy trình quy định 9.2.6.2 đến 9.2.6.5 (xem sơ đồ Phụ lục D) Để biết thêm thông tin phép thử kháng nguyên khác nhau, xem Phụ lục B 9.2.6.2 Nếu O:4 dương tính Ngưng kết với O:5 Kết dương tính hay âm tính Salmonella Typhimurium, cịn có thơng tin liên quan đến mục đích dịch tễ Ngưng kết với kháng huyết H:i H:2 (có thể cần đảo pha) Các serovar chủng Typhimurium hai phản ứng dương tính Ngưng kết với O:12 không cần thiết để chứng tỏ chủng phân lập Salmonella Typhimurium, O:4 dương tính chứng tỏ có mặt O:12 Tương tự, việc phát kháng ngun H:1 khơng có khả phân biệt khơng cần phải kiểm tra bổ sung 9.2.6.3 Nếu O:9 dương tính Ngưng kết với kháng huyết H:G (hỗn hợp) với kháng huyết H:g (kháng thể đơn giá) Nếu phản ứng dương tính, tiến hành ngưng kết tiếp với kháng huyết H:m Nếu kết dương tính, ngưng kết với kháng huyết H:q H:s để kiểm chứng âm Nếu phản ứng âm tính, ngưng kết tiếp với O:46 muốn, ngưng kết tiếp với O:12 Nếu O:46 âm tính (và O:12 dương tính), serovar chủng Enteritidis CHÚ THÍCH: Ngồi yếu tố H:g,m, số chủng Salmonella Enteritidis cho phản ứng dương tính với kháng huyết H:p H:f H:t Tuy nhiên, chủng Trừ chủng đặc biệt có kháng nguyên H:1,7 pha thứ hai 9.2.6.4 Nếu O:7 dương tính Ngưng kết với kháng nguyên H:r, H:2 H:5 (có thể cần đảo pha) Nếu H:r H:2 dương tính, serovar chủng là: Virchow Nếu H:r H:5 dương tính, serovar chủng là: Infantis Việc phát kháng ngun H:1 khơng có khả phân biệt không cần phải kiểm tra bổ sung 9.2.6.5 Nếu O:8 dương tính Ngưng kết với kháng nguyên H:z10 H:x Nếu hai dương tính, ngưng kết tiếp với kháng huyết O:6 O:6,7 O:6,14,24 Nếu O:61 O:6,7 O:6,14,24 dương tính serovar chủng là:Hadar Một số mẻ kháng huyết O:6,7 không phản ứng với chủng O:6,8 Khi mua kháng huyết này, cần chắn có phản ứng với chủng O:6,8 (hỏi nhà sản xuất) CHÚ THÍCH: Dạng biến thể khuẩn lạc xảy với biểu kháng nguyên O:61 số serovar nhóm huyết C2 (Tài liệu tham khảo [11]) Vì lý đó, khơng phải lúc nhận biết được, ví dụ Salmonella Hadar Salmonella Istanbul serovar rõ ràng 9.2.7 Ví dụ đảo pha sử dụng phương pháp Sven Gard Ví dụ mơ tả việc đảo pha dùng cho việc xác định typ huyết Salmonella Typhimurium Nhìn chung, phương pháp áp dụng cho serovar Salmonella khác LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Khi O:4 H:i dương tính, cịn H:2 âm tính, chuẩn bị đĩa thạch di chuyển (xem A.3 F.1), với kháng-H:i (ví dụ: hỗn hợp huyết đảo pha có chứa H:i) Chấm chủng vi khuẩn vào đĩa thạch Ủ đĩa từ 34 °C đến 38 °C (6.1) qua đêm (khoảng 18 h) Sau ủ, tàm lại việc ngưng kết chủng với kháng nguyên H:2 Nếu H:2 lại âm tính, ngưng kết tiếp với H:i Nếu H:i âm tính có phản ứng yếu, chủng khơng phải Salmonella Typhimurium Nếu H:i cho phản ứng dương tính (mạnh), lặp lại việc đảo pha Chuẩn bị lại đĩa thạch với khángH:i lấy vi khuẩn từ điểm xa mọc lan đĩa thạch, đảo pha thứ để cấy vào đĩa thứ hai Lặp lại quy trình đảo pha CHÚ THÍCH 1: Đơi cần bổ sung kháng huyết H:i vào thạch (của đĩa đảo pha lặp lại) để thu phản ứng tốt CHÚ THÍCH 2: Cũng có biến thể pha Salmonella Typhimurium, ví dụ thiếu khơng thể pha H thứ hai 1.4.[5]12:i:- Trong xác định typ huyết biến thể này, phải lặp lại lần nhiều lần việc đảo pha để loại trừ có mặt pha thứ hai Ngồi ra, cò thể sử dụng phương pháp phân tử để khẳng định có phải biến thể Salmonella Typhimurium hay khơng 10 Kiểm sốt chất lượng Huyết sử dụng để ngưng kết phải (trừ kháng huyết sử dụng để thử nghiệm latex) Luôn phải kiểm tra huyết trước khỉ sử dụng Trường hợp bị đục, thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Các quy trình kiểm sốt chất lượng quy trình xác định typ huyết sau: - Mỗi tuần làm việc chọn hai chủng (hoặc số lượng chủng chiếm khoảng % khối lượng chủng phân lập được) Mỗi chủng cấy hai lần Các chủng cấy chuyển xử lý hai chủng phân lập để xác định typ huyết Sau hoàn thành công việc, kết hai chủng chủng cấy chuyển so sánh khác biệt Nếu có khác biệt nào, nghiên cứu tiếp - Phịng thử nghiệm lưu giữ đầy đủ chủng gốc serovar Salmonella đặc hiệu (ví dụ: từ sưu tập chủng cấy từ nghiên cứu so sánh liên phòng) Chủng lưu gốc này, định kỳ (ví dụ: hàng tuần) chọn hai serovar 10 serovar thường gặp phịng thử nghiệm để kiểm tra quy trình xác định typ huyết Các serovar sử dụng để thực việc kiểm sốt chất lượng thay đổi hàng tuần để đảm bảo khoảng