Kỹ Thuật - Công Nghệ - Y khoa - Dược - Quản trị kinh doanh Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (4A): 887-897, 2012 887 MỘT SỐ HỆ THỐNG NUÔI CẤY TRONG NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH RỄ BẤT ĐỊNH VÀ RỄ THỨ CẤP CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Dương Tấn Nhựt 1 , Nguyễn Cửu Thành Nhân1 , Hoàng Xuân Chiến1 , Nguyễn Phúc Huy 1 , Nguyễn Bá Nam1 , Trần Xuân Ninh2 , Phạm Phong Hải2 , Vũ Quốc Luận1 , Phan Quốc Tâm1 , Vũ Thị Hiền1 , Trịnh Thị Hương 1 , Trần Công Luận3 , Paek Kee Yoeup4 1 Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2 Đại Học Yersin Đà Lạt, Việt Nam 3 Trung tâm Sâm và Dược liệu, Việt Nam 4 Khoa Cây trồng, Đại học Quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc TÓM TẮT Sinh khối rễ sâm in vitro có chứa các hợp chất saponin đã và đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất rộng rãi các sản phẩm về sâm trên thế giới. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện với mục đích sản xuất sinh khối rễ sâm từ nguồn nguyên liệu ban đầu là rễ bất định và rễ thứ cấp. Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu thích hợp cho sự hình thành rễ bất định ban đầu là mô sẹo có nguồn gốc trực tiếp từ lá (20,4 rễmẫu). Môi trường thích hợp cho quá trình hình thành rễ bất định là môi trường SH bổ sung 3 mgl NAA và 30 gl sucrose. Rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh đã được tạo thành và so sánh thông qua nuôi cấy trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít). Hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc với thể tích môi trường 2 lít và khối lượng mẫu ban đầu 11,01 g cho kết quả sinh khối rễ tăng cao nhất (103,59 g). Sắc ký lớp mỏng cho thấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro có chứa cả 3 loại saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh tự nhiên đó là MR2 , G-Rb1 và G-Rg1. Từ khóa: bioreactor Hàn Quốc, bioreactor BioPia, G-Rb1 , G-Rg 1, MR 2 , mô sẹo, Panax vietnamensis, rễ bất định, rễ thứ cấp, saponin. MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh là loài sâm quý của Việt Nam đã được đồng bào dân tộc ở khu vực núi Ngọc Linh sử dụng làm thuốc từ rất lâu với tên gọi là cây thuốc giấu, loài sâm này đã được nghiên cứu và đánh giá là có giá trị dược liệu tương đồng như các loài sâm quý trên thế giới (Nguyễn Thượng Dong et al ., 2007). Hiện nay nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh còn rất hạn chế do loài sâm này chỉ được trồng tập trung ở vùng núi Ngọc Linh và thời gian từ lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến 5 - 6 năm. Do tình trạng khai thác quá mức, sâm Ngọc Linh hiện đang nằm trong 250 loài quý hiếm, đang có nguy cơ bị tuyệt chủng trong Sách đỏ Việt Nam. Do đó, yêu cầu tìm được những kỹ thuật mới giúp thu được sinh khối sâm mang dược tính nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết. Nuôi cấy rễ bất định được xem như là phương pháp hiệu quả nhất cho việc sản xuất sinh khối vì chúng sinh trưởng nhanh và sản xuất hợp chất ổn định (Asaka et al ., 1993) . Rễ bất định thu được trong nuôi cấy in vitro đã được thực hiện trên nhiều đối tượng cây dược liệu nhằm hướng tới việc sản xuất nguyên liệu nhân tạo (Carvalho, Curits, 1998; Choi et al ., 2000). Trên đối tượng cây sâm Triều Tiên các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu các hệ thống nuôi cấy bioreactor (10.000 lít) để thu nhận sinh khối rễ thứ cấp và đã ứng dụng hệ thống này trong sản xuất thương mại (Carvalho, Curits, 1998). Trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh hiện tại chưa có những thông tin chính thống nào nghiên cứu trên quy mô lớn sản xuất rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor có thể tích lớn. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thiết lập quy trình nhân nhanh rễ bất định và rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor để có thể thu nhận sinh khối sâm Ngọc Linh trong một thời gian ngắn với số lượng lớn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nguồn mẫu ban đầu Nguồn mẫu ban đầu là mô sẹo được cảm ứng từ mẫu lá ex vitro của cây sâm Ngọc Linh (mô sẹo cấp 1) được trồng tại Viện Sinh học Tây Nguyên và mô Dương Tấn Nhựt et al. 888 sẹo được cấy chuyền nhiều lần (mô sẹo được cấy chuyền từ 2 lần trở lên với nguồn mô sẹo được cảm ứng từ lá) trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm (Dương Tấn Nhựt et al ., 2010). Mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần nhằm loại bỏ các mô sẹo già và tạo nguồn mẫu đồng đều về kích thước và trạng thái. Mô sẹo được chọn để chuyển sang môi trường tạo rễ có màu vàng nhạt và xốp. Mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá có màu xanh lá và cứng. Mô sẹo cấy chuyền trên môi trường tạo rễ có kích thước khoảng 1,0 x 1,0 cm, khối lượng tươi 0,400 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,048 ± 0,001 g đối với mô sẹo đã được cấy chuyền nhiều lần; khối lượng tươi 0,320 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,030 ± 0,001 g đối với mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá. Môi trường nuôi cấy Môi trường phát sinh rễ: môi trường khoáng SH (Schenk, Hildebrandt, 1972) bổ sung 3,0 mgl NAA, tùy vào nuôi cấy lỏng hay bán rắn mà bổ sung thêm agar (8 gl), đường sucrose được bổ sung theo từng nghiệm thức và pH môi trường được chỉnh ở khoảng 5,7 - 5,8 (Nhut et al ., 2006). Môi trường sau đó được hấp vô trùng ở 121°C, 1 atm trong vòng 30 phút. Điều kiện nuôi cấy Các mẫu cấy phát sinh rễ bất định và hệ thống nuôi cấy bioreactor được đặt trong phòng tối hoàn toàn. Nhiệt độ phòng nuôi cấy là 23 ± 2°C; độ ẩm trung bình 75 - 80. Hệ thống nuôi cấy Bình tam giác 3 lít cho nghiệm thức nuôi cấy môi trường bán rắn và lỏng lắc. Bioreactor BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) cho nghiệm thức nuôi cấy môi trường lỏng sục khí. Phương pháp Khảo sát khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy chuyền Nhằm xác định nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho quá trình phát sinh rễ bất định trong cùng điều kiện nuôi cấy. Trong thí nghiệm này nguồn mẫu mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo đã cấy chuyền nhiều lần được cắt nhỏ thành các kích thước đồng đều nhau. Mẫu cấy được cấy vào môi trường tạo rễ bất định. Mỗi bình cấy 3 - 4 mẫu, mỗi thí nghiệm được lặp lại 5 lần. Các chỉ tiêu như khả năng tạo rễ trên các mẫu cấy, số lượng rễ bất định hình thành trên mỗi mẫu được thu nhận sau 8 tuần. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn Mô sẹo được cắt theo kích thước 1,0 x 1,0 cm, nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 3,0 mgl NAA, 8 gl agar và bổ sung đường sucrose ở các nồng độ từ 0 đến 40 gl. Mỗi bình nuôi cấy được cấy 3 mẫu, mỗi thí nghiệm được lặp lại 5 lần. Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ, số lượng rễ trên mỗi mẫu cấy được thu nhận sau 8 tuần. So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định và rễ thứ cấp trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít) Rễ bất định hình thành trên các mẫu mô sẹo được cấy chuyền vào các hệ thống được trình bày trong bảng 1 với cùng thể tích nuôi cấy và các dạng nuôi cấy khác nhau: bán rắn, lỏng lắc và lỏng có sục khí. Cách cấy mẫu được tiến hành như sau: cụm rễ bất định được cấy vào bình tam giác 250 ml để chuẩn bị và được cấy chuyền vào các hệ thống nuôi cấy. Môi trường trong các hệ thống là môi trường SH có bổ sung 3,0 mgl NAA và 30 gl sucrose. Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ thứ cấp trên các rễ bất định, số lượng rễ thứ cấp trên mỗi mẫu cấy, tỷ lệ tăng sinh khối trong các hệ thống khác nhau được thu nhận sau thời gian nuôi cấy là 10 tuần. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Thể tích môi trường nuôi cấy trong bioreactor Hàn Quốc được thay đổi từ 1 đến 2 lít, khối lượng mẫu cấy ban đầu là 11 ± 0,4 g. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ tăng sinh khối rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy vào môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về thể tích nhưng khác nhau về khối lượng mẫu đưa vào ban đầu (Bảng 2). Chỉ tiêu theo dõi là khả năng tăng sinh rễ bất định và tạo rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy. Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (4A): 887-897, 2012 889 Bảng 1. Thể tích và môi trường nuôi cấy trong 2 hệ thống khác nhau. STT Hệ thống nuôi cấy Khối lượng mẫu cấy (g) Tỷ lệ mẫu cấymôi trường () Dạng nuôi cấy 1 Bình tam giác (3 lít) 12,03 1,2 Bán rắn 2 Bình tam giác (3 lít) 10,56 1,1 Lỏng lắc 3 Bioreactor BioPia 12,94 1,3 Lỏng, sục khí 4 Bioreactor Hàn Quốc 11,49 1,2 Lỏng, sục khí Bảng 2. Tỷ lệ mẫu cấy khác nhau trong hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc (3 lít). STT Thể tích môi trường (lít) Khối lượng mẫu ban đầu (g) Tỷ lệ mẫumôi trường () 1 2 5,37 0,27 2 2 11,01 0,55 Định tính saponin trong sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh được nuôi cấy trong các hệ thống bioreactor BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Chuẩn bị bản mỏng silica gel Cắt tấm silica gel với kích thước phù hợp, cách mép dưới 1 cm kẻ một đường thẳng, phía dưới đường thẳng ghi tên các chất cần sắc ký, ở sát mép trên ghi tên dung môi, bản mỏng Silica gel 60F256 . Hệ dung môi khai triển Sử dụng 2 hệ dung môi khai triển là chloroform : methanol : nước (65 : 35 : 10) và n-butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 5). Thể tích chấm: 10 μl dung dịch chiết của dịch môi trường, 10 μl dung dịch chiết từ mô sẹo sâm và 2 μl dung dịch các chất chuẩn. Phát hiện Phun thuốc thử H2 SO4 10 trong Ethanol 96, sấy ở 105°C đến khi xuất hiện vết và quan sát dưới ánh sáng thường. Tiến hành Dịch chiết của dịch môi trường: dịch môi trường được cô đến cắn. Hòa cắn với 100 ml nước cất, siêu âm hòa tan hết cắn. Dịch nước lắc với ether ethylic, loại dịch ether. Dịch nước lắc tiếp với n-butanol bão hòa nước. Dịch n-butanol bão hòa nước được cô đến cắn. Hòa cắn với 1 ml methanol làm dung dịch thử (Dịch A). Dịch A sau khi chấm sắc kí tập trung cho qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch C). Dịch chiết từ sinh khối rễ sâm: rễ sâm được sấy khô trong tủ sấy ở 50°C đến khô. Rễ sâm được nghiền nát và sấy khô trong methanol và lọc. Dịch lọc cô còn 1 ml làm dung dịch thử (Dịch B). Dịch B sau khi chấm sắc kí tập trung cho qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch D). Dịch chiết các chuẩn MR2 , G-Rb1 , G-Rg 1 : hòa 2 mg các chuẩn MR2 , G-Rb1 , G- Rg1 trong 10 ml methanol làm dung dịch chuẩn. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1955) với P = 0,05. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy chuyền Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy loại mẫu cấy mô sẹo có ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành rễ bất định cũng như số rễ hình thành trên mẫu. Mẫu cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng phát sinh rễ bất định cao hơn (100) so với mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần và số rễ bất định hình thành trên mẫu cấy từ mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá (20,40 rễmẫu) (Hình 3a) nhiều hơn so với số rễ hình thành trên mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần (5,80 rễmẫu) (Bảng 3). Khả năng phát sinh rễ bất định đồng đều hơn trên mô sẹo có nguồn gốc từ lá. Mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có màu trắng và xốp hơn so với mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần trên cùng môi trường nuôi cấy. Chính vì vậy, hình thái rễ phát sinh trên 2 loại mẫu mô sẹo cũng có sự khác biệt rõ rệt. Rễ hình thành trên mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng duy trì trạng thái cảm ứng và tiếp tục kéo dài, rễ có màu trắng từ khi phát sinh cho đến cuối giai đoạn thu nhận sinh khối. Bên cạnh Dương Tấn Nhựt et al. 890 đó, rễ phát sinh từ mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần lại có con đường phát triển khác biệt, rễ có dấu hiệu của sự già hóa (chuyển sang màu vàng) và phát sinh thêm rễ thứ cấp. Điều này có thể được giải thích là do mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần, hormone nội sinh suy giảm do quá trình hấp thu hormone ngoại sinh từ môi trường nuôi cấy, từ đó đã làm giảm khả năng biệt hóa và kéo dài rễ bất định khi cảm ứng từ mẫu cấy mô sẹo này. Mặt khác, mẫu cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá ex vitro , hormone nội sinh vẫn còn được duy trì, tế bào mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá vẫn còn khả năng cảm ứng biệt hóa mạnh hơn, vì vậy khả năng phát sinh và kéo dài rễ bất định cũng mạnh hơn. Các mẫu cấy thường phản ứng khác nhau dưới tác động của auxin ngoại sinh, nhưng đa phần đều chịu ảnh hưởng bởi loại mẫu, tuổi của mẫu, dạng auxin sử dụng và thời gian tiếp xúc (Nemeth, 1986). Nguyễn Thị Liễu và đồng tác giả (2011) đã nuôi cấy thành công rễ bất định trên nguồn mẫu là mô sẹo hình thành từ củ ex vitro , tuy nhiên khi so sánh thì số rễ hình thành (16,5 rễmẫu) không cao so với nghiên cứu này (20,40 rễmẫu). Như vậy, nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho khả năng hình thành rễ bất định là mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá. Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu cấy mô sẹo lên khả năng phát sinh rễ bất định của cây sâm Ngọc Linh. Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan. Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn Đường là cơ chất quan trọng trong các con đường biến dưỡng ở thực vật, tùy vào mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật mà nó được sử dụng nhiều hay ít. Rễ là cơ quan đặc biệt ở thực vật hầu như không có diệp lục tố, vì vậy nhu cầu về đường của chúng thường là cao hơn ở các cơ quan khác. Mặt khác, nồng độ đường trong môi trường còn ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu và khả năng hút chất dinh dưỡng và nước ở thực vật (Bùi Trang Việt, 2002). Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn từ mẫu cấy là mô sẹo. Sucrose (gl) Tỷ lệ phát sinh rễ bất định () Số rễmẫu 0 0 0 10 0 0 20 50 2,20b 30 90 6,00a 40 0 0 Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P=0,05 bằng phép thử Duncan. Ở các nghiệm thức khi bổ sung sucrose ở nồng độ 10 gl và đối chứng không đường cho thấy mẫu cấy không có khả năng cảm ứng tạo rễ bất định. Ngoài ra, mẫu cấy có hiện tượng thủy tinh thể, điều này có thể được giải thích là khi mẫu cấy không được cung cấp năng lượng cho các hoạt động trao đổi chất của tế bào, các kênh dẫn truyền và trao đổi các chất không hoặc giảm hoạt động, chúng mất đi khả năng tự cân bằng hàm lượng nước giữa tế bào và môi trường dẫn đến sự trương nước trong tế bào. Đây là nguyên nhân gây nên hiện tượng thủy tinh thể ở mẫu cấy. Khi gia tăng nồng độ đường trong môi trường từ 20 - 40 gl đã có sự hình thành rễ bất định, mẫu cấy mô sẹo vẫn duy trì được trạng thái ban đầu (vàng, xốp). Tỷ lệ hình thành rễ bất định (90) và số rễ bất định đạt cao nhất (6 rễmẫu) ở nồng độ 30 gl so với các nghiệm thức bổ sung 20 gl và 40 gl đường sucrose (Bảng 4). Theo Khuri và Moorby (1995), nguồn cacbon tốt nhất và phổ biến nhất trong nuôi cấy in vitro là sucrose ở nồng độ khoảng 2 - 5, chủ yếu tập trung ở rễ và hấp thụ nhanh. Trong khi đó sử dụng glucose và fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm cho sự hấp thụ hexoses không đầy đủ và sự hấp thụ hexoses không đầy đủ xuất hiện vào giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy sẽ làm gián đoạn sự hình thành rễ và được ghi nhận bởi các nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau: Panax ginseng (Inomata et al., Nguồn gốc mô sẹo Tỷ lệ phát sinh rễ () Số rễmẫu Trực tiếp từ lá 100 20,40a Cấy chuyền nhiều lần 80 5,80b Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (4A): 887-897, 2012 891 1993), Catharanthus roseus (Jung et al., 2005), Datura stramonium (Holmes et al., 1997) và Erythrorhizon (Sim, Chang, 1997). Sự xuất hiện của hexoses trong môi trường thì thường liên quan đến sự gia tăng hoạt động của vách tế bào đã được mô tả trong nuôi cấy nhiều loại mô khác nhau và đặc biệt là nuôi cấy lỏng (Wendler et al ., 1990). Mối liên hệ của việc gia tăng vách tế bào cùng với sự xuất hiện của hexoses đã được chứng minh trong nuôi cấy phát sinh rễ bất định từ callus của Panax ginseng (Odnevall, Bjork, 1989). Thí nghiệm đã cho thấy rõ vai trò quan trọng của đường đối với sự hình thành và phát triển của rễ. Tuy nhiên khi nồng độ đường quá cao, khả năng phát sinh rễ trên mẫu cấy lại suy giảm, điều này phù hợp với những nghiên cứu của Hahn và đồng tác giả (2003) trên rễ của cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Meyer). Như vậy, nồng độ đường sucrose tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định là 30 gl. So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít) Sự hình thành rễ bất định là một sự biến đổi sâu sắc về hoạt động mô học, những tế bào cùng chung một tổ chức được tách ra khỏi sự kiểm soát và đi vào một chức năng khác cho phép sự hình thành cấu trúc đỉnh sinh trưởng sơ khởi. Trong đa số trường hợp nó có nguồn gốc nội sinh, tức là nó khởi đầu từ trụ giữa hoặc ở mô dẫn truyền (Võ Thị Bạch Mai, 2004). Nghiên cứu của Teisson và Alvard (1995) cho thấy khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện thoáng khí và được cung cấp dinh dưỡng liên tục thì có khả năng phát triển tốt hơn so với các mẫu cấy trên môi trường bán rắn và lỏng lắc. Mẫu cấy trên môi trường bán rắn cho thấy có khả năng hình thành rễ bất định thấp và không đồng đều, thời gian duy trì mẫu cấy lâu trên môi trường dẫn đến sự già hóa của mẫu cấy, mẫu cấy không sử dụng hết được các chất dinh dưỡng trong cùng thể tích môi trường nuôi cấy như các hệ thống khác, đây là nhược điểm của hệ thống nuôi cấy bán rắn, vì vậy phải cấy chuyền liên tục. Mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy lỏng lắc thì lại không có sự phát triển và hình thành rễ trên mẫu cấy do sự ngập chìm hoàn toàn trong môi trường, mẫu có dấu hiệu hóa nâu và chết, các rễ bất định đã hình thành trên mẫu bị đứt ra khỏi mẫu cấy và không có khả năng hình thành rễ thứ cấp. Trong 2 hệ thống bioreactor Hàn Quốc và BioPia, mẫu cấy có khả năng tăng sinh tốt hơn, hình thái rễ bất định và rễ thứ cấp tốt hơn đối với các nghiệm thức môi trường bán rắn và lỏng lắc (Hình 3b, e) (Bảng 5). Mẫu mô sẹo phát sinh rễ bất định tiếp tục phát sinh thêm ...
Trang 1MỘT SỐ HỆ THỐNG NUÔI CẤY TRONG NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH RỄ BẤT ĐỊNH
VÀ RỄ THỨ CẤP CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.)
