Xác định kiểu gene virus hpv (human papilloma virus) trên các bệnh nhân đến khám tại bệnh viện đại học y thái bình bằng phương pháp pcr reverse dot blot và multiplex realtime pcr

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn “Xác định kiểu gene virus HPV human papilloma virus trên các bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Đại học y Thái Bình bằng phương pháp PCR Reverse do

–––––––––––––––––––––––––

ĐINH THẾ HÙNG

XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRUS HPV (HUMAN

PAPILLOMA VIRUS) TRÊN CÁC BỆNH NHÂN ĐẾN

KHÁM TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR REVERSE DOT BLOT VÀ

MULTIPLEX REALTIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

–––––––––––––––––––––––––

ĐINH THẾ HÙNG

XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRUS HPV (HUMAN

PAPILLOMA VIRUS) TRÊN CÁC BỆNH NHÂN ĐẾN

KHÁM TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR REVERSE DOT BLOT VÀ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn “Xác định kiểu gene virus HPV (human

papilloma virus) trên các bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Đại học y Thái

Bình bằng phương pháp PCR Reverse dot blot và Multiplex realtime PCR” là công trình nghiên cứu của tác giả, với sự hướng dẫn tận tình của TS Phan Ngọc Quang và PGS TS Nguyễn Phú Hùng Công trình được tác giả nghiên cứu và hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên từ năm 2022 đến năm 2023

Các tài liệu tham khảo, các số liệu thống kê phục vụ mục đích nghiên cứu công trình này được sử dụng đúng quy định, không vi phạm quy chế bảo mật của Nhà nước

Trong quá trình nghiên cứu, tác giả có sử dụng một số kết quả của các tác giả trong nước và ngoài nước, được thể hiện ở phần "Tài liệu tham khảo" Kết quả nghiên cứu của Luận văn này chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác ngoài các công trình nghiên cứu của tác giả Tác giả xin cam đoan những vấn đề nêu trên là hoàn toàn đúng sự thật Nếu sai, tác giả xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật

Tác giả

Đinh Thế Hùng

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng – Công nghệ Sinh học là một công trình quan trọng đòi hỏi sự nỗ lực lớn của em và được sự giúp đỡ tận tình, động viên, khích lệ đến từ nhiều cá nhân, đoàn thể

Trước hết, Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, Các Quý Thầy Cô trong Khoa Công nghệ Sinh học đã giúp em trang

bị tri thức, tạo môi trường điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình em học tập và thực hiện luận văn

Xin cảm ơn Lãnh đạo, các Cán bộ Trung tâm Dịch vụ KHKT Y Dược – Trường Đại học Y Dược Thái Bình, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho

em thực hiện cho đề tài luận văn này

Em xin cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái Bình đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá học này

Với sự kính trọng sâu sắc, em xin được bày tỏ lời cảm ơn tới 2 thầy hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Phú Hùng, TS Phan Ngọc Quang đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Em cũng xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè

đã động viên, hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Human Papillomavirus (HPV) 3

1.1.1 Cấu tạo của HPV 3

1.1.2 Bộ gene 4

1.1.3 Phân type HPV 9

1.1.4 Chu kỳ sống của HPV 10

1.2 Ung thư cổ tử cung do HPV ở người 12

1.2.1 Cơ chế gây ung thư của Human Papilloma virus 12

1.2.2 HPV và Ung thư cổ tử cung 13

1.2.3 Ung thư cổ tử cung 14

1.2.4 Dịch tễ học HPV trên thế giới và Việt Nam 16

1.3 Các phương pháp phát hiện HPV 18

1.3.1 Phương pháp lai phân tử 18

1.3.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20

1.3.3 Phương pháp real-time PCR 23

1.3.4 Phương pháp DNA microarray (Phương pháp DNA chip) 25

1.3.5 Phương pháp giải trình tự gene trên máy tự động 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 28

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm 30

2.3.2 Xử lý mẫu dịch phết CTC 31

2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA bằng cột silica 31

2.3.4 Phương pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA 32

2.3.5 Phương pháp Multiplex real-time PCR sử dụng Taqman probe 33

2.3.6 Phương pháp lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) 34

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

2.5 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 36

3.1 Tình trạng nhiễm HPV ở phụ nữ viêm cổ tử cung 36

3.1.1 Phân tích kết quả 37

3.1.2 Kết quả phát hiện HPV-DNA và tỷ lệ nhiễm HPV 38

3.2 Kết quả xác định type (genotype) virus HPV 39

3.2.1 Phương pháp Multiplex real-time PCR sử dụng Taqman probe 39

3.2.2 Phương pháp lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) 43

3.3 So sánh kết quả xác định genotype bằng 2 phương pháp Multiplex Real-time PCR và RBD 53

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 AGC Atypeical Grandular Cells Tế bào tuyến không điển hình

2 ASCUS Atypeical Squamous cell of

5 DNA Deoxyribonucleic Acide

6 HPV Human Papilloma virus

7 HSIL High-grade Squamous

Nguy cơ nhiễm virus HPV thấp

10 LSIL Low-grade Squamous

Intraepithelial Lesion

Tổn thương biểu mô lát mức thấp

11 ORF Open reading frame Khung đọc mở

12 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

16 URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa thượng nguồn

19 VLPs Virus like particle Hạt virus giả

20 RDB Reverse Dot Blot Phương pháp lai điểm ngược

21 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu trúc L1, L2 của Human Papilloma virus 3

Hình 1.2: Cấu trúc của bộ gene HPV mạch thẳng và mạch vòng 9

Hình 1.3: Cơ chế gây ung thư của HPV 13

Hình 1.4: Sự phát triển và lây nhiễm HPV trên tế bào CTC 14

Hình 3.1: Kết quả phát hiện mẫu dương tính với HPV 37

Hình 3.2: Kết quả phát hiện mẫu có type HPV-DNA dương tính bằng phương pháp Multiplex real-time PCR 40

Hình 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm genotype HPV 41

Hình 3.4: Vị trí các genotype HPV trên màng lai (trái) và kết quả đồng nhiễm type HPV (16;18;39;56;11) trên mẫu (phải) 43

Hình 3.5: Vị trí các genotype HPV trên màng lai (trái) và kết quả đồng nhiễm type HPV (18;11) trên mẫu (phải) 44

Hình 3.6: Vị trí các genotype HPV trên màng lai (trái) và kết quả đồng nhiễm type HPV (39;58;11) trên mẫu (phải) 44

Hình 3.7 Các genotype HPV phổ biến ở phụ nữ viêm CTC do HPV 46

Hình 3.8 Tỷ lệ đồng nhiễm genotype HPV 47

Hình 3.9 Cơ cấu nhiễm HPV theo nguy cơ gây ung thư 49

Hình 3.10 Cơ cấu nhiễm HPV theo nhóm tuổi ở các trường hợp dương tính 50 Hình 3.11 Tần suất xuất hiện của một số HR-HPV phổ biến trong số HR-HPV 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm HPV (n=477) 38

Bảng 3.2 Kết quả định type bằng kỹ thuật Multiplex real-time PCR 40

Bảng 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV theo nhóm tuổi 41

Bảng 3.4 Sự phân bố các genotype HPV theo nhóm tuổi 42

Bảng 3.5 Tần suất nhiễm các genotype HPV 45

Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các type HPV 47

Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và và đồng nhiễm ở các mẫu dương tính phân bố theo nhóm tuổi 48

Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm HPV và các type đơn thuần và đồng nhiễm theo nhóm tuổi 50

Bảng3.9 So sánh kết quả xác định genotype của 2 phương pháp Multiplex Real time PCR và RBD trên các mẫu HPV dương tính (n=79) 53

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ung thư cổ tử cung(UTCTC) là loại ung thư phổ biến thứ hai trong các loại ung thư ở phụ nữ Năm 2018, ước tính có khoảng 570.000 trường hợp mắc mới và 311.000 ca tử vong trên toàn thế giới Trong số này, 85% ghi nhận được ở các nước có thu nhập thấp và trung bình Ung thư cổ tử cung đang giảm dần ở các nước phát triển, nơi có các chương trình kiểm soát hiệu quả Tuy nhiên, ung thư cổ tử cung đang gia tăng ở các nước không có chương trình kiểm soát hoặc chương trình kiểm soát không hiệu quả [21] Ung thư cổ tử cung là ung thư phát sinh ở cổ tử cung, nơi kết nối tử cung và

âm đạo Hầu hết tất cả các trường hợp ung thư cổ tử cung (99%) đều có liên quan đến nhiễm Human papilloma virus (HPV), một loại virus phổ biến lây truyền qua đường tình dục HPV được định type (genotype) dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA của virus Đến nay các nhà khoa học đã xác định được trên 100 type HPV khác nhau trong đó hơn 80 type đã được giải trình tự toàn

bộ hệ gene và các type còn lại cũng đã được giải mã một phần Dựa trên khả năng gây ra các tổn thương mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thư cổ tử cung, HPV được chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV-6, -18, -31, -45, -33, -35, -39, -51, -52, -56, -58, -

66, -68, -70 trong đó HPV-16, -18 chiếm tỷ lệ cao nhất [1] Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương nghiêm trọng và phát triển thành ung thư cổ tử cung Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các type HPV-1, -2, -6, -8, -9, -11, -42, -43, -44, -48, -49, -50, -64 Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng sùi mào gà sinh dục (HPV-6, -11), mụn cóc ở chân (HPV-1), mụn cơm ở tay (HPV-2) và các dạng viêm nhiễm khác Tuy nhiên, cách phòng ngừa nhiễm HPV hiệu quả nhất là tiêm ngừa vacxin Với những tiến bộ của y khoa hiện đại, ung thư cổ

tử cung có thể được chữa khỏi nếu bệnh được phát hiện sớm Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thư cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus này cũng có vai trò rất quan trọng Trên cơ sở các kết quả thu được từ những đề

tài nghiên cứu về HPV trước tôi thực hiện đề tài “Xác định kiểu gene virus

HPV (Human papilloma virus) trên các bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Đại

học Y Thái Bình bằng phương pháp PCR Reverse Dot Blot và Multiplex

Real-time PCR”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định kiểu gene virus HPV ở phụ nữ đến khám tại Bệnh viện trường Đại học Y Thái Bình bằng phương pháp PCR Reverse Dot Blot và Multiplex Realtime PCR

3 Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu và phát hiện tình trạng nhiễm HPV ở nhóm phụ nữ được lựa chọn bằng kỹ thuật Realtime-PCR

 Xác định các genotype HPV ở những trường hợp nhiễm virus này

bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot

 Xác định các genotype HPV bằng kỹ thuật Multiplex PCR

Realtime-CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Human Papillomavirus (HPV)

1.1.1 Cấu tạo của HPV

Human Papilloma Virus (HPV) là nhóm virus có kích thước nhỏ, thuộc

họ Papovaviridae HPV là loại Papillomavirus gây tổn thương biểu mô da và niêm mạc của người, loại virus này lây lan qua con đường tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt qua quan hệ tình dục [22]

HPV là virus không vỏ, đối xứng xoắn ốc có đường kính 52-55 nm Vỏ gồm 72 đơn vị capsomer Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với protein L2 Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa

Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus Protein capsid phụ (L2) chiếm khoảng 20% Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ được gọi là Virion giả hay Pseudovirion [24]

Hình 1.1: Cấu trúc L1, L2 của Human Papilloma virus

(Nguồn ảnh: http://www.genesium.ro/proceduri/depistare-si-tipizare-hpv.html)

1.1.2 Bộ gene

HPV có vật liệu di truyền là DNA, một mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-DNA) Bộ gene của virus chiếm khoảng 12% trọng lượng của hạt virus, chiều dài từ 7800 đến 8000 cặp base (bp) trong đó guanosine và cytosine chiếm 42% DNA của virus liên kết với histone của tế bào chủ tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like complex) Cấu trúc bộ gene nhóm Papillomavirus giống nhau

ở các loài vật chủ, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên một chuỗi DNA Điều này có nghĩa là tất cả các gene của virus nằm trên một mạch DNA và quá trình phiên mã xảy ra trên một mạch duy nhất Bộ gene của HPV có 10 khung đọc mở ORF được chia làm hai loại là khung đọc mở sớm và khung đọc mở muộn tùy theo vị trí của ORF trong bộ gene

Bộ gene của HPV được chia làm ba vùng:

1 Vùng điều hòa thượng nguồn URR (Upstream Regulatory Region)

hay còn được gọi là vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region), chứa DNA không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép DNA và quá trình phiên mã Đây là vùng biến động nhất, chiếm khoảng 10% chiều dài của

bộ gene, tương đương 800 đến 1000 bp tùy theo từng genotype khác nhau Trình tự vùng URR bao gồm:

 Trình tự tăng cường: là nơi gắn của các nhân tố phiên mã như

AP-1, NFAP-1, otc AP-1, TEFAP-1, TEF2, YY1…

 Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu cho quá trình phiên mã tổng hợp RNA (P97 ở HPV-16 và P105 ở HPV-18)

 Điểm khởi đầu sao chép ORI, các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gene câm (Silencing gene)

2 Vùng gene sớm (Early region): Gồm 6 gene, ký hiệu là E1, E2, E4,

E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF Sản phẩm của vùng gene này là các

protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên của DNA virus, gây hiện tƣợng tăng sinh tế bào và gây biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử [27]

 Gene E1

HPV là virus sử dụng hoàn toàn các thành phần tế bào chủ để sao chép DNA Gene E1 là một trong hai vùng gene bảo tồn nhất của HPV (cùng với L1) mã hóa các protein chức năng có vai trò cần thiết cho quá trình sao chép DNA và plasmid Gene E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gene của virus duỗi ra trong quá trình sao chép Hoạt động tháo xoắn của gene E1 không phụ thuộc ATP

Tại cơ thể sống, gene E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên của virus Gene E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1 Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gene E1 điều chỉnh Trong quá trình sao chép virus, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gene E1 nhƣ DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì gene E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này

 Gene E2

Ngoài chức năng trong sao chép DNA của virus, gene E2 còn đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phiên mã cũng nhƣ trong quá trình giải mã và duy trì chuỗi gene virus ở ngoài nhiễm sắc thể Chức năng điều hòa giải mã của gene E2 đƣợc thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gene của virus

có ái lực với gene E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của gene E2 trong quá trình giải mã

Ở chuỗi gene của HPV nhóm "nguy cơ cao", gene E2 có khả năng ức chế quá trình sao chép từ yếu tố thúc đẩy bộc lộ các gene sớm của virus, do

đó khi gene HPV nhóm "nguy cơ cao" xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủ sẽ làm tăng khả năng bộc lộ gene gây ung thƣ E6 và E7

