Xác định kiểu gene virus hpv (human papilloma virus) trên các bệnh nhân đến khám tại bệnh viện đại học y thái bình bằng phương pháp pcr reverse dot blot và multiplex realtime pcr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––––––– ĐINH THẾ HÙNG XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRUS HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) TRÊN CÁC BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR REVERSE DOT BLOT VÀ MULTIPLEX REALTIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2023 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––––––– ĐINH THẾ HÙNG XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRUS HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) TRÊN CÁC BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR REVERSE DOT BLOT VÀ MULTIPLEX REALTIME PCR Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1 TS Phan Ngọc Quang 2 PGS TS Nguyễn Phú Hùng THÁI NGUYÊN - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn “Xác định kiểu gene virus HPV (human papilloma virus) trên các bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Đại học y Thái Bình bằng phƣơng pháp PCR Reverse dot blot và Multiplex realtime PCR” là công trình nghiên cứu của tác giả, với sự hƣớng dẫn tận tình của TS Phan Ngọc Quang và PGS TS Nguyễn Phú Hùng Công trình đƣợc tác giả nghiên cứu và hoàn thành tại Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên từ năm 2022 đến năm 2023 Các tài liệu tham khảo, các số liệu thống kê phục vụ mục đích nghiên cứu công trình này đƣợc sử dụng đúng quy định, không vi phạm quy chế bảo mật của Nhà nƣớc Trong quá trình nghiên cứu, tác giả có sử dụng một số kết quả của các tác giả trong nƣớc và ngoài nƣớc, đƣợc thể hiện ở phần "Tài liệu tham khảo" Kết quả nghiên cứu của Luận văn này chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác ngoài các công trình nghiên cứu của tác giả Tác giả xin cam đoan những vấn đề nêu trên là hoàn toàn đúng sự thật Nếu sai, tác giả xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật Tác giả Đinh Thế Hùng ii LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng – Công nghệ Sinh học là một công trình quan trọng đòi hỏi sự nỗ lực lớn của em và đƣợc sự giúp đỡ tận tình, động viên, khích lệ đến từ nhiều cá nhân, đoàn thể Trƣớc hết, Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học Trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, Các Quý Thầy Cô trong Khoa Công nghệ Sinh học đã giúp em trang bị tri thức, tạo môi trƣờng điều kiện thuận lợi nhất trong suốt quá trình em học tập và thực hiện luận văn Xin cảm ơn Lãnh đạo, các Cán bộ Trung tâm Dịch vụ KHKT Y Dƣợc – Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thái Bình, đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện cho đề tài luận văn này Em xin cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Thái Bình đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá học này Với sự kính trọng sâu sắc, em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn tới 2 thầy hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Phú Hùng, TS Phan Ngọc Quang đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ, chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn này Em cũng xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề 1 2 Mục tiêu nghiên cứu 2 3 Nội dung nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Human Papillomavirus (HPV) 3 1.1.1 Cấu tạo của HPV 3 1.1.2 Bộ gene 4 1.1.3 Phân type HPV 9 1.1.4 Chu kỳ sống của HPV 10 1.2 Ung thƣ cổ tử cung do HPV ở ngƣời 12 1.2.1 Cơ chế gây ung thƣ của Human Papilloma virus 12 1.2.2 HPV và Ung thƣ cổ tử cung 13 1.2.3 Ung thƣ cổ tử cung 14 1.2.4 Dịch tễ học HPV trên thế giới và Việt Nam 16 1.3 Các phƣơng pháp phát hiện HPV 18 1.3.1 Phƣơng pháp lai phân tử 18 1.3.2 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20 1.3.3 Phƣơng pháp real-time PCR 23 1.3.4 Phƣơng pháp DNA microarray (Phƣơng pháp DNA chip) 25 1.3.5 Phƣơng pháp giải trình tự gene trên máy tự động 26 iv CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 28 2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phƣơng pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm 30 2.3.2 Xử lý mẫu dịch phết CTC 31 2.