thời gian kháng huyết khác kiểm tra - Phải kiểm tra khả xác định typ huyết phòng thử nghiệm khác Để thực hiện, nên thường xuyên tham gia vào nghiên cứu so sánh liên phịng, 11 Báo cáo kết Đối với chủng phân lập thuộc S enterica subsp enterica, báo cáo tên (đầy đủ) có thể/khi cần kèm theo cơng thức kháng ngun Đối với lồi (phân lồi) khác, báo cáo cơng thức kháng ngun tìm thấy Các ký hiệu công thức kháng nguyên sau: Kháng nguyên-O (cách dấu phẩy), kháng nguyên-Vi (nếu có): kháng nguyên-H pha (cách dấu phẩy): kháng nguyên-H pha thứ hai (nếu có; cách dấu phẩy); kháng nguyên-H pha thứ ba (nếu có) Ví dụ, theo hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [9]), công thức Kháng nguyên đầy đủ Salmonella Typhimurium là: 1,4,[5],12:i:1,2 Với kháng nguyên-O O:1,4,[5],12; yếu tố O gạch xác định thể thực khuẩn biến trạng xuất chủng cấy dung giải thực khuẩn thể biến trạng tương ứng dấu ngoặc vng có khơng có mặt yếu tố liên quan đến thực khuẩn thể biến trạng (Tài liệu tham khảo [9]); với kháng nguyên-H, H:i pha thứ H:1,2 pha thứ hai Để báo cáo thức, cơng thức kháng nguyên chủng phân lập, tốt khơng có ngoặc vng khơng có gạch Báo cáo cơng thức kháng ngun xác định, ví dụ 4,12:i:1,2 Đối với phân loài khác S enterica, lồi có serovar phù hợp thể ký hiệu sau (Tài liệu tham khảo [9]): LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn II serovar S enterica subsp salamae; llla serovar S enterica subsp arizonae; lllb serovar S enterica subsp diarizonae; IV serovar S enterica subsp houtenae; VI serovar S enterica subsp indica Ví dụ báo cáo kết loài khác với S enterica subsp enterica S II 30:z10:e,n,x,z15 Phụ lục A (Tham khảo) Thành phần chuẩn bị môi trường nuôi cấy thuốc thử A.1 Yêu cầu chung Trong Phụ lục đưa môi trường nuôi cấy liên quan đến phép thử sinh hóa (xem Phụ lục C) Thành phần môi trường nuôi cấy nêu phụ lục lấy làm ví dụ Mơi trường ni cấy có tên gọi tương tự nêu tài liệu bán sẵn với thành phần khác Do đó, điều quan trọng phép thử sinh hóa cần kiểm tra phản ứng môi trường nuôi cấy với chủng kiểm chứng dương tính âm tính điển hình ĐIỀU QUAN TRỌNG - Nếu môi trường nuôi cấy thuốc thử chuẩn bị từ môi trường nuôi cấy hồn chỉnh khơ thuốc thử mơi trường ni cấy chuẩn bị sẵn sử dụng, thực theo hướng dẫn nhà sản xuất chuẩn bị, điều kiện bảo quản, hạn sử dụng cách sử dụng Thời hạn sử dụng môi trường nuôi cấy nêu phụ lục thể số tài liệu nghiên cứu Người sử dụng cần kiểm tra xác nhận điều kiện bảo quản [xem TCVN 8128 (ISO 11133)] A.2 Thạch dinh dưỡng A.2.1 Thành phần Chất chiết từ thịt Pepton a 3,0 g 5,0 g Natri clorua (NaCI)(tùy chọn) 5,0 g Thạch từ 9g đến 18 gb Nước 000 ml a Ví dụ: thủy phân casein enzym b Tùy thuộc vào sức đông thạch A.2.2 Chuẩn bị Đun nóng để hịa tan thành phần nước Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng 7,0 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển mơi trường ni cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) 121 °C 15 Chuyển khoảng 20 ml môi trường tan chảy vào đĩa Petri vơ trùng với đường kính 90 mm (6.7) Để cho đơng đặc Bảo quản đĩa rót (hướng lên trên), tránh hút ẩm để nơi tối °C (6.3) đến tháng Nếu cần, làm khô đĩa trước sử dụng A.3 Môi trường thạch - Sven Gard (ví dụ) A.3.1 Ví dụ (Tài liệu tham khảo [16]) Sử dụng thạch dinh dưỡng với nồng độ thạch cải biến Cần xác định nồng độ thạch thạch dinh dưỡng dùng cho đảo pha H đĩa Petri Nồng độ thay đổi từ 0,5 % đến % phần khối lượng, tùy thuộc vào mẻ thạch sử dụng Môi trường thạch yêu cầu phải đủ mềm cho Salmonella di chuyển dễ dàng khắp môi trường sau ủ qua LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn đêm từ 34 °C đến 38 °C (6.1) Các thử nghiệm sơ bộ, khơng bổ sung kháng huyết thanh, cần sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng (pH 7,4) chuẩn bị cho mục đích thạch dinh dưỡng phịng thử nghiệm thơng thường, làm bán bổ sung canh thang với tỷ lệ thích hợp để qua đêm Thể tích cần cho đĩa Petri 10 cm 30 ml Việc di chuyển bề mặt thạch dễ bổ sung natri desoxycholate (0,3 g/l) vào mơi trường (natri desoxycholate kích thích di chuyển), xem A.3.2 A.3.2 Ví dụ A.3.2.1 Thành phần Chất chiết từ thịt 5,0 g Chất chiết nấm men 1,0 g Canh thang đậu tương trypto-casein 30,0 g Glucose 0,35 g Natri desoxycholat 1,0 g Thạch từ g đến ga Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đơng thạch Có thể cần cải thiện để xác định nồng độ thạch môi trường cần thiết cho di chuyển tối ưu Salmonella A.3.