 Gene E5

Gene E5 mã hóa cho sản phẩm là protein E5, một protein chuỗi đôi kỵ nước, kích thước nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lưới nguyên sinh chất của tế bào, cần thiết cho quá trình xâm nhập và tồn tại của virus trong tế bào chủ Protein E5 là yếu tố tác động ngay trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, tạo ra các phức hợp với các thụ thể của yếu tố kích thích tăng trưởng

và biệt hóa tế bào đồng thời giúp cho virus lẩn trốn đáp ứng miễn dịch của chủ thể Mặt khác, protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào khi có sự sai hỏng do chính virus gây ra Khả năng của E5 gây nên sự biến đổi của tế bào do gene E5 có khả năng hoạt hóa receptor của yếu tố phát triển và ức chế ATPase không bào

 Gene E6

Gene E6 mã hóa cho protein E6, gồm khoảng 150 acid amin hình thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm (Zn) điều hòa, mã hóa cho khung đọc mở ORF đầu tiên trong chuỗi gene của HPV và là một trong các protein gây ung thư chính của HPV Ba chức năng chính của gene E6 cũng là ba chức năng rất

nguy hiểm đối với tế bào vật chủ: (1) Protein E6 của HPV nhóm “nguy cơ cao” liên kết hoặc không liên kết với protein E7 gây kích thích tế bào chủ phân chia mạnh mẽ và sự phân chia này là mãi mãi, gây bất tử hóa tế bào Protein E6 có khả năng gây quá sản bằng cách ức chế chu kỳ nghỉ của vòng tế bào do sự phá hủy DNA và gây thúc đẩy sự tiến triển của tế bào Khả năng gây ung thư của E6 được điều hòa bởi khả năng hoạt động như giá đỡ và điều hòa tương tác protein với protein Một số tương tác protein mà được mã hóa trên chuỗi E6 gồm: p53, protein liên quan đến E6 (E6AP), protein gắn với E6 (E6BP), c-myc, p300/CBP, paxillin, protein PDZ, yếu tố điều hòa interferon 3

và đồng phần của Bcl-2 (Bak) (2) Tương tác với p53 thông qua sự liên kết giữa E6 với E6AP bằng liên kết ligand, tạo ra thoái triển của p53 (yếu tố giải

mã và ức chế ung thư, có vai trò điều hòa chính hoạt động ức chế tổng hợp DNA thông qua chu kỳ nghỉ của vòng tế bào) Bình thường, khi có tín hiệu phá hủy tế bào hoặc có sự nhân lên sai của DNA, gene ức chế ung thư p53 được hoạt hóa sẽ chuyển vòng tế bào sang chu kỳ nghỉ hoặc gây chết tế bào theo chương trình (apotosis) thông qua hoạt động giải mã của gene Hơn nữa, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein được bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho

sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào (3) Liên kết với gene ras trong quá trình bất tử hóa tế bào và kích thích sự phát triển của NIH 3T3, đồng thời hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus [29]

 Gene E7

Protein E7 được mã hóa từ gene E7 gồm 98 acid amin, tuy nhỏ hơn protein E6 nhưng cũng có vai trò không kém phần quan trọng trong cơ chế gây ung thư ở tế bào chủ Hoạt động chức năng của E7 trong cơ chế gây ung thư do (1) protein E7 có vùng bảo tồn đầu tận cùng N và có domain gắn Kẽm

ở đầu C giúp liên kết chặt chẽ hơn với E6, hỗ trợ nhau trong cơ chế gây bất tử hóa tế bào; (2) E7 chứa mồi gắn protein pocket (LXCXE) giúp E7 gắn kết với

các gene ức chế khối u (như pRb) hoặc gắn với 2 protein pocket khác là p107

và p130 làm giải phóng một số lượng lớn yếu tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào

Protein E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” cũng như của nhóm “nguy cơ thấp” đều có khả năng gắn kết với protein pocket Tuy nhiên, sự ưu tiên gắn kết của protein E7 với protein pocket khác nhau giữa hai nhóm HPV Ái lực liên kết này ở những type “nguy cơ cao” cao gấp 10 lần so với ở những type

“nguy cơ thấp” Thông thường, pRb bị thủy phân sớm ở chu kỳ của tế bào Ở giai đoạn phosphorin hóa, pRb ngắn với yếu tố sao chép E2F/DP (phức hợp hoạt hóa sao chép điều khiển sự bộc lộ các gene ở giai đoạn S) gây ức chế quá trình hoạt hóa phức hợp sao chép Sang giai đoạn G1 muộn, pRb được phosphorine hóa bởi phức hợp cyclin/cdk, giải phóng phức hợp E2E/DP do

đó các gene thúc đẩy giai đoạn S được hoạt hóa và giải mã Trong trường hợp nhiễm HPV, sự bộc lộ gene E7 không cần quá trình phosphorine hóa pRb để hoạt hóa phức hợp sao chép E2F/DP Sự kết hợp của E7 với pRb đã được khử phosphorin dẫn đến giải phóng phức hợp E2F/DP từ pRb và hoạt hóa tiếp theo của phức hợp E2F Do đó, sự bất hoạt E7 của pRb tạo điều kiện cho HPV có khả năng vượt quả sự ức chế pRb trong chu kỳ tế bào [28], [29]

3 Vùng gene muộn (Late region): Gồm 2 gene tổng hợp protein L1 và

L2, là những protein cấu trúc capsid của virus Đây là vùng gene mã hóa muộn hơn, do đó vùng chứa gene L1 và gene L2 còn được gọi là vùng sao chép muộn [27]

L1 và L2 là hai vùng gene cấu trúc còn gọi là vùng gene mã hóa muộn cho protein vỏ capsid chính và phụ Trên kính hiển vi điện tử, vỏ capsid của HPV chứa 72 capsomere có cấu trúc vòng bảy cạnh trên hàng rào dạng lưới

10 icosahedral T=7 với kích thước đường kính khoảng 55nm Gene L1 là vùng bảo tồn nhất của virus và được dùng để phát hiện cũng như trong phân loại Papillomavirus Thành phần của vỏ capsid virus gồm protein capsid chính

L1, và capsid phụ L2 Khi chỉ gene L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả virus hoặc phân tử giống (Virus like particles, VLPs), các thành phần này khó phân biệt với virus thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất virus, sản xuất vắc xin Nếu L2 cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhƣng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớp ngoài cùng của tế bào sừng Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhƣng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm

Hình 1.2: Cấu trúc của bộ gene HPV mạch thẳng và mạch vòng

loại đến mức type phụ và những dạng dễ thay đổi Được xếp vào type phụ khi

bộ gene của chúng khác nhau 2-10% trong cùng 1 type đã biết Nếu sự khác nhau chiếm 1-2% nằm trong vùng mã hóa, hoặc 5% trong vùng không mã hóa thì được xem là dạng dễ thay đổi

Dựa trên khả năng gây ra các tổn thương mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thư cổ tử cung, HPV được chia làm hai nhóm:

Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV-16, - 18, -

31, - 45, - 33, - 35, - 39, - 51, - 52, - 56, - 58, - 66, - 68, -70 Trong đó

HPV-16, -18 chiếm tỷ lệ cao nhất Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương nghiêm trọng và phát triển thành ung thư cổ tử cung Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các type HPV-1, - 2, - 6,

