Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Enzyme pectinase Các nguồn thu nhận enzyme trong công nghệ thực phẩm Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật ứng dụng enzyme pectinase trong sản xuất nước quả và công nghệ thực phẩm
TỔNG QUAN VỀ ENZYME – ENZYME PECTINASE
Cơ chất pectin
Hình 1 Cơ chất pectin Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của acid galacturonic qua các liên kết α – 1,4 – glucoside Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80000 – 200000 Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác, pectin hòa tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng Độ hòa tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hóa trong phân tử tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm
Pectin là tên chung được gọi cho những hỗn hợp chứa các hành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysacaride và protein để tạo thành các proto pectin không hòa tan Có thể phân hủy để làm cho pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid, vì thế các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau.
Phân loại pectin
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hòa tan, pectinic acid và protopectin
Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằng methanol Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đường có nồng độ 0,06% Enzyme pectinase tác động lên pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là α – D- galcturonan hay α - D – galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị D- galactonosyluronic acid (liên kết theo kiểu α -1,4) Mặt khác, mức độ oxy hóa trong các phân tử polumer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị ester hóa bới các nhóm methoxyl TRong một số trường hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl và các nhóm acetyl
Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hóa bằng methanol Pectinase là muối của pectinic acid Pectic acid là polygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic acid Pectate là muôi của pectic acid
Protopectin tạo độ cứng cho quả màu xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa học phức tạp Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion
Ca 2+ , Mg 2+ , các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Cấu tạo enzyme pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol…Đây là một trong nhóm enzyme được ứng dụng rỗng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease Enzyme này ban đầu được phát hiện trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch.
Phân loại enzyme pectinase
Hiện nay hệ thống enzyme pectinase được chia thành 2 nhóm chính: hydrolase, transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành
Thuộc nhóm này có 2 enzyme chủ yếu: pectinesterase và polygalacturonase
Pectinesterase - gọi tắt là PE: enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin hóa acid pectinic để giải phóng sản phẩm là methanol và acid polygalacturonic PE chỉ phân cắt các nhóm metoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự do Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau Nếu thu nhận từ nguồn vi sinh vật thì pH tối ưu từ 4,5 – 5,5 còn nếu thu nhận từ thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0 – 8,5 Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30 0 - 45 0 và bị vô hoạt ở 55 0 – 62 0 Pectinesterase thường được vô hoạt bởi các ion Ca 2+ , Mg 2+
Polygalacturonase - gọi tắt là PG: xúc tác sự phân cắt các muối liên kết α – 1,4- glycoside Các exo - PG phân cắt từ các đầu không khử, và endo – PG tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất
Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu gặp trong vi khuẩn và nấm mốc Đây là một phức hệ enzyme và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Dựa vào đó người ta chia ra 4 kiểu sau:
Polymetyl – galcaturonase (PMG – poly – α -1,4- galacturozit – metyl este glucanhydrolase) PMG được phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắt liên kết α – 1,4 ở trong hay ở cuối và đầu mạch
+ Endo glucozidase polymetyl galcatunase kiểu I (endo – PMG – 1) Đây là enzyme có tính chất dịch hóa, pectin có mức độ metyl hóa cao (nhiều gốc metoxy – OCH3) thì bị Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhóm 10 Trang 9 thủy phân càng nhanh và triệt để Trong môi trường khi có mặt pectinesterase (PE) thì enzyme này càng bị giảm hoạt lực
Endo – PMG – 1 rất phổ biến trong các nấm mốc: Asp Niger; Asp.Awamori; Botrytis cinezea; Neurispora crassa
+ Exo – glucozidase polymetyl galacturonase kiểu III (exo – PMG – III) Đây là enzyme có tính chất đường hóa, có khả năng cắt từng gốc monomer acid galacturonoc ra khỏi mạch bắt đầu từ đầu không khử có nhóm metoxy (-OCH3)
Enzyme tác dụng lên acid pectinic hay acid pectid - gọi là polygalacturonase (PG) cũng được phân thành hai nhóm nhỏ:
+ Endo glucozidase poly galacturonase kiểu II (endo – PG –II) Đây là enzyme có tính chất dịch hóa, chỉ thủy phân cơ chất khi có mặt nhóm -COOH tự do Hoạt độ của endo –
PG – II tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý trước bằng pectinesterase (để tạo ra nhiều gốc –COOH tự do) Nấm mốc và vi khuẩn tổng hợp được enzyme này
+ Enxo – glucozidase polygalacturonase kiểu IV (exo – PG –IV) Thủy phân các liên kết gắn với nhóm -COOH tự do ở đầu hay nối mạch
2.2.2 Transeliminase (TE) Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm (khoảng năm 1960-1961) bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan khỏi protopectin để tạo thành pectin hòa tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thủy phân (không có sự tham gia của phân tử nước) pectin để tạo ra các gốc galacturonoc có nổi kép giữa C4 và C5 Phản ứng xảy ra dễ dàng ở môi trường trung tính hay kiềm yếu
3 Các nguồn thu nhận enzyme pectinase
Sơ lược chung
Có hai loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương pháp tách và thu nhận tiêng:
+ Enzyme ngoại bào (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hòa tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch
+ Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào Mục đích của việc này là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm enzyme nội bào Hốn hợp thu nhận được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhóm 10 Trang 10 những chất có phân tử lượng lớn, còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối Enzyme sau đó sẽ được đem tinh sạch
Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào
Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào Thường lẫn chung với các chất khác của tế bào sau khi bị phá vỡ ( acid nucleic, chất nguyên sinh, lipid )
Không lẫn chung với thành phần nội bào, nếu có chỉ là một vài enzyme ngoại bào khác
Chỉ bền vững ở trong môi trường nội bào Bền vững hơn
Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt
Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn.