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng 7,6 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển môi trường ni cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 110 °C 20 Làm nguội thạch đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C (6.8), bảo quản chai đậy kín °C (6.3) đến tháng Ngay trước sử dụng: - bổ sung giọt kháng huyết có liên quan (SG1 đến SG6) vào môi trường tan chảy trộn đều; - rót khoảng 10 ml vào đĩa Petri đường kính 55 mm (6.7) rót khoảng 20 ml vào đĩa Petri đường kính 90 mm A.4 Canh thang malonat A.4.1 Thành phần (Tài liệu tham khảo [14]) Amoni sulfat 2,0 g Dikali phosphat 0,6 g Monokali phosphat 0,4 g Natri clorua 2,0 g Natri malonat 3,0 g Bromothymol xanh 0,025 g Nước 000 ml A.4.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng 6,7 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển môi trường nuôi cấy với lượng ml vào ống cho phép có đủ oxy để xảy phản ứng malonat Ví dụ, sử dụng ống kích thước xấp xỉ 22 mm x 220 mm Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 121 °C 15 Bảo quản nơi tối °C (6.3) đến tháng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn A.5 Canh thang Dulcitol (Tài liệu tham khảo [2]) A.5.1 Mơi trường hồn chỉnh A.5.1.1 Thành phần a Chất chiết từ thịt 3,0 g Peptona 10,0 g Natri clorua 5,6 g Chất thị Andrade (A.5.2) 10 ml Dung dịch Dulcitol (A.5.3) 50 ml Nước 000 ml Ví dụ: phân giải casein enzym A.5.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước Chỉnh pH để sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển môi trường nuôi cấy với lượng ml vào ống có dung tích danh nghĩa 15 ml Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 121 °C 15 Bảo quản nơi tối °C (6.3) đến tháng A.5.2 Chất thị Andrade A.5.2.1 Thành phần (sau Andrade-Penny năm 1895; trích dẫn Tài liệu tham khảo [7]) Fuchsin axit 0,5 g Natri hydroxit (1,0 mol/l) 0,5 g Nước 000 ml A.5.2.2 Chuẩn bị Hòa tan fuchsin nước, thêm natri hydroxit Nếu sau vài mà fuchsin không màu thêm ml ml natri hydroxit Thuốc thử có hạn sử dụng dài cần chuẩn bị lượng đủ lớn để dùng nhiều năm A.5.3 Dung dịch Dulcitol A.5.3.1 Thành phần Dulcitol 10 g Nước 000 ml A.5.3.2 Chuẩn bị Hòa tan dulcitol nước Tiệt trùng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm Bảo quản °C (6.3) đến tháng A.6 Dung dịch ONPG (0,013 mol/l) (Tài liệu tham khảo [2]) A.6.1 Mơi trường hồn chỉnh A.6.1.1 Thành phần o-Nitrophenyl-D-galactoside (ONPG) 0,08 g Dung dịch mononatri phosphat (NaH2PO4.H2O; A.6.2) ml Nước 15 ml A.6.1.2 Chuẩn bị Hòa tan ONPG nước khoảng 37 °C Thêm dung dịch NaH2PO4 1,0 mol/l (A.6.2.1) Dung dịch phải không màu Bảo quản dung dịch °C (6.3) Trước sử dụng, làm ấm lượng thích hợp (đủ cho số lượng phép thử) dung dịch ONPG đến LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn khoảng 37 °C A.6.2 Dung dịch mononatri phosphat (1,0 mol/l) A.6.2.1 Thành phần NaH2PO4.H2O 6,9 g Dung dịch NaOH, 300 g/l ml Nước 45 ml A.6.2.2 Chuẩn bị Hòa tan NaH2PO4.H2O nước Thêm dung dịch NaOH 300 g/l chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 (ở 25 °C) Thêm nước đến 50 ml bảo quản dung dịch °C (6.3) đến tháng A.7 Canh thang D-tartrat (axit tartrat hữu cơ) A.7.1 Thành phần a Peptona 10,0 g Kali natri (+) tartrat 10,0 g Dung dịch bromothymol xanh, 10 g/l 2,4 ml Nước 000 ml Ví dụ: phân giải casein enzym A.7.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng 7,4 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển môi trường nuôi cấy với lượng ml vào ống có dung tích danh định 15 ml Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 115 °C 10 Bảo quản nơi tối °C (6.3) đến tháng A.8 Dung dịch chì axetat A.8.1 Thành phần Chì axetat khoảng 50 g Nước 10 ml A.8.2 Chuẩn bị Cho nước vào chai có nắp vặn thích hợp Bổ sung đủ lượng chì axetat để tạo dung dịch bảo hịa (nghĩa có thấy chì axetat khơng tan rõ đáy chai) Bảo quản nhiệt độ phòng đến tháng A.9 Canh thang tim-não (BHI) A.9.1 Thành phần Bột não 12,5 g Bột tim bò 5,0 g Pepton proteose 10,0 g Glucose 2,0 g Natri clurua 5,0 g Dinatri phosphat 2,5 g Nước 000 ml A.9.