kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sắc ký

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLCØHPLC = High - Performance Liquid Chromatography High - Pressure Liquid ChromatographyØQuá trình phân tách dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình:- Những câ

Trang 1

KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

MSc Trương Phú Chí Hiếu

Trang 2

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

MSc Trương Phú Chí Hiếu

Trang 3

Mục tiêu

• Hiểu được cơ sở lý thuyết sắc ký, cấu tạo cơ bản của hệ thống và các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao.

• Trình bày các ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích thuốc.

Trang 4

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Sắc ký lỏng

Sắc ký cột

Sắc ký cột thông thường

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký phẳng

Sắc ký lớp mỏng Sắc ký giấy

Trang 5

ØHPLC = High - Performance Liquid Chromatography

High - Pressure Liquid Chromatography

ØQuá trình phân tách dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình:

- Những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha

động

- Sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất phân tích theo từng lớp qua chất nhồi cột, từ đầu đến cuối cột tách

Trang 6

- Chất phân tích có ái lực nhiều với pha động thì có tốc độ di chuyển

nhanh, ít bị lưu giữ

=> Xảy ra quá trình tách các chất trên cột sắc ký

Trang 7

Detector ở cuối cột ghi lại

sự có mặt của các chất phân tích trong pha động qua dạng các pic sắc ký (sắc

ký đồ) được dùng cho phân tính định tính và định lượng

Trang 8

ØDựa vào kỹ thuật sắc ký:

Sắc ký phân bố Sắc ký hấp phụ Sắc ký trao đổi ion Sắc ký loại trừ kích thước

Trang 9

pha động

Độ phân cực của chất phân tích gần với độ phân cực pha động và khác xa độ phân cực

pha tĩnh

Trang 10

ØSắc ký phân bố:

- Độ phân cực của các nhóm chức hữu cơ:

Hydrocarbon mạch thẳng < olefin < hydrocarbon thơm < dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester ≈ andehyd ≈ ceton

< alcol ≈ amin < sulfo < sulfoxid < acid carboxylic < nước.

Trang 11

Si OH

Trang 12

ØPha tĩnh:

-(CH2)3-CN:

cyanopropyl -(CH2)3-NH2: aminopropyl -(CH2)2-O- CH(OH)-CH2-OH:

diol

-C 18 H 37 : octadecyl -C 8 H 17 : octyl -(CH 2 ) n -

Trang 13

là nhóm thế phân

cực)

Dùng trong phântích các hợp chất

từ không phâncực đến phân cực

Trang 14

Trang 15

+ Độ tan tăng thêm khi dùng acid hoặc kiềm: sắc ký trao đổi ion

+ Độ tan không bị ảnh hưởng bởi acid hoặc kiềm; dung dịch nước của chất phân tích trung tính: sắc ký phân bố pha đảo

+ Mẫu không tan trong nước: sắc ký phân bố pha thuận hoặc sắc ký hấp phụ

+ Tách các đồng phân: sắc ký hấp phụ

+ Tách các đồng đẳng: sắc ký phân bố

Trang 16

5 Detecter 6 Máy tính 7 Bình thải

Trang 17

ØPha động (bình dung môi):

Trang 18

- Lựa chọn dung môi dựa vào độ phân cực của chất phân tích, pha tĩnh và pha động

Nước, Methanol, Acetonitrile, Ethanol

hexane, pentane,

Trang 19

- Yêu cầu kỹ thuật với dung môi:

Không chứa bụi bẩn và vật lạ

Lọc qua giấy lọc 0,45 𝛍m trước khi sử dụng

Có đầu lọc ở đầu ống nhựa trong bình dung môi

Loại bỏ khí hòa tan (sục khí trơ)

Trang 20

- Chương trình trộn dung môi:

+ Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp

Bình dung môi 1

Bình dung môi 2

Bình dung môi 3

Ưu điểm: chỉ dùng một bơm, chi phí không cao Nhược điểm: hệ thống ba van để lấy ba dung môi, ảnh hướng đến độ chính xác.

Trang 21

- Chương trình trộn dung môi:

+ Chương trình trộn dung môi ở áp suất cao

Nhược điểm: tốn kém hơn,

hệ thống cồng kềnh hơn.

Bơm 1

Bơm 3

Trang 22

Dung môi

• Chịu được tác động của nhiều loại dung môi.

Tốc độ dòng

• Lưu lượng lặp lại.

• Có thể chọn lựa

và thay đổi

dễ dàng.

Trang 23

ØHệ thống bơm:

- Các loại bơm thông dụng:

Bơm đẩy liên tục:

dung môi được bơm đầy một lần, được đẩy đến khi hết thì dừng.

