HƯỚNG DẪN CHUNG CHO KIỂM TRA CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG MỸ PHẨM

TCVN T I ÊU C H U ẨN Q U Ố C G I A TC VN DỰ THẢO TH ẢO HƯỚNG DẪN CHUNG CHO KIỂM TRA CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG MỸ PHẨM D Ự Cosmetics - Microbiology – General instructions for microbiological examination THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – TCVN ….:06… Lời nói đầu TCVN 06 xây dựng sở ISO 21148:2017 – Cosmetics Microbiology – General instructions for microbiological examination TCVN …06 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề VN nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công D Ự TH ẢO TC nghệ công bố TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN Hướng dẫn chung kiểm tra tiêu vi sinh vật mỹ phẩm VN Cosmetics – Microbiology – General instructions for microbiological examination Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung kiểm tra tiêu vi sinh vật mỹ phẩm, nhằm đảm nồng độ cồn, giá trị pH cực đoan) TC bảo chất lượng độ an toàn mỹ phẩm, với việc đánh giá rủi ro (ví dụ, hoạt độ nước thấp, TH ẢO Do đa dạng sản phẩm mỹ phẩm tiềm sử dụng lớn nên phạm vi áp dụng này, phương pháp khơng phù hợp cho số sản phẩm đặc biệt (ví dụ sản phẩm không thấm nước) Tài liệu viện dẫn Ự ISO 21148:2017 – Cosmetics – Microbiology – General instructions for microbiological examination Thuật ngữ định nghĩa D Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Sản phẩm Một phần sản phẩm mỹ phẩm xác định mà phịng thí nghiệm nhận để sử dụng cho mục đích thử nghiệm 3.2 Mẫu Một phần sản phẩm (ít g mL) dung để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu 3.3 Hỗn dịch ban đầu Hỗn dịch hay dung dịch mẫu thử thể tích định môi trường tăng sinh lỏng phù hợp TCVN 06 3.4 Mẫu pha loãng Mẫu pha loãng từ hỗn dịch mẫu ban đầu 4.1 Phòng thử nghiệm Khu vực thử nghiệm Các khu vực yêu cầu cho hoạt động cụ thể phòng thử nghiệm vi sinh sau: Nhận, bảo quản, chuẩn bị xử lý mẫu; - Chuẩn bị tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy, dụng cụ dụng cụ thủy tinh; - Thử nghiệm: cân, pha lỗng, cấy chủng, ni cấy, ủ, bảo quản chủng vi sinh, etc.; - Khử nhiễm làm dụng cụ, dụng cụ thủy tinh xử lý rác thải thử nghiệm Các khu vực khác Các khu vực bao gồm: TC 4.2 VN - Lối vào, hành lang, cầu thang, thang máy; - Khu vực hành (VD: khu thư ký, văn phòng, phòng tài liệu…); - Phòng thay đồ nhà vệ sinh; - Phịng lưu trữ; - Kho Vị trí sở thử nghiệm Ự 4.3 TH ẢO - D Môi trường cho thử nghiệm vi sinh không ảnh hưởng tới độ tin cậy thử nghiệm Cần thận trọng xác định vị trí phịng thử nghiệm để tránh nguy lây nhiễm chéo Cần thận trọng để tránh điều kiện khắc nhiệt nhiệt độ, độ ẩm cao, bụi, ồn, rung, tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng Diện tích bề mặt phải đủ rộng để khu vực làm việc ngăn nắp Trong trình thử nghiệm, cần ý hạn chế vào khu vực thử nghiệm, cho phép cán tiến hành thử nghiệm vào Các phòng riêng biệt / khu vực riêng biệt / dụng cụ chứa chuyên dụng phải cung cấp cho mục sau: TCVN 06 - Nhận, lưu trữ chuẩn bị mẫu thử; - Thao tác với chủng vi sinh vật; - Chuẩn bị môi trường, dụng cụ dụng cụ thủy tinh; - Khử nhiễm khu vực rửa dụng cụ; - Tiệt khuẩn; - Tủ ủ, tủ lạnh tủ đông Trang thiêt bị phòng thử nghiệm Phòng thử nghiệm phải lắp đặt theo hướng nhằm mục đích giảm thiểu tối đa nguy 4.4.1 nhiễm bẩn bụi vi sinh vật khác: - Tường, trần sàn nhà phải nhẵn, không rỗ, dễ làm chịu chất tẩy rửa TC chất khử trùng sử dụng phịng thí nghiệm; - VN 4.4 Khơng để đường ống dẫn chất lỏng ngang qua sở thử nghiệm trừ chúng bọc kín; Hệ thống bảo vệ chống xạ mặt trời lắp đặt bên cửa sổ; - Cửa sổ cửa vào đóng thử nghiệm để tránh gió lùa Hơn nữa, chúng phải TH ẢO - thiết kế cho tránh tạo bẫy bụi dễ lau rửa 4.4.2 Nhiệt độ chất lượng khơng khí (nồng độ vi sinh, độ ẩm, tốc độ phát tán bụi, ) cần Ự phù hợp với thử nghiệm 4.4.3 D Do đó, sử dụng hệ thống cấp khí tủ an tồn sinh học cho mục đích Bàn ghế nội thất phịng thí nghiệm phải làm vật liệu nhẵn, không thấm nước, không xốp, dễ làm khử trùng Các tủ, thiết bị cần đủ thấp để dễ dàng vệ sinh Có thể sử dụng đồ nội thất có chân khơng cố định để thuận tiện cho việc vệ sinh sàn nhà Các tài liệu sách không thường xuyên sử dụng giữ bên khu vực thử nghiệm 4.5 Bảo trì Mặt sàn, tường, trần, mặt bàn trang thiết bị phịng thử nghiệm phải bảo trì trạng thái tốt nhằm tránh nứt rạn dẫn đến bụi bẩn tích tụ tạo nguồn lây nhiễm TCVN 06 Thường xuyên lau rửa khử trùng để giữ phịng thí nghiệm ln trạng thái thích hợp để tiến hành thử nghiệm Hệ thống thơng gió lọc cần bảo dưỡng thường xuyên thay lọc cần thiết Thiết bị 5.1 Quy định chung Tất thiết bị cần giữ điều kiện làm việc tốt Các hoạt động bảo trì phải giám sát Dụng cụ thiết bị đo lường phải kiểm tra định kỳ theo thời gian biểu thích hợp, kết ghi nhận lưu trữ Tủ cấy sinh học VN 5.2 Tủ cấy vi sinh gồm hai loại: TC a) Tủ cấp khí sạch, nhằm mục đích bảo vệ sản phẩm tránh bị tạp nhiễm hạn chế tạp nhiễm người vận hành; vận hành mơi trường TH ẢO b) Tủ an tồn sinh học nhằm mục đích bảo vệ sản phẩm tránh bị tạp nhiễm, đồng thời bảo vệ người Hai loại tủ sử dụng Tủ an tồn sinh học nên sử dụng tất công việc có nguy rủi ro với người vận hành Tủ cấy vi sinh có khu vực làm việc bảo vệ luồng khí đẳng hướng Cân D 5.3 Ự Trong thử nghiệmvi sinh, tủ an toàn sinh học sử dụng để giữ vi sinh vật màng lọc Phịng thí nghiệm vi sinh phải trang bị cân có dải đo độ xác phù hợp với nhiều sản phẩm khác Nhìn chung, độ xác cân dùng để cân mẫu, mơi trường thuốc thử ± 0,01 g 5.4 Thiết bị đồng Thiết bị (ví dụ: thiết bị trộn, stomacher, vv…) sử dụng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu cho thử nghiệm mẫu không dạng lỏng 5.5 Máy đo pH Thiết bị đo pH phải có khả đo xác tới ± 0,1 đơn vị pH độ phân giải 0,01 đơn vị pH TCVN 06 5.6 Nồi hấp Nồi hấp cần phải điều kiện làm việc tốt kiểm tra thường xuyên quan có lực theo dẫn nhà sản xuất kết kiểm tra phải ghi lại lưu giữ Không sử dụng nồi hấp để tiệt khuẩn dụng cụ khử nhiễm vật liệu sử dụng đồng thời Nên dùng hai nồi hấp riêng cho hai q trình 5.7 Tủ ấm Tủ ấm cần có hệ thống điều chỉnh để giữ nhiệt độ ổn định đồng lòng tủ Nếu nhiệt độ môi trường gần cao nhiệt độ tủ ấm, cần phải bố trí hệ thống Nên bảo vệ tủ ấm tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp VN làm mát Nếu có thể, không nên chất đầy tủ ấm lần mơi trường ni cấy nhiều thời gian TC để cân nhiệt độ, dù loại tủ ấm sử dụng (đối lưu khí cưỡng cách khác) 5.8 Bể ổn nhiệt Bể ổn nhiệt có hai loại: - Bể ổn nhiệt điều chỉnh tự động, thích hợp ủ mơi trường ni cấy, cho phép thử định danh, Ự vv…; - TH ẢO Nhiệt độ phải kiểm tra ghi lại ngày làm việc Bể cách thủy để giữ môi trường thạch vô khuẩn trạng thái lỏng để dùng cho thử nghiệm 5.9 D Nhiệt độ độ xác nhiệt độ quy định phương pháp áp dụng Tủ lạnh phòng bảo quản lạnh Nhiệt độ phải từ oC ± oC, trừ có quy định khác 5.10 Tủ đơng Nhiệt độ phải -18 oC, trừ có quy định khác 5.11 Tủ sấy tiệt khuẩn Tủ sấy tiệt khuẩn cho phép diệt vi sinh vật nhiệt khô Nhiệt độ phải phân bố tủ TCVN 06 Tủ sấy phải trang bị: - Một ổn nhiệt; - Một nhiệt kế dụng cụ đo nhiệt thích hợp; - Một đồng hồ phận đặt chương trình/thời gian 5.12 Thiết bị đếm khuẩn lạc Thiết bị đếm khuẩn lạc sử dụng 5.13 Các thiết bị khác tủ tiệt khuẩn Các dụng cụ thiết bị khác sử dụng ngày bao gồm: VN 5.14 CẢNH BÁO – Các dụng cụ thủy tinh có độ xác cao khơng tiệt khuẩn Dụng cụ lọc; - Bình chứa thủy tinh nhựa (ống nghiệm, bình, chai); - Đĩa petri thủy tinh nhựa (đường kính phổ biến 85 mm 100 mm); - Pipet thủy tinh nhựa (10 mL, mL, mL), pipet tự động; - Thiết bị lấy mẫu; - Que cấy thẳng que cấy vòng (bằng niken/crom, platin/iridium nhựa sử dụng lần, vv ); - Kính hiển vi quang học; - Đèn gas lò đốt que cấy; - Dụng cụ phân phối môi trường nuôi cấy thuốc thử; - Máy khuấy học D Ự TH ẢO TC - Nếu phương pháp màng lọc sử dụng, thiết bị bao gồm: - Một hệ thống lọc phễu lọc làm chất liệu thích hợp, với phận chứa 50 mL thích hợp cho việc sử dụng màng lọc có đường kính từ 47 mm đến 50 mm kích thước lỗ lọc khơng 0,45 µm; - Vật liệu màng lọc lựa chọn vi khuẩn không bị ảnh hưởng thành phần dư mẫu cần kiểm tra; TCVN 06 - Một bơm chân không hỗ trợ cho tốc độ lọc phù hợp (thiết bị phải thiết lập để lọc 100 mL chất lỏng phút) Chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật cần cho đánh giá phù hợp phương pháp quy định phương pháp áp dụng 7.1 Nhân Năng lực Tất nhân viên làm việc phịng thí nghiệm vi sinh phải đào tạo đầy đủ để hoàn thành VN cơng việc giao phó Nhân viên thực thử nghiệm phải có kiến thức tốt kinh nghiệm thực tế kỹ thuật vi kết chấp nhận 7.2 Vệ sinh TC sinh vật vi sinh vật tìm kiếm Nhân viên đánh giá độ xác độ để thu TH ẢO Về lĩnh vực vệ sinh cá nhân, phải tuân thủ lưu ý sau để tránh làm nhiễm bẩn mẫu thử môi trường nuôi cấy, đồng thời để tránh nguy lây nhiễm sang người: - Phải mặc áo choàng phịng thí nghiệm sáng màu, trạng thái tốt, sản xuất từ loại sợi hạn chế nguy cháy, không mang quần áo khỏi khu vực làm việc; Giữ móng tay, tốt cắt ngắn; - Rửa tay trước sau thử nghiệm vi sinh sau vệ sinh ăn; làm khô tay Ự - D khăn giấy khăn tay lần; - Tránh nói, ho, thao tác cầy truyền; - Không hút thuốc, uống nước ăn khu vực thử nghiệm; - Không để thực phẩm cá nhân sau thử nghiệm vi sinh sau vệ sinh ăn; làm khô tay khăn giấy khăn tay lần; - Tránh nói, ho thao tác cầy truyền, vv ; - Không hút thuốc, uống nước tủ lạnh phòng thử nghiệm; - Đặc biệt lưu ý người bị nhiễm trùng da bị ốm lây nhiễm vi sinh vật sang mẫu thử làm sai lệch kết TCVN 06 Chuẩn bị dụng cụ dụng cụ thủy tinh 8.1 Chuẩn bị Dụng cụ dụng cụ thủy tinh dùng thử nghiệm vi sinh phải đảm bảo / vô khuẩn sử dụng Đậy nút ống nghiệm nắp chai vật liệu thích hợp trước tiệt khuẩn Nút pipet vật liệu thích hợp khác Nếu cần thiết, dụng cụ dụng cụ thủy tinh tiệt khuẩn phải đặt thùng chứa đặc biệt gói vật liệu thích hợp (ví dụ giấy đặc biệt, nhôm, vv) 8.2.1 Tiệt khuẩn VN 8.2 Tiệt khuẩn nhiệt khô nhiệt độ thời gian khác thẩm định TC Tiệt khuẩn tủ sấy 170 °C đến 180 °C sử dụng chương trình kết hợp Có thể dùng loại thị để đảm bảo việc tiệt khuẩn đạt Tiệt khuẩn nhiệt ẩm TH ẢO 8.2.2 Tiệt khuẩn nhiệt độ tối thiểu 121 °C 15 phút, dùng loại thị phù hợp để đảm bảo trình tiệt khuẩn đạt Các chất thị sử dụng để đảm bảo việc tiệt khuẩn đạt Dụng cụ sử dụng lần Ự 8.3 Dụng cụ sử dụng lần dùng tương tự dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần (đĩa petri, D pipet, ống, vv) chúng có chất lượng tương đương Trong trường hợp này, liên hệ với nhà sản xuất để xác định dụng cụ dụng cụ thủy tinh cần phù hợp để sử dụng vi sinh (đặc biệt độ vơ khuẩn) vật liệu khơng chứa chất ức chế phát triển vi sinh vật Dụng cụ sử dụng lần khử nhiễm trước thải bỏ Ngồi phương pháp mơ tả 8.6, phụ thuộc vào quy định quốc gia, sử dụng lị đốt Nếu có lị đốt sở, việc khử nhiễm thải bỏ đạt đồng thời 8.4 Bảo quản dụng cụ dụng cụ thủy tinh Dụng cụ dụng cụ thủy tinh phải bảo vệ chống lại tạp nhiễm từ bên ngồi q trình bảo quản bảo quản điều kiện tốt để trì độ dụng cụ TCVN 06 Nước 9.2 CẢNH BÁO - Nước xử lý qua trao đổi ion (khử ion) có hàm lượng vi sinh cao Do khơng nên sử dụng nước mà không chắn hàm lượng vi sinh vật nước mức thấp Tham khảo ý kiến nhà sản xuất để có cách tốt giảm số lượng sinh vật Nước khử ion bị ô nhiễm nặng lọc tiệt khuẩn chứa chất ức chế phát triển số vi sinh vật Sử dụng nước cất nước có chất lượng tương đương, ví dụ nước tinh khiết nước khử ion Nếu nước cất sản