- 8, - 9, - 11, - 42, - 43, - 44, - 48, - 49, - 50, - 64 phổ biến nhất là HPV-6, -

11 Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc sinh dục (HPV-6,- 11), sùi mào gà ở chân (HPV-1), sùi mào gà ở tay (HPV-2) và các dạng viêm nhiễm khác Và có một nhóm chưa xác định được nguy cơ (Unknown-risk type): Gồm đa số các genotype HPV chưa xác định được khả năng gây ung thư như: HPV-2, - 3, - 7, -10, - 13, - 27, - 28, - 29, -

30, - 32, - 34, - 55, - 57, - 62, - 67, - 69, - 71, - 74… Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của chúng là do vùng gene E6, E7 Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của người và không có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ [34]

1.1.4 Chu kỳ sống của HPV

Chu kỳ sống của HPV liên quan chặt chẽ với tế bào biểu mô vật chủ, được chia làm 4 giai đoạn:

lớp đáy ở những vị trí dễ tổn thương thông qua receptor integrin Ở lớp tế

bào này, số lượng virus thấp và tồn tại ở dạng episomal tách rời với gene của tế bào vật chủ

 Giai đoạn tiềm tàng: DNA HPV có thể tồn tại rất lâu với số lượng ít

và không sao chép, không tạo các hạt virus Các gene E1, E2 rất cần thiết cho

sự nhân lên của virus ở giai đoạn này

 Giai đoạn nhân bản mạnh: Cùng với quá trình nhân lên và biệt hóa

từ lớp tế bào đáy lên các tế bào ở lớp trên, các tế bào sừng bị nhiễm HPV mới hình thành cũng di chuyển lên các lớp trên, các gene muộn HPV được bộc lộ

và khởi động giai đoạn tăng sinh của virus, DNA HPV được nhân lên trong tế bào chủ Chu kỳ nhân lên của virus không kèm theo hiện tượng chết hoặc phân hủy tế bào do vậy không gây hiện tượng viêm và sản xuất các cytokine tiền viêm Các gene E5, E6, E7 tác động hỗ trợ cho hoạt động nhân lên của virus đồng thời tăng hoạt động tổng hợp DNA của tế bào chủ và ngăn hiện tượng appotosis

 Giai đoạn giải phóng: Ở lớp tế bào sừng ngoài cùng, gene L1 và L2

có vai trò hình thành vỏ capsid cho DNA của virus Các hạt virus mới được hình thành giải phóng ra bề mặt tế bào sừng Quá trình biểu hiện gene và quá trình phát triển nhân lên của virus xảy ra trong nhân tế bào chủ, liên quan chặt chẽ với quá trình tăng sinh của tế bào chủ ở lớp tế bào đáy mà không có giai đoạn HPV di chuyển trong máu Tuy nhiên, HPV DNA vẫn có thể được tìm thấy trong các tế bào bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi, trong các tế bào di căn trên các bệnh nhân ung thư do HPV, các trường hợp đồng nhiễm HIV Điều này được giải thích do trong quá trình biểu hiện gene và trong quá trình nhân nhân bản mạnh của virus đã xảy ra hiện tượng đứt gãy đoạn gene E2 và gene E6 [13]

Có nhiều cơ chế giải thích sự lẩn trốn của HPV khỏi đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối, gây nhiễm dai dẳng HPV dẫn đến sự biến đổi tế bào E6 và E7 của HPV nhóm “nguy cơ cao” làm cơ thể suy giảm khả năng sản xuất interferon, cytokine, ức chế đáp ứng miễn dịch tự nhiên tiêu diệt virus và điều hòa miễn dịch E6 có khả năng gắn vào yếu tố 3 điều hòa interferon (IRF-3) gây ức chế chức năng hoạt hóa của yếu tố này Đồng thời, gene E7 phản ứng với IRF-1 gây ức chế sự sao chép đối với yếu tố thúc đẩy IFN-1

Mặc dù, HPV có khả năng lẩn trốn khỏi cơ chế đáp ứng bảo vệ của cơ thể vật chủ nhưng hầu hết các trường hợp nhiễm HPV diễn ra ngắn và tổn thương có thể tự hết trong vòng 1 năm hoặc dưới tác động của đáp ứng của hệ miễn dịch cơ thể Khoảng 91% HPV bị loại bỏ tự nhiên trong năm đầu sau nhiễm và 70% xảy ra trong năm thứ hai Tuy nhiên, một tỷ lệ nhỏ HPV có thể tồn tại dai dẳng ở lớp tế bào đáy và là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi tế bào

1.2 Ung thư cổ tử cung do HPV ở người

1.2.1 Cơ chế gây ung thư của Human Papilloma virus

Human Papilloma virus (HPV) có DNA gồm 8000 cặp base Hai chuỗi,

phân tử DNA cuộn lại trong một vỏ protein bao gồm 2 phân tử L1 và L2 Bộ

mã di truyền của HPV ngoài phần mã để tạo L1, L2 còn có phần mã hóa của

6 loại protein sớm từ E1 đến E7 cần thiết cho sự nhân đôi của DNA và sự thành lập hạt thể virion mới trong tế bào bị nhiễm HPV Các type gây ung thư của HPV tác động vào gene của tế bào chủ vốn làm nhiệm vụ ức chế quá trình phát triển của tế bào (p53 và RB); do đó sẽ gây ra sự phát triển hỗn loạn của nhóm tế bào bị nhiễm

Diễn tiến tự nhiên của HPV là khả năng lui bệnh đến khỏi hẳn, tuy nhiên, nhóm nguy cơ cao có thể gây tổn thương về mô học của CTC để hình

thành ung thư HPV tác động vào tế bào biểu mô vảy không sừng hóa của CTC, với chức năng che chở, bảo vệ, sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó được bong ra ngoài HPV sát nhập vào gene tế bào ký chủ, vùng gene E6, E7 điều khiển tổng hợp protein E6, E7 theo chiều hướng bất thường làm kích hoạt các chất sinh ung thư, bất hoại gene ức chế tạo khối u Các protein này làm vô hiệu hóa chức năng của protein điều khiển sự tăng trưởng tế bào làm tế bào tăng sinh liên tục và bất thường nên sinh ung thư Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô vảy, có khả năng lan rộng khỏi màng đáy vào lớp sâu hơn biểu mô vảy và hình thành ung thư CTC giai đoạn xâm lấn [5], [9]

Hình 1.3: Cơ chế gây ung thư của HPV

(Nguồn ảnh: https://dailyinfo.vn/su-nguy-hiem-cua-ung-thu-co-tu-cung/)

1.2.2 HPV và Ung thư cổ tử cung

Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng HPV liên quan đến tổn thương

cổ tử cung cũng như Ung thư sinh dục nữ Tỉ lệ dương tính HPV tại các mô tổn thương cổ tử cung tăng dần theo mức độ tổn thương tế bào, từ <10% trong cộng đồng tới 20 - 30% ở đối tượng gái mại dâm và dao động từ 80 - 98% ở

những bệnh nhân UTCTC Crosbie đã mô tả chi tiết các giai đoạn tổn thương sinh dục nữ liên quan đến HPV Những tổn thương tới lớp biểu mô đáy tạo điều kiện thuận lợi cho HPV xâm nhập và nhân lên ở lớp tế bào đáy Các tế bào mang hạt virus có các hình thái tổn thương khác nhau HPV biến nạp vào nhiễm sắc thể chủ, tồn tại như thể nhẫn, phân chia cùng với sự phân bào của

tế bào chủ Các hình thái tổn thương từ mức độ nhẹ như loạn sản từ 1/3 dưới lớp biểu mô (CIN1) cho tới 1/3 trên (CIN2), cho tới mức độ nặng khi biến đổi hình thái nhân và tế bào của toàn bộ tầng biểu mô (CIN 3), sự quá sản dẫn tới phá vỡ màng đáy xâm (ISC) xâm nhiễm xuống lớp dưới biểu mô HPV thoát khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch sẽ tiếp tục tồn tại dai dẳng trong cơ thể chủ gây nên bệnh lý ung thư [40]

