kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sắc ký

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLCØHPLC = High - Performance Liquid Chromatography High - Pressure Liquid ChromatographyØQuá trình phân tách dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình:- Những câ

Trang 1

KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

MSc Trương Phú Chí Hiếu

Trang 2

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

MSc Trương Phú Chí Hiếu

Trang 3

Mục tiêu

• Hiểu được cơ sở lý thuyết sắc ký, cấu tạo cơ bản của hệ thống và các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao.

• Trình bày các ứng dụng của sắc ký lỏng hiệunăng cao trong phân tích thuốc.

Trang 4

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Trang 5

ØHPLC = High - Performance Liquid Chromatography High - Pressure Liquid Chromatography

ØQuá trình phân tách dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình:

- Những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động.

- Sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất phân tích theo từng lớp qua chất nhồi cột, từ đầu đến cuối cột tách.

Trang 6

ØCác chất phân tích di chuyển theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động:

- Chất phân tích có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị lưu giữ lại lâu hơn trên cột.

- Chất phân tích có ái lực nhiều với pha động thì có tốc độ di chuyển nhanh, ít bị lưu giữ.

=> Xảy ra quá trình tách các chất trên cột sắc ký.

Trang 7

Detector ở cuối cột ghi lại

Trang 8

Trang 9

ØSắc ký phân bố:

- Được ứng dụng nhiều nhất vì phân tích được những chất có khoảng phân cực rộng (từ không phân cực đến rất phân cực) hoặc hợp chất ion - Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động:

Trang 10

ØSắc ký phân bố:

- Độ phân cực của các nhóm chức hữu cơ:

Hydrocarbon mạch thẳng < olefin < hydrocarbon thơm < dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester ≈ andehyd ≈ ceton < alcol ≈ amin < sulfo < sulfoxid < acid carboxylic < nước.

Trang 11

ØPha tĩnh:

- Thường dùng silica SiO2 được xử lý bề mặt bằng cách đun nóng với acid (thủy phân) để tạo nhóm –OH

- Tiếp tục cho phản ứng với dẫn chất hữu cơ của chlorosilan tạo ra các dẫn chất siloxan có độ phân cực phụ thuộc vào nhóm thế R

Trang 12

Trang 13

Trang 14

Trang 15

- Phân tử lượng lớn hơn 2000: sắc ký loại trừ kích thước Pha động là nước hay dung môi hữu cơ tùy thuộc vào tính tan của chất phân tích - Phân tử lượng từ 2000 trở xuống: xem xét tính tan của chất phân tích: + Mẫu tan hoặc ít tan trong nước: sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký phân bố pha đảo.

+ Độ tan tăng thêm khi dùng acid hoặc kiềm: sắc ký trao đổi ion.

+ Độ tan không bị ảnh hưởng bởi acid hoặc kiềm; dung dịch nước của chất phân tích trung tính: sắc ký phân bố pha đảo.

+ Mẫu không tan trong nước: sắc ký phân bố pha thuận hoặc sắc ký hấp phụ

+ Tách các đồng phân: sắc ký hấp phụ + Tách các đồng đẳng: sắc ký phân bố.

Trang 16

5 Detecter6 Máy tính7 Bình thải

Trang 17

ØPha động (bình dung môi):

Dung môi được dẫn từ bình đến bơm nhờ hoạt động của bơm.

Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký, đưa chất phân tích di chuyển qua cột.

Trang 18

ØPha động (bình dung môi):

- Lựa chọn dung môi dựa vào độ phân cực của chất phân tích, pha tĩnh và

Trang 19

ØPha động (bình dung môi): - Yêu cầu kỹ thuật với dung môi:

Không chứa bụi

Trang 20

ØPha động (bình dung môi): - Chương trình trộn dung môi:

+ Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp

Bình dung môi 1

Bình dung môi 2

Bình dung môi 3

Ưu điểm: chỉ dùng một bơm, chi phí không cao.Nhược điểm: hệ thống ba van để lấy ba dung môi, ảnh hướng đến độ chính xác.

Trang 21

ØPha động (bình dung môi): - Chương trình trộn dung môi:

+ Chương trình trộn dung môi ở áp suất cao lại cao hơn.

Nhược điểm: tốn kém hơn, hệ thống cồng kềnh hơn.

Bơm 1

Bơm 3

Trang 22

Trang 23

ØHệ thống bơm:

- Các loại bơm thông dụng:

Bơm đẩy liên tục: dung môi được bơm đầy một lần, được đẩy

đến khi hết thì dừng.

Bơm đẩy hút luân phiên: việc đẩy và bơm dung môi xảy ra

đồng thời.