xuất từ nước khử clo, cần trung hòa clo trước chưng cất Nước phải chứa thùng chứa vật liệu trơ (ví dụ bình thủy tinh trung tính, VN polyethylene, vv…) Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 9.3.1 Quy định chung Có hai cách để chuẩn bị mơi trường nuôi cấy: Từ thành phần bản, khô khơng; - Từ mơi trường khơ hồn chỉnh TH ẢO - TC 9.3 Cần tuân thủ điều kiện bảo quản hạn sử dụng nhà sản xuất Không sử dụng môi trường nuôi cấy hết hạn sử dụng quản sử dụng Hịa mơi trường vào nước D 9.3.2 Ự Môi trường nuôi cấy khô cần tránh bị ảnh hưởng độ ẩm môi trường suốt thời gian bảo Thực theo khuyến nghị nhà sản xuất 9.3.3 Đo pH Đo pH máy đo pH (xem mục 5.5) điều chỉnh cần thiết để sau tiệt khuẩn làm mát đến nhiệt độ phịng, mơi trường pH cần thiết ± 0,2, trừ có quy định khác CHÚ Ý - Việc điều chỉnh pH thực dung dịch natri hydroxyd (NaOH) khoảng 40 g/l (khoảng mol/l) dung dịch acid hydroclorid (HCl) khoảng 36,5 g/l (khoảng mol/l) 9.3.4 Phân phối môi trường Phân phối môi trường vào bình chứa thích hợp, tay sử dụng thiết bị tự động 10 TCVN 06 9.4 Tiệt khuẩn 9.4.1 Quy định chung Tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy thuốc thử thực kỹ thuật khác nhau, bao gồm: - Tiệt khuẩn nhiệt ẩm; - Tiệt khuẩn cách lọc Tùy theo kỹ thuật sử dụng, môi trường tiệt khuẩn cần theo dõi, đặc biệt tiêu pH, màu sắc, độ vô khuẩn đánh giá hiệu Tiệt khuẩn nhiệt ẩm VN 9.4.2 Sử dụng nồi hấp (xem mục 5.6) để tiệt khuẩn Theo quy định chung, điều kiện hấp tiệt khuẩn nhiệt độ tối thiểu 121 °C 15 phút Có thể điều chỉnh thơng số tiệt khuẩn cần thiết để phù hợp TC với thể tích số lượng bình chứa, sơ đồ mẻ hấp loại mơi trường Quy trình tiệt khuẩn phải kiểm tra phương pháp thích hợp Tiệt khuẩn phương pháp lọc TH ẢO 9.4.3 Việc tiệt khuẩn phương pháp lọc thực với hỗ trợ bơm chân không điều kiện áp suất Sử dụng màng vơ khuẩn có đường kính lỗ lọc 0,22 μm (trừ trường hợp định, sử dụng lọc vô khuẩn sẵn Ự màng lọc 0,45 μm) Tham khảo hướng dẫn nhà sản xuất việc sử dụng vật liệu lọc màng D Tiệt khuẩn thành phần khác dụng cụ lọc, lắp ráp không, hấp tiệt khuẩn 121°C 15 phút Nếu cần thiết, việc lắp ráp thực tủ vi sinh sau hấp Có thể mua dụng cụ vơ khuẩn có sẵn thị trường 9.5 Bảo quản 9.5.1 Quy định chung Mỗi bao bì chai, ống nghiệm đĩa Petri phải dán nhãn, có đầy đủ thơng tin sau: - Tên môi trường; - Ngày chuẩn bị / hạn sử dụng 11 TCVN 06 9.5.2 Môi trường ni cấy thuốc thử phịng thí nghiệm tự chuẩn bị Môi trường nuôi cấy phân phối ống nghiệm chai thuốc thử chưa sử dụng cần tránh ánh sáng bay cách sử dụng nút đậy nút xốy Mơi trường nuôi cấy thuốc thử phải bảo quản điều kiện không làm thay đổi thành phần chúng Khơng sử dụng mơi trường bị, vón cục Trước sử dụng, nhiệt độ môi trường nuôi cấy cần cân với nhiệt độ phịng thí nghiệm, trừ có quy định khác Ví dụ: Mơi trường TSA, chuẩn bị phịng thí nghiệm, giữ bình bảo quản Mơi trường ni cấy thuốc thử pha sẵn Cần tuân thủ hướng dẫn nhà sản xuất: Hạn sử dụng; - Nhiệt độ điều kiện bảo quản; - Điều kiện sử dụng (pH, vv); - Kiểm soát chất lượng 9.6 TH ẢO - TC 9.5.3 VN bóng tối, thường khơng q tháng, trừ có quy định khác Đun chảy môi trường nuôi cấy thạch Ự Đun chảy môi trường nuôi cấy thạch cách đun cách thủy trình khác cho hiệu D tương tự (ví dụ, nồi hấp hơi) Tránh để nhiệt độ lấy môi trường nuôi cấy tan chảy Giữ môi trường nuôi cấy trạng thái lỏng bể ổn nhiệt nhiệt độ không 48 °C sử dụng Không sử dụng môi trường nuôi cấy nhiệt độ cao 48 °C Tốt không giữ môi trường nóng chảy q Trong trường hợp mơi trường nuôi cấy nhạy cảm đặc biệt, rút ngắn thời gian đun chảy Khơng sử dụng mơi trường nóng chảy nhiều lần để sử dụng 9.7 Chuẩn bị đĩa Petri Đổ môi trường nuôi cấy đun chảy vào đĩa Petri vơ khuẩn để đạt độ dày mm đến mm (ví dụ: đĩa có đường kính 90 mm, cần 15 mL đến 20 mL môi trường thạch) Đặt đĩa Petri