HƯỚNG DẪN THƯỜNG QUY KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA TRONG BỆNH PHẨM

HƯỚNG DẪN THƯỜNG QUY KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI KHUẨN SALMONELLA TRONG BỆNH PHẨM PHẠM VI ÁP DỤNG Quy trình hướng dẫn phân lập vi khuẩn Salmonella bệnh phẩm TÀI LIỆU ÁP DỤNG - Tài liệu tập huấn “Kỹ thuật xét nghiệm bệnh truyền nhiễm (Phần I: Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn)”, Bộ Y tế, 14/4/2010 - Tài liệu tập huấn “Kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán tả bệnh tiêu chảy khác”, Viện Pasteur Nha Trang, tháng – 2010 LẤY MẪU BỆNH PHẨM XÉT NGHIỆM 3.1 Nguyên tắc thu thập mẫu cần đảm bảo - Đúng chủng loại - Đúng thời gian - Đúng cách - Đủ số lượng - Đảm bảo chất lượng 3.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm * Bệnh phẩm phân bệnh nhân - Lấy mẫu thời kỳ ỉa chảy cấp bệnh nhân chưa điều trị kháng sinh - Lấy phân trực tiếp: lấy phân bệnh nhân bơ khơng có chất khử trùng pipet xi – ranh cho vào lọ đậy kín 16 - Lấy phân que tăm bông: dùng que tăm vô khuẩn thấm vào mơi trường bảo quản, ngốy vào hậu mơn bệnh nhân qua thắt hậu môn khoảng 2cm ngốy nhiều vịng cho que tăm bơng vào mơi trường bảo quản Lưu ý que tăm bơng phải có màu phân - Lấy phân ống thông trực tràng: dùng ống thông bôi trơn chất lỏng vô trùng luồng qua thắt hậu môn nhẹ nhàng luồng sâu vào khoảng 10cm đến phân chảy cho vào type môi trường bảo quản * Bệnh phẩm chất nôn - Dùng pipet xi - ranh hút chất nôn cho vào lọ - Mẫu cần thu thập sớm sau có biểu bệnh trước điều trị kháng sinh - Đối tượng thu thập mẫu phân bệnh nhân người tiếp xúc với bệnh nhân * Bệnh phẩm phân người tiếp xúc với bệnh nhân - Lấy mẫu phân bệnh nhân * Máu tủy xương - Phải cấy máu sớm mắc bệnh, kết dương tính cao Vi khuẩn máu nhanh chóng sau điều trị kháng sinh Điều trị kháng sinh lần đầu cho kết cấy máu dương tính cấy tủy xương - Môi trường cấy máu tốt canh thang BHI (Brain Heart Infusion broth) Tỷ lệ thích hợp máu canh thang 1/10 * Thu thập mẫu bệnh phẩm thực địa 17 Trong vụ dịch ngộ độc thực phẩm cần thu thập mẫu thực phẩm liên quan đến bệnh nhân để xác định tác nhân gây bệnh nguồn truyền nhiễm Thu thập khoảng 100g loại thực phẩm khác cho vào túi ni lông riêng loại, vận chuyển tới phòng xét nghiệm 3.3 Bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm cần giữ vào môi trường bảo quản vận chuyển xa phịng xét nghiệm bệnh phẩm khơng làm xét nghiệm sau (tính từ thu thập mẫu) Môi trường vận chuyển thu thập mẫu chuyển sớm tới phòng xét nghiệm giữ tủ lạnh oC chưa xét nghiệm CẢNH BÁO VỀ AN TOÀN SỨC KHỎE 4.1.Thao tác với vi khuẩn gây bệnh cần thực tủ an toàn sinh học 4.2 Dùng găng tay, trang tiếp xúc với dịch vi khuẩn 4.3 Các thiết bị phịng thí nghiệm, bàn ghế cần tẩy uế lần tuần 4.4 Những cố tai nạn cần thơng báo với quản lý phịng thí