Tiểu luận đề tài enzyme protease

-Giáo trình “Công Nghệ Enzyme” – Đặng Thị Thu, NXB KHKT 2004 -Giáo trình “Hóa Sinh Công Nghiệp” – Lê Ngọc Tú, NXB KHKT 2002Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRƯỜNG HÓA VÀ KHOA HỌC SỰ SỐNG

TIỂU LUẬN

Đề tài: Enzyme Protease

Giáo viên hướng dẫn: Quản Lê Hà Sinh viên thực hiện: Đào Cẩm Ly

-Giáo trình “Công Nghệ Enzyme” – Đặng Thị Thu, NXB KHKT 2004 -Giáo trình “Hóa Sinh Công Nghiệp” – Lê Ngọc Tú, NXB KHKT 2002

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm,

nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…

Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống con người, nhiều loại enzyme protease được dùng để sản xuất thuốc hay các chế phẩm của chúng được dùng để mang lại lợi ích cho con người Thông qua bài tiểu luân này giúp em hiểu rõ hơn cấu trúc hóa học và chức năng của enzyme protease, cũng như các ứng dụng quan trọng của protease trong cuộc sống.

PHẦN I TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE

1.Khái niệm

Protease (còn được gọi là proteinase hay peptidase) (EC.3.4.) là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide

(-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp Trong cùng một phản ứng, các protease khác nhau có các hướng xúc tác khác nhau.

Enzyme Protease có những đặc tính:

 Được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi trường.

 Tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống.

 Có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau.

 Có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ống nghiệm)

 Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao

 Có tính chọn lọc cao

 Chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường.

Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực Đặc biệt là công nghiệp sinh học, protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease.

Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây.

2.Cấu tạo

Protease (còn được gọi là proteinase hay peptidase) là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử

thấp Trong cùng một phản ứng, các protease khác nhau có các hướng xúc tác khác nhau.

Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer.

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê…) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.

3.Phân loại

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,

subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11

4.Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật

Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau vê nhiều tính chất Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động Enzyme protease thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm sau:

P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid

Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm

Trong 4 protease kể trên, các protease – xerin và protease – thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất

của acid amin Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin

Các P-xerin có trọng lượng phân tư thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton Tuy nhiên, cũng có một số p-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp (52.000),… Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin ( vào khoảng 33.800 – 48.400).

Protease thiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton

5.Cấu trúc trung tâm hoạt động ( TTHĐ) của protease

Trong TTHĐ của protease vi sinh vật (VSV) ngoài gốc aa đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aa khác Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease VSV cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:

-TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả các cofactơ kim loại

+ Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 A0 , có thể phân biệt thành 6 phần dưới TTHĐ ( subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất Enzyme protease.

+ Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và endothia đã cho thấy phân tử các phân tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 A0 Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc asp-35 và asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy

- Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide

Mặc dù TTHĐ của các protease VSV có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng một cơ chế chung như sau:

E+S → enzyme -S →Enzyme-S + P1 →enzyme + P2

Trong đó: E: Enzyme, S: cơ chất, Enzyme-S: phức chất

enzyme-cơ chất, P1, P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 của phản ứng.

PHẦN II NGUỒN CUNG CẤP PROTEASE

Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về kinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu suất cao Hiên chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.

1.Nguồn động vật

- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có nhiều enzyme nhất.

Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin Enzyme này từ lâu đã được dùng phổ biến trong công nghệ phomat Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa Enzyme protease trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+ Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩn renin bị nhiễm pepxin ( trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi

Gần đây có nhiều nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Edothia Parasitica và Mucor Purullus.

Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá basa Dịch trích ly enzyme thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là 15.78 UI/gCKNT trong điều kiện trích ly : tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w), pH 9.5: nhiệt đọ 35 0C: thời gian trich ly 10 phút.

2 Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

3.Nguồn vi sinh vật:

Hai nguồn nguyên liệu trên không thể dùng dùng nguyên liệu trong sản xuất công nghiệp qui mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ Vì vậy, dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế trên

+ Nguồn nguyên liệu vô hạn

+ Hệ enzyme phong phú + Hoạt tính mạnh

+ Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọn giống

+ Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh + Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền

Các protease từ vi sinh vật được ứng dụng nhiều: Thường sử dụng protease của vi khuẩn và nấm sợi.

– Protease kiềm (EC.3.4.21.14) : Còn có tên thương mại là SUBTILISIN Có khoảng pH hoạt động là 7 – 11 Trong trung tâm hoạt động có serine Chế phẩm dạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1 – 6 đơn vị Anson/gram Dạng kết tinh có hoạt tính khoảng 25-30 đơn vị Anson/ Gram Ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa.

– Protease trung tính ( EC.3.4.24.4) : Protease trung tính là metalloenzym có pH hoạt động từ 6-9 Được sản xuất từ Bacillus subtilic, B thermoproteolycus và Streptomycesgriceus Chế phẩm thương mại là dạng bột có hoạt tính 0.5-2 đơn vị anson/1gam Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bia, da và protein thuỷ ngân

- Protease từ nấm sợi : Protease từ nấm sợi thuộc protease acid, kiềm và cả trung tính Ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo.

PHẦN III ỨNG DỤNG PROTEASE1 Trong công nghiệp thực phẩm

a Trong công nghệ chế biến thịt

- Trong công nghiệp thịt, có thể dùng các chế phẩm protease để làm mềm thịt.

- Chế phẩm enzyme để làm mềm thịt thường là papain hay hỗn hợp của papain với protease của vi sinh vật.

- Tùy theo tính chất thịt mà sử dung các chế phẩm thích hợp.

- Chất lượng các loại thịt được nâng cao.

- Thời gian chin của thịt rút xuống nhiều lần.

+ Tiêm dung dịch enzyme vào mô.

+ Đưa dung dịch enzyme vào máu động vật trước khi giết thịt

b Trong công nghệ chế biến sữa

- Protease có khả năng làm đông tụ sữa

- Tính chất này từ lâu được ứng dụng vào công nghiệp thực phẩm.

- Ứng dụng chính : sản xuất phomát.

- Rennin đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghệ này.

- Người ta đang cố gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay thế một phần rennin.

c Trong công nghệ sản xuất nước chấm

- Sử dụng enzym từ các nguồn tự nhiên:

+ Động vật: trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin

+ Thực vật: có một vài loại thực vật cũng có enzym protease như trong đu đủ có enzym papain, khóm có enzym bromelin

+ Vi sinh vật: trong quá trình hoạt động sống nhiều hệ enzym sinh ra từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Asp niger

- Phương pháp sử dụng