lên bề mặt nằm ngang, mát để môi trường nguội đông đặc 12 TCVN 06 Đĩa Petri chuẩn bị sử dụng bảo quản điều kiện thích hợp (trong tối, nhiệt độ thời gian thích hợp) khơng làm thay đổi thành phần chúng Nhãn đĩa petri theo mô tả mục 9.5 Nếu cần làm khơ đĩa trước sử dụng Các đĩa môi trường pha sẵn có thị trường Bảo quản sử dụng chúng theo hướng dẫn nhà sản xuất 10 Mẫu phòng thí nghiệm 10.1 Quy định chung VN Sản phẩm mẫu quy định mục 3.1 mục 3.2 10.2 Lấy mẫu sản phẩm mỹ phẩm TC Điều quan trọng phịng thí nghiệm nhận sản phẩm sản phẩm phải đại diện cho sản phẩm mỹ phẩm khơng bị hư hỏng q trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu phải thực theo văn thích hợp, cụ thể Nếu khơng có văn cụ thể, 10.3 Vận chuyển TH ẢO khuyến nghị bên liên quan phải thỏa thuận vấn đề Trong trình vận chuyển đến phịng thí nghiệm, sản phẩm để thử nghiệm phải giữ điều kiện hạn chế tối đa thay đổi số lượng vi sinh vật Ự 10.4 Tiếp nhận bảo quản Nhân viên phịng thí nghiệm kiểm tra tình trạng mẫu tiếp nhận xác nhận điều kiện số D lượng phù hợp Nếu tình trạng mẫu khơng đảm bảo số lượng khơng đủ, phịng thí nghiệm khơng thể thực thử nghiệm yêu cầu Tuy nhiên, trường hợp đặc biệt việc thử nghiệm hồn thành, nhân viên phải ghi lại tình trạng sản phẩm lý thử nghiệm Các sản phẩm phép đưa vào phịng thí nghiệm phải ghi chép đầy đủ cho kiểm soát suốt trình viết báo cáo thử nghiệm Cần lưu ý thông tin sau đây: - Ngày nhận mẫu; - Chi tiết việc lấy mẫu (ngày thời gian lấy mẫu, điều kiện lấy mẫu, ); 13 TCVN 06 - Tên, tài liệu quy chuẩn, nguồn gốc yêu cầu khách hàng; - Đặc điểm mẫu Nếu cần thiết, bảo quản sản phẩm để kiểm tra nhiệt độ phịng Khơng ủ, giữ lạnh đóng băng sản phẩm mẫu trước sau phân tích 10.5 Xử lý sản phẩm mẫu Để tránh lây nhiễm từ môi trường, sản phẩm mẫu, cần xử lý theo quy trình để tránh tất nguy lây nhiễm Để đạt điều này, cần thực kỹ thuật vô khuẩn, ví dụ: Tất dụng cụ dùng để mở bao bì phải vơ khuẩn; - Dụng cụ sử dụng để lấy mẫu khỏi sản phẩm phải vô khuẩn; - Nếu cần thiết, khử trùng bao bì VN - TC 10.6 Lưu hủy sản phẩm Ngoại trừ trường hợp đặc biệt, giữ mẫu phòng thử nghiệm thu tất kết quả, lâu cần TH ẢO Hủy bỏ sản phẩm lấy mẫu, trừ chất mức độ ô nhiễm mẫu cho thấy cần xử lý vật liệu bị ô nhiễm (xem mục 8.6) 11 Thực hành vi sinh 11.1 Các biện pháp giữ vệ sinh trình thử nghiệm Ự Chú ý tiến hành cơng việc điều kiện vơ khuẩn, ví dụ như: D a) Đảm bảo khu vực làm việc khơng có gió lùa (cửa cửa sổ phải đóng lại); b) Trước sau làm việc, khử nhiễm bề mặt làm việc chất sát trùng thích hợp; c) Trước tiến hành cơng việc, phải đảm bảo thứ cần thiết chuẩn bị sẵn; d) Trong trường hợp công việc tiến hành tủ cấy vi sinh, sử dụng găng tay vô khuẩn sát khuẩn tay trước bắt đầu làm việc; e) Khi không làm việc tủ cấy vi sinh, mở vật chứa mẫu gần lửa, giữ chúng vị trí nghiêng có thể; f) Thực cơng việc nhanh có thể, khơng thực thao tác không cần thiết; 14 TCVN 06 g) Nếu không sử dụng hết pipet, đĩa petri sử dụng lần v.v… cần đảm bảo bao gói đóng kín sau lấy dụng cụ ra; h) Tiệt khuẩn que cấy thẳng vòng, vv trước sau sử dụng cách đốt lửa; để tránh phát tán chất vi sinh vật nên sử dụng lò đốt dây điện sử dụng que cấy thẳng vòng dùng lần; i) Ngâm pipet, thìa, vv… thùng chứa chất khử trùng thích hợp (ví dụ dung dịch natri hypochlorit cho pipet) trước xử lý (xem mục 8.6); j) Đặt thiết bị sử dụng nhiều lần có chứa vi sinh vật vào thùng chứa trước tiệt khuẩn rửa; k) Đặt dụng cụ dùng lần bình chứa thích hợp trước tiệt khuẩn đốt (xem mục 8.6); Lau chất lỏng bị đổ khăn bơng vật liệu thích hợp khác làm VN l) khử nhiễm bề mặt làm việc trước tiếp tục TC Việc thao tác với sản phẩm mơi trường có khả chứa vi khuẩn gây bệnh yêu cầu biện pháp phòng ngừa đặc biệt Những điều sau khuyến cáo: Tất thao tác cần thiết để tiến hành thử nghiệm cần thực tủ cấy