Bao cao th thiet bi

Điều đó đã được thể hiện qua các sự việc ngộ độc Salmonella nghiêm trọng và gần đây nhất là vụ việc ngày 22/11, đoàn công tác Bộ Y tế làm việc với Sở Y tế cùng các đơn vị liên quan của t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG

THỰC PHẨM BẲNG PHƯƠNG PHÁP PCR

NGUYỄN HOÀI AN

TP Thủ Đức, 10/2023

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU7 3.1 Thiết lập phản ứng PCR phát hiện Salmonella 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vụ ngộ độc thực phẩm ở trường iSchool Nha Trang 1

Hình 1.2 Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét cho thấy vi khuẩn Salmonella

PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của công nghiệp hóa, hiện đại hóa thì kèm theo đó là sự phát triển của xã hội, nhu cầu vật chất và tinh thần ngày càng cao và càng đa dạng Trong đó nhu cầu về thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu, yêu cầu về giá trị dinh dưỡng và mức độ an toàn của thực phẩm Tuy nhiên, những năm trở lại đây, vẫn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng nhiều và xảy ra trên khắp đất nước.Vệ sinh an toàn thực phẩm đã và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Có rất nhiều vi sinh vật gây độc thực phẩm, nhưng trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây độc rất nguy hiểm Điều đó đã được thể hiện qua các sự việc ngộ độc Salmonella nghiêm trọng và gần đây nhất là vụ việc ngày 22/11, đoàn công tác Bộ Y tế làm việc với Sở Y tế cùng các đơn vị liên quan của tỉnh Khánh Hòa về việc hàng trăm học sinh và nhiều giáo viên trường iSchool Nha Trang nhập viện do ngộ độc, các bệnh viện tiếp nhận 648 học sinh và giáo viên Trường iSchool Nha Trang tới thăm khám, nghi ngộ độc thực phẩm Trong đó, 1 nam sinh lớp 6 đã tử vong; 205 bệnh nhân đang điều trị và 21 trường hợp bị nặng đã dần ổn định sức khỏe.

Hình 1.1 Vụ ngộ độc thực phẩm ở trường iSchool Nha Trang

Vi khuẩn Salmonella là nguyên nhân của hàng loạt vụ ngộ độc thực phẩm quy mô lớn trong những năm qua, Salmonella thường gây ngộ độc thông qua các sản phẩm như: thịt, trứng, sữa Ngộ độc do Salmonella có thể biểu hiện từ nhẹ cho tới rất nghiêm trọng và thậm chí gây tử vong Salmonella là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn cầu, trong đó có nhiều vụ ngộ độc quy mô lớn, theo Tổ chức Y tế Thế giới.

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi

khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfide Salmonella không lên men lactose (trừ Salmonella arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và glucose Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite

Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động vật

máu nóng, và trong môi trường Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis) Các triệu chứng do Salmonella gây

ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 - 36 giờ sau khi tiêu thụ thực

phẩm nhiễm Salmonella Các triệu chứng thường kéo dài từ 2 - 7 ngày.

Salmonella có thể phân tích định tính bằng một quy trình gồm 4 bước: tăng sinh,

tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số

lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng

trưởng của Salmonella.

Với những hậu quả vô cùng nặng nề của chủng vi khuẩn này gây ra Việc phát hiện chúng có hiện diện trong thực phẩm hay không là một việc hết sức cần thiết Cho đến hiện nay, phương pháp phát hiện và định danh thông qua môi trường nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc kết hợp kiểm tra sinh hóa, miễn dịch được xem là tiêu chuẩn vàng trong

phát hiện Salmonella Tuy nhiên, phương pháp này tốn rất nhiều thời gian và có khả năng

ngoại nhiễm cao Để giảm thiểu được những hạn chế kể trên các nhà khoa học đã đưa ra

giải pháp là “ Phương pháp PCR dùng trong phát hiện Salmonella trong thực phẩm”

2

Hình 1.2 Ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử quét cho thấy vi khuẩnSalmonella (nhuộm màu đỏ) xâm nhập vào tế bào của con người

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vật liệu

- Mẫu thịt bò, thịt heo, thịt gà được lấy từ lò mổ hay các lô bày trong chợ trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế.

- Môi trường nuôi cấy tăng sinh chọn lọc.

- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR và chạy điện di.

- Cặp mồi được sử dung cho PCR là Stn101 và Stn111 có trình tự nucleotid của gene Stn, mã hóa enterotoxin của Salmonella (Theo Chopra A.K và cộng sự)

phẩm PCR

Stn 111 5’- TGCCCAAAGCAGAGAGACTTC -3’

2.2 Kĩ thuật PCR

PCR được viết tắt từ Polymerase Chain Reaction mang nghĩa là chuỗi phản ứng polymerase hay phản ứng khuếch đại gen.

PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA hoặc sản xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của một trình tự DNA nào đó từ một mẫu nhỏ ban đầu hoặc là một bản sao duy nhất Nó được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình xử lý DNA để giải trình tự PCR giúp phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của một gen để xác định các tác nhân gây bệnh trong quá trình nhiễm trùng và khi tạo ra các cấu hình DNA pháp y từ các mẫu DNA nhỏ Phương pháp PCR này được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới.

2.2.1 Thành phần PCR

Năm thành phần cốt lõi được yêu cầu để thiết lập một PCR gồm: + Mẫu DNA cần được sao chép.

+ Đoạn DNA ngắn bắt đầu phản ứng PCR, được thiết kế để liên kết với hai bên của phần DNA mà bạn muốn sao chép.

+ 4 loại nucleotide DNA (còn được gọi là dNTPs) tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích DNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1).

+ DNA polymerase chịu nhiệt enzyme : phải là men polymerase chịu được nhiệt độ Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men Taq polymerase Đây là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus.

4

+ Các loại muối cần thiết để tạo ra một môi trường thích hợp cho enzyme hoạt động thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 2 1.5mM.

2.2.2 Nguyên tắc hoạt động của kĩ thuật PCR

Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt,nghĩa là các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong

phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA Đoạn mồi (là đoạn DNA ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự DNA mẫu và DNA polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại Khi quá trình PCR diễn ra, DNA mới được tạo ra từ DNA khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử DNA tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền khuếch đại theo cấp số nhân.

2.2.3 Quy trình phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) củaphân tử, thường ở 94-95oC vòng 30

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer ) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ nỳ do động khoảng từ 40 – 60 C tùy thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 72oC giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa 2 primer được tổng hợp tọ thành chuỗi DNA Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng

DNA mẫu của lần trước Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA polymerase có thể tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc phá hủy bởi chu kỳ tiếp theo Sản phẩm ở chu kỳ thứ 2 cũng không xác định tuy nhiên , ở chu kỳ 3, đoạn DNA mong muốn được tổng hợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại.

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thiết lập phản ứng PCR phát hiện Salmonella

3.1.1 Ly trích DNA vi khuẩn

Vi khuẩn Salmonella mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng (1%

tryptone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl) ở 37 , tốc độ lắc 200rpm Dùng dịch huyền phù ℃, tốc độ lắc 200rpm Dùng dịch huyền phù vi khuẩn sau 16 giờ nuôi cấy (nuôi qua đêm) được sử dụng để ly trích plasmid theo quy trình gồm các bước sau:

Bước 1: Lấy 1000𝜇𝐿 dịch khuẩn cho vào tube 1,5 mL sau đó đem ly tâm dịch khuẩn ở tốc độ 5.000 vòng/phút trong vòng 5 phút

Bước 2: Loại bỏ dịch nổi Nhẹ nhàng úp tube lên giấy thấm để loại môi trường khỏi kết tủa Lặp lại bước 1 và 2 thêm một lần nữa

Bước 3: Thêm 100 𝜇𝐿 dung dịch I (được giữ lạnh), đem đi vortex kỹ để dồng nhất mẫu Bước 4: Thêm 200 𝜇𝐿 dung dịch II Dùng pipette để trộn đều hỗn hợp Không vortex ở bước này Giữ tube trên đá

Bước 5: Thêm 150 𝜇𝐿 dung dịch III (được giữ lạnh) Dùng pipette để trộn đều hỗn hợp Giữ tube trên đá khoảng 1 phút Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 10 phút Bước 6: Chuyển 350 𝜇𝐿 dịch nổi sang tube mới Thêm 210 𝜇𝐿 isopropanol, vortex nhẹ, để yên trong vòng 20 phút ở -20˚C Sau đó đem đi ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 10 phút để thu được kết tủa

Bước 7: Đổ dịch nổi, thêm 500 𝜇𝐿 ethanol 70o Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 3 phút Loại bỏ hết dịch xong đem phơi để cho bay ethanol

Bước 8: Thêm 50 𝜇𝐿 TE Vortex nhẹ và bảo quản ở -20˚C

Sau khi ly trích., DNA bộ gen sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% 6

trong TBE buffer 0.5X ở điện thế 100V trong 15 phút Sau đó nhuộm bằng Green loading buffer Kết quả được xem dưới đèn UV máy chụp gel MultiDoc- It.

3.1.2 Tiến hành PCR

Để tiến hành kiểm tra sự hiện diện của Salmonella bằng phương pháp PCR, các mẫu thịt được nghiền nhỏ, sau đó tiến hành nuôi tăng sinh lần 1 hoặc lần 2.

+ Nuôi tăng sinh lần 1: môi trường được sử dụng cho việc tăng sinh là TSB (Trypticase Soy Broth) ở nhiệt độ 37oC trong 16 giờ.