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng 7,4 ± 0,2 25 °C, cần LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Chuyển môi trường nuôi cấy với lượng ml vào ống có dung tích danh nghĩa 15 ml Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 121 °C 15 Bảo quản nơi tối °C (6.3) đến tháng A.10 Dung dịch nước muối formal (1 % phần thể tích) A.10.1 Thành phần Dung dịch formaldehyd, 370 g/l 40,0 ml Dung dịch natri clurua 170 g/l 200 ml Nước Lên đến 000 ml A.10.2 Chuẩn bị Cho dung dịch formaldehyd vào dung dịch natri clurua Thêm nước đến tổng thể tích I A.11 ỐNG Craigie A.11.1 Thành phần a Canh thang dinh dưỡnga 25,0 g Thạch 2,75 g Nước 000 ml Đối với thành phần, xem A.2 (khơng có thạch) A.11.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng 7,2 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển môi trường nuôi cấy với lượng ml vào ống chai miệng rộng có nắp vặn có dung tích danh nghĩa khoảng 15 ml chứa ống Craigie (các ống hẹp ngắn, mở hai đầu) Ống Craigie cần cao bề mặt thạch Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 115 °C 10 Bảo quản nhiệt độ phòng đến tháng A.12 Gelatin dinh dưỡng A.12.1 Thành phần Chất chiết từ thịt Pepton a a 3,0 g 5,0 g Gelatin 120,0 g Nước 000 ml Ví dụ: phân giải casein enzym A.12.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng Chỉnh pH để sau khử trùng pH tương ứng tà 6,8 ± 0,2 25 °C, cần Chuyển môi nuôi cấy trường với lượng ml vào ống có dung tích danh nghĩa 15 ml Khử trùng nồi hấp áp lực (6.2) trì 121 °C 15 Để mơi trường nguội theo vị trí thẳng đứng bảo quản °C (6.3) đến tháng Phụ lục B (Tham khảo) Ví dụ quy trình xác định typ huyết chủng phân lập Salmonella chưa biết Trong Hình B.1 bước cần thực trước xác định typ huyết chủng phân lập Salmonella Đưa đề xuất cách xử lý với chủng tự ngưng kết (chủng thô), xem 9.2.3 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Các ví dụ quy trình sử dụng để xác định typ huyết chủng phân lập Salmonella chưa biết tóm tắt Bảng B.1 Hình B.2 Trong Bảng B.2 đưa thông tin thành phần kháng huyết đa giá (có thể khác nhà cung cấp) Hình B.2 Bảng B.2 thu từ Tài liệu tham khảo [6] Hình B.1 - Các bước cần thực trước xác định typ huyết Salmonella spp Bảng B.1 - Quy trình xác định typ huyết chủng phân lập Salmonella chưa biết cách ngưng kết với kháng huyết OMA OMB đa giá Bước Phân tích kháng nguyên-O Sử dụng kháng 1.1 huyết đa giá OMA 1.2 OMB Nếu dương tính: bước 2.1.1 Nếu dương tính: bước 2.2.1 Nếu âm tính: sang bước 1.2 Nếu âm tính: xem thích a Bước Sử dụng nhóm 2.1.1 O:4,5 nhóm B kháng huyết Phân tích kháng Nếu dương tính: bước 3.1.1 đặc hiệu - dùng cho nguyên-O chủng phân lập Nếu âm tính: bước 2.1.2 nhóm huyết 2.1.2 O:9 nhóm D thanhb Nếu dương tính: bước 3.1.2 2.2.1 O:6,7,8 nhóm C Nếu dương tính: bước 3.2.1 Nếu âm tính: bước 2.2.2 2.2.2 O:13.22,23 O:13 Nếu dương tính: bước 3.2.2 Nếu âm tính: bước 2.1.3 2.1.3 O:3,10,15 nhóm E Nếu âm tính: bước 2.2.3 2.2.3 Nếu dương tính: bước 3.1.3 Nếu âm tính: bước 2.1.4 2.1.4 O:21 nhóm L Nếu âm tính: bước 2.1.5 2.1.5 O:1,2 nhóm A LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 O:11 Công ty luật Minh Khuê Bước Phân tích kháng nguyên-O www.luatminhkhue.vn Sử dụng kháng 1.1 huyết đa giá OMA 1.2 OMB Nếu dương tính: bước 2.1.1 Nếu dương tính: bước 2.2.1 Nếu âm tính: sang bước 1.2 Nếu âm tính: xem thích a Sử dụng kháng 3.1.1 Chủng phân lập nhóm B: huyết đơn Phân tích kháng O:5, O:27 giá - nhận biết nguyên-O serovar kháng 3.1.2 Chủng phân lập nhóm D: nguyên-O đặc hiệu O:46 nhóm D2 3.2.1 Chủng phân lập nhóm C Bước O:7 nhóm C1 O:8, O:61, O:20 nhóm C2-3 O:14, O:24, O:25 nhóm H O:27 nhóm D3 3.1.3 Chủng phân lập nhóm E: Bước Phân tích kháng ngun lơng O:10,O:15,O:34 nhóm E1 3.2.2 Chủng phân lập nhóm G O:19 nhóm E4 O:22, O:23 Sử dụng kháng huyết đa giá H đa giá (pha pha 2) Sử dụng kháng huyết đơn giá H:1(1,2) → (H:2, H:5, H:6, H:7) d H đa giá (pha 2) H:a, H:b, H:c, H:d, H:E→(H:h, H:n, H:x, Hz15)d H:G(g.m) → (H:f, H:g, H:m; H:p, H:q H:s, H:t, H:u]d H:i, H:k H:L→(H:v, H:w, H:l,z13, H:l,z28)d H:y H:z, H:Z4→ (H:z23, H:z24, H:z32)d H:z6, H:z10, H:z29, H:z35, v.v a Trong trường hợp phản ứng âm tính với hai kháng huyết đa giá thử phân lập tiếp với kháng huyết đa giá nhóm kháng huyết đặc hiệu cho phép nhận biết lên đến nhóm O:67 gửi chủng phân lập đến phòng thử nghiệm chuẩn b Nếu Bước