Thu nhận enzyme pectinase
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV Có hai phương pháp sản xuất pectinase:
+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
3.2.1 Thu nhận theo chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase để thu nhận pectinase thường là cám gạo hay cám mì, bã củ hay thóc mầm Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường ammonium, photphoric Độ ẩm thường phải nằm trong khoảng 60%
Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30 0 C trong thời gian 4 giờ, sau đó giảm xuống 24 0 C và nuôi cấy trong thời gian 48 – 52 giờ Sản phẩm lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế Để thu nhận được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ enzyme pectinase có thể là rượu enthanol (72,5 – 75%) hoặc isopropanol (55-57%) Muối ammonium sunfat sử dụng có độ bão hòa 0,79, khi kết tửa bằng rượu ethanol chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết 99%, còn nếu bằng muối thì độ tinh khiết 75% Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-5 0 C, thời gian tiếp xúc Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhóm 10 Trang 11 với rượu càng ngắn càng tốt Sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản
3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu
Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường khi bị acid hóa mạnh và khi lượng photpho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp Đối với nấm mốc pH kiềm kìm hãm sự tống hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase, pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy của enzyme pectinase Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5 -5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm Tuy nhiên pH môi trường nuôi cấy của các
A.niger và A.awamori 16 có thể dịch về 3,5 -3,8 và 2,9 – 3,2 theo thứ tự
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48 giờ với hàm lượng từ 2-10% Đối với
A.niger và A.awamori, vật liệu gieo là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu sinh bào tử Thời gian ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đên skhi bắt đầu sinh bào tử THời gian ủ sơ bộ thường là 38-42 giờ, lượng sợi nấm gieo cấy thường là 2% Trong quá trinh nuôi cấy, hàm lượng chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8% Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt từ 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun, điều khiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt từ 165-180 0 C và đi ra đạt 60-70 0 C Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy không quá 40 0 C Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm, có thể thu được chế phẩm enzyme pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1; với aceton theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ 1,3:1 hoặc với muối amoni sunfat (50-80%) trong muối kết Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectin trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu Nếu kết tủa bằng muối amoni sunfat Cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1,0 thì sẽ có kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao
Môi trường: Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ, pH ban đầu của môi trường dung dịch là 6,5-7,0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35 0 C
Cl Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí thu được pectinase Thành phần môi trường gồm có: (NH4)2SO4 0,4%; KH2PO4 0,3%; K2HPO4 0,7%; NaCl 0,1%; MgSO4
0,025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic acid 0,5%
Có thể tiến hành thu phế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết hợp kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc muối amoni sunfat Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6,5 – 6,8, nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6,5 – 6,8 Nếu kết tủa bằng 2 -2,5 thể tích axeton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu
Khi kết tủa bằng amoni sunfat có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterse và pectintranseliminase và exopolygalacturonase
Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước cơ bản sau đây:
+ Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100)
+ Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion (DEAE Biogel A) hay trao đổi cation (CM Biogel A)
+ Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang
+Tinh sạch FPLC Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tính điện thay thế pectate liên kết ngang.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME TỪ VI SINH VẬT
Nguyên liệu từ vi sinh vật
Nhiều vi sinh vật sống trong đất, trong nước có khả năng phân giải pectin Chúng có ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn 2 cacbon trong tự nhiên mà còn đối với một số ngành sản xuất trong công nghiệp