Dương Tấn Nhựt1, Nguyễn Cửu Thành Nhân1, Hoàng Xuân Chiến1, Nguyễn Phúc Huy1, Nguyễn Bá Nam1, Trần Xuân Ninh2, Phạm Phong Hải2, Vũ Quốc Luận1, Phan Quốc Tâm1, Vũ Thị Hiền1, Trịnh Thị Hương1, Trần Công Luận3, Paek Kee Yoeup4
1
Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2
Đại Học Yersin Đà Lạt, Việt Nam
3
Trung tâm Sâm và Dược liệu, Việt Nam
4
Khoa Cây trồng, Đại học Quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc
TÓM TẮT
Sinh khối rễ sâm in vitro có chứa các hợp chất saponin đã và đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu
để sản xuất rộng rãi các sản phẩm về sâm trên thế giới Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện với mục đích sản xuất sinh khối rễ sâm từ nguồn nguyên liệu ban đầu là rễ bất định và rễ thứ cấp Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu thích hợp cho sự hình thành rễ bất định ban đầu là mô sẹo có nguồn gốc trực tiếp từ lá (20,4 rễ/mẫu) Môi trường thích hợp cho quá trình hình thành rễ bất định là môi trường SH bổ sung 3 mg/l NAA và 30 g/l sucrose Rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh đã được tạo thành và so sánh thông qua nuôi cấy trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau [bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít)] Hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc với thể tích môi trường 2 lít và khối lượng mẫu ban đầu 11,01 g cho kết quả sinh khối rễ tăng cao nhất (103,59 g) Sắc ký lớp mỏng cho thấy rễ bất định và rễ thứ cấp
sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro có chứa cả 3 loại saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh tự nhiên đó là MR2 , G-Rb1 và G-Rg1
Từ khóa: bioreactor Hàn Quốc, bioreactor BioPia, G-Rb 1 , G-Rg 1 , MR 2 , mô sẹo, Panax vietnamensis, rễ bất định, rễ thứ cấp, saponin
MỞ ĐẦU
Sâm Ngọc Linh là loài sâm quý của Việt Nam đã
được đồng bào dân tộc ở khu vực núi Ngọc Linh sử
dụng làm thuốc từ rất lâu với tên gọi là cây thuốc giấu,
loài sâm này đã được nghiên cứu và đánh giá là có giá
trị dược liệu tương đồng như các loài sâm quý trên thế
giới (Nguyễn Thượng Dong et al., 2007) Hiện nay
nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh còn rất hạn chế do
loài sâm này chỉ được trồng tập trung ở vùng núi
Ngọc Linh và thời gian từ lúc trồng từ hạt cho đến khi
thu được củ lên đến 5 - 6 năm Do tình trạng khai thác
quá mức, sâm Ngọc Linh hiện đang nằm trong 250
loài quý hiếm, đang có nguy cơ bị tuyệt chủng trong
Sách đỏ Việt Nam Do đó, yêu cầu tìm được những kỹ
thuật mới giúp thu được sinh khối sâm mang dược
tính nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết
Nuôi cấy rễ bất định được xem như là phương
pháp hiệu quả nhất cho việc sản xuất sinh khối vì
chúng sinh trưởng nhanh và sản xuất hợp chất ổn định
(Asaka et al., 1993) Rễ bất định thu được trong nuôi
cấy in vitro đã được thực hiện trên nhiều đối tượng
cây dược liệu nhằm hướng tới việc sản xuất nguyên
liệu nhân tạo (Carvalho, Curits, 1998; Choi et al.,
2000) Trên đối tượng cây sâm Triều Tiên các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu các hệ thống nuôi cấy bioreactor (10.000 lít) để thu nhận sinh khối rễ thứ cấp và đã ứng dụng hệ thống này trong sản xuất thương mại (Carvalho, Curits, 1998) Trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh hiện tại chưa có những thông tin chính thống nào nghiên cứu trên quy mô lớn sản xuất
rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor có thể tích lớn Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thiết lập quy trình nhân nhanh rễ bất định và rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor để có thể thu nhận sinh khối sâm Ngọc Linh trong một thời gian ngắn với số lượng lớn VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Nguồn mẫu ban đầu
Nguồn mẫu ban đầu là mô sẹo được cảm ứng từ
mẫu lá ex vitro của cây sâm Ngọc Linh (mô sẹo cấp
1) được trồng tại Viện Sinh học Tây Nguyên và mô
Trang 2sẹo được cấy chuyền nhiều lần (mô sẹo được cấy
chuyền từ 2 lần trở lên với nguồn mô sẹo được cảm
ứng từ lá) trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo để
tiến hành các thí nghiệm (Dương Tấn Nhựt et al.,
2010) Mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần nhằm loại
bỏ các mô sẹo già và tạo nguồn mẫu đồng đều về
kích thước và trạng thái Mô sẹo được chọn để
chuyển sang môi trường tạo rễ có màu vàng nhạt và
xốp Mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá có màu xanh lá
và cứng Mô sẹo cấy chuyền trên môi trường tạo rễ
có kích thước khoảng 1,0 x 1,0 cm, khối lượng tươi
0,400 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,048 ± 0,001 g
đối với mô sẹo đã được cấy chuyền nhiều lần; khối
lượng tươi 0,320 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,030
± 0,001 g đối với mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá
Môi trường nuôi cấy
Môi trường phát sinh rễ: môi trường khoáng SH
(Schenk, Hildebrandt, 1972) bổ sung 3,0 mg/l NAA,
tùy vào nuôi cấy lỏng hay bán rắn mà bổ sung thêm
agar (8 g/l), đường sucrose được bổ sung theo từng
nghiệm thức và pH môi trường được chỉnh ở khoảng
5,7 - 5,8 (Nhut et al., 2006)
Môi trường sau đó được hấp vô trùng ở 121°C, 1
atm trong vòng 30 phút
Điều kiện nuôi cấy
Các mẫu cấy phát sinh rễ bất định và hệ thống
nuôi cấy bioreactor được đặt trong phòng tối hoàn
toàn Nhiệt độ phòng nuôi cấy là 23 ± 2°C; độ ẩm
trung bình 75 - 80%
Hệ thống nuôi cấy
Bình tam giác 3 lít cho nghiệm thức nuôi cấy
môi trường bán rắn và lỏng lắc Bioreactor BioPia (2
lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) cho nghiệm thức
nuôi cấy môi trường lỏng sục khí
Phương pháp
Khảo sát khả năng hình thành rễ bất định từ mô
sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy
chuyền
Nhằm xác định nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp
cho quá trình phát sinh rễ bất định trong cùng điều
kiện nuôi cấy Trong thí nghiệm này nguồn mẫu mô
sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo đã cấy
chuyền nhiều lần được cắt nhỏ thành các kích thước
đồng đều nhau Mẫu cấy được cấy vào môi trường
tạo rễ bất định Mỗi bình cấy 3 - 4 mẫu, mỗi thí
nghiệm được lặp lại 5 lần Các chỉ tiêu như khả năng tạo rễ trên các mẫu cấy, số lượng rễ bất định hình
thành trên mỗi mẫu được thu nhận sau 8 tuần
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn
Mô sẹo được cắt theo kích thước 1,0 x 1,0 cm, nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 3,0 mg/l NAA, 8 g/l agar và bổ sung đường sucrose ở các nồng độ từ 0 đến 40 g/l Mỗi bình nuôi cấy được cấy