vi sinh; - Sử dụng pipet tự động (cấm hút pipet miệng ) TH ẢO - LƯU Ý: Khí dung ngun nhân gây nhiễm bẩn mơi trường nhiễm khuẩn Khí dung hình thành từ: Khi sử dụng lắc, ống tiêm, vv; - Khi làm rỗng pipet cách thổi; - Khi tiệt khuẩn que cấy ướt; D Ự - Vì vậy, cần hạn chế hình thành khí dung 11.2 Chuẩn bị hỗn dịch ban đầu mẫu pha loãng 11.2.1 Quy định chung Trong trường hợp chuẩn bị hỗn dịch ban đầu mãu pha loãng, thời gian từ kết thúc việc chuẩn bị đến cấy vào môi trường nuôi cấy không vượt 45 phút, trừ có quy định riêng tiêu chuẩn cụ thể Hỗn dịch ban đầu chuẩn bị từ g mL hỗn hợp sản phẩm đồng điều kiện thử nghiệm 15 TCVN 06 Ghi lại khối lượng thể tích xác mẫu (S) 11.2.2 Sản phẩm phân tán nước Chuyển mẫu (S) sản phẩm vào vật chứa thích hợp pha loãng theo tiêu chuẩn áp dụng Ghi lại hệ số pha lỗng (d) 11.2.3 Sản phẩm khơng phân tán nước Chuyển mẫu (S) sản phẩm vào vật chứa thích hợp có chứa lượng chất hịa tan thích hợp (ví dụ polysorbate 80) pha lỗng theo tiêu chuẩn áp dụng Ghi lại hệ số pha loãng (d) VN 11.3 Phương pháp đếm 11.4 Phương pháp phát TC Thực theo yêu cầu phương pháp chuẩn áp dụng Để biết thông tin, xem Phụ lục B 12 Cách ghi kết TH ẢO Thực theo yêu cầu phương pháp chuẩn áp dụng Thực theo yêu cầu phương pháp chuẩn áp dụng 13 Trung hòa chất kháng khuẩn sản phẩm Trước phát đếm vi sinh vật sản phẩm mỹ phẩm, cần trung hòa khả Ự ức chế vi sinh vật mẫu thử Trong trường hợp phương pháp khác, việc kiểm tra trung hịa đặc tính kháng khuẩn sản phẩm phải kiểm tra thực D Thực theo yêu cầu phương pháp chuẩn áp dụng 16 TCVN 06 Phụ lục A Các kỹ thuật định danh A.1 Chuẩn bị chủng khiết A.1.1 Quy định chung Chuẩn bị chủng khiết cách chọn khuẩn lạc môi trường thạch cấy thể tích mẫu thử pha lỗng chủng vi sinh Sau ni cấy khuẩn lạc chọn môi trường thạch không chọn lọc Sau ủ, chọn khuẩn lạc riêng lẻ Lặp lại thao tác cần Sử dụng kỹ thuật trải mơ tả mục A.1.2 Có thể sử dụng phương pháp khác A.1.2 Kỹ thuật cấy trải A.1.2.1 Quy định chung VN số trường hợp cụ thể TC Lấy lượng nhỏ từ bề mặt khuẩn lạc riêng lẻ que cấy vịng vơ khuẩn Sau ria trực tiếp tế bào có vịng que cấy (xem mục A.1.2.2) sau tạo hỗn dịch tế bào (xem mục A.1.2.3) Phương pháp trực tiếp: TH ẢO A.1.2.2 Ví dụ: Sử dụng que cấy vịng, cấy ria theo đương sát phần ba diện tích bề mặt môi trường thạch Tiệt khuẩn làm mát que cấy vịng Từ rìa khu vực ria chủng, tạo đường cấy khác, gần so với vệt ria Lặp lại thao tác diện tích bề mặt cịn D Ự lại với khoảng cách đường ria xa (xem hình A.1) Hình A.1 - Ví dụ kỹ thuật trải: Phương pháp trực tiếp A.1.2.3 Phương pháp pha loãng Phân tán tế bào mL đến mL dung dịch pha loãng chọn, chạm que cấy vòng vào thành ống nghiệm bề mặt chất lỏng, sau trộn 17 TCVN 06 Tiệt khuẩn làm mát que cấy vòng Sử dụng que cấy vòng, lấy phần nhỏ dung dịch vi khuẩn tiến hành nêu mục A.1.2.2 Ủ A.1.3 Lật ngược đĩa Petri cấy chủng, ủ tủ ấm với thời gian, nhiệt độ chọn A.1.4 Lựa chọn Sau ủ, lựa chọn khuẩn lạc riêng lẻ từ đĩa, để ria tiếp để thực thử nghiệm Nếu có thể, thử nghiệm cuối nên thực với tế bào từ khuẩn lạc riêng lẻ Nếu lượng tế bào khuẩn lạc không đủ, trước tiên nên nuôi cấy mơi trường lỏng mơi trường thạch, sau sử dụng chủng để thực thử nghiệm Nhuộm Gram (kỹ thuật Hucker cải tiến) A.2.1 VN A.2 Quy định chung TC Việc nhuộm màu tế bào vi khuẩn cho phép mô tả hình thái vi khuẩn phân loại chúng thành hai nhóm theo chức năng, chúng hay khơng thể giữ màu tím thuốc nhuộm tím tinh thể điều kiện thử nghiệm Các kết phân loại phần lớn dựa TH ẢO khác cấu trúc thành tế bào hai nhóm điểm khác biệt hai nhóm Có số cách để tiến hành nhuộm Gram, tất theo trình tự A.2.2 Các dung dịch A.2.2.1 Quy định chung Ự Có thể dùng dung dịch thương mại Trong trường hợp này, phải tuân theo dẫn nhà sản xuất Dung dịch tím tinh thể A.2.2.2.1 Thành phần D A.2.2.2 Tím