Những vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ nhất:
+ Nấm mốc: Asp Ficuum; Asp.niger; Asp.oryza; Asp.awamori; Asp.terrus; Asp.saitoi; Pen.glaucum; Pen.chrlichii; Mucor mucedo; Rhizopus tritici…
Trong số các biến chủng của nấm mốc đáng chú ý là Asp.niger và Asp.awamori
+ Nấm men: Sac.fraglis; Sac.ellipsoideus; Sac.ludwigii…
+ Vi khuẩn: Bac.polymyxa; felseneus; Clostridium roserum; Pseudomonas flurescens… Tất cả các vi sinh vật dùng để thu enzyme pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí Đặc điểm phân bố enzyme pectinase ở vi sinh vật:
Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo được một số enzyme song đa số cơ chế khác lại ra được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau mà tùy theo loài
Sac.fragilis: chế tạo ra duy nhất 1 loài enzyme phân giải pectin dài nhất là endo – polygalacturonase
Các nấm mốc Asp.niger; Asp.awamori; Asp.foelidus; Asp,saitoi…thường tạo ra được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Enzyme pectinesterase: chủ yếu được tạo ra từ Asp.niger Ngược lại ở Pencitrimin; Asg.campestris lại không tạo được enzyme này
Các enzyme pectin – hydrolase (pectinesterase và polygalacturonase): chủ yếu được tạo ra từ vi khuẩn Erwina caralovona; Bac.polymxa; Klebsiella acrogens; Flawobact pectinovorum; Actinomyces
Enzyme pectin – transeliminase: chủ yếu do Bac.species; Asp Fonseaner; bac.polymyxa…
Các enzyme polygalacturonase thường được tạo ra chủ yếu bởi Con.diplodiella; Ag.campestris; Pen.citrimin…
Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng, hoặc chỉ là enzyme bán thể Theo F.Moran và M.P.Starr các vi sinh vật Erwinia eurolovora và Erwinia aroidease chỉ tạo ra enzyme polygalacturonat – transeliminase bán thể song sẽ tạo ra enzyme này cảm ứng khi có mặt acid Polygalacturonic hoặc các sản phẩm phân giải của nó Ngược lại D.K nosel thì cho rằng các acticomyces chỉ có khả năng sinh tống hợp ra enzyme polygalacturonat - transelominase cảm ứng
Một điểm khác cũng đáng lưu ý là các enzyme pectinase ở các vi sinh vật không những khác nhau về đặc điểm phân bố mà còn khác nhau về tính chất Điều kiện hình thành enzyme pectinase bởi các vi sinh vật
Sự sinh trưởng tốt của vi sinh vật trên môi trường này hay môi trường khác chưa thể coi là tiêu chí của sự tân tạo tối đa của 1 enzyme nào đó Môi trường mà trước hết nguồn C,
N, P được chọn một cách đặc hiệu sẽ đảm bảo được sự định hướng tổng hợp các enzyme, không những vậy môi trường dinh dưỡng còn sẽ tác động đến các enzyme trong chế phẩm thu được Theo P, Kontio, với enzyme pectinase, chế phẩm enzyme thu được khi nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường dinh dưỡng khác nhau sẽ khác nhau về vị trí số pH tối ưu trên cơ chất.
Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn cacbon
Chất cảm ứng pectin bắt buộc
Nguồn cacbon: polysaccharide; disaccharide; monosaccharide
Nếu sử dụng hỗn hợp glucide trong đó có pectin để nuôi cấy vi sinh vật thì hoạt lực của pectinase ngoại bào có thể tăng 4 -6 lần so với khi nuôi cấy không có pectin Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Giống Asp Niger được nuôi cấy trên môi trường có nhiều nguồn cacbon như pectin, tinh bột, isulin, lactose, saccarose, manose, galactose nồng độ 2,4,6% sẽ cho monosacchride và glyxerin thì hoàn toàn không thể sinh tổng hợp này Đường glucose sẽ có tác dụng kìm hãm sự sinh tổng hợp enzyme pectinase trên môi trường nuôi cấy là pectin và lactose đối với loài Asp.niger, Asp.awamori
Nguồn cacbon ở trong môi trường pH cuối Khối lượng sợi nấm khô (g)
Hoạt độ pectinase đơn vị
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nếu dùng kết hợp nitơ hữu cơ và vô sơ sẽ có tác động tốt đến quá trình sinh tổng hợp pectinase Tuy nhiên, muối natri kim loại kiềm lại kìm hãm enzyme này
Ví dụ: Đối với Asp niger thì sử dụng muối photphat diamond (NH4H2PO4) để sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt nhất
+ Đối với Asp.awamori thì nguồn nitơ thuận lợi nhất là (NH4)2SO4
+ Đối với nấm mốc Asp Foetidus thì (NH4)2SO4, nước chiết nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực polygalacturonase
Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hóa đến pH
= 2,5-3,0 và có sự tích lũy enzyme pectinase tốt hơn
Nói chung tỷ lệ thích hợp nhất đối với C/N khi tổng hợp pectinase trong khoảng 7/1 – 13/1 Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Khối lượng sợi nấm khô (gam)
Hoạt độ đơn vị/10ml
Hoạt độ PE Hoạt dộ
Hoạt độ PG Đơn vị/g
Ảnh hưởng của các yếu tố khác
Ngoài nguồn C, N các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo thành phức hơp hệ enzyme này Trong số đó P là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường, hàm lượng P trong môi trường phải là 8 -10% Khi sử dụng nguồn N của photphat diamond thì nhu cầu về P của nầm mốc hoàn toàn được thỏa mãn Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến sự tạo ra enzyme pectinase