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA bằng cột silica 31 2.3.4 Phƣơng pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA 32 2.3.5 Phƣơng pháp Multiplex real-time PCR sử dụng Taqman probe 33 2.3.6 Phƣơng pháp lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) 34 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 35 2.5 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 36 3.1 Tình trạng nhiễm HPV ở phụ nữ viêm cổ tử cung 36 3.1.1 Phân tích kết quả 37 3.1.2 Kết quả phát hiện HPV-DNA và tỷ lệ nhiễm HPV 38 3.2 Kết quả xác định type (genotype) virus HPV 39 3.2.1 Phƣơng pháp Multiplex real-time PCR sử dụng Taqman probe 39 3.2.2 Phƣơng pháp lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) 43 3.3 So sánh kết quả xác định genotype bằng 2 phƣơng pháp Multiplex Real-time PCR và RBD 53 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 63 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt STT tắt 1 AGC Atypeical Grandular Cells Tế bào tuyến không điển hình 2 ASCUS Atypeical Squamous cell of Tế bào biểu mô Undetermined Significance vảy có ý nghĩa không xác định 3 CIN Cervical Intraepithelial Tân sinh trong biểu mô Neoplasia cổ tử cung 4 CTC Cổ tử cung 5 DNA Deoxyribonucleic Acide 6 HPV Human Papilloma virus 7 HSIL High-grade Squamous Tổn thƣơng biểu mô lát Intraepithelial Lesion mức độ cao 8 HR-HPV High-risk Human Nguy cơ nhiễm virus HPV cao Papilloma virus 9 LR-HPV Low-risk Human Nguy cơ nhiễm virus HPV thấp Papilloma virus 10 LSIL Low-grade Squamous Tổn thƣơng biểu mô lát Intraepithelial Lesion mức thấp 11 ORF Open reading frame Khung đọc mở 12 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 13 IARC International Agenecy for Tổ chức nghiên cứu ung Resegrch on Cancer Thƣ quốc tế 14 kb Kilo base 15 kDa Kilodalton 16 URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa thƣợng nguồn 17 UTCTC Ung thƣ cổ tử cung 18 UTSDN Ung thƣ sinh dục nữ 19 VLPs Virus like particle Hạt virus giả 20 RDB vi Phƣơng pháp lai điểm ngƣợc 21 WHO Tổ chức Y tế thế giới Reverse Dot Blot World Health Organization vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu trúc L1, L2 của Human Papilloma virus 3 Hình 1.2: Cấu trúc của bộ gene HPV mạch thẳng và mạch vòng 9 Hình 1.3: Cơ chế gây ung thƣ của HPV 13 Hình 1.4: Sự phát triển và lây nhiễm HPV trên tế bào CTC 14 Hình 3.1: Kết quả phát hiện mẫu dƣơng tính với HPV 37 Hình 3.2: Kết quả phát hiện mẫu có type HPV-DNA dƣơng tính bằng phƣơng pháp Multiplex real-time PCR 40 Hình 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm genotype HPV 41 Hình 3.4: Vị trí các genotype HPV trên màng lai (trái) và kết quả đồng nhiễm type HPV (16;18;39;56;11) trên mẫu (phải) 43 Hình 3.5: Vị trí các genotype HPV trên màng lai (trái) và kết quả đồng nhiễm type HPV (18;11) trên mẫu (phải) 44 Hình 3.6: Vị trí các genotype HPV trên màng lai (trái) và kết quả đồng nhiễm type HPV (39;58;11) trên mẫu (phải) 44 Hình 3.7 Các genotype HPV phổ biến ở phụ nữ viêm CTC do HPV 46 Hình 3.8 Tỷ lệ đồng nhiễm genotype HPV 47 Hình 3.9 Cơ cấu nhiễm HPV theo nguy cơ gây ung thƣ 49 Hình 3.10 Cơ cấu nhiễm HPV theo nhóm tuổi ở các trƣờng hợp dƣơng tính50 Hình 3.11 Tần suất xuất hiện của một số HR-HPV phổ biến trong số HR-HPV 52 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm HPV (n=477) 38 Bảng 3.2 Kết quả định type bằng kỹ thuật Multiplex real-time PCR 40 Bảng 3.3 Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV theo nhóm tuổi 41 Bảng 3.4 Sự phân bố các genotype HPV theo nhóm tuổi 42 Bảng 3.5 Tần suất nhiễm các genotype HPV 45 Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các type HPV 47 Bảng 3.7 Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và và đồng nhiễm ở các mẫu dƣơng tính phân bố theo nhóm tuổi 48 Bảng 3.8 Tỷ lệ nhiễm HPV và các type đơn thuần và đồng nhiễm theo nhóm tuổi 50 Bảng3.9 So sánh kết quả xác định genotype của 2 phƣơng pháp Multiplex Real time PCR và RBD trên các mẫu HPV dƣơng tính (n=79) 53