Kỹ thuật hóa mô miễn dịch

Laø phöông phaùp xaùc ñònh vò trí khaùng nguyeân ñaëc hieäu hieän dieän trong moâ hoaëc teá baøo (baøo töông, maøng teá baøo, nhaân)  döïa treân phaûn öùng mieãn dòch (khaùng nguyeân – khaùng theå) keát hôïp vôùi hoùa chaát.

PGS TS HỨA THỊ NGỌC HÀ

HÓA MÔ MIỄN DỊCH

Mục tiêu

• Biết được các ứng dụng của HMMD trong chẩn đoán, điều trị và tiên luợng bệnh

HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY – IHC) LÀ GÌ?

• Là phương pháp xác định vị trí kháng nguyên đặc hiệu hiện diện trong mô hoặc tế bào (bào tương, màng tế bào, nhân)  dựa trên phản ứng miễn dịch (kháng nguyên – kháng thể) kết hợp với hóa

chất.

1 ĐẠI CƯƠNG

HÓA MÔ MIỄN DỊCH – LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

 1940s: Coons (miễn dịch hùynh quang)

Kháng nguyên

Kháng thể

Chất phát huỳnh quang

HÓA MÔ MIỄN DỊCH – LỊCH SỬ

PHÁT TRIỂN

xác định một số kháng nguyên trong tế bào

ở mô đã được xử lý thường quy tại các phòng xét nghiệm GPB.

- kết quả lưu trữ được lâu

trước

- Không cần KHV hùynh quang

Kháng nguyên (Antigens)

 từ ngoài cơ thể: protein hay

polysaccharide của v i khuẩn, độc tố, virus, flagella,

Kháng Nguyên

• từ trong cơ thể: KN gồm:

- các sợi trung gian (intermediate filaments),

• - thụ thể hormon (ER, PR, AR ),

• - các protein là sản phẩm của đột biến gen:

c-kit, p53, Her2/Neu, EGFR

•

Antigen - Epitope:

tiếp xúc với kháng thể.

thể riêng biệt.

với kháng thể (trong quy trình nhuộm

HMMD).

Kháng thể (Antibody)

 Là các protein nhận biết và kết nối với kháng nguyên đặc hiệu

 Được sản xuất từ sự đáp ứng với biểu hiện của kháng nguyên

 Mỗi kháng thể có ít nhất hai vị trí kết nối kháng nguyên

Một phân tử hình chữ Y với 4 chuỗi protein:

2 chuỗi nhẹ

2 chuỗi nặng

 Vùng thay đổi (Fab):

hai phần đầu của nhánh chữ Y, chứa vị trí kết nối kháng nguyên

Cấu trúc của kháng thể

Antibody Structure

Kháng Thể (KT)

• Kháng thể đa dòng : gây miễn dịch ở

động vật với kháng nguyên đặc hiệu

•bất lợi : (1) chứa các KT không đặc hiệu • (2) có khuynh hướng nhuộm

nền cao

• Kháng thể đơn dòng : sản xuất

phản ứng

Nguyên tắc của kỹ thuật

hóa mô miễn dịch

• Kháng nguyên

Hệ thống phát hiện

Hệ thống phát

AEC)

CÁC KỸ THUẬT MIỄN

DỊCH MEN

• 1 Miễn dịch men trực tiếp:

•Kháng nguyên (mô)

+ kháng thể thứ nhất

+ men

Kháng thể I

men

• đơn giản, nhanh, có tính đặc hiệu

ít nhạy cảm do thiếu hệ thống phóng đại dấu

CÁC KỸ THUẬT MIỄN

DỊCH MEN

• 2 Miễn dịch men gián tiếp

•Kháng nguyên (mô) + kháng thể thứ nhất + kháng thể thứ hai có gắn men đồng thời

kháng Ig loài của kháng thể thứ

Kháng nguỵên (mô)

menKháng thể II

Kháng thể I

CÁC KỸ THUẬT MIỄN

DỊCH MEN

• 3 KT men – chống men

antiperoxidase : PAP)

CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN

• 4 Cầu nối Biotin – Streptavidin

• tính nhạy cảm cao và đặc hiệu cao

hệ thống nhận biết được phóng đại lên 4 lần.