Môi trường lên men giống
Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek
Chuẩn bị bột carrot: carrot xay nhuyễn, sấy ở nhiệt dộ 60 0 C cho đến khi độ ẩm carrot đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng)
Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm:
Trấu 21,5% Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
(NH4)2SO4 2% Độ ẩm 55% Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
3 Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme pectinase và thuyết minh
Làm nguội, làm tơi Thanh trùng
Cấy giống vi sinh vật Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy Thu nhận phế phẩm enzyme thô
Chế phẩm ezyme thô đem tinh chế
Thu nhận, sấy kết tủa Kết tủa enzyme
Tinh chế kết tủa Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Thành phẩm
Nhân giống Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Trộn: Nguyên liệu được trộn với nhau
Làm ẩm: có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của môi trường cám là 58 – 60%, khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi hàm ẩm 65 -68% Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm thì sẽ bị dính kết (khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy), dễ bị nhiễm vi sinh vật tạp nhiễm (bị lên men rượu…) Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn
Thanh trùng bằng hơi nhiệt: làm cho môi trường được tinh khiết hơn, về phương diện vi sinh vật và làm cho chín môi trường (tinh bột, protein) Thông thường người ta thanh trùng bằng hơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120 -130 0 C trong 2 -3 giờ
Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống: Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính kết Vì vậy phải làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy Yêu cầu thời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ nên ngoài Nhiệt độ yêu cầu cần đạt được để gieo giống là 25 – 30 0 C
Nuôi cấy nấm mốc: Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy Quy trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải thực hiện các điều kiện kĩ thuật đặc biệt và khắt khe hơn: nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp đôi) để nấm mốc hình thành bào tử và đều
Tiến hành quá trình nuôi cấy: Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi
(mành hay khay đục lỗ) rồi chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí cũng như mức độ thông khí Quá trình nuôi cấy nấm mốc kéo dài 33-48 giờ/mẻ được trải qua 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: Từ khi nuôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ 10-12, xảy ra sự trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm Để đảm bảo bào tử nảy mầm nhanh và hạn chế nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu từ 55 – 60%, 𝜑 = 96 -100%, T = 30-32 0 C
+ Giai đoạn 2: Kéo dài trong 10 -1 8 giờ, nấm mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt và trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ chất ) dẫn đến hiện tượng kết bánh Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO2, Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhóm 10 Trang 21 nhiệt độ phòng tăng lên 38 – 40 0 C Để khống chế nhiệt dộ thích hợp 28 – 30 0 C cần thông gió ( quạt), bão hòa ẩm không khí phòng nuôi
+ Giai đoạn 3: Kéo dài từ 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra enzyme nhiều nhất Cường độ trao đổi chất giam đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khi nấm mốc đạt độ già chin sinh lí và bắt đầu tạo thành bào tử
Thu nhận chế phẩn enzyme thô: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme thô, chế phẩm này được gọi là enzyme thô ( vì ngoài thành phần enzyme ra còn chưa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường) Để đảm bảo chế phẩm enzyme pectinase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp, thường sử dụng sấy phun với chất tải nhiệt đi vào đạt 165-180 0 C, đi ra đạt 60-70 0 C, thời gia lưu của chế phẩm enzyme không quá 7 giây với nhiệt độ chế phẩm không quá 40 0 C, được đóng gói kín để tránh hút ẩm Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không cần phải qua quá trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta cần phải tiến hành làm sạch enzyme, để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau:
+ Toàn bộ khối lượng enzyme thô pectinase được đem đi nghiền nhỏ Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm thô các thành phần của chế phẩm thô, khi thành phần tế bào phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát ra khỏi tế bào Phần lớn enzyme pectinase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phân môi trường Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi thành phần này dễ dàng hơn