nghiệm 4.5 Xem danh mục hóa chất , mơi trường ni cấy có chứa chất độc hại KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG 5.1 Kiểm tra ghi nhiệt độ tủ ni cấy lần/ngày, cách 4h, nhiệt kế phải kiểm tra tính xác lần năm 5.2 Kiểm tra tính vơ khuẩn môi trường nuôi cấy cách ủ môi trường 35oC±0,5oC, loại bỏ môi trường nhiễm khuẩn 5.3 Kiểm tra pH môi trường trước sau hấp áp suất điều chỉnh NaOH HCl cần thiết 18 NGUYÊN TẮC Tiêu chuẩn để xác định vi khuẩn Salmonella dựa tính chất không lên men đường saccharose môi trường SS MC, lên men glucose, không lên men lactose, (-/+), H 2S (-/+) KIA, Urê (-), Indol (-), mannit (+), di động (+), Citrate Simon’s (-/+), PAD (-), VP (-), MR (+), ngưng kết với kháng huyết đặc hiệu DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 7.1 Dụng cụ - Bình cầu đáy 500ml - Ống đong 500ml - Đĩa Petri 10 - Cốc có mỏ 50ml, 250ml, 500ml - Ống nghiệm 18 - Bình cồn - Pippet 1ml - Đèn cồn - Ống nghiệm 12 - Que cấy tròn, que cấy thẳng - Giấy đo pH - Giá đựng ống nghiệm 7.2 Thiết bị - Cân điện tử - Nồi cách thủy - Tủ ấm 37oC - Lị vi sóng - Dụng cụ dập kháng sinh đồ - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp ướt - Kính hiển vi - Tủ sấy - Bộ phân phối mơi trường MƠI TRƯỜNG, THUỐC THỬ 19 Cary Blair Thuốc thử Kovac’s SS (DCLS, MC) KHTĐG T, A, B, C, Vi (Biorad) Selenite broth Các loại đĩa kháng sinh KIA MH (Mueller-Hinton) broth Ure-Indol MH (Mueller-Hinton) agar Mannit di động VP-MR PAD Simmon’s Citrate TIẾN HÀNH Ngày 1: Cấy trực tiếp từ Cary Blair lên môi trường SS MC ủ ấm 37oC 18-24h, đồng thời cấy tăng sinh lên môi trường Selenite/18-24h 37oC Ngày 2: Ria cấy từ môi trường canh thang Selenite lên môi trường phân lập MC SS ủ ấm 37oC/18-24h, đồng thời quan sát khuẩn lạc nghi ngờ mơi trường SS MC, trích khuẩn lạc trịn trong, bóng, dẹt có khơng có chấm đen cấy vào thạch KIA ủ ấm 37oC/18-24h Ngày thứ 3: Quan sát ống thạch KIA: Glucose (+), Lactose (-), H2S (-/+), (-/+) nghi ngờ loại Salmonella Cấy chuyển từ KIA vào dãy SVHH gồm: Urê, Indol, Mannitol, Simmon’s Citrate, PAD Ủ ấm 37oC/18-24h Chọn khuẩn lạc từ môi trường SS, MC cấy tăng sinh, cấy lên môi trường KIA ủ tiếp 37oC/18-24h Ngày thứ 4: Đọc SVHH: Urê (-), Indol (-), PAD (-), VP (-), MR(+) 20 Chú ý: Đọc dãy SVHH để phân biệt sàng lọc vi khuẩn Việc xác định vi khuẩn chủ yếu dựa vào ngưng kết kháng huyết * Ngưng kết kháng huyết - Hơ lam kính lửa đèn cồn cho vết dầu mở - Nhỏ giọt nước muối sinh lý giọt KHT (T, A, B, C, Vi) lên lam kính dùng que cấy mài nhuyễn vi khuẩn vào giọt nước muối sinh lý - Đọc kết thấy tượng đục tiếp tục ngưng kết với KHT, thấy tượng hạt ngưng kết mịn loại bỏ - Dùng vi khuẩn mài nhuyễn lên giọt kháng huyết - Đọc kết quả: Âm tính: giọt nước đục Dương tính: hạt ngưng kết mịn, nước * KHÁNG SINH ĐỒ Hiện có nhiều phương pháp để