3 mẫu, mỗi thí nghiệm được lặp lại 5 lần Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ, số lượng rễ trên mỗi mẫu cấy được thu nhận sau 8 tuần
So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định và rễ thứ cấp trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít)
Rễ bất định hình thành trên các mẫu mô sẹo được cấy chuyền vào các hệ thống được trình bày trong bảng 1 với cùng thể tích nuôi cấy và các dạng nuôi cấy khác nhau: bán rắn, lỏng lắc và lỏng có sục khí Cách cấy mẫu được tiến hành như sau: cụm rễ bất định được cấy vào bình tam giác 250 ml để chuẩn bị và được cấy chuyền vào các hệ thống nuôi cấy Môi trường trong các hệ thống là môi trường
SH có bổ sung 3,0 mg/l NAA và 30 g/l sucrose Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ thứ cấp trên các rễ bất định, số lượng rễ thứ cấp trên mỗi mẫu cấy, tỷ lệ tăng sinh khối trong các hệ thống khác nhau được thu nhận sau thời gian nuôi cấy là 10 tuần
Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít)
Thể tích môi trường nuôi cấy trong bioreactor Hàn Quốc được thay đổi từ 1 đến 2 lít, khối lượng mẫu cấy ban đầu là 11 ± 0,4 g Chỉ tiêu theo dõi là tỷ
lệ tăng sinh khối rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy vào môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít)
Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về thể tích nhưng khác nhau về khối lượng mẫu đưa vào ban đầu (Bảng 2) Chỉ tiêu theo dõi là khả năng tăng sinh rễ bất định và tạo rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy
Trang 3Bảng 1 Thể tích và môi trường nuôi cấy trong 2 hệ thống khác nhau
STT Hệ thống nuôi cấy Khối lượng mẫu cấy (g) Tỷ lệ mẫu cấy/môi trường (%) Dạng nuôi cấy
Bảng 2 Tỷ lệ mẫu cấy khác nhau trong hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc (3 lít)
STT Thể tích môi trường (lít) Khối lượng mẫu ban đầu (g) Tỷ lệ mẫu/môi trường (%)
Định tính saponin trong sinh khối rễ cây sâm Ngọc
Linh được nuôi cấy trong các hệ thống bioreactor
BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít)
Chuẩn bị bản mỏng silica gel
Cắt tấm silica gel với kích thước phù hợp, cách
mép dưới 1 cm kẻ một đường thẳng, phía dưới
đường thẳng ghi tên các chất cần sắc ký, ở sát mép
trên ghi tên dung môi, bản mỏng Silica gel 60F256
Hệ dung môi khai triển
Sử dụng 2 hệ dung môi khai triển là chloroform :
methanol : nước (65 : 35 : 10) và n-butanol : acid
acetic : nước (4 : 1 : 5) Thể tích chấm: 10 µl dung
dịch chiết của dịch môi trường, 10 µl dung dịch chiết
từ mô sẹo sâm và 2 µl dung dịch các chất chuẩn
Phát hiện
Phun thuốc thử H2SO4 10% trong Ethanol 96%,
sấy ở 105°C đến khi xuất hiện vết và quan sát dưới
ánh sáng thường
Tiến hành
Dịch chiết của dịch môi trường: dịch môi trường
được cô đến cắn Hòa cắn với 100 ml nước cất, siêu
âm hòa tan hết cắn Dịch nước lắc với ether ethylic,
loại dịch ether Dịch nước lắc tiếp với n-butanol bão
hòa nước Dịch n-butanol bão hòa nước được cô đến
cắn Hòa cắn với 1 ml methanol làm dung dịch thử
(Dịch A) Dịch A sau khi chấm sắc kí tập trung cho
qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch C)
Dịch chiết từ sinh khối rễ sâm: rễ sâm được sấy
khô trong tủ sấy ở 50°C đến khô Rễ sâm được
nghiền nát và sấy khô trong methanol và lọc Dịch
lọc cô còn 1 ml làm dung dịch thử (Dịch B) Dịch B
sau khi chấm sắc kí tập trung cho qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch D) Dịch chiết các chuẩn MR2, G-Rb1, G-Rg1: hòa 2 mg các chuẩn MR2, G-Rb1,
G-Rg1 trong 10 ml methanol làm dung dịch chuẩn
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1955) với P = 0,05
Khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy chuyền
Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy loại mẫu cấy mô sẹo có ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành rễ bất định cũng như số rễ hình thành trên mẫu Mẫu cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng phát sinh rễ bất định cao hơn (100%) so với mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần và số rễ bất định hình thành trên mẫu cấy từ mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá (20,40 rễ/mẫu) (Hình 3a) nhiều hơn so với số rễ hình thành trên mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần (5,80 rễ/mẫu) (Bảng 3) Khả năng phát sinh rễ bất định đồng đều hơn trên mô sẹo có nguồn gốc từ lá
Mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có màu trắng và xốp hơn so với mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần trên cùng môi trường nuôi cấy Chính vì vậy, hình thái rễ phát sinh trên 2 loại mẫu mô sẹo cũng có sự khác biệt rõ rệt Rễ hình thành trên mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng duy trì trạng thái cảm ứng
và tiếp tục kéo dài, rễ có màu trắng từ khi phát sinh cho đến cuối giai đoạn thu nhận sinh khối Bên cạnh
Trang 4đó, rễ phát sinh từ mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền
nhiều lần lại có con đường phát triển khác biệt, rễ có
dấu hiệu của sự già hóa (chuyển sang màu vàng) và
phát sinh thêm rễ thứ cấp Điều này có thể được giải
thích là do mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần,
hormone nội sinh suy giảm do quá trình hấp thu
hormone ngoại sinh từ môi trường nuôi cấy, từ đó đã
làm giảm khả năng biệt hóa và kéo dài rễ bất định
khi cảm ứng từ mẫu cấy mô sẹo này Mặt khác, mẫu
cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá ex vitro, hormone
nội sinh vẫn còn được duy trì, tế bào mô sẹo cảm
ứng trực tiếp từ lá vẫn còn khả năng cảm ứng biệt
hóa mạnh hơn, vì vậy khả năng phát sinh và kéo dài
rễ bất định cũng mạnh hơn Các mẫu cấy thường phản ứng khác nhau dưới tác động của auxin ngoại sinh, nhưng đa phần đều chịu ảnh hưởng bởi loại mẫu, tuổi của mẫu, dạng auxin sử dụng và thời gian tiếp xúc (Nemeth, 1986)
Nguyễn Thị Liễu và đồng tác giả (2011) đã nuôi cấy thành công rễ bất định trên nguồn mẫu là mô sẹo
hình thành từ củ ex vitro, tuy nhiên khi so sánh thì số
rễ hình thành (16,5 rễ/mẫu) không cao so với nghiên cứu này (20,40 rễ/mẫu)
Như vậy, nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho khả năng hình thành rễ bất định là mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá
Bảng 3 Ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu cấy mô sẹo lên khả năng phát sinh rễ bất định của cây sâm Ngọc Linh
*Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan
Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả
năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi
cấy bán rắn
Đường là cơ chất quan trọng trong các con
đường biến dưỡng ở thực vật, tùy vào mỗi giai đoạn