+ Trong khi nhiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100 0 C để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật
Trích ly: Sau khi nghiền mịn người ta cho vào nước để trích ly enzyme pectinase Các loại enzyme thủy phân có khả năng hòa tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, người ta cho 4 -5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn) Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó chứa nước và các chất hòa tan khác từ khối lượng môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này
Quá trình kết tủa enzyme pectinase:
+ Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme pectinase nhờ những tác nhân gây kết tủa Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ hơn những tác nhân gây kết tủa khác
Quy trình tách chiết và làm sạch
Các dạng chế phẩm enzyme:
+ Chế phẩm thô từ canh trường lỏng
+ Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt
Chế phẩm kĩ thuật: Là chế phẩm được tinh chế sơ bộ, trong đó một số enzyme và protein đã được tách ra Trong chế phẩm kĩ thuật thường chưa một vài enzyme chủ yếu Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Chế phẩm tinh khiết: Là chế phẩm trong đó chỉ chưa một loại enzyme nhất định với hàm lượng cao Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô Chế phẩm thô thường chứa những thành phần cơ bản sau:
+ Nước chiếm khối lượng lớn nhất
+ Protein không có hoạt tính sinh học
+ Các tạp chất từ tế bào (nếu là nguồn động thực vật), từ môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn vi sinh vật)
+ Enzyme ( hay protein có hoạt tính sinh học cao): Quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba thành phần đầu, chỉ nhận sản phẩm là enzyme mong muốn (trong đó phần lớn enzyme tạp đã được loại bỏ) Việc loại ba thành phần đầu không thể cũng thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme mong muốn ra khỏi hỗn hợp, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo Ý nghĩa của kĩ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme:
Các kỹ thuật tinh sạch thường đưa lại những kết quả quan trọng sau:
+ Khối lượng chế phẩm enzyme được giảm dần qua từng bước tinh sạch
+ Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sử dụng sau này
+ Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm
+ Tạo những chế phẩm tính khiết nhằm mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong y học…
Từ canh trường bề mặt
Vi sinh vật: Botryti8 cinerea; Penicilium expanrum và Aspergillus aureus
30 g mẫu của môi trường được tách với 300 ml nước cất
Enzyme được kết tủa từ hai cách:
+ Cách 1: thêm vào 5 lần thể tích dung dịch ethanol 95% Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
+ Cách 2: 70 g (NH4)2SO4/100ml dịch chiết
Vi sinh vật: Aspergillus awamori
Sử dụng rượu ethanol ( 72,5 – 77%) hoặc isopropanol (55-57%) Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%
Sử dụng muối ammonium sunfat có đọ bão hòa là 0,79 Khi kết tủa bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 95%
Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2 -5 0 C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt Sau đó ly tâm để tách kết tủa ra khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản
Từ canh trường bề sâu
Thu lọc dịch canh trường
Phối trộn canh trường với ethanol theo tỉ lệ 1-4, với aceton theo tỉ lệ 2-1 và isopropanol thoe tỉ lệ 1,3 -1 hoặc với ammonium sunfat (50 – 80% trong muối kết)
Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88 -90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu
Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn thì chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao
3.1.3 Ứng dụng phương pháp thẩm tích trong tinh sạch pectinase
Chế phẩm pectinase sau khi được kết tủa bằng nuối (NH4)2SO4 được cho vào túi tẩm tích; rồi đặt túi đó vào dung dịch có chứa polymer cacboxyl methyl cellulose, polyetylenglycol (PEG) là những polymer có tính háo nước nên dùng để cô đặc enzyme
Kết tủa ái lực là phương pháp phân tách dựa trên sự tạo phức giữa một phối từ ái lực với protein cần tách nằm trong dịch mô enzyme thô, sau đó phứ này sẽ được kết tủa bằng cách thêm vào một tác nhân hợp lý
Alginate là copolymer của acis guluronic và acid manutonic, tạo kết tủa với ion Ca 2+ , được dùng để liên kết với pectinase trong quá trình tinh sạch (đi từ A.niger) Nêu xử lý Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhóm 10 Trang 25 alginate bằng vi song ở nhiệt độ 75 0 C sẽ làm tăng khả năng chọn lọc, chế phẩm enzyme thu được có tỷ lệ tinh sạch 20 lần và giữ được 83% hoạt tính
Chuẩn bị dung dịch alginate
Alginate đượ hòa tan vào đệm acetate 0,05M với pH5,0 với tỉ lệ 2% (w/v) Dung dịch này được đem bảo quản ở 4 0 C và có thể được pha loãng khi sử dụng