Hình 1.4: Sự phát triển và lây nhiễm HPV trên tế bào CTC

(Nguồn ảnh: http://sclchd.com/detail-1343.html)

1.2.3 Ung thư cổ tử cung

1.2.3.1 Lịch sử phân loại tổn thương cổ tử cung:

Đầu thế kỷ 19, William mô tả biến đổi mô bệnh học ở tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung dạng xâm lấn mà sau này gọi là ung thư tại chỗ Năm

1956, Reagan và Hamoic đưa ra khái niệm loạn sản (dysplasia) để ám chỉ các

tế bào biểu mô không điển hình kém biệt hóa Năm 1987, Richart với khái

niệm CIN (cervical intraepithelial neoplasia) đã mô tả tổn thương từ dạng loạn sản nhẹ tới ung thư tại chỗ CIN1 (loạn sản vừa) - lớp tế bào đáy (màng cơ bản) tăng sinh 1/3 dưới tầng biểu mô bào tương không rộng, không có hốc sáng, nhân to nhỏ không đều CIN2 (loạn sản trung bình) - lớp tế bào đáy và cầu sừng xuất hiện ở 2/3 dưới tầng biểu mô, nhân to, tăng sắc, bào tương có các hốc sáng CIN3 (loạn sản nặng) - cầu sừng cà lớp đáy xuyên suốt tầng biểu mô, nhân sẫm màu, to nhỏ không đều, nhân múi, nhân chia

Năm 1992, theo hệ thống phân loại của Bethesda, tổn thương tế bào biểu

mô được chia thành 2 loại: tổn thương biểu mô sừng mức độ nhẹ (low- grade squamous intraepithelial lesion - LSIL) và tổn thương biểu mô sừng mức độ nặng (high grade squamous intraepithelial lesion - HSIL) LSIL gồm CIN1 hay loạn sản nhẹ, u nhú, HSIL gồm CIN2, 3, loạn sản vừa và nặng, ung thư tại chỗ

Hệ thống phân loại Bethesda 2001 và Bethesda 2014 bổ sung đã đề cập tới ung thư tế bào vảy và ung thư tế bào tuyến [31]

1.2.3.2 Phân loại ung thư cổ tử cung

Theo phân loại giải phẫu bệnh về u cổ tử cung của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2018, ung thư biểu mô cổ tử cung thành các loại tế bào sau: ung thư vảy, ung thư tế bào tuyến và các ung thư biểu mô khác

Ung thư vảy:

 Ung thư tế bào vảy: Sừng hóa; không sừng hóa; màng đáy hóa, lympho biểu mô hóa; Ung thư vảy tế bào sáng

 Vi xâm nhập: ung thư vảy tại chỗ

Ung thư tế bào tuyến:

 Ung thư tế bào tuyến tiết nhày

 Ung thư tế bào tuyến nội tiết

 Ung thư tế bào trong

 Ung thư tế bào tuyến khác

Ung thư biểu mô khác:

 Ung thư tế bào tuyến vảy

 Ung thư tế bào kính

 Ung thư thần kinh nội tiết

 Ung thư tế bào tuyến bàng quang

 Ung thư tế bào tuyến đáy

1.2.4 Dịch tễ học HPV trên thế giới và Việt Nam

 Trên Thế giới:

Có nhiều bằng chứng cho thấy có sự liên quan giữa nhiễm HPV với ung thư CTC, trong đó HPV16 gặp khoảng 50% trường hợp, HPV-18 từ 10- 12% Các nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng không có triệu chứng thay đổi từ 2 đến 44% ở phụ nữ có tế bào bình thường Theo Hiệp hội Quốc tế Nghiên cứu về ung thư ghi nhận tỷ lệ nhiễm HPV là 10,41% (95% khoảng tin cậy là 10,2- 10,7%) và các type HPV thay đổi tùy theo vùng

và miền trên thế giới Trên thế giới có khoảng 291 triệu phụ nữ bị nhiễm HPV

và hơn 105 triệu người từng bị nhiễm HPV mà type HPV thường gặp là

HPV-16, -18 Đây là type HPV có nguy cơ gây ung thư CTC cao nhất Một nghiên cứu khác của IARC thực hiện trên 1000 phụ nữ ở 22 quốc gia có mô học là ung thư CTC và kiểm soát bằng xét nghiệm sinh học phân tử; HPV-DNA hiện diện trong 99,7% khối u này Từ đó, HPV là nguyên nhân gây ung thư CTC Dựa vào nghiên cứu của IARC trên 3000 trường hợp và tổng phân tích của 10.000 trường hợp ung thư CTC trên thế giới, 90% trường hợp là do 8 type HPV gây ra với tần suất giảm dần là HPV-16, - 18, - 45, -31, - 33, - 52, -58, -

35 Khi phân tích tổng hợp trên 53 nghiên cứu về type HPV ghi nhận 4338 trường hợp HSIL và hơn 7000 bệnh nhân bị HSIL cho thấy các type HPV giảm dần theo thứ tự gồm HPV-16, -31, -58, -18, - 33, - 52, -35, -51, -56, -45, -66 Các type HPV tùy thuộc vào vùng, miền trên thế giới nhưng HPV-16 là

type thường gặp nhất trên thế giới, chiếm từ 34% 52% trường hợp ở Châu Âu

và Châu Á; đối với HPV- 18 có khoảng 6% ở Châu Âu đến 10% tại Nam Phi

Ở nhóm phụ nữ bị LSIL, HPV-16 chiếm 26%, HPV-31 (12%); HPV-51 (11%), 10% là nhóm HPV-53, -56; 9% gặp HPV-52, -18, -66, HPV 58 chiếm 8% HPV-16 thường gặp các vùng trên thế giới: 16% ở Châu Phi đến 29% ở Châu Âu Dương tính với HPV-18 ở phụ nữ bị LSIL từ 5% ở Bắc/ trung tâm

Mỹ đến 12% ở Nam Mỹ [14], [15], [16], [19], [20]

Theo Klug Stefanie J và cộng sự nghiên cứu type HPV ở Đức cho biết 45,4% phụ nữ trong độ tuổi 30- 39 tuổi; 40- 49 tuổi chiếm 33,2% Các type HPV16, 18 gây tổn thương CTC từ CIN đến CIS với tỷ lệ là 48,4% và 14,5% Phân bố type HPV lần lượt là HPV-16, -18, -33, -39, -52 và -58 Kết quả có

403 người nhiễm HPV với 70,2% phụ nữ nhiễm 1 type, 28,1% người bị nhiễm đa type HPV và có 1,7% không xác định type HPV Phần lớn type HPV ở phụ nữ bị CIN II là HPV-16 (55,3%), HPV-45 (8,5%), HPV-58 (8,5%), tiếp theo là HPV-18, -31, - 32, -52 là 6,4% cho mỗi type HPV Kết quả Pap’s chỉ có 3,1% người có Pap’s bất thường, 2,1% trường hợp Pap II [25] Tóm lại, tỷ lệ nhiễm HPV tăng dần theo mức độ tổn thương tiền ung thư

và ung thư CTC dao động từ 60% đến 100% trường hợp; và tỷ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng thường dao động khoảng 10%