thử tính nhạy cảm kháng sinh như: pha loãng kháng sinh canh thang, pha loãng thạch, thông dụng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khếch tán thạch Kirby – Bauer - Tiến hành: + Lấy ml nước muối sinh lý vô trùng, dùng que cấy lấy vi khuẩn từ ống thạch KIA thạch BHI (Brain Heart Infussion) cấy qua đêm, cấy vào nước muối, lắc + So sánh với ống đo độ đục chuẩn Mac-Farland 0,5 tương đương 10 vi khuẩn Pha loãng dung dịch 100 lần để có dung dịch tương đương 10 tbvk/ml (có thể dùng máy đo độ đục chuẩn hơn) 21 + Dùng que tăm nhúng vi khuẩn, ria que tăm lên mặt thạch hong khô Mueller – Hinton + Đặt disk kháng sinh lên đĩa thạch MH (Mueller – Hinton), ủ ấm 37oC/18-24h + Đọc kết quả: Đo vịng vơ khuẩn thước đo (mm) ghi độ nhạy cảm, giới hạn, đề kháng kháng sinh Sau đem so sánh bảng chuẩn kháng sinh hãng sản xuất + Nếu có điều kiện dùng máy để đo vịng vơ khuẩn chuẩn Chú ý: Mỗi hãng sản xuất đĩa kháng sinh có bảng mẫu chuẩn, đọc phải dựa vào để đánh giá nhạy cảm, giới hạn kháng * GIỮ CHỦNG Tất chủng phân lập cấy vào canh thang BHI có 20% Glycerin giữ chủng -73oC năm đồng thời chuyển lên tuyến 10 KẾT QUẢ Định danh nhóm Salmonella kết nhạy cảm kháng sinh đồ mẫu phân bệnh nhân Phiếu trả lời kết xét nghiệm lưu vòng năm 11 QUẢN LÝ CHẤT THẢI Tất môi trường nuôi cấy, sản phẩm chứa đựng vi khuẩn phải khử khuẩn nồi hấp áp suất trước loại bỏ 12 PHÂN LẬP SALMONELLA 22 Carry Blair SS, MC Selenite broth, Ủ 37oC/18-24h (Cấy chuyển 2lần) KIA MC, SS SVHH NK: KHT KSĐ Giữ chủng Sơ đồ phân lập Salmonella 23 HƯỚNG DẪN THƯỜNG QUY KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI KHUẨN SHIGELLA TRONG BỆNH PHẨM PHẠM VI ÁP DỤNG Quy trình hướng dẫn phân lập vi khuẩn Shigella bệnh phẩm TÀI LIỆU ÁP DỤNG - Tài liệu tập huấn “Kỹ thuật xét nghiệm bệnh truyền nhiễm (Phần I: Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn)”, Bộ Y tế, 14/4/2010 - Tài liệu tập huấn “Kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán tả bệnh tiêu chảy khác”, Viện Pasteur Nha Trang, tháng – 2010 LẤY MẪU BỆNH PHẨM XÉT NGHIỆM 3.1 Nguyên tắc thu thập mẫu cần đảm bảo - Đúng chủng loại - Đúng thời gian - Đúng cách - Đủ số lượng - Đảm bảo chất lượng 3.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm * Bệnh phẩm phân bệnh nhân: - Lấy mẫu thời kỳ ỉa chảy cấp bệnh nhân chưa điều trị kháng sinh - Lấy phân trực tiếp: lấy phân bệnh nhân bơ khơng có chất khử trùng pipet xi – ranh cho vào lọ đậy kín - Lấy phân que tăm bông: dùng que tăm vô khuẩn thấm vào mơi trường bảo quản, ngốy vào hậu mơn bệnh nhân qua thắt hậu môn khoảng 2cm ngốy nhiều vịng cho que tăm bơng vào mơi trường bảo quản Lưu ý que tăm bơng phải có màu phân 24 - Lấy phân ống thông trực tràng: dùng ống thông bôi trơn chất lỏng vô trùng luồng qua thắt hậu môn nhẹ nhàng luồng sâu vào khoảng 10cm đến phân chảy