phát triển khác nhau của thực vật mà nó được sử
dụng nhiều hay ít Rễ là cơ quan đặc biệt ở thực vật
hầu như không có diệp lục tố, vì vậy nhu cầu về
đường của chúng thường là cao hơn ở các cơ quan
khác Mặt khác, nồng độ đường trong môi trường
còn ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu và khả năng
hút chất dinh dưỡng và nước ở thực vật (Bùi Trang
Việt, 2002)
Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả
năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn
từ mẫu cấy là mô sẹo
Sucrose (g/l) Tỷ lệ phát sinh rễ
bất định (%)
Số rễ/mẫu
*Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý
nghĩa ở mức P=0,05 bằng phép thử Duncan
Ở các nghiệm thức khi bổ sung sucrose ở nồng
độ 10 g/l và đối chứng không đường cho thấy mẫu cấy không có khả năng cảm ứng tạo rễ bất định Ngoài ra, mẫu cấy có hiện tượng thủy tinh thể, điều này có thể được giải thích là khi mẫu cấy không được cung cấp năng lượng cho các hoạt động trao đổi chất của tế bào, các kênh dẫn truyền và trao đổi các chất không hoặc giảm hoạt động, chúng mất đi khả năng tự cân bằng hàm lượng nước giữa tế bào và môi trường dẫn đến sự trương nước trong tế bào Đây là nguyên nhân gây nên hiện tượng thủy tinh thể
ở mẫu cấy
Khi gia tăng nồng độ đường trong môi trường từ
20 - 40 g/l đã có sự hình thành rễ bất định, mẫu cấy
mô sẹo vẫn duy trì được trạng thái ban đầu (vàng, xốp) Tỷ lệ hình thành rễ bất định (90%) và số rễ bất định đạt cao nhất (6 rễ/mẫu) ở nồng độ 30 g/l so với các nghiệm thức bổ sung 20 g/l và 40 g/l đường sucrose (Bảng 4)
Theo Khuri và Moorby (1995), nguồn cacbon tốt
nhất và phổ biến nhất trong nuôi cấy in vitro là
sucrose ở nồng độ khoảng 2 - 5%, chủ yếu tập trung
ở rễ và hấp thụ nhanh Trong khi đó sử dụng glucose
và fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm cho sự hấp thụ hexoses không đầy đủ và sự hấp thụ hexoses không đầy đủ xuất hiện vào giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy sẽ làm gián đoạn sự hình thành rễ
và được ghi nhận bởi các nghiên cứu trên các đối
tượng khác nhau: Panax ginseng (Inomata et al.,
Trang 51993), Catharanthus roseus (Jung et al., 2005),
Datura stramonium (Holmes et al., 1997) và
Erythrorhizon (Sim, Chang, 1997) Sự xuất hiện của
hexoses trong môi trường thì thường liên quan đến
sự gia tăng hoạt động của vách tế bào đã được mô tả
trong nuôi cấy nhiều loại mô khác nhau và đặc biệt
là nuôi cấy lỏng (Wendler et al., 1990) Mối liên hệ
của việc gia tăng vách tế bào cùng với sự xuất hiện
của hexoses đã được chứng minh trong nuôi cấy phát
sinh rễ bất định từ callus của Panax ginseng
(Odnevall, Bjork, 1989) Thí nghiệm đã cho thấy rõ
vai trò quan trọng của đường đối với sự hình thành
và phát triển của rễ Tuy nhiên khi nồng độ đường
quá cao, khả năng phát sinh rễ trên mẫu cấy lại suy
giảm, điều này phù hợp với những nghiên cứu của
Hahn và đồng tác giả (2003) trên rễ của cây sâm
Triều Tiên (Panax ginseng C.A Meyer)
Như vậy, nồng độ đường sucrose tốt nhất cho sự
hình thành rễ bất định là 30 g/l
So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định trong
3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít),
bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia
(2 lít)
Sự hình thành rễ bất định là một sự biến đổi sâu
sắc về hoạt động mô học, những tế bào cùng chung
một tổ chức được tách ra khỏi sự kiểm soát và đi vào
một chức năng khác cho phép sự hình thành cấu trúc
đỉnh sinh trưởng sơ khởi Trong đa số trường hợp nó
có nguồn gốc nội sinh, tức là nó khởi đầu từ trụ giữa
hoặc ở mô dẫn truyền (Võ Thị Bạch Mai, 2004)
Nghiên cứu của Teisson và Alvard (1995) cho
thấy khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện thoáng
khí và được cung cấp dinh dưỡng liên tục thì có khả
năng phát triển tốt hơn so với các mẫu cấy trên môi
trường bán rắn và lỏng lắc
Mẫu cấy trên môi trường bán rắn cho thấy có
khả năng hình thành rễ bất định thấp và không đồng
đều, thời gian duy trì mẫu cấy lâu trên môi trường
dẫn đến sự già hóa của mẫu cấy, mẫu cấy không sử
dụng hết được các chất dinh dưỡng trong cùng thể
tích môi trường nuôi cấy như các hệ thống khác, đây
là nhược điểm của hệ thống nuôi cấy bán rắn, vì vậy
phải cấy chuyền liên tục Mẫu cấy trong môi trường
nuôi cấy lỏng lắc thì lại không có sự phát triển và
hình thành rễ trên mẫu cấy do sự ngập chìm hoàn
toàn trong môi trường, mẫu có dấu hiệu hóa nâu và
chết, các rễ bất định đã hình thành trên mẫu bị đứt ra
khỏi mẫu cấy và không có khả năng hình thành rễ
thứ cấp
Trong 2 hệ thống bioreactor Hàn Quốc và BioPia, mẫu cấy có khả năng tăng sinh tốt hơn, hình thái rễ bất định và rễ thứ cấp tốt hơn đối với các nghiệm thức môi trường bán rắn và lỏng lắc (Hình 3b, e) (Bảng 5) Mẫu mô sẹo phát sinh rễ bất định tiếp tục phát sinh thêm các rễ bất định mới trong hệ thống bioreactor, đồng thời các rễ bất định cũ kéo dài và hình thành các rễ thứ cấp trên đó (Hình 3d, e)
So với môi trường nuôi cấy bán rắn, mẫu cấy chỉ hấp thu được các chất dinh dưỡng của môi trường ở vùng gần, thì đối với hệ thống bioreactor mẫu cấy có khả năng tiếp xúc với các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy hầu như toàn phần, đây chính là điều làm tăng hiệu quả trong việc nuôi cấy tăng sinh khối
mô thực vật (Hình 3c) Cùng với điều kiện nuôi cấy lỏng, nhưng mẫu cấy trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc không có khả năng tăng sinh mạnh như hệ thống bioreactor, điều này được giải thích là chế độ sục khí
có một vai trò quan trọng cho sự phát triển của mẫu
ở điều kiện nuôi cấy ngập chìm trong môi trường lỏng Mặc dù mẫu cấy ngập chìm hoàn toàn trong môi trường nhưng nhờ có sục khí mà mẫu cấy vẫn có khả năng trao đổi O2 và CO2 với không khí, đây là các thành phần quan trọng trong quá trình đồng hóa
và dị hóa của mẫu cấy, giúp mẫu cấy không xảy ra các hiện tượng rối loạn chuyển hóa bên trong tế bào Kết quả giải phẫu cho thấy, nguồn gốc của rễ thứ cấp là từ nội sinh, tức là nó được khởi đầu từ trụ giữa hoặc ở mô dẫn truyền của rễ bất định phát sinh từ mô sẹo (Hình 3f) Sự phân chia ngang hình thành một phát thể, ở vùng ngọn và bề mặt, sự tạo vách song song với bề mặt của khối mô phân sinh dẫn đến sự tạo thành vùng vỏ và biểu bì của rễ thứ cấp sau này, chúng sẽ có các chức năng hoàn thiện của một cấu trúc rễ bất định ban đầu
Như vậy, hệ thống bioreactor Hàn Quốc là thích hợp nhất cho sự tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp cây sâm Ngọc Linh
Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít)