 Tại Việt Nam

Nghiên cứu tại cộng đồng phụ nữ Việt Nam đã kết hôn tại 5 thành phố lớn như Hà Nội; TP Hồ Chí Minh; Thừa Thiên-Huế; Đà Nẵng; Cần Thơ cho thấy, tỉ lệ nhiễm HPV dao động từ 6,1 - 10,2%; tỉ lệ nhiễm HPV-16, HPV-18 dao động từ 3,1-7,4% Năm 2021, tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên tổng số 302 bệnh nhân được xét nghiệm HPV có 87 trường hợp bệnh nhân dương tính: trong đó số bệnh nhân trong nhóm tuổi nhỏ hơn 25 tuổi dương tính HPV chiếm tỷ lệ cao nhất 45,8%; không có sự khác biệt về giới và địa

dư, tất cả bệnh nhân dương tính HPV chưa được tiêm vaccin HPV trước đó

Nhóm bệnh nhân nhiễm 12 type nguy cơ cao khác type 16, type 18 chiếm 60,92% [4] Dường như các vùng địa lý với những đặc điểm về lối sống đã tạo nên sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm HPV nhưng đều cho thấy tỉ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng người Việt Nam cũng như trên thế giới dưới 20% và nhiễm HPV-16 là phổ biến [16]

1.3 Các phương pháp phát hiện HPV

1.3.1 Phương pháp lai phân tử

Phương pháp lai là phương pháp khuếch đại tín hiệu được sử dụng phổ biến để phát hiện HPV trong bệnh phẩm, dựa sự phát quang bằng phản ứng hóa học của phức hợp gồm kháng thể bị bắt giữ -dung dịch lai và tín hiệu được khuếch đại Các loại phương pháp lai sử dụng trong phát hiện HPV bao gồm:

 Hệ xét nghiệm II bắt giữ thể lai (Hybrid Capture II Test System):

Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tượng lai HPV DNA với đầu dò RNA đặc hiệu Đầu dò RNA có thể được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ Phức hợp lai DNA-RNA được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu

đã gắn alkaline phosphatase trên máy miễn dịch huỳnh quang Mỗi phức hợp lai sẽ phát một tín hiệu huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượng tính hiệu huỳnh quang tương ứng lượng DNA đích trong mẫu bệnh phẩm Kit HCII sử dụng mồi DNA đặc hiệu 13 type HPV “nguy cơ cao”: HPV-16, -18, -

31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 68 và 5 type HPV “nguy cơ thấp”:

-6, -11, -42, -43, -44 Lai bắt giữ là xét nghiệm có độ nhạy cao và có khả năng phát hiện được 1pg/µl của DNA HPV-16, tương ứng với 105 đoạn gene sao chép

 Phương pháp lai Southern-blot:

Nguyên tắc lai Southern-blot dựa trên khả năng tiếp nhận DNA của màng lai nitrocellulose Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các đoạn DNA được cắt bởi enzym cắt giới hạn dựa trên kích

thước của chúng và phương pháp chuyển DNA từ gel sang màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đời của phương pháp lai do E.M Southern mô

tả năm 1975 Lai Southern-blot là phương pháp được ứng dụng sớm nhất trong phát hiện HPV Đây là phương pháp có độ nhạy rất cao, cho phép phát hiện đoạn DNA đích sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng enzym) Các điều kiện cho quá trình lai có thể được kiểm soát tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối Lai Southern-blot có thể sử dụng DNA tách từ bệnh phẩm đã bảo quản hoặc bệnh phẩm tươi Sự xuất hiện của sản phẩm lai được đánh giá như tiêu chuẩn chẩn đoán sự có mặt của HPV trong bệnh phẩm vì kích thước của kích thước của đoạn lai được đánh giá bằng nội kiểm dương đặc hiệu cho mỗi phản ứng Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phương pháp này không cao và cần thực hiện bắt buộc tại các phòng xét nghiệm chuyên sâu

 Dot-blot và Slot-blot

Dot-blot và Slot-blot cũng dựa trên nguyên tắc lai tương tự như phương pháp Southern-blot nhưng thời gian tiến hành nhanh và đơn giản hơn Sản phẩm PCR sau khuếch đại được chuyển trực tiếp sang màng và lai hóa trực tiếp với đầu dò đặc hiệu Kỹ thuật này không phải qua giai đoạn điện di trên gel và không qua giai đoạn chuyển màng Phương pháp này cho phép xác định 105 - 106 bản DNA sao chép của HPV Trong quá trình lai ngược, DNA được đánh dấu và được sử dụng như mẫu dò để lai trên màng có nhiệt độ cao

 Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization)

Phản ứng lại tại chỗ là phương pháp có khả năng phát hiện, xác định genotype và xác định vị trí của DNA HPV trong tế bào hoặc mô bằng các mẫu dò đặc hiệu đã gắn huỳnh quang, do đó có thể sử dụng một mẫu mô cho

cả xét nghiệm tế bào học và xét nghiệm lai phát hiện HPV Mặc dù phương

pháp này dễ sử dụng nhưng có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp, độ đặc hiệu khoảng 70% cho các mẫu sùi mào gà và khoảng 30% cho các mẫu ung thư nội mạc tử cung (chỉ phát hiện tế bào nhiễm một số lượng lớn virus có thể lai chéo với các marker khác trên cùng mẫu mô Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào so sánh, đánh giá phương pháp lai tại chỗ và các kỹ thuật khác phát hiện HPV

1.3.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR là phản ứng dây chuyền nhân bản DNA

in vitro nhờ DNA polymerase nhằm thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự xác định, do Kary Mullis phát minh năm 1983 Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR thường để khuếch đại vùng gene L1 HPV

Một số kit thương mại phát hiện HPV DNA dựa trên nguyên lý phản ứng PCR:

 Kỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda,

CA) là kỹ thuật đầu tiên ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện HPV

DNA và HPV genotype Kỹ thuật line blot dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng mồi PGMY09/11 khuếch đại vùng gene L1 HPV Sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò gồm các mẩu olionucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng Phức hợp gắn được phát hiện bằng mắt thường Reverse line blot có thể phát hiện được 27 HPV genotype khác nhau trong đó có 11 type HPV

"nguy cơ thấp" Hiện nay, trên thương mại đã công bố Linear Array HPV Genotypeing Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) có thể phát hiện 37 HPV genotype bao gồm 14 type HPV "nguy cơ thấp" Đây là loại kit được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm ở Châu Âu, đã được FDA chấp thuận nhưng chưa được phê chuẩn Ngoài ra, trên thương mại còn có kit INNO-LiPA HPV Genotypeing Extra (Innogenetics, Ghent, Begium) với nguyên lý lai Reverse line blot phát hiện 24 HPV genotype khác nhau, L1

DNA HPV được khuếch đại bằng mồi SPF 10 và được lai với các đầu dò đặc hiệu trên màng

 Kỹ thuật Reverse Dot Blot (RDB)