+ Nuôi tăng sinh lần 2: sau khi nuôi tăng sinh lần 1 thì tiến hành lấy 0,1ml canh khuẩn cho vào 10ml môi trường Salmonella enrichment broth (được dùng trong việc chọn lọc làm giàu vi khuẩn Salmonella dưới điều kiển thẩm thấu cao và độ pH thấp) rồi đem ủ ở 37oC trong 16 giờ, không lắc Lấy 1ml của mỗi canh khuẩn đem ly tâm, phần kết tủa được rửa với nước cất 5 lần Dịch tái huyền phù được giữ trong 95oC trong 15 phút sau đó đem ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút Lấy 1µl dịch nổi cho phản ứng PCR.

Chương trình cho khuếch đại với 30 chu kì và chu trình nhiệt như sau:

3.1.3 Điện di

Điện di là phương pháp sử dụng điện trường nhằm di chuyển phân tử về phía điện cực tích điện trái dấu với nó từ cực âm sang dương trên những bán thể rắn là các gel agarose hoặc polyacrylamide Dùng để tách các phân tử DNA, RNA và protein.

Chuẩn bị:

Bồn điện di có chưa dung dịch đệm, gel agarose đã chuẩn bị trước sau khi nguội, đặt lại thì nó được đặt vào bồn điện di ngập trong dung dịch đệm điện di Lược gel được tháo ra tạo nên các giếng rỗng dành để cho mẫu điện di vào

Sau đó dùng micropipet hút 1µl master mix (Loading dye và gel red) cố định trên giấy bạc Hút 5µl DNA mẫu trộn cho vào master mix trộn đều và hạn chế tạo bọt khí.

Hút 6µl cho vào giếng và đem đi điện di 7

Hình 2.2 Chu kì phản ứng PCR

Sau khi kiểm tra bằng điện di chọn 1 mẫu có kết quả tốt nhất để gửi mẫu và phân tích giải

trình tự, sử dụng phần mềm BLAST so sánh tỉ lệ tương đồng với khuẩn Salmonella đã

công bố trên ngân hàng NCBI Và chọn mẫu khuẩn có độ tương đồng cao làm mẫu đối chứng dương

Tiếp theo đó, là kiểm tra độ đặc hiệu của primer: Phản ứng PCR với một số chủng

khuẩn không phải Salmonella , so sánh kết quả với đối chứng dương Ta sẽ nhận được kết

quả là âm tính khi primer đặc hiệu

Kiểm tra độ nhạy của primer: Tiến hành đo nồng độ DNA và pha loãng mẫu DNA

Salmonella đối chứng dương với nồng độ từ 10-1 đến 10-5, rồi tiến hành phản ứng PCR

cho từng nồng độ pha loãng Sản phẩm sau đó được điện di và xem kết quả dưới tia UV.

Hình 2.3 Kết quả di

Hình 3.3 Kết quả phát hiện Salmonella ở thịt heo

Tỉ lệ ô nhiễm Salmonella ở thịt heo rất cao chiếm 55% số mẫu lấy vào buổi sáng và 71,66% số mẫu lấy vào buổi chiều Tỷ lệ ô nhiễm Salmonella ở thịt gà thấp hơn nhiều so với thịt heo vì gà được giết mổ theo dây chuyền bán công nghiệp nên điều kkieenj vệ sinh tại lò mổ tốt hơn so với các lò mổ khác Tuy nhiên, tỷ lệ này vẫn còn cao, cần quan tâm để hoàn thiện tốt hơn nữa quy trình giết mổ Tỷ lệ ở bò là thấp nhất chiếm 17,22% mẫu lấy vào buổi sáng và 33,88% mẫu lấy vào buổi chiều Theo kết quả nghiên cứu tỷ lệ ô nhiễm trên thịt của các chợ chính (Đông Ba, An Cựu, Bến Ngự) thấp hơn các chợ (chợ đường Hai Bà Trưng và chợ đường Trần Quang Khải)

Bên cạnh đó tỷ lệ ô nhiễm thịt vào buổi chiều cao hơn nhiều so với ô nhiễm thịt vào buổi sáng Điều này thể hiện điều kiện vệ sinh trong quá trình bảo quản , lưu thông thực phẩm còn nhiều bất cập, cần có những biện pháp thích hợp để bảo quản sản phẩm và bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng

3.3 Kết luận và kiến nghị

PCR là 1 phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm đơn giản nhanh có độ nhạy cao hơn so với phương pháp xét nghiệm vi khuẩn nâng cao khả năng phát hiện sự hiện diện của Salmonella trong thực phẩm.

10

Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt còn tương đối cao cần có biện pháp nâng cao điều kiện vệ sinh trong quá trình giết mổ cũng như bảo quản sản phẩm trong quá trình lưu thông.

11