Với cùng tỷ lệ tương đương mẫu cấy ban đầu, thể tích môi trường nuôi cấy lại có ảnh hưởng lớn đến khả năng tăng sinh sinh khối rễ bất định và rễ thứ cấp cây sâm Ngọc Linh, điều này cho thấy ưu điểm của hệ thống nuôi cấy bioreactor là khả năng sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường một cách hiệu quả Hình thái của mẫu cấy trong 2 thể tích môi trường khác nhau được thu nhận là hoàn toàn giống
Trang 6nhau, điều khác biệt ở 2 nghiệm thức là tỷ lệ tăng
sinh khối khác nhau trong 2 nghiệm thức: 428,11%
cho nghiệm thức 1 lít và 940,90% cho nghiệm thức 2
lít Giải thích cho sự khác biệt về tỷ lệ tăng sinh khác
nhau có thể là do lượng chất dinh dưỡng trong 2 thể
tích là khác nhau Thể tích nghiệm thức 2 là 2 lít
(gấp 2 lần so với nghiệm thức 1), chúng ta cũng thu
nhận được kết quả tỷ lệ tăng sinh sinh khối cũng cao
hơn (tương đương 2 lần) (Bảng 6) Kết quả này phù
hợp với lý thuyết về khả năng chuyển hóa và bảo
toàn vật chất
Các cụm rễ phát triển mạnh trong hệ thống
bioreactor cho thấy đây là hệ thống nuôi cấy phù hợp
để tăng sinh khối trong nuôi cấy mô thực vật nói
chung và cây sâm Ngọc Linh nói riêng
Về hình thái của cụm rễ cho thấy mẫu cấy vẫn đang trong quá trình kéo dài và hình thành thêm các cấu trúc rễ thứ cấp cao hơn Trong các thí nghiệm này, có thể thời gian thu nhận sinh khối quá sớm nên chưa thể thấy được các cấu trúc rễ thứ cấp bậc
3 trở lên
Từ mẫu rễ thứ cấp bậc 1, trong quá trình nuôi cấy chúng bị đứt khỏi cụm rễ và vẫn tiếp tục hình thành những cấu trúc rễ thứ cấp khác Kết quả giải phẫu cũng cho thấy các rễ thứ cấp bậc 2 này vẫn có nguồn gốc từ nội sinh, tức là được khởi đầu từ trục giữa của rễ thứ cấp bậc 1 (Hình 3f)
Qua thí nghiệm chúng tôi nhận thấy thể tích môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ sâm trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc là 2 lít
Bảng 5 Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp cây sâm Ngọc Linh
sinh khối (%)
Tỷ lệ chất khô (%) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
*Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan
Bảng 6 Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định trong bioreactor Hàn Quốc
Thể tích môi
trường (lít)
sinh khối (%)
Tỷ lệ chất khô (%) Khối lượng tươi
(g)
Khối lượng khô (g)
*Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan
Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy vào môi trường lên
khả năng tăng sinh rễ bất định trong bioreactor
Hàn Quốc (3 lít)
Kết quả thu nhận cho thấy, cùng với thể tích môi
trường nuôi cấy, thì tỷ lệ mẫu cấy ban đầu cao hơn
cho tỷ lệ tăng sinh cao hơn (940,90%) so với
(578,03%) (Bảng 7) Điều này có thể được giải thích
là khi tỷ lệ mẫu cấy ban đầu quá nhỏ thì chúng
không có khả năng kết hợp với nhau để có thể nổi
lên trên bề mặt thoáng của môi trường nuôi cấy
Trong nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy thấp hơn, các
mẫu cấy đều chìm ở dưới đáy của bioreactor, đây là
điểm dòng khí được bơm vào và chưa kịp phân tán đều ra trong môi trường nuôi cấy, vì vậy khả năng sử dụng dòng khí sục vào môi trường hiệu quả không cao, làm giảm hiệu quả tăng sinh của sinh khối Đối với nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy ban đầu cao hơn, toàn sinh khối liên kết với nhau và nổi lên trên, như
đã giải thích ở trên, vị trí này là nơi không khí được phân tán đều nhất trong môi trường nuôi cấy, khả năng trao đổi khí của toàn sinh khối rễ tốt hơn làm gia tăng hệ số tăng sinh
Hình thái rễ của nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy thấp hơn có dấu hiệu của sự già hóa, rễ thứ cấp có
Trang 7hình thành trên rễ bất định nhưng không có khả năng
kéo dài hoặc là bị đứt gãy sau đó Mô sẹo có rễ bất
định ban đầu không có khả năng phát sinh thêm rễ
như nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy cao hơn
Cụm rễ thứ cấp ở nghiệm thức có tỷ lệ mẫu
cấy cao hơn có khả năng hình thành thêm các rễ
bất định trên mô sẹo và rễ thứ cấp trên các rễ bất
định, các rễ bất định và thứ cấp tiếp tục được kéo
dài Môi trường trong nghiệm thức có tỷ lệ mẫu
cấy thấp hơn không có hiện tượng đục; tuy nhiên,
môi trường trong nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy
cao hơn lại bị đục, điều này được giải thích là do
trong bình có tỷ lệ mẫu cấy thấp hơn không có sự
tiết saponin từ sinh khối và bình có tỷ lệ mẫu cấy
cao hơn bị đục là do có sự tiết saponin của mẫu
cấy, điều này được chứng minh là nhờ hiện tượng tạo bọt ở mặt thoáng môi trường, đối chiếu lại với nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy thấp thì không thấy
có hiện tượng này
Kết quả giải phẫu cho thấy, có một số rễ thứ cấp bậc 2 đang được hình thành và có nguồn gốc nội sinh, điểm sơ khởi rễ kéo dài từ trục giữa của rễ thứ cấp bậc 1 Qua ảnh chụp soi nổi và ảnh giải phẫu cho thấy trên cùng một mặt cắt ở rễ thứ cấp bậc 1 có đến
2 điểm sơ khởi rễ cấp 2 Điều này chứng tỏ khả năng hình thành rễ thứ cấp bậc 2 trên các rễ thứ cấp bậc 1
là rất cao Như vậy, trong 2 tỷ lệ mẫu cấy ban đầu (0,27% và 0,55%) thì tỷ lệ mẫu cấy ban đầu lớn (0,55%) cho khả năng tăng sinh tốt hơn
Bảng 7 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy lên khả năng tăng sinh sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh
Khối lượng mẫu cấy ban
đầu (g)
Khối lượng tươi (g)
Khối lượng khô (g)
Tỷ lệ tăng sinh khối (%)
Tỷ lệ chất khô (%)
*Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan
Định tính saponin trong sinh khối rễ cây sâm
Ngọc Linh được nuôi cấy trong các hệ thống
bioreactor BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc
(3 lít)
Dựa vào vị trí và màu sắc các vết trên bản mỏng
thu được chúng tôi xác định Rf của các vết chất Kết
quả cho thấy trong các sinh khối có cả 3 vết màu
hồng tím tương ứng với 3 vết của chất chuẩn MR2,
G-Rb1 và G-Rg1 với giá trị Rf lần lượt là 0,61; 0,59;
0,27 với hệ I (Hình 1a) và 0,75; 0,72; 0,35 với hệ II
(Hình 1b)
Qua hình ảnh sắc kí đồ cho thấy sự hiện diện của
saponin toàn phần của sinh khối rễ sâm Ngọc Linh
được nuôi cấy trong hệ thống bioreactor với các
phương pháp sắc kí khác nhau và các hệ dung môi
khác nhau (Hình 1)
Nhựt và đồng tác giả (2010) đã xác định được
hàm lượng của saponin trong các loại sinh khối callus, chồi và rễ cây sâm Ngọc Linh Trong 3 loại sinh khối thì chồi được xác định là có hàm lượng saponin cao nhất, tiếp đến là sinh khối callus và rễ