kháng huyết đa giá kháng thể khác với OMA OMB sử dụng thi kháng huyết nhóm đặc hiệu bước phải sửa lại tương ứng c Có thể bỏ qua việc sử dụng kháng huyết đa giá kháng H chọn kháng huyết đơn giá tương ứng với chứng phân lập serovar nhóm huyết ước tính d Kháng huyết ngoặc đơn cần thiết để nhận biết kháng nguyên phức hợp kháng nguyên H tương ứng LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn * Có thể sử dụng huyết O:1,2 để kiểm tra có mặt kháng nguyên O:1 a) Các kháng nguyên thân - Các phép thử tiến hành với kháng huyết đơn giá đa giá để phát kháng nguyên Salmonella thân (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước dãy hàng ngang thực thử nghiệm trước cho thấy có phản ứng dương tính (ví dụ: O:4,5 dương tính, kiểm tra O:5, v.v ) Thành phần kháng huyết đa giá sử dụng sơ đồ đưa Bảng B.2.] b) Kháng ngun lơng - Các phép thử tiến hành với kháng huyết đơn giá đa giá để phát kháng nguyên Salmonella lông (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước đường ngang thực thử nghiệm trước cho thấy có phản ứng dương tính Thành phần kháng nguyên đa giá sử dụng sơ đồ nêu Bảng B.2.] Hình B.2 - Phát kháng nguyên Bảng B.2 - Thành phần kháng huyết đa giá liên quan đến Hình B.2 (Tài liệu tham khảo [6]) Yếu tố O H Kháng huyết đa giá Kháng nguyên tương ứng OMA 1,2,12 + 4,5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3,19 + 21 OMB 6,7 + 6,8+ 11 + 13,22+ 13,23 + 6,14,24 + 8,20 H1 1,2 + 1,5 + 1,6 + 1,7 + z6 HE e,h + e,n,x + e,n,z15 HG f,g + g,p + g,m,s + g,m + m,t HMA a + b + c + d + i + z10 + z29 HMB e,h + e,n,x + e,n,z15 + G HMC k + y + L + z4 + r Phụ lục C LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn (Tham khảo) Phép thử sinh hóa C.1 Phân biệt phân loài Salmonella C.1.1 Yêu cầu chung Để phân biệt phân loài Salmonella, cần thực số phép thử sinh hóa (xem bảng 2) Một số ví dụ phép thử đưa C.1.2 đến C.1.5 C.1.2 Phép thử malonat Cấy vào canh thang malonat (xem A.4) dịch cấy thu từ thạch nghiêng từ canh thang cấy (tốt cấy vòng cấy mm đầy canh khuẩn) Ủ ấm canh thang cấy khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) quan sát phản ứng sau 24 h ± h sau 48 h ± h Trong trường hợp có phản ứng dương tính, màu sắc mơi trường thay đổi từ màu xanh sang màu xanh chàm (Prussian blue) C.1.3 Phép thử dulcitol Cấy vào canh thang dulcitol (xem A.5) với ml canh khuẩn từ môi trường thạch nghiêng Ủ canh thang cấy khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) quan sát phản ứng sau 24 h ± h sau 48 h ± h Trong trường hợp có phản ứng dương tính (axit hóa), mơi trường chuyển sang màu hồng C.1.4 Phép thử ONPG Nuôi cấy chủng phân lập cần thử nghiệm thạch dinh dưỡng nghiêng (hoặc mơi trường khác) (xem A.2) có chứa 1,0 % khối lượng lactose Nhũ hóa mọt vịng cấy đầy sinh khối vi khuẩn vào 0,25 ml dung dịch nước muối sinh lý để thu huyền phù “đặc” Thêm giọt toluen vào ống lắc để giải phóng enzym Để ống nhiệt độ khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) Thêm 0,25 mol dung dịch ONPG 0,013 mol/l (A.6) vào ống dung dịch huyền phù cần thử nghiệm Ủ ống khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) kiểm tra ống khoảng thời gian đến 24 h Màu vàng chứng tỏ kết dương tính C.1.5 Phép thử gelatinase Cấy đâm sâu chất cấy thu từ chủng cấy ủ “qua đêm” vào môi trường gelatin dinh dưỡng (xem A.12) Ủ ống khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) 24 h ± h Đặt ống nước đá để tủ lạnh khoảng 30 Nếu gelatin bị phân giải, mơi trường ống đông đặc sau làm lạnh, điều cho thấy có mặt gelatinase Ngồi ra, ống ủ 25 °C đến tuần, kiểm tra hàng ngày hóa lỏng gelatin Vì gelatin hóa lỏng nhiệt độ 28 °C, nên cần làm mát ống ủ để đảm bảo việc hóa lỏng gelatinase khơng phải nhiệt độ ủ Điều hữu ích cho việc sử dụng ống khơng ni cấy làm kiểm chứng C Phân biệt Salmonella Paratyphi B Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java Để phân biệt Salmonella Paratyphi B Salmonella Paratyphi B biovar Java, cần thực phép thử phản ứng D-tartrat Ngồi ra, thực phép thử PCR, Tài liệu tham khảo [15] Đối với phản ứng D-tartrat, thực quy trình sau (Tài liệu tham khảo [1]) - Nuôi cấy chủng cần thử nghiệm môi trường thạch không chọn lọc - Hòa khuẩn lạc dung dịch nước muối 8,5 g/l đến mật độ khoảng 109 cfu/ml - Cấy phần 50 µl chủng vào hai ống chứa