EnVisionTM+

System

Đánh giá kết quả

nhuộm

• Điều kiện:

•- Có lam chứng âm và chứng dương

•- Đối chiếu với tiêu bản nhuộm HE

•- Biết rõ vị trí kháng nguyên ở nhân, bào

tương hay màng bào tương.

Đánh giá kết quả

nhuộm

• ÂM TÍNH

KẾT QUẢ NHUỘM

DƯƠNG TÍNH (màu EAC: đỏ)

KẾT QUẢ NHUỘM

• DƯƠNG TÍNH (DAB: vàng nâu)

2 ỨNG DỤNG CỦA HMMD 2.1 Chẩn đoán

2.2 Tiên lượng 2.3 Điều trị

2.1 Ứng dụng trong CHẨN ĐOÁN

2.1.1 Xác định nguồn gốc u

• 2.1.1 Xác định nguồn gốc u, đặc biệt là ung thư di căn

Vì sao cần ?

- U hốc mũi

- Sarcom mỡ ?

- Carcinom tuyến biệt hóa kém ?

HE

Hình ảnh vi thể không đặc hiệu

Có nhiều chẩn đóan trên cùng tiêu bản

• 2.1.1 Xác định nguồn gốc u, đặc biệt là ung thư di căn

-Cách điều trị khác nhau tùy lọai ung thư

Vì sao cần ?

U chưa rõ nguồn gốc

Melanoma

(+) (+)

Sarcoâm (Vimentin +)

CD 34

Myosin Desmin

Carcinom (EMA/CK +)

đại

(+)

Tuyến tiền liệt

(+)

Gai không sừng

đáy Chẩn đoán

CK7 ++ ++ Oáng và tuyến

Gan, nội mạc,

TK nội tiết thận, chuyển tiếp,

Nhuộm

CK

Dương tính trong Âm tính trong

CK20 Đại tràng, ovary, chuyển

tiếp, dạ dày, ông mật, tụy,

Car vú, phổi, nội mạc, u không chế nhầy của buồng trứng, car tế bào nhỏ của

phổi

-Melan A

Melanôm

ác

U Carcinoid,

u có nguồn gốc thần kinh nội tiết

NSE

Rhabdomyosarcoma

Sarcom Ewing

Beänh Hodgkin

Mesothelioma

GastroIntestinal Stromal Tumor (GIST)

Vimentin

Các trường hợp minh họa

- U hoác muõi

CK

Kết luận: CHORDOMA

- Hạch trên đòn + U

trung thất

- Lymphoma ?

- Carcinom di căn hạch ?

- U khác ?

LCA NSE

Kết luận: U có nguồn gốc thần kinh nội tiết

U Amiñan

HE

Kết luận: Lymphoma

U AMIÑAN

HE CK

Kết luận: CARCINOM không biệt hóa

LCA

Kết luận: Melanoma

HMB45

U Đại tràng

Hạch góc hàm P 4 x 5 cm, dính vào mô sâu

CEA (-): tuyến bình thường

CEA (+): tuyến ung thư

Ứng dụng của HMMD trong chẩn đóan

tế bào vỏ thượng thận

Ứng dụng HMMD trong

chẩn đoán

•bieåu moâ tuyeán

• KN Lewis (Le x và Le y )

Ứng dụng HMMD trong

chẩn đoán

Ứng dụng HMMD trong

chẩn đoán

p63 (+) trong tuyến tiền liệt bình thường (hình trên, phải)

PIN của tuyến tiền liệt

Ứng dụng HMMD trong

chẩn đoán

– Vi khuẩn: Helicobacter pylori, Tropheryma

whipplei, …

– Virus: HBV, HCV, HPV, Adenovirus,

Parvovirus, Cytomegalovirus, virus Dengue, Virus Epstein-Barr, virus Herpes simplex, HPV, HIV

– Nhiễm nấm – Protozoa

– ….

2.1.3 Xác định tác nhân nhiễm khuẩn

Ứng dụng HMMD trong

chẩn đoán

Tế bào bị nhiễm

Cytomegalovirus

2.2 Ứng dụng trong TIÊN LƯỢNG

ung thư

• Dùng kháng thể chống màng đáy:

• collagen typ IV, laminin

2.2.1 Xác định carcinôm vi xâm nhập

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

•còn

nguyên

Mô lành tính

bị phá hủy hoàn toàn

Carcinôm vi xâm nhập

• Laminin: protein chính của màng đáy

mô vú

•màng đáy + tế bào cơ biểu

mô

kháng thể chống actin

mô tuyến tiền liệt

tế bào đáy:

CK trọng lượng

phân tử cao

tế bào lòng ống :

CK trọng lượng phân tử thấp.