cho vào type môi trường bảo quản * Bệnh phẩm chất nôn: - Dùng pipet hút chất nôn cho vào lọ (không có khử trùng) - Mẫu cần thu thập sớm sau có biểu bệnh trước điều trị kháng sinh - Đối tượng thu thập mẫu phân bệnh nhân người tiếp xúc với bệnh nhân * Bệnh phẩm phân người tiếp xúc với bệnh nhân: - Lấy mẫu phân bệnh nhân * Thu thập mẫu bệnh phẩm thực địa Trong vụ dịch ngộ độc thực phẩm cần thu thập mẫu thực phẩm liên quan đến bệnh nhân để xác định tác nhân gây bệnh nguồn truyền nhiễm Thu thập khoảng 100g loại thực phẩm khác cho vào túi ni lông riêng loại, vận chuyển tới phòng xét nghiệm 3.3 Bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm Yêu cầu vận chuyển bảo quản khơng rị rỉ bảo đảm vi khuẩn sống xét nghiệm * Đối với bệnh phẩm phân bệnh nhân: bảo quản môi trường Cary blair axit Borique bảo quản lạnh oC tốt trình chuyển phòng xét nghiệm vòng 24h 25 * Đối với bệnh phẩm chất nôn, cho vào lọ bảo quản lạnh 4oC tiến hành xét nghiệm 2h sau lấy CẢNH BÁO VỀ AN TOÀN SỨC KHỎE 4.1.Thao tác với vi khuẩn gây bệnh cần thực tủ an toàn sinh học 4.2 Dùng găng tay, trang tiếp xúc với dịch vi khuẩn 4.3 Các thiết bị phịng thí nghiệm, bàn ghế cần tẩy uế lần tuần 4.4 Những cố tai nạn cần thông báo với quản lý phịng thí nghiệm 4.5 Xem danh mục hóa chất , mơi trường ni cấy có chứa chất độc hại KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG 5.1 Kiểm tra ghi nhiệt độ tủ nuôi cấy lần/ngày, cách 4h, nhiệt kế phải kiểm tra tính xác lần năm 5.2 Kiểm tra tính vơ khuẩn mơi trường ni cấy cách ủ môi trường 35oC±0,5oC, loại bỏ môi trường nhiễm khuẩn 5.3 Kiểm tra pH môi trường trước sau hấp áp suất điều chỉnh NaOH HCl cần thiết NGUYÊN TẮC Tiêu chuẩn để xác định vi khuẩn Shigella dựa tính chất khơng lên men đường saccharose môi trường nuôi cấy chọn lọc SS MC, lên men glucose, không lên men lactose, (-), H2S (-) KIA, Urê (-), Indol (-/+), Mannit (-/+), di động(-), Citrate Simon’s (-), VP(-), MR (+), ngưng kết với kháng huyết đặc hiệu DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 7.1 Dụng cụ - Bình cầu đáy 500ml - Ống đong 500ml - Đĩa Petri 10 - Cốc có mỏ 50ml, 250ml, 500ml 26 - Ống nghiệm 18 - Bình cồn - Pippet 1ml - Đèn cồn - Ống nghiệm 12 - Que cấy tròn, que cấy thẳng - Giấy đo pH - Giá đựng ống nghiệm 7.2 Thiết bị - Cân điện tử - Nồi cách thủy - Tủ ấm 37oC - Lị vi sóng - Dụng cụ dập kháng sinh đồ - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp ướt - Kính hiển vi - Tủ sấy - Bộ phân phối mơi trường MƠI TRƯỜNG, THUỐC THỬ Cary Blair Thuốc thử Kovac’s SS (DC, MC) KHT nhóm A (Sh dysenteria) Selenite broth KHT nhóm B (Sh flexneri) MH (Mueller Hinton) broth KHT nhóm C (Sh boydii) MH (Mueller Hinton) agar KHT nhóm D (Sh sonnei) KIA Các loại đĩa kháng sinh Mannit di động Simmon’s Citrate VP-MR Ure-Indol TIẾN HÀNH 27 Ngày 1: Cấy trực