canh thang D-tartrat (xem A.6) Cũng cấy hai chủng kiểm chứng vào hai ống canh thang D-tartrat Phép kiểm chứng: dương tính Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java, âm tính Salmonella Paratyphi B - Ủ ống hiếu khí (khơng lắc) khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) 18 h ± h LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn - Sau ủ, kiểm tra ống đổi màu Nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính - Thêm vào dãy ống đựng canh thang ống 0,5 ml dung dịch chì axetat bão hịa (xem A.8) để n ống tối thiểu 30 kết tủa lắng xuống - Sau đó, kiểm tra ống kết tủa (thường sau h đến h) Trường hợp phản ứng dương tính có kết tủa lắng đáy ống trường hợp phản ứng âm tính kết tủa cịn lơ lửng mơi trường canh thang Các ống nghiệm so sánh với ống kiểm chứng dương tính âm tính Nếu phép thử dương tính chủng coi Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java ống D-tartrat thứ hai loại bỏ - Nếu phép thử âm tính ống thứ hai ống kiểm chứng ủ thêm ngày (tổng thời gian ủ ngày) - Sau ủ xong, bổ sung chì axetat vào ống - Các chủng dương tính sau ngày coi Salmonella Paralyphi B typ sinh học Java chủng âm tính coi Salmonella Paratyphi B Phụ lục D (tham khảo) Sơ đồ tổng thể xác định typ huyết năm sarovar Salmonella có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng 0:4 0:9 0:7 0:7 0:8 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + + + + + ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ (O:5→ + -) H:G H:g H:r H:r H:z10 │ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + + + + ↓ ↓ ↓ ↓ H:m H:2 H:2 H:x ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ H:2 + + - + ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ + H:q, H:s H:5 H:5 O:6 (O:61, O:6,7) O:6,14,24] ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ │ - - + + │ ↓ │ │ │ │ 0:46 │ │ │ │ ↓ │ │ │ │ - │ │ │ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Salmonella ser Typhimurium Salmonella ser Enteritidis Salmonella ser Virchow Salmonella ser Infantis Salmonella ser Hadar H:i ↓ + LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Phụ lục E (Tham khảo) Phương pháp đĩa chuẩn độ vi giếng để xác định typ huyết Salmonella spp E.1 Yêu cầu chung Quy trình nêu phụ lục dựa Tài liệu tham khảo [21] Trong phòng thử nghiệm việc xác định typ huyết với số lượng lớn chủng Salmonella, sử dụng kỹ thuật đĩa chuẩn độ vi giếng kết hợp với hệ thống phân phối kháng huyết bán tự động vào đĩa có nhiều ưu điểm Tổng quan phương pháp: - Các huyền phù vi khuẩn chuẩn bị để phát kháng nguyên O (huyền phù-O) kháng nguyên-H (huyền phù H) Huyền phù vi khuẩn chuẩn bị cách nuôi cấy chủng cần thử nghiệm hai canh thang não-tim (xem A.9): chai huyền phù O ống nghiệm huyền phù H Cả hai canh thang ủ nhiệt độ khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) h đến h - Sau ủ, huyền phù O hấp nước 30 sau pha lỗng với lượng tương đương dung dịch nước muối 8,5 g/l - Sau ủ, huyền phù H bị diệt cách thêm lượng tương đương dung dịch nước muối formal % (xem A.10) để yên nhiệt độ phòng qua đêm trước thử nghiệm - Kháng huyết phân phối vào đĩa 96 giếng đáy tròn, sử dụng pipet đa kênh hệ thống phân phối tự động Các đĩa chuẩn bị gắn kín bảo quản °C (6.3) tối đa tuần - Các huyền phù O H chuẩn bị phân phối thủ công vào đĩa vi giếng chuẩn bị, sử dụng pipet chất dẻo dùng lần pipet có đầu tip dùng lần - Các đĩa ngưng kết O gắn kín ủ 50 °C (6.9) 18 h ± h - Các đĩa ngưng kết H ủ h nồi cách thủy 50 °C (6.9) Tốt sử dụng nồi cách thủy có giá đỡ khơng có lỗ nằm ngang mức nước - Sau ủ, kiểm tra ngưng kết Quan sát ngưng kết lắng đáy giếng tốt quan sát từ phía đĩa, sử dụng gương Trước sử dụng; xác định độ chuẩn kháng huyết cần thử nghiệm đĩa vi giếng Các kháng huyết dự định sử dụng phương pháp đĩa vi giếng 23 kháng huyết thanh-O xếp hai đĩa vi giếng có kiểm sốt dung dịch muối đĩa thứ hai Đĩa chứa kháng huyết thanh-O đa giá (PSO), bảy kháng huyết nhóm 4,5,12; 6,7; 6,8; 9,12; 3,10; 13,22; 6,14,24 bốn kháng huyết hấp thụ 1, 20, 27 46 Các đĩa thứ hai chứa kháng huyết hấp thụ 4, 5, 7,8,9,10,14,15,19, 22 23 E.2 Đĩa vi giếng kháng nguyên O Cột đĩa Huyết giếng cột PSO 4,5,12 6,7 6,8 9,12 3,10 13,22 10 11 12 6,14,24 20 27 46 E.3 Đĩa vi giếng kháng nguyên O Cột đĩa 10 11 12 Huyết giếng cột 10 14 15 