Sản phẩm PCR đánh dấu biotin được lai với allele-specific oligonucleotide (ASO) probe Probe được liên kết với màng nylon bằng liên kết chéo poly(dT) và UV hoặc bằng liên kết cộng hóa trị với các trình tự liên kết amino Các thể lai có thể được phát hiện bằng phản ứng của một cơ chất không màu với HRP (horseradish peroxidase) để tạo thành kết tủa có màu Phương pháp lai điểm ngược (reverse dot-blot) là một quy trình chẩn đoán đơn giản và nhanh chóng, cho phép sàng lọc mẫu để tìm nhiều loại đột biến/đa hình trong một phản ứng lai đơn Một số phương pháp cố định các mẫu dò oligonucleotide đã được đưa ra Phương pháp lai điểm ngược có một

số đặc tính độc đáo có giá trị trong việc thiết lập chẩn đoán:

 Nhiều kết quả định type từ một mẫu đơn lẻ có thể được hiện diện trên một màng lai Điều này giúp cho hoạt động trượt và tìm kiếm trình tự của đầu

dò thuận lợi và giảm thiểu khả năng xảy ra lỗi của kỹ thuật viên

 Có sẵn màng lai cho định type Điều này giảm thiểu thao tác thủ công của kỹ thuật viên cũng như khả năng xảy ra lỗi và có thể dùng chất chuẩn

 Không giống như định type bằng dot-blot/oligonucleotide, chỉ sản phẩm PCR được gắn biotin mới xảy ra phản ứng lai, do đó loại bỏ vấn đề tiềm

ẩn của các probe gắn biotin không đặc hiệu Phương pháp này đã được sử dụng trong các lĩnh vực xác định gene pháp y (xét nghiệm HLA-DQα Amplitype), xác định loại mô để cấy ghép (xét nghiệm HLA-DRβ), sàng lọc

xơ nang, cũng như trong nhiều nghiên cứu ứng dụng khác nhau

Với ưu điểm nổi bật cho phép phát hiện được nhiều đột biến trong cùng một lần thực hiện, phương pháp lai điểm ngược đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để phát hiện đột biến của 1 loại bệnh như β-thalassemia, đột biến kháng thuốc lao, định type HPV,… Tại Việt Nam, kỹ thuật này cũng đã được ABT áp dụng để sản xuất bộ TopSENSI® HPV GENOTYPE RDB KIT nhằm

xác định sự đồng nhiễm của 35 type HPV phổ biến tại việt Nam Bộ kit có

khả năng nhận diện 35 genotype HPV bao gồm:

• 12 genotype HPV nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,

 Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) là kỹ thuật có thể

phát hiện 13 type HPV "nguy cơ cao" Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR khuếch đại sản phẩm lai sau khi DNA đích đã lai kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang Nhược điểm của kit là chỉ phát hiện được nhóm genotype HPV

mà không phát hiện từng HPV genotype đặc hiệu So sánh Amplicor với Hybrid Capture II Assay (cùng phát hiện được 13 type HPV "nguy cơ cao") cho thấy độ tương đồng là 83,3% [12]

 Multiplex HPV Genotypeing Kit (Multimetrix, Heidelberg,

Gemany) là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu

Mồi kit gồm 24 mẫu dò tương ứng 24 genotype HPV, 1 mẫu dò β-globin và 1 mẫu dò chứng Sau khi sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò sẽ được gắn Rphycoerythrin đã đánh dấu streptavidin và được đọc trên máy phân tích Luminex Đây là Kit có độ nhạy cao và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học, tuy nhiên hiện nay Kit thường chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu vì giá thành cao

 Phương pháp PCR đặc hiệu theo type (type-specific PCR) là

phương pháp PCR phát hiện riêng cho từng type HPV khác nhau dựa vào sự khác nhau trên vùng gene E6 và E7 Phát hiện đa nhiễm các type HPV trong cùng một mẫu cũng phải được thực hiện riêng biệt cho từng type Kit gồm cặp mồi đặc hiệu cho 14 genotype HPV nhóm “nguy cơ cao” dựa trên khả năng

khuếch đại 100 bp trên vùng gene E7 HPV Các genotype HPV có mồi đặc hiệu được phát hiện là HPV-16, -18, - 31, -33, -35, -39, -45, -51,- 52, -56,- 58, -59,- 66, -68

Phương pháp PCR đặc hiệu theo type có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện với 0,005 - 0,01ng DNA HPV/µl, tiến hành nhanh và xác định được

1.3.3 Phương pháp real-time PCR

Các phương pháp PCR thông thường chỉ đánh giá định tính mà không đánh giá định lượng virus Real-time PCR là phương pháp khuếch đại đích có

độ nhạy cao, thường được sử dụng trong định tính và định lượng DNA HPV

 Real-time PCR cho phép khuếch đại và xác định số lượng bản sao

được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt Kết quả DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra

và số lượng bản sao DNA được tổng hợp Đường chuẩn của phản ứng được xây dựng dựa trên số lượng bản sao DNA đích trong một gam mẫu chuẩn và xác định giá trị chu kỳ ngưỡng cho từng mẫu tương ứng Chu kỳ ngưỡng (Ct-threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó sản phẩm PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vượt qua cường độ huỳnh quang nền Nếu số lượng DNA đích càng lớn thì Ct càng nhỏ và nếu số lượng DNA đích ít thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn Phản ứng real-time PCR lý tưởng khi tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt Chất phát huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA làm bản sao DNA đích được tạo ra phát huỳnh quang khi có nguồn sáng kích thích Chất phát quang thường được sử dụng là SYBR Green

1 hoặc các mẫu dò đặc hiệu (Taqman probe, Beacon probe, Hybridization probe )

Phương pháp real-time PCR có thể thực hiện nhanh, giá thành không đắt, định lượng được sản phẩm DNA và RNA Phương pháp này có thể phát hiện được 10.000 chuỗi gene sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm) Việc xác định số lượng virus cho phép xác định được mRNA, đánh giá

sự hoạt động của gene E6 và E7 Khi 2 vùng gene này hoạt động sẽ gây ra những biến đổi cũng như cho các sản phẩm của các vùng gene này Đây là phương pháp có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 70%

Trên thương mại có các loại Kit khác nhau dựa trên nguyên lý của realtime PCR như Roche LightCycler 2, Applied Biosystems 7900 HT và Corbett Rotor-Gene 6600 Những kit này thường được sử dụng trong chẩn đoán in vitro tại Châu Âu, tuy nhiên vẫn chưa được FDA công nhận

Multiplex real-time PCR là kỹ thuật nhân bản một hoặc nhiều trình tự DNA trong cùng một phản ứng PCR, nhiều trình tự sẽ được nhân bản sử dụng nhiều cặp mồi và các thành phần master mix Phương pháp này được xem là một phương pháp cải tiến của PCR thông thường, có độ nhạy cao, thời gian thực hiện ngắn và phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ trong một phản ứng

Taqman probes là đầu dò đánh dấu kép có thể bị thủy phân, sử dụng hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase để xác định số lượng trình tự đích Đầu dò (probe) Taqman là oligonucleotide dài 18-22 base, đánh đánh dấu chất phát huỳnh quang ở đầu 5 và chất hấp thụ chất phát quang (quencher) ở đầu 3’ Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm nhân bản đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp

và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Càng nhiều sản phẩm nhân bản xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích

Nguyên tắc multiplex real-time PCR với mẫu dò TaqMan, nhân bản vùng gene đặc trưng của các type HPV AccuPid HR-HPV Genotypeing Kit (16, 18) dựa Vùng gene mục tiêu để phát hiện HPV-16 và HPV-18 là E6-E7,