Kết tủa ái lực pectinase hai pha bằng alginate
Cho pectin vào 0,4ml dung dịch alginate, định mức thành 4 ml bằng đệm acetate 0,05% với pH =5,0 của hỗn hợp được chỉnh về 3,8 bằng acid acetic 3M vì đây là pH tối ưu để enzyme kết hợp với alginate Ủ hỗn hợp ở 25 0 C trong 1 h Thêm vào 0,4 ml dung dịch CaCl2 1M tạo kết tủa Tách kết tủa bằng máy ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút, trong 10 phút, rửa 3 lần bằng 4 ml đệm acetate 0,05 M, pH 5,0 có chứa CaCl2 0,1M
Phức pectinase – alginate thu được đem hòa tan vào 6 ml đệm acetate 0,05M, pH 5,0 có chứa NaCL 1M, đem ử ở 4 0 C trong 18h Sau đó, alginate sẽ bị kết tủa và được lấy ra khỏi hốn hợp Các muối (NaCl và CaCl2) sẽ được tách bằng cách cho qua cột Sephadex
Kết tủa ái lực pectinase ba pha bằng alginate
Hòa tan dung dịch enzyme thô với alginate, 1% w/v (alginate đóng vai trò là phối từ liên kết ai lực) Sauk hi hòa tan, alginate sẽ liên kết đặc hiệu với pectinase trong dung dịch Tiếp theo, ta cho vào dung dịch t – butanol ( tỉ lệ 2 :1) và cho vào (NH4)2SO4 với tỉ lệ 30% (w/v) Khuấy trộn đều các pha sẽ tách ra, khi đó ta sẽ tách pha trung gian có hòa tan phức alginate và pectinase Rồi đem phức đó đi tách rửa với dung dịch NaCl 1 M ở nhiệt độ 4 0 C trong vòng 18 giờ ta sẽ thu được pectinase tinh khiết
Trong phương pháp này, khi sử dụng alginate được ester háo làm phối từ ái lực có thể đtạ hiệu suất thu hồi 100% với tỷ lệ tinh sạch 4 lần Nếu kết tủa bằng alginate 1% cho hiệu suất 52% và tỷ lệ tinh sạch là 10 lần Mặt khác, sử dụng 0,5% alginate ester hóa cho tỷ lệ tính sạch chỉ là 7 lần nhưng có thể thu hồi 75% hoạt tính
Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp chất khác nhau của một hỗn hợp
Phép phân tích sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất định phân tách làm pha tĩnh
Tương tác giữa chất hòa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học Dựa vào kiểu liên kết người ta chia thành các kiểu sắc ký sau
+ Sắc ký lọc gel: (sắc ký loại trừ phân tử) phân đoạn protein theo klg
+ Sắc ký trao đổi ion: liên kết ion
+ Sắc ký ái lực: liên kết kỵ nước
+ Sắc ký hấp phụ: liên kết như liên kết kỵ nước, liên kết Van der Waals
Xác định hoạt độ của enzyme pectinase
Theo “Tạp chí phát triển và khoa học-công nghệ”, tập 11, số 08-2008, hai tác giả Huỳnh Ngọc Anh và Trần Ngọc Hùng, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Với đề tài “Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger – tinh sạch bằng phương pháp lọc gel và lọc màng”
Xác định hoạt độ của enzyme pectinase: Enzyme pectinase thô được xác định hoạt độ bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt kế Brookfield hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% (w/v) phản ứng với 18ml dung dịch pectin 1% ở pH 4,5 và nhiệt độ 40 o C Một đơn vi hoạt độ pectinase (UI) là lượng enzyme cần thiết làm giảm 10%, độ nhớt của hỗn hợp chứa 180mg pectin dưới những điều kiện như trên
Hình 4 Đồ thị tương quan giữa thời gian và hoạt độ enzyme thô
Thông số vật lý Exo-PG
Mr (Sự lọc gel – Gel sinh học P 100) 63 kDa 79 kDa
Nhiệt độ tối ứu 50 0 C 50 0 C pH tối ưu 5.0 5.8
185 U/mg Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase trên môi trường có chất cảm ứng là pectin của bột carrot bởi chủng Aspergillus niger có hoạt độ cao nhất sau 48 giờ (30,01 UI/g CPE)
Do đó, thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ nuôi cấy và sau đó đem tiến hành tinh sạch Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PECTINASE TRONG CÔNG NGHÊ THỰC PHẨM – NƯỚC QUẢ
Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới
Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme loài ngoài đã tăng nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng dùng enzyme trong công nghiệp Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme dùng vào trong công nghiệp ngày càng nhiều Các enzyme quan trọng sử dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình bày trong bảng sau:
Bảng 6 Mức độ ứng dụng của một số enzyme quan trọng trên thế giới
Trong số các loại enzyme được sản xuất và ứng dụng trên Thế giới thì các nước Châu Âu sản xuất và bán ra thị trường với số lượng nhiều nhất Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Bảng 7 Thị trường enzyme Châu Âu
Riêng trong công nghệ thực phẩm, lượng enzyme được tiêu thụ nhiều nhất Số lượng enzyme được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm chủ yếu ở các nước Châu Mỹ và Châu Âu
Bảng 8 Thị trường enzyme trong công nghệ thực phẩm, thức ăn gia súc trên thế giới Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Ứng dụng của enzyme Pectinase
Các chế phẩm của enzyme pectinase thường được sử dụng trong sản xuất nước quả, sản xuất rượu vang, trích ly đông dược (sắc thuốc) và trong chăn nuôi