19 22 23 Kiểm chứng Mỗi chủng thử nghiệm tất huyết đĩa vi giếng Tám chủng thử nghiệm hai đĩa vi giếng Để xác định kháng nguyên-H, chủng thử nghiệm với gồm 11 kháng huyết nước muối kiểm chứng Các kháng huyết gợi ý Salmonella H đa giá (PSH 1+2) có chứa kháng thể H = a H = z29 để bao trùm pha kháng thể pha phức H = 1,2,5,6,7 (PSH 2) Bốn kháng huyết phức H = E;G;L;1,2,5,6,7 sáu kháng huyết hấp thụ H = b,d,i,r,z,z10 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn E.4 Đĩa vi giếng kháng nguyên-H Cột đĩa Huyết giếng cột 10 11 12 PSH 1+2 E G L PSH2 b d i r z z10 Kiểm chứng Việc nhận biết pha hoàn chỉnh chủng ngưng kết với PSH 1+2 sáu kháng huyết hấp thụ không cần tiếp tục thử pha Đối với chủng ngưng kết với PSH bốn phức, cần thử nghiệm tiếp để nhận biết kháng nguyên đơn giá Các chủng ngưng kết với PSH thử nghiệm với kháng huyết H = a,c,k,y,z4 z29 Sau đảo pha, cần lặp lại quy trình thử kháng nguyên-H để xác định Kháng nguyên pha khác Phụ lục F (Tham khảo) Ví dụ quy trình đảo pha F.1 Phương pháp Sven Gard rút gọn Phương pháp trích dẫn từ Tài liệu tham khảo [8], [13] Chuẩn bị đĩa Petri đường kính 55 mm (6.7) với 10 ml thạch di động bồ mặt đông đặc (A.3) Thêm 0,1 ml kháng Salmonella H giọt dàn bề mặt, sử dụng thìa vơ trùng (thủy tinh) Cấy chủng điểm đĩa Ủ đĩa cấy 34 °C đến 38 °C (6.1) từ 18 h đến 21 h Chủng di động bề mặt không bị ức chế pha H sử dụng để xác định lần thứ hai Phương pháp rút gọn thường cho phép nhận biết pha thứ hai lần thử Phương pháp có ưu đĩa thạch chuẩn bị trước bảo quản để sử dụng cần nhằm cải thiện biểu kháng nguyên-H để xác định pha F.2 Phương pháp ống Craigie F.2.1 Yêu cầu chung Ống Craigie sử dụng để biểu lộ khả di động Phương pháp gồm có ống lọ rộng miệng, có nắp vặn, có chứa thạch bán đặc (thạch từ 0,2 % đến 0,4 % phần khối lượng) có ống hẹp, ngắn mở hai đầu, cho nhơ mặt thạch (xem Hình F.1) cẩn thận cấy đâm sâu chủng cần thử nghiệm vào ống Sau ủ, lấy chủng cấy bề mặt thạch di động bên ống trung tâm tạo quần thể tế bào di động (Tài liệu tham khảo [5]) F.2.2 Chuẩn bị ống Craigie cho đảo pha - Đặt ống môi trường Craigie (xem A.11) vào nồi hấp (hoặc thiết bị thích hợp khác) 30 để làm tan chảy thạch - Đặt ống Craigie với thạch tan chảy vào nồi cách thủy 47 °C đến 50 °C (6.8) cân nhiệt - Thêm 200 µl kháng huyết cần thiết vào ống Craigie - Trộn cách lắc nhẹ - Đặt ống Craigie °C (6.3) đặc lại F.2.3 Quy trình đảo pha sử dụng ống Craigie - Cấy Salmonella vào ống Craigie que cấy nhựa dùng lần que cấy thẳng (chủng cấy cấy vào ống bên trong) - Ủ ống Craigie nhiệt độ khoảng từ 34 °C đến 30 °C (6.1) - Kiểm tra phát triển vi khuẩn ống Craigie sau 24 h, 48 h 72 h - Khi xuất vi khuẩn bề mặt thạch (bên ống trung tâm), gạt phần vi khuẩn phát triển vào canh thang não-tim (xem A.9) - Sau canh khuẩn đêm thử kháng nguyên-H LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn CHÚ DẪN nắp đường Salmonella sau đảo pha miệng ống bề mặt cấy truyền điểm cấy ống Craigie mơi trường bán đặc Hình F.1 - Phương pháp ống Craigie F.3 Phương pháp cầu-giấy Quy trình nêu điều lấy từ Tài liệu tham khảo [4], quy trình sửa đổi từ quy trình ban đầu nêu Tài liệu tham khảo [23] Xem Hình F.2 Lấy dải thạch trypton đậu tương (rộng cm) để tạo thành rãnh qua tâm đĩa Các dài giấy lọc (3 mm x cm) bố trí rãnh Kháng huyết dựa theo pha nhận biết chấm vào cầu-giấy (được nhận biết vòng tròn màu trắng) Các chủng vi khuẩn cấy vào phần cuối bên trái dải (được nhận biết vòng tròn màu trắng) Sau ủ, pha biến thể, thể kháng ngun lơng khác, di chuyển phía cuối bên phải dải Sau ủ 16 h, nhìn thấy phát triển vi khuẩn xung quanh viền giấy lọc (thể điểm tam giác màu trắng) Các chủng cấy đĩa Hình F.2 (A) S Choleraesuis var Kunzendorf (6,7:c:-); (B) S Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); (C) S Stanley (4,5,12:d:1;2) Hình F.2 - Phương pháp cầu-giấy đảo pha Salmonella Thư mục tài liệu tham khảo [1] ALFREDSSON G.A., BARKER R.M., OLD D.C., DUGUID J.p Use of tartaric acid isomers and citric acid in the biotyping of Salmonella typhimurium J Hyg (Lond) 1972, 70 pp 651-666 [2] US Food and Drug officials 2001.BacteriologicalAnalyticalManual.BAMR53:ONPGtest Available (viewed 2013-06-04] at: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062262.htm [3] BRENNER F.W., VlLLAR R.G., ANGULO