tinh thể Ethanol (95%) Amoni oxalat (C2H8N2O4) Nước A.2.2.2.2 2,0 g 20 mL 0,8 g 80 mL Chuẩn bị Hịa tan tím tinh thể ethanol amoni oxalat nước cất Trộn hai dung dịch để hỗn hợp ổn định 24 trước sử dụng 18 TCVN 06 A.2.2.3 Dung dịch iod A.2.2.3.1 Thành phần Iod 1,0 g Kali iodid (KI) 2,0 g Nước 100 mL A.2.2.3.2 Chuẩn bị Hòa tan Kali iodid 10 mL nước cất, thêm iod Sau hòa tan, thêm nước vạch 100 mL bình định mức A.2.2.4 Dung dịch Safranin VN A.2.2.4.1 Thành phần 0,25 g TC Safranin O Ethanol (95 %) 10 mL Nước Chuẩn bị TH ẢO A.2.2.4.2 100 mL Hòa tan safranin ethanol sau trộn với nước cất đến thể tích cuối 100 mL Khi tím tinh thể sử dụng, ổn định dung dịch cần xác định Để xác định, trộn giọt dung dịch tinh thể tím với giọt dung dịch iod mặt lam kính để xem phản ứng hóa học Kỹ thuật nhuộm D A.2.2.5 Ự Nếu thấy kết tinh mặt kính, khơng sử dụng dung dịch tím tinh thể Sau cố định vết vi khuẩn (được chuẩn bị từ dịch nuôi từ 18 đến 24 giờ, từ canh thang đục) lam kính (ví dụ với lửa) phủ lên vết dung dịch tím tinh thể (xem mục A.2.2.2) Để phản ứng xảy phút Rửa nhẹ lam kính để tư nghiêng nước vài giây Phủ lên lam kính dung dịch iod (xem mục A.2.2.3) Để phản ứng xảy phút Rửa nhẹ lam kính để tư nghiêng nước vài giây Đổ nhẹ nhàng liên tục lớp mỏng dung dịch ethanol (95 %) lên lam kính để nghiêng khoảng thời gian không 30 s khơng cịn màu tím Rửa nhẹ lam kính tư nghiêng nước để loại bỏ ethanol Phủ lên lam kính dung dịch safranin (xem mục A.2.2.4) 10 giây Rửa nhẹ lam kính để tư nghiêng nước vài giây Làm khơ lam kính 19 TCVN 06 A.2.2.6 Cách đọc kết Kiểm tra lam kính kính hiểm vi có độ phóng đại cao (xem mục 5.13) Các tế bào vi khuẩn có màu màu tím Gram dương; có màu từ hồng thẫm đến đỏ Gram âm Đối với số loại vi khuẩn, thu tế bào Gram dương Gram âm thị trường kính hiển vi CHÚ THÍCH: Các tế bào vón đặc cho hình ảnh khơng đặc trưng A.3 Phản ứng catalase A.3.1 Quy định chung Việc phát enzyme phân hủy hydrogen peroxid (H2O2) để tạo nước oxy, thực cách sử dụng môi trường lỏng, môi trường thạch khuẩn lạc đơn môi trường thạch Từ môi trường lỏng VN A.3.2 Thêm vào mL môi trường, 0,5 mL dung dịch hydrogen peroxid 10% thể tích (3 % khối lượng) (catalase âm tính) A.3.3 Từ trường mơi trường thạch TC Quan sát xuất bong bóng oxy (catalase dương tính) khơng có bong bóng oxy TH ẢO Nhỏ lên môi trường mL - mL dung dịch hydrogen peroxid 10 % thể tích (3 % khối lượng) Quan sát sau phút dù có hình thành bọt khí oxy hay khơng A.3.4 Từ khuẩn lạc Nhỏ riêng hai giọt dung dịch hydrogen peroxid 10 thể tích lam kính Ự Chọn khuẩn lạc nhựa que cấy vô khuẩn (đặc biệt dây kim loại) nhũ hóa nhẹ nhàng vào hai giọt Quan sát sau vài phút (ít D phút) có hay khơng bong bóng oxy hình thành Trong trường hợp có nghi ngờ, trải cho giọt với la men so sánh xuất bong bóng hai la men Có thể quan sát mắt thường sử dụng kính hiển vi có độ phóng đại thấp A.4 Thử nghiệm oxidase A.4.1 Quy định chung Việc phát phản ứng oxidase thực thay đổi màu sắc hợp chất thời điểm q trình oxy hóa tác động enzym A.4.2 Thuốc thử A.4.2.1 Thành phần N,N,N',N'-Tetramethyl-3-p-phenylenediamine dihydrochloride (C10H16N2⋅2HCl) Nước 1,0 g 100 mL 20 TCVN 06 A.4.2.2 Chuẩn bị Hoà tan thuốc thử nước lạnh Chuẩn bị thuốc thử trước sử dụng Có thể sử dụng đĩa que thử có sẵn Trong trường hợp này, thực theo khuyến cáo nhà sản xuất A.4.2.3 Kỹ thuật Làm ướt miếng giấy lọc thuốc thử Lấy mẫu vi khuẩn thu từ môi trường thạch que cấy bạch kim thủy tinh nhựa (một dây niken/chrome cho kết dương tính giả) đặt lên giấy lọc ẩm A.4.2.4 Cách đọc kết Trong trường hợp có diện oxidase, màu tím đến tím đỏ xuất khoảng thời gian từ giây đến 10 giây Nếu màu sắc không thay đổi sau 10 giây, thử nghiệm xem âm A.5 VN tính Sử dụng thử sinh hóa để nhận biết TC Các KIT sinh hóa sử dụng để định danh Tuy nhiên, tất KIT thương