tiếp từ Cary Blair lên môi trường SS MC ủ ấm 37oC/1824h, đồng thời cấy tăng sinh lên môi trường Selenite/18-24h 37oC Ngày 2: Ria cấy từ môi trường canh thang Selenite lên môi trường phân lập MC SS ủ ấm 37oC/18-24h, đồng thời quan sát khuẩn lạc nghi ngờ môi trường SS MC, trích khuẩn lạc trịn trong, bóng cấy vào thạch KIA ủ ấm 37oC/18-24h Ngày thứ 3: Quan sát ống thạch KIA: Glucose (+), Lactose (-), H2S (-), (-) nghi ngờ loại Shigella Cấy chuyển từ KIA vào dãy SVHH gồm: Urê, Indol, Mannitol, Simmon’s Citrate, Ủ ấm 37oC/ 18-24h Chọn khuẩn lạc từ môi trường SS, MC cấy tăng sinh, cấy lên môi trường KIA ủ tiếp 37oC/ 18-24h Ngày thứ 4: Đọc SVHH: Urê (-), Indol (-/+), VP(-), MR(+), Simmon’s Citrate(-), di động (-), LDC (-) Chú ý: Đọc dãy SVHH để phân biệt sàng lọc vi khuẩn Việc xác định vi khuẩn chủ yếu dựa vào ngưng kết kháng huyết * Ngưng kết kháng huyết - Hơ lam kính lửa đèn cồn cho vết dầu mở - Nhỏ giọt nước muối sinh lý giọt KHT lên lam kính dùng que cấy mài nhuyễn vi khuẩn vào giọt nước muối sinh lý - Đọc kết thấy tượng đục tiếp tục ngưng kết với KHT, thấy tượng hạt ngưng kết mịn loại bỏ - Dùng vi khuẩn mài nhuyễn lên giọt kháng huyết - Đọc kết quả: Âm tính: giọt nước đục 28 Dương tính: hạt ngưng kết mịn, nước * KHÁNG SINH ĐỒ Hiện có nhiều phương pháp để thử tính nhạy cảm kháng sinh như: pha lỗng kháng sinh canh thang, pha lỗng thạch, thơng dụng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khếch tán thạch Kirby – Bauer - Tiến hành: + Lấy ml nước muối sinh lý vô trùng, dùng que cấy lấy vi khuẩn từ ống thạch KIA thạch BHI (Brain Heart Infussion) cấy qua đêm, cấy vào nước muối, lắc + So sánh với ống đo độ đục chuẩn Mac-Farland 0,5 tương đương 10 vi khuẩn Pha loãng dung dịch 100 lần để có dung dịch tương đương 10 tbvk/ml (có thể dùng máy đo độ đục chuẩn hơn) + Dùng que tăm nhúng vi khuẩn, ria que tăm lên mặt thạch hong khô Mueller – Hinton + Đặt disk kháng sinh lên đĩa thạch MH (Mueller – Hinton), ủ ấm 37oC/18-24h + Đọc kết quả: Đo vịng vơ khuẩn thước đo (mm) ghi độ nhạy cảm, giới hạn, đề kháng kháng sinh Sau đem so sánh bảng chuẩn kháng sinh hãng sản xuất + Nếu có điều kiện dùng máy để đo vịng vơ khuẩn chuẩn Chú ý: Mỗi hãng sản xuất đĩa kháng sinh có bảng mẫu chuẩn, đọc phải dựa vào để đánh giá nhạy cảm, giới hạn kháng * GIỮ CHỦNG 29 Tất chủng phân lập cấy vào canh thang BHI có 20% Glycerin giữ chủng -73oC năm đồng thời chuyển lên tuyến 10 KẾT QUẢ Định danh nhóm Shigella kết nhạy cảm kháng sinh đồ mẫu phân bệnh nhân Phiếu trả lời kết xét nghiệm lưu vòng năm 11 QUẢN LÝ CHẤT THẢI Tất môi trường nuôi cấy, sản phẩm chứa đựng vi khuẩn phải khử khuẩn nồi hấp áp suất trước loại bỏ 12 PHÂN LẬP SHIGELLA Cary Blair SS, MC Selenite broth, Ủ 37oC/18-24h (Cấy chuyển 2lần) KIA MC, SS SVHH NK: KHT KSĐ Giữ chủng Sơ đồ phân lập Shigella 30