3.2.1 Giới thiệu về ứng dụng ezyme Pectinase
Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase dưới dạng tinh khiết Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc sấy khô Tỷ lệ chế phẩm Pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0,03-0,05 đến 1,0%
Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong dịch quả rất dễ dàng do đó làm tăng hiệu suất của sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả sẽ làm tăng hiệu suất nước ép quả khi ép tới 15-20% Enzyme pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và các chất hòa tan nữa, do đó làm tăng them chất lượng thành phẩm
Tồn tại 3 nhóm enzyme pectinase phân giải pectin
Pectin methyl esterase (EC 3.1,1,11): enzyme thành tham gia phân giải pectin thành acid pectic và methanol Enzyme này còn có tên khác là pectiestenase (PE) Hiệu suất của enzyme này rất cao có thể đạt được đến 98%
+ Pectiestenase của nấm sợi hoạt động mạnh ở pH 3-5
+ Cả 3 loại enzyme này biến tính ở 80 0 C
+ Enzyme Pectin Depolymease có trong tế bào thực vật, tuy nhiên hiện nay người ta sản xuất enzyme này theo quy mô công nghiệp từ nấm sợi và từ vi khuẩn Chúng được phân làm 4 loại:
1/ Endo pectin traseliminase (EC, 4.2.2.3) viết tắt là PTE-pectiliase
2/ Endo pectin acid traseliminase (EC, 4.2.2.1) viết tắt là PATE
3/ Endo poly galacturonase (EC, 3.2.1.15) viết tắt là PMG
4/ Endo poly methyl galacturonase Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vào năm 1930
Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên phổ biến ở nhiều nước trên Thế giới Việc thu nhận nước quả từ trước tới nay chủ yếu là phương pháp ép nên nếu pectin có trong nước quả quá nhiều sẽ gây ra hiện tượng đục, có độ keo cao và khó lọc trong
Trong tế bào của quả nước chiếm 90-95% nên nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa Khi ta cho enzyme pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30% Nhiều trường hợp hiệu suất tăng đến 50% Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03-0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5-2% Nhiệt độ duy trì trong quá trình thủy phân là 43-45 0 C Thời gian thủy phân là 4-8h, dịch quả thu được bằng pectinase sẽ trong hơn, hiệu quả lọc cao hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ
Ứng dụng enzyme pectinase sản xuất nước quả
Trong sản xuất rượu vang và nước quả việc sử dụng enzyme là một bước tiến bộ khoa học rất lớn Các chế phẩm enzyme được sử dụng trong quá trình sản xuất nước quả và rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều loại enzyme hay từng loại enzyme riêng biệt phụ thuộc vào nguyên liệu và sản phẩm cần đạt tới Ngoài ra việc sử dụng các loại chế phẩm enzyme như trình bày còn phụ thuộc vào công nghệ sản xuất (các yếu tố kỹ thuật)
Trong sản xuất rượu vang và nước quả, người ta thường sử dụng 1 trong 6 loại enzyme sau:
+ Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được lượng sản phẩm lớn
+ Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phân hoàn toàn các pectin, protein, làm giảm độ nhớt và triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả
+ Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hóa nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả
+ Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất bán phẩm rượu vang nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm
+ Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hóa và làm cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang
+ Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong sản xuất siro thành phẩm Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Việc sử dụng các chế phẩm enzyme cần được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm Trong nhiều trường hợp việc sử dụng enzyme phải đảm bảo được việc giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theo ý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng enzyme Theo màu sắc tự nhiên, loại trái cây được chia làm 2 loại:
+ Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi,…
+ Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận đen, dâu… Để xử lý quả nghiền có màu nhạt người ta thường sử dụng 1 trong các loại enzyme sau: + Enzyme endo-PMG làm giảm độ nhớt của dịch quả
+ Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly
+ Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc
3.3.2 Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả
Từ các loại quả khác nhau, người ta thường chế biến thành các loại nước quả trong, nước quả đục Trước tiên cần chiết rút được dịch quả từ mô cơ bản, mô bì đôi hoặc đôi khi cả mô cơ học Do đó, hiệu suất chiết rút dịch quả sẽ phụ thuộc vào khả năng thấm của tế bào, cấu tạo giải phẩu và tính chất cơ lý của nguyên liệu, độ nhớt của chính dịch quả, độ chắc của thịt quả cũng như thành phần định tính và định lượng của pectin chứa trong dịch bào và trong thành tế bào của mô quả Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm pectinase phải có enzyme endo và exo-polygalacturonse, enzyme pectinestenaza Trong chế phẩm loại này thì những enzyme kể trên là những enzyme quyết định hiệu quả của chế phẩm Vì enzyme endo và exo-polygalacturonse sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzyme PE cũng góp phần vào tác dụng của enzyme này Enzyme proteinase của chế phẩm sẽ thủy phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ dàng
Sự có mặt của cenlluase và hemixenlulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc Khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì chế phẩm không được có enzyme protopectinase vì nếu có sẽ phân hủy protopectin làm mềm hóa mô quả, tăng độ nhớt của dịch quả nên làm giảm hiệu suất lấy nước quả trong Ngược lại khi sử dụng cho các loại quả mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzyme PTE lại cần thiết vì enzyme này sẽ làm mùn hóa tế bào làm cho tính thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Ngoài ra nước quả không được phép chứa các enzyme oxy hóa(ascobatoxydase, polyphenoloxydase, peroxidase) làm hao tổn vitamin C và sẫm màu, biện pháp sử dụng nhiệt (đun nóng) sẽ vô hoạt hóa hệ enzyme này
Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzyme PTE, cenlluase và hemixenlulase lại là những enzyme quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm, trong đó vai trò dẫn động là ezyme PTE có tác dụng phân hủy protopectin của mô quả Hemixenlulase và cenlluase sẽ cùng với PTE làm cho độ đồng thể của nước quả có màu sang thể trong, chế phẩm không chứa enzyme oxy hóa, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antoian thì không chứa các ezyme phá hủy các chất này Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzyme pectinase thì người ta thường nghiền thịt quả, xử lý bằng chế phẩm enzyme pectinase sau đó mới đem cắt, ly tâm hay ép Trong trường hợp sử dụng enzyme người ta có thể nghiền nhỏ tới mức tối đa, chủ yếu để thuận lợi cho tác dụng của enzyme
Dùng pectinase còn có tác dụng làm trong do sự phá hủy hệ keo trong nước quả, vị của quả tốt hơn và ít bị đục trở lại
Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể chia làm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn “Bất ổn định hóa” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một cách sâu sắc gọi là “phá vỡ”
- Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi kết tủa hoàn toàn
- Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt của các pectin kết tủa bởi ion canxi
Sử dụng enzyme để sản xuất nước quả thanh trùng uống trực tiếp từ quả táo hay quả vải
Ngày nay, nước quả trong hay nước quả đục được sản xuất ở nhiều nước trên Thế giới Tùy theo hàm lượng đường và acid có trong nước quả người ta chế tạo nước quả có hàm lượng đường và acid thấp rồi bổ sung đường và acid điều chỉnh chất lượng cuối cùng của sản phẩm Hàm lượng pectin trong sản phẩm cao không có lợi vì nó tạo độ nhớt trong sản phẩm rất cao nên việc thủy phân dịch quả còn làm cho sản phẩm dịch quả không bị đục Tuy nhiên việc xử lý pectin bằng pectinase không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần giữ 1 lượng nhất định trong sản phẩm nước quả Chính lượng pectin này làm cho chất lượng dịch quả tốt hơn
Trong sản xuất nước táo và nước vải người ta sử dụng chế phẩm pectinase cho hiệu quả rất cao Khi xử lý nước quả ở 50 0 C trong 2 giờ, hiệu suất tách nước quả tăng 20%, ở 37-
40 0 C trong 2-4 giờ thì tăng 20-25% Đặc biệt đối với nước táo hiệu quả rất cao nên Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhóm 10 Trang 38 enzyme pectinase được ứng dụng ở tất cả các nhà máy sản xuất nước táo trên Thế giới( trong khi xử lý bằng pectinase thì người ta thường cho thêm ascorbic acid vào chống quá trình oxy hóa của nước quả táo
Bảng 9 Hiệu quả xử lý nước quả bằng chế phẩm enzyme pectinase
Sản xuất nước quả uống ngay từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử
Người ta thường sản xuất cả dạng nước quả trong và nước quả đục từ các loại trái cây trên Trong quá trình sản xuất thì người ta thường cho thêm đường và acid để điều vị sản phẩm cho phù hợp
Các loại nước quả này thường chứa nhiều pectin do đó việc sử dụng các chế phẩm enzyme pectinase sẽ dễ dàng loại bỏ khả năng gây đục cho nước quả cũng như ổn định và nâng cao chất lượng dịch quả là điều cần thiết
Các nhãn hàng nước quả đang có trên thị trường
Nhãn hàng Vfresh – Công ty Cổ phần sữa Việt Nam (Vinamilk) Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhãn hàng Juicie – Công ty Tân Hiệp Phát
Nhãn hàng Minute Maid Teppy – Công ty Coca Cola Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………
Nhãn hàng Twister – Công ty Pepsico Ứng dụng CNSH trong CNTP GVHD: ………