Bơm đẩy hút luân phiên: việc đẩy và bơm dung môi xảy ra

đồng thời.

Trang 24

Trang 25

ØCột sắc ký:

- Vai trò: tách các mẫu phân tích ra khỏi nhau

- Cấu tạo: được làm bằng vật liệu không rỉ (thép Cr – Ni – Mo) với mặt trong của cột được làm nhẵn, hoặc làm bằng thủy tinh

Trang 26

Trang 27

Trang 28

ØCột sắc ký:

- Hệ thống điều nhiệt:

+ HPLC thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng

+ Sự thay đổi nhiệt độ (dù nhỏ) cũng gây ảnh hưởng đến chất lượng của sắc ký đồ

=> Các thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm bộ phận điều nhiệt, có thể giữ ổn định nhiệt độ lên tới 1500C với sai số không quá 0,050C

Trang 29

ØDetecter:

- Vai trò: chuyển các tín hiệu thành dạng điện

- Yêu cầu kỹ thuật với detecter:

Đáp ứng nhanh và

lặp lại

Độ nhạy cao, pháthiện chất phân tích

Trang 30

ØDetecter:

- Phân loại: Detecter hấp thụ UV-VIS

Detecter huỳnh quang Detecter chỉ số khúc xạ Detecter tán xạ bay hơi Detecter đo dòng

Detecter độ dẫn

Trang 31

ØDetecter:

- Detecter hấp thụ UV-VIS: gồm ba cấu hình

Detecter đo ở bước

• Cho phép lựa chọn bước sóng

có đáp ứng tối ưu

Detecter mảng diod

(DAD)

• Có một hoặc hai mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc

• Có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng, thời gian

Trang 32

ØDetecter:

- Detecter huỳnh quang:

+ Có thể sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh

quang cho detecter huỳnh quang

+ Có độ chọn lọc và độ nhạy lớn hơn (có thể gấp 1000 lần) so với detecter UV-VIS: dùng trong phân tích vết trong kiểm soát môi trường, giám định pháp y …

+ Phù hợp với phân tích các chất phát huỳnh quang: hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinoline, steroid, alkaloid

Trang 33

ØHệ số phân bố K:

- Đặc trưng cho tốc độ di chuyển của một chất phân tích qua pha tĩnh

K = !!

!"

Trong đó: CS là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

CM là nồng độ chất phân tích trong pha động

- Hệ số phân bố K phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, pha tĩnh và pha động

=> Các chất phân tích có K càng khác nhau thì càng dễ tách

Trang 34

ØThời gian lưu tR:

tR’ = tR – t0

Trong đó: tR là thời gian lưu của một

chất phân tích từ khi vào đến khi ra

Trang 35

Trang 36

ÞtR ⟫ t0 thì k’ càng lớn: chất phân tích ở trong cột lâu, đỉnh pic tù

- Giá trị k’ trong khoảng 2 – 5 là lý tưởng

Trang 37

ØSố đĩa lý thuyết N:

N = 16 x (##

%)2 hoặc N = 5,54 x ( tR

W1/2)2Trong đó: W là chiều rộng pic sắc ký tính ở đáy pic

W1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao của pic

- Số đĩa lý thuyết (hiệu năng) của cột đặc trưng cho khả năng tách sắc ký của các chất phân tích trên cột

ÞN càng lớn, khả năng tách càng cao

W = 1,7 x W1/2

Trang 38

ØĐộ chọn lọc 𝛂:

- Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột, giá trị luôn lớn hơn 1

𝛂 = K2

K1 = kk21’’

Trang 39

ØĐộ phân giải R:

- Đặc trưng cho sự giải hấp thụ, sự chọn lọc và hiệu năng tách

R = tR2 − tR1

12(W2+ W1) =

N

4 x tR2t− tR2 R1

Trang 40

*Bài tập 1: Thực hiện tách ba chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 40 cm được bảng số liệu sau đây:

a Tính số đĩa lý thuyết trung bình của cột

b Tính chiều cao của đĩa

c Tính độ phân giải cho từng cặp chất

Trang 41

Lời giải

a Số đĩa lý thuyết: N = 5,54 x ( tR

W1/2)2

- Đối với chất phân tích A: NA = 959

- Đối với chất phân tích B: NB = 979

- Đối với chất phân tích C: NC = 885

ÞSố đĩa lý thuyết trung bình: N = (NA + NB + NC) : 3 = 941

b Chiều cao của đĩa: H = '& = *(+() = 0,0425 cm = 0,425 mm

Trang 42

c Độ phân giải: R = tR2 − tR1

12(W2+ W1) và W = 1,7 W1/2

- Độ phân giải cho B và A: RBA = 0,67

- Độ phân giải cho C và B: RCB = 1,56

- Độ phân giải cho C và A: RCA = 2,2

Trang 43

*Bài tập 2: Thực hiện tách hai chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 30 cm được bảng số liệu sau đây:

a Tính độ phân giải của cột

b Tính số đĩa lý thuyết trung bình của cột và chiều cao của đĩa

c Muốn độ phân giải là R’ = 1,5 thì cột phải có số đĩa lý thuyết là bao

nhiêu? Biết rằng pha động và pha tĩnh được giữ nguyên

Trang 44

Lời giải

a Độ phân giải: R = tR2 −tR1

12(W2+ W1)

=> R = 1,06

b Số đĩa lý thuyết: N = 16 x (tR

W)2

- Đối với chất phân tích A: NA = 3493

- Đối với chất phân tích B: NB = 3397

ÞSố đĩa lý thuyết trung bình: N = (NA + NB) : 2 = 3445

Chiều cao của đĩa: H = '& = ,((-,) = 8,71 x 10-3 cm

Trang 45

c Số đĩa lý thuyết của cột tương ứng với độ phân giải R’ = 1,5

R’ = tR2 − tR1

tR2 x 4N′

=> N’ = 16 x ( R′x tR2

tR2 − tR1)2 = 7396

Trang 46

*Bài tập 3: Thực hiện tách hai chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 40 cm được bảng số liệu sau đây:

Biết thể tích pha tĩnh và pha động lần lượt là: VS = 19,6 ml và VM = 62,6 ml

a Tính hệ số dung lượng cho mỗi chất phân tích

b Tính hệ số phân bố cho mỗi chất phân tích

Trang 47

Lời giải

a Hệ số dung lượng: k’ = ## $ #$

#$

- Hệ số dung lượng cho chất phân tích A: k’A = 4,26

- Hệ số dung lượng cho chất phân tích B: k’B = 4,74

b Ta có: k’ = K x "!

""

ÞK = k’ x ""

"!

- Hệ số phân bố cho chất phân tích A: KA = 13,61

- Hệ số phân bố cho chất phân tích B: KB = 15,14

c Độ chọn lọc: 𝛂 = k2’

k1’ = 1,11

Trang 48

Trang 49

ØPhân tích định lượng:

- Dựa vào chiều cao hoặc

diện tích của pic sắc ký

để từ đó tính ra nồng độ

của chất phân tích

Trang 50

- Phương pháp ngoại chuẩn:

+ Tiến hành sắc ký cả hai mẫu chuẩn (đã biết nồng độ) và mẫu thử trong cùng điều kiện

+ So sánh diện tích hoặc chiều cao pic sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử.ÞTính được nồng độ của mẫu thử: CX = CS x .%

.!

Trong đó: CX và CS lần lượt là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn

SX và SS lần lượt là diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn

Trang 51

*Bài tập 4: Tiến hành định lượng viên nén Captopril 25 mg bằng phương pháp HPLC thu được pic sắc ký có diện tích 17,661 Hỏi chế phẩm này có đạt yêu cầu về hàm lượng Captopril (phải nằm trong khoảng 98,0% đến 101,5%) Biết khi định lượng nguyên liệu chuẩn Captopril 25 mg trong

cùng điều kiện thu được pic sắc ký có diện tích 17,768

Trang 52

- Phương pháp ngoại chuẩn:

+ Có thể tiến hành sắc ký với một dãy mẫu chuẩn có nồng độ tăng dần

+ Tính toán các diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của các mẫu chuẩn này

=> Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn quan hệ giữa nồng độ và diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký, từ đó tính toán được nồng độ của mẫu thử dựa vào diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của mẫu thử

Trang 53

*Bài tập 5: Tiến hành định lượng nguyên liệu Loratadin bằng phương pháp HPLC Cân khoảng 20 mg nguyên liệu cho mỗi lần thử, tiến hành 6 lần thử thu được các pic sắc ký có diện tích được ghi lại theo bảng số liệu sau:

Hỏi diện tích pic sắc ký là bao nhiêu khi cân chính xác 20,00 mg nguyên liệu Loratadin và tiến hành thử trong cùng điều kiện như trên

Trang 54

v Tài liệu tham khảo

Xuất Bản Y Học.

Trang 55

Thank you for your attention!

Tiêu đề	Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sắc ký
Tác giả	Trương Phỳ Chớ Hiếu

Định dạng
Số trang	55
Dung lượng	1,21 MB