mại hóa khơng có độ tin cậy Do đó, nên đánh giá hiệu chúng trước sử dụng, trừ D Ự TH ẢO chúng xác nhận nhà sản xuất / tổ chức độc lập 21 TCVN 06 Phụ lục B Các kỹ thuật đếm cấy trải B.1 Phương pháp đổ đĩa thạch Chuẩn bị môi trường, đĩa Petri, dung dịch pha loãng mẫu pha loãng phải kiểm tra số lượng tương ứng với kế hoạch sử dụng Lấy lượng thể tích xác định mẫu pha loãng cần kiểm tra vào đĩa Petri (đã dán nhãn) Đổ vào lượng môi trường theo quy định mục 9.7 vào đĩa petri Ngay lắc cẩn thận để tạo phân bố đồng vi sinh vật môi trường Làm mát đông đặc môi trường cách đặt đĩa Petri lên bề mặt mát (thời gian đông đặc thạch không vượt 10 phút) VN B.2 Phương pháp cấy trải Cho dung dịch cần cấy vào đĩa Petri có chứa mơi trường thạch dán nhãn (được chuẩn TC bị theo mục 9.7) Trải nhanh bề mặt mơi trường cách sử dụng que trải thủy tinh nhựa dẻo vô khuẩn xoay đĩa khơng cịn chất lỏng nhìn thấy bề mặt thạch TH ẢO B.3 Phương pháp lọc qua màng Chuyển lượng mẫu phù hợp chuẩn bị theo hướng dẫn phương pháp, dụng cụ lọc làm ướt với lượng nhỏ dung dịch pha loãng vơ khuẩn thích hợp, lọc rửa theo quy trình thích hợp D Ự Chuyển màng lọc lên bề mặt môi trường thạch đĩa petri 22 TCVN 06 Phụ lục C Chuẩn bị tạo hỗn dịch vi sinh vật chuẩn C.1 Nuôi cấy chủng chuẩn Để tăng độ lặp lại độ tái lặp kết quả, nên sử dụng chủng vi sinh vật hệ thứ ba (ít hệ thứ hai) nuôi cấy môi trường thạch, thu từ môi trường nuôi cấy chuẩn bị theo EN 12353 Khi sử dụng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, hỗn dịch thu sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 18 đến 24 Khi sử dụng Candida albicans, nuôi cấy lần đầu lần hai, ủ khoảng từ 36 đến 48 phù hợp C.2 Chuẩn bị hỗn dịch chủng vi sinh vật Lấy 10 mL chất pha lỗng cho vào bình 100 mL vơ khuẩn có chứa g hạt thủy tinh Dùng que cấy vịng thu sinh khối từ mơi trường thạch vào dung dịch pha lỗng Nhúng vịng cấy chất pha VN lỗng chà xát vào cạnh bình để giải phóng tế bào Lắc bình từ phút đến phút (sử dụng máy lắc học có thể) Hút phần hỗn dịch phía (tránh tiếp xúc với hạt thủy tinh) C.3 Hiệu chỉnh hỗn dịch TC chuyển vào bình chứa vơ khuẩn Điều chỉnh nồng độ tế bào hỗn dịch từ x 108 CFU/ mL đến x 108 CFU/mL (với TH ẢO C albicans từ x 107 CFU/mL đến x 107 CFU/mL) dung dịch pha loãng theo liệu hiệu chuẩn phịng thử nghiệm Ví dụ, sử dụng máy quang phổ (620 nm ± 20 nm, bước sóng] cuvet dùng lần dài 10 mm Đo độ hấp thu phần hỗn dịch cần pha loãng hỗn dịch để độ hấp thu nằm giá trị xác định Các giá trị mật độ quang phổ thích hợp nằm D Ự khoảng từ 0,150 đến 0,460 tùy theo chủng 23 TCVN 06 Tài liệu tham khảo [1] ISO 6887-1:2017 Microbiology of the food chain Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions [2] ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs —General requirements and guidance for microbiological examinations [3] ISO 11133:2014 Microbiology of food, animal feed and water Preparation, production, storage and performance testing of culture media [4] ISO/IEC 17025:2005 General requirements for the competence of testing and calibration [5] VN laboratories BS EN 12353:2013 Chemical disinfectants and antiseptics Preservation of test organisms TC used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity CTFA Microbiology Guidelines Toiletry and Fragrance Association, 2001 TH ẢO [6] [7] E P Microbiological Examination of non-sterile products, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002 [8] FDA Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S Food and Drug Administration, J P 14, General Tests -Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001 D [9] Ự 1995 [10] JCIA Microbial test methods for cosmetics, pub Japanese Cosmetics Industry Association, 1997 [11] USP 28, Microbial Limit test (61), published by the U.S Pharmacopoeia, 2005 24