Trang 24

ØHệ thống tiêm mẫu:

- Vai trò: nạp một lượng chính xác mẫu các chất phân tích vào trong vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích nhất định (5 – 500 𝛍l), sau đó

được đưa vào cột sắc ký - Chế độ tiêm:

+ Tiêm thủ công bằng xy lanh + Tiêm tự động.

Trang 25

ØCột sắc ký:

- Vai trò: tách các mẫu phân tích ra khỏi nhau.

- Cấu tạo: được làm bằng vật liệu không rỉ (thép Cr – Ni – Mo) với mặt trong của cột được làm nhẵn, hoặc làm bằng thủy tinh.

Trang 26

Trang 27

ØCột sắc ký: - Cột bảo vệ:

+ Được đặt trước cột sắt ký để loại các chất bẩn có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích.

+ Có kích thước ngắn hơn cột sắc ký và được nhồi cùng loại hạt nhưng có kích thước nhỏ hơn.

+ Trải qua một số lần tiêm mẫu nhất định, khi hình dáng pic trên sắc ký đồ thay đổi, hoặc độ phân giải giảm là những dấu hiệu cho thấy cần thay cột bảo vệ.

Trang 28

ØCột sắc ký:

- Hệ thống điều nhiệt:

+ HPLC thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng.

+ Sự thay đổi nhiệt độ (dù nhỏ) cũng gây ảnh hưởng đến chất lượng của sắc ký đồ.

=> Các thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm bộ phận điều nhiệt, có thể giữ ổn định nhiệt độ lên tới 1500C với sai số không quá 0,050C.

Trang 29

- Vai trò: chuyển các tín hiệu thành dạng điện - Yêu cầu kỹ thuật với detecter:

Trang 30

- Phân loại: Detecter hấp thụ UV-VIS Detecter huỳnh quang

Detecter chỉ số khúc xạ Detecter tán xạ bay hơi Detecter đo dòng

Detecter độ dẫn

Trang 31

- Detecter hấp thụ UV-VIS: gồm ba cấu hình

Detecter đo ở bước

Trang 32

- Detecter huỳnh quang:

+ Có thể sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh quang cho detecter huỳnh quang.

+ Có độ chọn lọc và độ nhạy lớn hơn (có thể gấp 1000 lần) so với detecter UV-VIS: dùng trong phân tích vết trong kiểm soát môi trường, giám định pháp y …

+ Phù hợp với phân tích các chất phát huỳnh quang: hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinoline, steroid, alkaloid.

Trang 33

ØHệ số phân bố K:

- Đặc trưng cho tốc độ di chuyển của một chất phân tích qua pha tĩnh K = !!

Trong đó: CS là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh CM là nồng độ chất phân tích trong pha động.

- Hệ số phân bố K phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

=> Các chất phân tích có K càng khác nhau thì càng dễ tách.

Trang 34

ØThời gian lưu tR: tR’ = tR – t0

Trong đó: tR là thời gian lưu của một chất phân tích từ khi vào đến khi ra khỏi cột.

t0 là thời gian để pha động đi qua cột (thời gian chết).

tR’ là thời gian lưu thật của một chất phân tích

Trang 35

Trang 36

ØHệ số dung lượng k’: - Ngoài ra: k’ = ##$ #$

ÞtR ~ t0 thì k’ ~ 0: chất phân tích gần như không tương tác với pha tĩnh (cột không có khả năng giữ chất phân tích).

ÞtR ⟫ t0 thì k’ càng lớn: chất phân tích ở trong cột lâu, đỉnh pic tù - Giá trị k’ trong khoảng 2 – 5 là lý tưởng.

Trang 37

ØSố đĩa lý thuyết N:

N = 16 x (##

%)2 hoặc N = 5,54 x ( tR W1/2)2 Trong đó: W là chiều rộng pic sắc ký tính ở đáy pic.

W1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao của pic.

- Số đĩa lý thuyết (hiệu năng) của cột đặc trưng cho khả năng tách sắc ký của các chất phân tích trên cột.

ÞN càng lớn, khả năng tách càng cao W = 1,7 x W1/2

Trang 38

ØĐộ chọn lọc 𝛂:

- Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột, giá trị luôn lớn hơn 1 𝛂 = K2

K1 = kk21’’

Trang 39

Trang 40

*Bài tập 1: Thực hiện tách ba chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 40 cm được bảng số liệu sau đây:

a Tính số đĩa lý thuyết trung bình của cột b Tính chiều cao của đĩa.

c Tính độ phân giải cho từng cặp chất.