So sánh với kết quả sắc kí đồ của Nhựt và đồng tác giả (2010) trên sinh khối rễ sâm Ngọc Linh cho thấy hàm lượng của saponin trong thí nghiệm này thấp hơn Điều này được giải thích là do thời gian nuôi cấy sinh khối rễ của Nhựt và đồng tác giả (2010) dài hơn thời gian nuôi cấy của sinh khối được thí nghiệm Tuy nhiên sinh khối rễ của Nhựt và đồng tác giả (2010) được nuôi cấy trên môi trường bán rắn nên saponin được tổng hợp hoàn toàn được giữ lại bên trong sinh khối, trái lại sinh khối rễ trong thí nghiệm này được nuôi cấy trong điều kiện lỏng và sục khí nên một phần saponin được tổng hợp đã tiết
ra trong dịch nuôi cấy Vì vậy khi tiến hành sắc kí đồ với dịch nuôi cấy, vẫn xác định là có sự hiện diện của saponin (Hình 2)
Trang 8Hình 2 Sắc kí đồ của dịch nuôi cấy và sinh khối rễ sâm sau khi qua daion khử đường a Hệ dung môi 1: Chloroform : methanol : nước (65 : 35 : 10); b Hệ dung môi 2: n-Butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 5)
Hình 1 Sắc kí đồ của dịch nuôi cấy và sinh khối rễ sâm trước khi qua daion khử đường a Hệ dung môi 1: Chloroform : methanol : nước (65 : 35 : 10); b Hệ dung môi 2: n-Butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 5)
Trang 9KẾT LUẬN
Nguồn mẫu thích hợp cho hình thành rễ bất
định ban đầu là mô sẹo có nguồn gốc trực tiếp từ lá
(20,40 rễ/mẫu) Môi trường thích hợp cho quá trình
hình thành rễ bất định là môi trường SH bổ sung 3
mg/l NAA và 30 g/l sucrose Hệ thống nuôi cấy
bioreactor Hàn Quốc với thể tích môi trường 2 lít và
khối lượng mẫu ban đầu 11,02 g cho kết quả tạo
thành rễ bất định và rễ thứ cấp tốt nhất Ngoài ra
thông qua sắc ký lớp mỏng chúng tôi cũng đã nhận thấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi
cấy in vitro có chứa cả 3 loại saponin quan trọng của
sâm Ngọc Linh tự nhiên đó là MR2, G-Rb1, G-Rg1
Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin cảm ơn đề tài cấp
nhà nước:“Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy bioreactor” đã hỗ trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện nghiên cứu này
Hình 3 Rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro a Rễ bất định hình thành trên mô sẹo có nguồn từ lá; b
Rễ thứ cấp; c Hệ thống bioreactor Hàn Quốc (3 lít); d, e Rễ bất định và rễ thứ cấp hình thành trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc; f Rễ thứ cấp hình thành trên rễ bất định
Trang 10TÀI LIỆU THAM KHẢO
Asaka I, Li L, Hirotani M, Asada Y, Furuya T (1993)
Production of ginsenoside saponin by culturing ginseng
(Panax ginseng) embryonic tissues in bioreactors
Biotechnol Lett 15: 1259-1264
Bùi Trang Việt (2002) Sinh lý thực vật đại cương - Phần
II: Phát triển Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh:
328-329
Carvalho EB, Curtis WR (1998) Characterization of fluid
flow resistance in root cultures with a convective flow
tubular bioreactor Biotechnol Bioeng 60: 375-384
Choi SM, Son SH, Yun SR, Kwon OW, Seon JH, Paek
KY (2000) Pilot-scale culture of adventitious roots of
ginseng in a bioreactor system Plant Cell Tiss Org 62:
187-193
Duncan DB (1955) Multiple range and multiple F test
Biometrics 11: 1-42
Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực,
Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận,
Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương,
Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ
Nga, Thái Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010) Nhân
giống vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha
et Grushv.) Tạp chí công nghệ sinh học 8(3B): 1211-1219
Dương Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan
Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân,
Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền,
Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Công Luận, Đoàn
Trọng Đức (2010) Xác định hàm lượng saponin và dư
lượng một số chất điều hòa sinh trưởng trong callus, chồi
và rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Tạp chí Công nghệ
Sinh học 8(2): 189-202
Hahn EJ, Kim YS, Yu KW, Joeng CS, Paek KY (2003)
Adventitious root cultures of Panax ginseng C.A Meyer
and ginsenoside production through large scale bioreactor
system J Plant Biotechnol 5(1): 1-6
Holmes P, Li SL, Green KD, Ford-Lloyd BV, Thomas NH
(1997) Drip-tube technology for continuous culture of
hairy-roots with integrated alkaloid extraction, In Doran
PM ed Hairy-roots culture and applications Harwood
Academic Publishers: 201-208
Inomata S, Yokoyama M, Gozu Y, Shimizu T, Yanagi M
(1993) Growth pattern and ginsenoside production of
Agrobacterium-transformed Panax ginseng roots Plant
Cell Rep 12: 681-686
Jung HK, Eun JC, Hoon-Il O (2005) Saponin production in
submerged adventitious root culture of Panax ginseng as affected by culture conditions and elicitors Asia-Pac J Mol Biol 13(2): 87-91
Khuri S, Moorby J (1995) Investigation into the role of
sucrose in potato: Estima microtuber production in vitro Ann Botany 75: 295-303
Nemeth G (1986) Induction of rooting In Bajaj YPS eds Biotechnology in Agriculture and Forestry, Tree I
Springer, Berlin Heidelberg New York Tokyo, 1: 49-64 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011) Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc
Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in vitro Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 27: 30-36
Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007) Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ
Nhân sâm Nxb Khoa học và Kỹ thuật 109-110
Nhut DT, Huy BN, Phong PT, Hai NT, Luan TC (2006) Primary study on multiplication of adventitious roots of
Panax vietnamensis – A valuable material source for saponin isolation Biotechnol Agron Plant Prot 118-121
Odnevall A, Bjork L (1989) Differentiated tissue cultures
of Panax ginseng and their response to various carbon sources Biochem Physiol Pfl 185: 403-413
Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous
and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot Rev Can Bot 50: 199-204
Sim SJ, Chang HN (1997) Shikonin production by hairy-roots of Lithospermum erythrorhizon in bioreactors with
in situ separation In Doran PM ed Hairy-roots Culture and Applications Harwood Academic Publishers, Australia: 219-225
Teisson C, Alvard D (1995) A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion In Terzi M et al Eds Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht:
105-110
Võ Thị Bạch Mai (2004) Sự phát triển chồi và rễ Nxb
Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh: 28-125
Wendler R, Veith R, Dacer J, Stitt M, Komor E (1990)
Sucrose storage in cell-suspension cultures of Sacharum
sp (sugarcane) is regulated by a cycle of synthesis and
degradation, Planta 183: 31-39