F.J., TAUXE R., SWAMINATHAN B Salmonella nomenclature J Clin Microbiol 2000, 38 pp 2465-2467 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn [4] CHIOU C.S., HUANG J.F., TSAI L.H., Hsu K.M., LIAO C.S., CHANG H.L A simple and low-cost paper- bridged method for Salmonella phase reversal Diagn Microbiol Infect Dis 2006, 54 pp 315317 [5] Craigie J STUDIES ON THE SEROLOGICAL REACTIONS OF FLAGELLA OF B TYPHOSUS J IMMUN 1931, 21 p 417 [6] DANAN C., FREMY S., MOURY F., BOHNERT M., BRISABOIS A 2009 Determining the serotype of isolated Salmonella strains in the veterinary sector using the rapid slide agglutination test Cahiers de la Référence, N°.2, CR2-09M01, December 2009 Available (viewed 2013-06-04] at: http://www.afssa.fr/euroreference/numero2/index.htm [7] EWING W.H Edwards and Ewing's identification of Enterobacteriaceae New York:Elsevier, Fourth edition, 1986 [8] GARD s Das Schwarmphanomen in der Salmonella-Gruppe und seine praktische Ausniitzung [The swarming phenomenon in the Salmonella group and its practical use], z Hyg Infektionskr 1938,120 pp 615-619 [9] GRIMONT P.A.D., & WEILL F.-X 2007 Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th edition1) WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella Paris:lnstitut Pasteur Available (viewed 2013-06-04] at:http://www pasteur.fr/ip/portal/action/ WebdriveActionEvent/oid/01s000036-089 [10] GUIBOURDENCHE M., ROGGENTIN R, MlKOLEIT M., FlELDS P.I., BOCKEMÜHL J., GRIMONT P.A.D et al Supplement 2003-2007 (No 47) to the White-Kauffmann-Le Minor scheme Res Microbiol 2010,161 pp 26-29 [11] HENDRIKSEN R.S., MlKOLEIT M., CARLSON V.P., KARLSMOSH s., VlEIRA A.R., [ENSEN A.B., et al WHO Global Salm-Surv Exlernal Quality Assurance System for Xác định typ huyết of Salmonella- Isolates from 2000 to 2007 J Clin Microbiol 2009, 47 pp 2729-2736 [12] KAUFFMANN F On the principles of classification and nomenclature of Enterobacteriaceae Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon 1959, pp 1-6 [13] KOEHN A; Technical modification of the swarming plate method according to Sven Gard in Salmonella diagnosis Zentralbl Bakteriol 1970, 215 pp 449-455 [14] LEIFSON E Fermentation of natri malonate as a means of differentiating Aerobacter and Escherichia coli ] Bacteriol 1933, 26 pp 329-330 [15] MALORNY B., BUNGE C., HELMUTH R Discrimination of D-tartrate-fermenting and nonfermenting Salmonella entérica subsp entérica isolates by genotypic and phenotypic methods J Clin Microbiol 2003, 41 pp 4292-4297 [16] POPOFF M Y Guidelines for the preparation of Salmonella antisera WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella Paris:lnstitut Pasteur, 2001 [17] POPOFF M.Y., & LE MINOR L.E Genus XXXIII Salmonella Lignieres 1900, 389 InBRENNER D J., KRIEG N.R., STALEY J.T editors Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edition, Vol The Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria New York, NY:Springer, 2005, pp 764-799 [18] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., BRENNER F.W Supplement 1998 (No 42] to the KauffmannWhite scheme Res Microbiol 2000, 154 pp 63-65 [19] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., GHEESLING L.L Supplement 2001 (No 45] to the KauffmannWhite scheme Res Microbiol 2003, 151 pp 173-174 [20] American Society for Microbiology Publications Board meeting minutes Salmonella nomenclature ASM News 1999, 65 p 769 [21] SHIPP C.R., & ROWE B A mechanized microtechnique for Salmonella serotyping J Clin Pathol 1980, 33 pp 595-597 [22] TINDALL B.J., GRIMONT P.A.D., GARRITY G.M., EUZEBY J.P Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella Int.J.Syst.Evol Microbiol 2005, 55 pp 521-524 [23] Wang T.K., TSENG T.C., LEE J.H., Wang W.T., TSAI J.L., Ho S.I., Pan T.M Analysis of Salmonella serovars in Taiwan by the phase induction method] [Article in Chinese] Zhanghua Min 1) Supplements to the White-Kauffmann-Le Minor scheme are published in Res Microbiol., a publication of the Institut Pasteur (formerly Ann Inst Pasteur/Microbiol), e.g Reference [10] LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Guo Wei Shang Wu Ji Mian YiXue Za Zhi [Chin J Microbiol Immunol.] 1994, 27, pp 13-24 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162