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

Xâm nhập mạch lymphô: Nhuộm D2-40 thấy rõ mạch lymphô bên trong có tế bào ung thư, dễ phân biệt với artifact do co rút

mô đệm trên tiêu bản nhuộm HE (×200)

2.2.2 Xác định carcinôm di căn “thầm

lặng”

(vi di căn)

Xét nghiệm giải phẫu bệnh thường quy

+ không phát hiện được 8 – 30% ung thư vú di

căn đến hạch

+ không phát hiện các ổ di căn nhỏ chỉ 3 tb

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

Vi di căn hạch , một đám tế bào ung thư với ít tế bào trong hạch khó phát hiện trên tiêu bản HE, nhưng dễ nhận biết trên tiêu bản nhuộm hóa mô

Pan CK

•2.2.3 Họat động phân bào (Ki67, PCNA)

Dương tính ở pha S

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

 Gen Ki-67 nằm trên nhánh dài của nhiễm

sắc thể số 10 (10q25).

 PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen),

protein được tìm thấy trong nhân tế bào

trong pha tổng hợp DNA của chu trình tế

bào.

 Dùng để phân độ mô học các lọai ung thư

khác nhau

 Có giá trị trong chẩn đóan và tiên lượng

 Tỷ lệ Ki67 và PCNA dương tính trong tế bào

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

Cách tính điểm Ki-67, PCNA

• Định tính dựa vào:

– Tỉ lệ % nhân tế bào bắt màu

– Đậm độ bắt màu

• Kết luận:

– Dương tính: bắt màu > 20%

AÂm tính Döông tính

Vi theå: bieåu hieän cuûa Ki-67, PCNA

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

p53

• p53 (protein 53) - một protein đè nén u (

tumor suppressor), được mã hóa bởi gen TP53

– rất quan trọng trong sinh vật đa bào,

– điều hòa chu trình tế bào

– có chức năng đè nén u

– và như vậy sẽ tránh được ung thư.

– Tên gọi p53 do có trọng lượng phân tử 53 kilodalton

Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng

• p53: gen đè nén u, đảm nhận

nhiều chức năng, đặc biệt là

chận tiến trình phân bào

• Đột biến gen p53 : tạo ra những phân tử protein không có chức

năng, tích tụ trong nhân

• p53 tích tụ càng nhiều tiên lượng càng xấu

Cách tính điểm p53

• Định tính dựa vào:

– Tỉ lệ % nhân tế bào bắt màu

– Đậm độ bắt màu

0: không hoặc <10 % bắt màu

1(+): 10% > bắt màu nhạt

2(+): bắt màu trung bình >10%

3(+): bắt màu đậm >10%

Vi theå: bieåu hieän cuûa p53

2.3.1 Dự đoán đáp ứng điều trị với hormon liệu pháp

Xác định thụ thể Estrogen, Progesteron ở ung thư vú

• liên quan đến tiên lượng bệnh nhân

• độ mô học

• giai đoạn bệnh

• U biệt hóa cao, grad thấp:

• ER, PR dương tính

•

• đáp ứng tốt với hormon liệu pháp

Ứng dụng của HMMD trong điều trị

2.3.2 Liệu pháp nhắm trúng đích (targeted therapy)

–Gen sinh ung Her-2/neu

Tỷ lệ dương tính cao

 tiên lượng xấu

Điều trị Herceptin

Ứng dụng của HMMD trong điều trị

•Các phân tử nhỏ

Imatinib mesylate

(Gleevec)

dermatofibrosarcoma protuberans

•Điều trị kháng thể đơn dòng

non-small cell lung cancer Bevacizumab

(Avastin)

breast cancer, non-small cell lung cancer,

sarcoma

KẾT LUẬN

* Kỹ thuật hiện đại, khách quan

* Giúp xác định nguồn gốc mô, chẩn đoán chính xác

loại u,  điều trị tốt các loại ung thư

* Giúp tiên lượng và theo dõi điều trị ung thư