12 type HR-HPV còn lại là E1 hoặc E2 Vùng gene mục tiêu này có độ tương đồng thấp khi so sánh với các vùng gene của người hay các tác nhân khác có thể xuất hiện trong mẫu

AccuPid HR-HPV Genotypeing Kit (16, 18) có chứa một chứng nội là gene ALAS1 ở người, cho phép kiểm tra sự hiện diện của vật liệu tế bào trong mẫu nhằm tránh hiện tượng âm tính giả Nếu mẫu dịch phết không được chuẩn bị đúng (nhiều chất nhầy hoặc không đủ lượng tế bào biểu mô), chứng nội sẽ không được phát hiện, như vậy mẫu sẽ được xem là không đạt tiêu chuẩn, cần thực hiện lại xét nghiệm

1.3.4 Phương pháp DNA microarray (Phương pháp DNA chip)

Phương pháp DNA microarray là kỹ thuật phát hiện DNA HPV hoặc cRNA HPV bằng cách lai hóa sản phẩm đích với các mẫu dò đặc hiệu đã gắn với các hạt chip silicon trong các giếng trên phiến kính Sản phẩm lai giữa DNA đích và mẫu dò được phát hiện bằng tín hiệu huỳnh quang hoặc bằng phương pháp hóa phát quang Cường độ của tín hiệu thu được phụ thuộc vào nồng độ DNA đích Mỗi giếng lai có khoảng 10-12 mole trình tự oligonucleotid mẫu dò được thiết kế đặc hiệu với các trình tự bổ xung trên DNA đích hoặc với các khung đọc mở trên DNA đích Chiều dài mẫu dò tùy thuộc vào đoạn DNA đích mong muốn

Phương pháp DNA microarray gồm hai loại:

 Loại DNA microarray hai kênh (two-channel microarray): Thường được sử dụng phát hiện cDNA từ hai mẫu cần so sánh với hai loại mẫu dò được đánh dấu bằng hai loại huỳnh quang khác nhau Loại huỳnh quang thường được sử dụng là Cy3 (phát xạ huỳnh quang ở bước sóng 570 nm) và Cy5 (phát xạ huỳnh quang ở bước sóng 670 nm) Hai mẫu DNA đích sau khi lai sẽ được trộn chung lại tạo ra một hỗn hợp lai và đọc trên máy scan bằng laser với hai loại bước sóng khác nhau

 Loại DNA microarray một kênh (one-channel microarray): Phương pháp này chủ yếu sử dụng trong đánh giá kết quả lai của DNA đích với mẫu

dò nhưng ít có giá trị trong đánh giá so sánh với các mẫu khác vì việc đánh giá so sánh khả năng lai của cùng DNA đích với mẫu dò phải thực hiện trong điều kiện hoàn toàn giống nhau

Hiện nay trên thương mại, kit dựa trên DNA array được sử dụng là PapilloCheck (Greiner Bio-One, Monroe, NC) phát hiện 24 HPV genotype E1 HPV genotype được khuếch đại trong phản ứng PCR sẽ được lai với DNA chip đã gắn cố định các HPV oligoprobe PapilloCheck có thể tiến hành với

12 mẫu trong cùng thời điểm nên có thể tránh kết quả âm tính hoặc dương tính giả So sánh với kit Roche Linear array, DNA array cho kết quả xác định genotype HPV tương đồng

1.3.5 Phương pháp giải trình tự gene trên máy tự động

Khác với phương pháp giải trình tự gene bằng phương pháp hóa học và phương pháp enzym, phương pháp giải trình tự gene trên máy tự động dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP Nguyên tắc hoạt động của máy là dựa trên sự nhận biết sự phát sáng của vạch điện di trên gel polyacrylamide trong quá trình điện di khi chiếu chùm tia laser đi qua và ghi lại cường độ sáng trên biểu đồ bằng các đỉnh màu khác nhau Các DNA có thể được xác định trình tự nucleotide trực tiếp hoặc sau khi dòng hóa Phương

pháp giải trình tự gene trực tiếp cho phép tiến hành nhanh và tiết kiệm, tuy nhiên phương pháp này chỉ có thể áp dụng với nguyên liệu giải trình tự là DNA trong sản phẩm PCR có chất lượng tốt, đảm bảo độ tinh sạch vì đôi khi

có những vùng gene được nhân lên không đặc hiệu trong phản ứng PCR mà qua điện di không thể xác định được sẽ làm kết quả xác định nucleotide bị rối

và khó xác định

Mục đích của việc dòng hóa nhằm phân tích chính xác vùng DNA cần nghiên cứu và nhân số lượng DNA cần giải trình tự nếu số lượng DNA trong sản phẩm PCR quá ít Hơn nữa, dòng hóa còn giúp duy trì và bảo tồn sảnphẩm PCR đặc biệt là bảo tồn những vùng gene quý [10]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

 Phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ đến khám phụ khoa có biểu hiện viêm cổ

tử cung

 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu:

 Phụ nữ tuổi từ 18-60, đã có quan hệ tình dục

 Chưa được tiêm vacxin phòng HPV, phụ nữ không mang thai

 Sạch kinh 2 ngày, không thụt tháo đặt thuốc âm đạo trong 24h

 Không điều trị bệnh phụ khoa ít nhất 7 ngày trước khi được khám

 Có tổn thương viêm cổ tử cung (mất biểu mô lát tầng nhẵn bóng, nốt sùi, vết loét, viêm lộ tuyến)

 Mẫu bệnh phẩm: là dịch phết cổ tử cung của phụ nữ đến khám phụ

khoa có đủ tiêu chuẩn lựa chọn cho nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị dụng cụ

1 Máy Real time Light Cycler 480 Roche - Thuỵ sỹ

2 Tủ an toàn sinh học cấp 2 ESCO - Singapore

8 Pipet, đầu côn các loại, ống

eppendorf các loại …

Trung Quốc, Đức, Việt Nam

2.1.2.2 Các Hoá chất và dung dịch đệm sử dụng trong thí nghiệm

EX- Hóa chất HPV- PCR: TopCARE ® HPV qPCR KIT

 Hoá chất chạy định genotype: TopSENSI ® HPV Genotype RDB Kit (RUO)

 AccuPid HR-HPV Genotypeing Kit (16, 18), Q01HPV03.4A

(Nguồn cung cấp: CÔNG TY TNHH THIẾT BỊ ABT & CÔNG TY

TNHH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOA THƯƠNG)

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian: Từ tháng 12/2022 đến tháng 5/2023

 Địa điểm nghiên cứu:

 Phòng Khám sản - Bệnh viện Đại học Y Thái Bình

 Trung tâm dịch vụ KHKT Y Dược - Trường Đại học Y Dược Thái Bình

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm

2.3.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm

 Mẫu sử dụng là dịch phết cổ tử cung, được cung cấp từ Phòng khám Sản - Bệnh viện Đại học Y Thái Bình Tăm bông vô trùng sau khi thu nhận mẫu được hòa trong dung dịch 01 ml dung dịch PBS 1X trong ống eppendorf 2ml, giữ lạnh, chuyển nhanh về Phòng xét nghiệm Vortex để các virus rời khỏi đầu tăm bông và hoà vào dung dịch

 Bảo quản mẫu ở -200C đến khi tiến hành tách chiết DNA