Trang 41

Lời giải a Số đĩa lý thuyết: N = 5,54 x ( tR

W1/2)2 - Đối với chất phân tích A: NA = 959 - Đối với chất phân tích B: NB = 979 - Đối với chất phân tích C: NC = 885.

ÞSố đĩa lý thuyết trung bình: N = (NA + NB + NC) : 3 = 941 b Chiều cao của đĩa: H = '& = *(+() = 0,0425 cm = 0,425 mm.

Trang 42

- Độ phân giải cho B và A: RBA = 0,67 - Độ phân giải cho C và B: RCB = 1,56 - Độ phân giải cho C và A: RCA = 2,2

Trang 43

*Bài tập 2: Thực hiện tách hai chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 30 cm được bảng số liệu sau đây:

a Tính độ phân giải của cột.

b Tính số đĩa lý thuyết trung bình của cột và chiều cao của đĩa.

c Muốn độ phân giải là R’ = 1,5 thì cột phải có số đĩa lý thuyết là bao nhiêu? Biết rằng pha động và pha tĩnh được giữ nguyên.

Trang 44

- Đối với chất phân tích A: NA = 3493 - Đối với chất phân tích B: NB = 3397.

ÞSố đĩa lý thuyết trung bình: N = (NA + NB) : 2 = 3445 Chiều cao của đĩa: H = '& = ,((-,) = 8,71 x 10-3 cm.

Trang 45

c Số đĩa lý thuyết của cột tương ứng với độ phân giải R’ = 1,5 R’ = tR2 − tR1

tR2 x 4N′ => N’ = 16 x ( R′x tR2

tR2 − tR1)2 = 7396

Trang 46

*Bài tập 3: Thực hiện tách hai chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 40 cm được bảng số liệu sau đây:

Biết thể tích pha tĩnh và pha động lần lượt là: VS = 19,6 ml và VM = 62,6 ml.

a Tính hệ số dung lượng cho mỗi chất phân tích b Tính hệ số phân bố cho mỗi chất phân tích.

Trang 47

Lời giải a Hệ số dung lượng: k’ = ##$ #$

- Hệ số dung lượng cho chất phân tích A: k’A = 4,26 - Hệ số dung lượng cho chất phân tích B: k’B = 4,74 b Ta có: k’ = K x "!

ÞK = k’ x ""

- Hệ số phân bố cho chất phân tích A: KA = 13,61 - Hệ số phân bố cho chất phân tích B: KB = 15,14 c Độ chọn lọc: 𝛂 = k2’

k1’ = 1,11.

Trang 48

Trang 49

ØPhân tích định lượng: - Dựa vào chiều cao hoặc

diện tích của pic sắc ký để từ đó tính ra nồng độ của chất phân tích.

Trang 50

ØPhân tích định lượng:

- Phương pháp ngoại chuẩn:

+ Tiến hành sắc ký cả hai mẫu chuẩn (đã biết nồng độ) và mẫu thử trong cùng điều kiện.

+ So sánh diện tích hoặc chiều cao pic sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử ÞTính được nồng độ của mẫu thử: CX = CS x .%

Trong đó: CX và CS lần lượt là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn.

SX và SS lần lượt là diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn.

Trang 51

*Bài tập 4: Tiến hành định lượng viên nén Captopril 25 mg bằng phương pháp HPLC thu được pic sắc ký có diện tích 17,661 Hỏi chế phẩm này có đạt yêu cầu về hàm lượng Captopril (phải nằm trong khoảng 98,0% đến 101,5%) Biết khi định lượng nguyên liệu chuẩn Captopril 25 mg trong cùng điều kiện thu được pic sắc ký có diện tích 17,768

Trang 52

ØPhân tích định lượng:

- Phương pháp ngoại chuẩn:

+ Có thể tiến hành sắc ký với một dãy mẫu chuẩn có nồng độ tăng dần + Tính toán các diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của các mẫu chuẩn này

=> Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn quan hệ giữa nồng độ và diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký, từ đó tính toán được nồng độ của mẫu thử dựa vào diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của mẫu thử.

Trang 53

*Bài tập 5: Tiến hành định lượng nguyên liệu Loratadin bằng phương pháp HPLC Cân khoảng 20 mg nguyên liệu cho mỗi lần thử, tiến hành 6 lần thử thu được các pic sắc ký có diện tích được ghi lại theo bảng số liệu sau:

Hỏi diện tích pic sắc ký là bao nhiêu khi cân chính xác 20,00 mg nguyên liệu Loratadin và tiến hành thử trong cùng điều kiện như trên.

Trang 54

vTài liệu tham khảo

Xuất Bản Y Học.

Trang 55

Thank you for your attention!