Kỹ Thuật - Công Nghệ - Y khoa - Dược - Quản trị kinh doanh Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (4A): 887-897, 2012 887 MỘT SỐ HỆ THỐNG NUÔI CẤY TRONG NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH RỄ BẤT ĐỊNH VÀ RỄ THỨ CẤP CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Dương Tấn Nhựt 1 , Nguyễn Cửu Thành Nhân1 , Hoàng Xuân Chiến1 , Nguyễn Phúc Huy 1 , Nguyễn Bá Nam1 , Trần Xuân Ninh2 , Phạm Phong Hải2 , Vũ Quốc Luận1 , Phan Quốc Tâm1 , Vũ Thị Hiền1 , Trịnh Thị Hương 1 , Trần Công Luận3 , Paek Kee Yoeup4 1 Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2 Đại Học Yersin Đà Lạt, Việt Nam 3 Trung tâm Sâm và Dược liệu, Việt Nam 4 Khoa Cây trồng, Đại học Quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc TÓM TẮT Sinh khối rễ sâm in vitro có chứa các hợp chất saponin đã và đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất rộng rãi các sản phẩm về sâm trên thế giới. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện với mục đích sản xuất sinh khối rễ sâm từ nguồn nguyên liệu ban đầu là rễ bất định và rễ thứ cấp. Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu thích hợp cho sự hình thành rễ bất định ban đầu là mô sẹo có nguồn gốc trực tiếp từ lá (20,4 rễmẫu). Môi trường thích hợp cho quá trình hình thành rễ bất định là môi trường SH bổ sung 3 mgl NAA và 30 gl sucrose. Rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh đã được tạo thành và so sánh thông qua nuôi cấy trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít). Hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc với thể tích môi trường 2 lít và khối lượng mẫu ban đầu 11,01 g cho kết quả sinh khối rễ tăng cao nhất (103,59 g). Sắc ký lớp mỏng cho thấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro có chứa cả 3 loại saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh tự nhiên đó là MR2 , G-Rb1 và G-Rg1. Từ khóa: bioreactor Hàn Quốc, bioreactor BioPia, G-Rb1 , G-Rg 1, MR 2 , mô sẹo, Panax vietnamensis, rễ bất định, rễ thứ cấp, saponin. MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh là loài sâm quý của Việt Nam đã được đồng bào dân tộc ở khu vực núi Ngọc Linh sử dụng làm thuốc từ rất lâu với tên gọi là cây thuốc giấu, loài sâm này đã được nghiên cứu và đánh giá là có giá trị dược liệu tương đồng như các loài sâm quý trên thế giới (Nguyễn Thượng Dong et al ., 2007). Hiện nay nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh còn rất hạn chế do loài sâm này chỉ được trồng tập trung ở vùng núi Ngọc Linh và thời gian từ lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến 5 - 6 năm. Do tình trạng khai thác quá mức, sâm Ngọc Linh hiện đang nằm trong 250 loài quý hiếm, đang có nguy cơ bị tuyệt chủng trong Sách đỏ Việt Nam. Do đó, yêu cầu tìm được những kỹ thuật mới giúp thu được sinh khối sâm mang dược tính nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết. Nuôi cấy rễ bất định được xem như là phương pháp hiệu quả nhất cho việc sản xuất sinh khối vì chúng sinh trưởng nhanh và sản xuất hợp chất ổn định (Asaka et al ., 1993) . Rễ bất định thu được trong nuôi cấy in vitro đã được thực hiện trên nhiều đối tượng cây dược liệu nhằm hướng tới việc sản xuất nguyên liệu nhân tạo (Carvalho, Curits, 1998; Choi et al ., 2000). Trên đối tượng cây sâm Triều Tiên các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu các hệ thống nuôi cấy bioreactor (10.000 lít) để thu nhận sinh khối rễ thứ cấp và đã ứng dụng hệ thống này trong sản xuất thương mại (Carvalho, Curits, 1998). Trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh hiện tại chưa có những thông tin chính thống nào nghiên cứu trên quy mô lớn sản xuất rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor có thể tích lớn. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thiết lập quy trình nhân nhanh rễ bất định và rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor để có thể thu nhận sinh khối sâm Ngọc Linh trong một thời gian ngắn với số lượng lớn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nguồn mẫu ban đầu Nguồn mẫu ban đầu là mô sẹo được cảm ứng từ mẫu lá ex vitro của cây sâm Ngọc Linh (mô sẹo cấp 1) được trồng tại Viện Sinh học Tây Nguyên và mô Dương Tấn Nhựt et al. 888 sẹo được cấy chuyền nhiều lần (mô sẹo được cấy chuyền từ 2 lần trở lên với nguồn mô sẹo được cảm ứng từ lá) trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm (Dương Tấn Nhựt et al ., 2010). Mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần nhằm loại bỏ các mô sẹo già và tạo nguồn mẫu đồng đều về kích thước và trạng thái. Mô sẹo được chọn để chuyển sang môi trường tạo rễ có màu vàng nhạt và xốp. Mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá có màu xanh lá và cứng. Mô sẹo cấy chuyền trên môi trường tạo rễ có kích thước khoảng 1,0 x 1,0 cm, khối lượng tươi 0,400 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,048 ± 0,001 g đối với mô sẹo đã được cấy chuyền nhiều lần; khối lượng tươi 0,320 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,030 ± 0,001 g đối với mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá. Môi trường nuôi cấy Môi trường phát sinh rễ: môi trường khoáng SH (Schenk, Hildebrandt, 1972) bổ sung 3,0 mgl NAA, tùy vào nuôi cấy lỏng hay bán rắn mà bổ sung thêm agar (8 gl), đường sucrose được bổ sung theo từng nghiệm thức và pH môi trường được chỉnh ở khoảng 5,7 - 5,8 (Nhut et al ., 2006). Môi trường sau đó được hấp vô trùng ở 121°C, 1 atm trong vòng 30 phút. Điều kiện nuôi cấy Các mẫu cấy phát sinh rễ bất định và hệ thống nuôi cấy bioreactor được đặt trong phòng tối hoàn toàn. Nhiệt độ phòng nuôi cấy là 23 ± 2°C; độ ẩm trung bình 75 - 80. Hệ thống nuôi cấy Bình tam giác 3 lít cho nghiệm thức nuôi cấy môi trường bán rắn và lỏng lắc. Bioreactor BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) cho nghiệm thức nuôi cấy môi trường lỏng sục khí. Phương pháp Khảo sát khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy chuyền Nhằm xác định nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho quá trình phát sinh rễ bất định trong cùng điều kiện nuôi cấy. Trong thí nghiệm này nguồn mẫu mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo đã cấy chuyền nhiều lần được cắt nhỏ thành các kích thước đồng đều nhau. Mẫu cấy được cấy vào môi trường tạo rễ bất định. Mỗi bình cấy 3 - 4 mẫu, mỗi thí nghiệm được lặp lại 5 lần. Các chỉ tiêu như khả năng tạo rễ trên các mẫu cấy, số lượng rễ bất định hình thành trên mỗi mẫu được thu nhận sau 8 tuần. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn Mô sẹo được cắt theo kích thước 1,0 x 1,0 cm, nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 3,0 mgl NAA, 8 gl agar và bổ sung đường sucrose ở các nồng độ từ 0 đến 40 gl. Mỗi bình nuôi cấy được cấy 3 mẫu, mỗi thí nghiệm được lặp lại 5 lần. Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ, số lượng rễ trên mỗi mẫu cấy được thu nhận sau 8 tuần. So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định và rễ thứ cấp trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít) Rễ bất định hình thành trên các mẫu mô sẹo được cấy chuyền vào các hệ thống được trình bày trong bảng 1 với cùng thể tích nuôi cấy và các dạng nuôi cấy khác nhau: bán rắn, lỏng lắc và lỏng có sục khí. Cách cấy mẫu được tiến hành như sau: cụm rễ bất định được cấy vào bình tam giác 250 ml để chuẩn bị và được cấy chuyền vào các hệ thống nuôi cấy. Môi trường trong các hệ thống là môi trường SH có bổ sung 3,0 mgl NAA và 30 gl sucrose. Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ thứ cấp trên các rễ bất định, số lượng rễ thứ cấp trên mỗi mẫu cấy, tỷ lệ tăng sinh khối trong các hệ thống khác nhau được thu nhận sau thời gian nuôi cấy là 10 tuần. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Thể tích môi trường nuôi cấy trong bioreactor Hàn Quốc được thay đổi từ 1 đến 2 lít, khối lượng mẫu cấy ban đầu là 11 ± 0,4 g. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ tăng sinh khối rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy vào môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về thể tích nhưng khác nhau về khối lượng mẫu đưa vào ban đầu (Bảng 2). Chỉ tiêu theo dõi là khả năng tăng sinh rễ bất định và tạo rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy. Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (4A): 887-897, 2012 889 Bảng 1. Thể tích và môi trường nuôi cấy trong 2 hệ thống khác nhau. STT Hệ thống nuôi cấy Khối lượng mẫu cấy (g) Tỷ lệ mẫu cấymôi trường () Dạng nuôi cấy 1 Bình tam giác (3 lít) 12,03 1,2 Bán rắn 2 Bình tam giác (3 lít) 10,56 1,1 Lỏng lắc 3 Bioreactor BioPia 12,94 1,3 Lỏng, sục khí 4 Bioreactor Hàn Quốc 11,49 1,2 Lỏng, sục khí Bảng 2. Tỷ lệ mẫu cấy khác nhau trong hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc (3 lít). STT Thể tích môi trường (lít) Khối lượng mẫu ban đầu (g) Tỷ lệ mẫumôi trường () 1 2 5,37 0,27 2 2 11,01 0,55 Định tính saponin trong sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh được nuôi cấy trong các hệ thống bioreactor BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Chuẩn bị bản mỏng silica gel Cắt tấm silica gel với kích thước phù hợp, cách mép dưới 1 cm kẻ một đường thẳng, phía dưới đường thẳng ghi tên các chất cần sắc ký, ở sát mép trên ghi tên dung môi, bản mỏng Silica gel 60F256 . Hệ dung môi khai triển Sử dụng 2 hệ dung môi khai triển là chloroform : methanol : nước (65 : 35 : 10) và n-butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 5). Thể tích chấm: 10 μl dung dịch chiết của dịch môi trường, 10 μl dung dịch chiết từ mô sẹo sâm và 2 μl dung dịch các chất chuẩn. Phát hiện Phun thuốc thử H2 SO4 10 trong Ethanol 96, sấy ở 105°C đến khi xuất hiện vết và quan sát dưới ánh sáng thường. Tiến hành Dịch chiết của dịch môi trường: dịch môi trường được cô đến cắn. Hòa cắn với 100 ml nước cất, siêu âm hòa tan hết cắn. Dịch nước lắc với ether ethylic, loại dịch ether. Dịch nước lắc tiếp với n-butanol bão hòa nước. Dịch n-butanol bão hòa nước được cô đến cắn. Hòa cắn với 1 ml methanol làm dung dịch thử (Dịch A). Dịch A sau khi chấm sắc kí tập trung cho qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch C). Dịch chiết từ sinh khối rễ sâm: rễ sâm được sấy khô trong tủ sấy ở 50°C đến khô. Rễ sâm được nghiền nát và sấy khô trong methanol và lọc. Dịch lọc cô còn 1 ml làm dung dịch thử (Dịch B). Dịch B sau khi chấm sắc kí tập trung cho qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch D). Dịch chiết các chuẩn MR2 , G-Rb1 , G-Rg 1 : hòa 2 mg các chuẩn MR2 , G-Rb1 , G- Rg1 trong 10 ml methanol làm dung dịch chuẩn. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1955) với P = 0,05. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy chuyền Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy loại mẫu cấy mô sẹo có ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành rễ bất định cũng như số rễ hình thành trên mẫu. Mẫu cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng phát sinh rễ bất định cao hơn (100) so với mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần và số rễ bất định hình thành trên mẫu cấy từ mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá (20,40 rễmẫu) (Hình 3a) nhiều hơn so với số rễ hình thành trên mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần (5,80 rễmẫu) (Bảng 3). Khả năng phát sinh rễ bất định đồng đều hơn trên mô sẹo có nguồn gốc từ lá. Mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có màu trắng và xốp hơn so với mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần trên cùng môi trường nuôi cấy. Chính vì vậy, hình thái rễ phát sinh trên 2 loại mẫu mô sẹo cũng có sự khác biệt rõ rệt. Rễ hình thành trên mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng duy trì trạng thái cảm ứng và tiếp tục kéo dài, rễ có màu trắng từ khi phát sinh cho đến cuối giai đoạn thu nhận sinh khối. Bên cạnh Dương Tấn Nhựt et al. 890 đó, rễ phát sinh từ mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần lại có con đường phát triển khác biệt, rễ có dấu hiệu của sự già hóa (chuyển sang màu vàng) và phát sinh thêm rễ thứ cấp. Điều này có thể được giải thích là do mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần, hormone nội sinh suy giảm do quá trình hấp thu hormone ngoại sinh từ môi trường nuôi cấy, từ đó đã làm giảm khả năng biệt hóa và kéo dài rễ bất định khi cảm ứng từ mẫu cấy mô sẹo này. Mặt khác, mẫu cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá ex vitro , hormone nội sinh vẫn còn được duy trì, tế bào mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá vẫn còn khả năng cảm ứng biệt hóa mạnh hơn, vì vậy khả năng phát sinh và kéo dài rễ bất định cũng mạnh hơn. Các mẫu cấy thường phản ứng khác nhau dưới tác động của auxin ngoại sinh, nhưng đa phần đều chịu ảnh hưởng bởi loại mẫu, tuổi của mẫu, dạng auxin sử dụng và thời gian tiếp xúc (Nemeth, 1986). Nguyễn Thị Liễu và đồng tác giả (2011) đã nuôi cấy thành công rễ bất định trên nguồn mẫu là mô sẹo hình thành từ củ ex vitro , tuy nhiên khi so sánh thì số rễ hình thành (16,5 rễmẫu) không cao so với nghiên cứu này (20,40 rễmẫu). Như vậy, nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho khả năng hình thành rễ bất định là mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá. Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu cấy mô sẹo lên khả năng phát sinh rễ bất định của cây sâm Ngọc Linh. Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan. Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn Đường là cơ chất quan trọng trong các con đường biến dưỡng ở thực vật, tùy vào mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật mà nó được sử dụng nhiều hay ít. Rễ là cơ quan đặc biệt ở thực vật hầu như không có diệp lục tố, vì vậy nhu cầu về đường của chúng thường là cao hơn ở các cơ quan khác. Mặt khác, nồng độ đường trong môi trường còn ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu và khả năng hút chất dinh dưỡng và nước ở thực vật (Bùi Trang Việt, 2002). Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn từ mẫu cấy là mô sẹo. Sucrose (gl) Tỷ lệ phát sinh rễ bất định () Số rễmẫu 0 0 0 10 0 0 20 50 2,20b 30 90 6,00a 40 0 0 Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P=0,05 bằng phép thử Duncan. Ở các nghiệm thức khi bổ sung sucrose ở nồng độ 10 gl và đối chứng không đường cho thấy mẫu cấy không có khả năng cảm ứng tạo rễ bất định. Ngoài ra, mẫu cấy có hiện tượng thủy tinh thể, điều này có thể được giải thích là khi mẫu cấy không được cung cấp năng lượng cho các hoạt động trao đổi chất của tế bào, các kênh dẫn truyền và trao đổi các chất không hoặc giảm hoạt động, chúng mất đi khả năng tự cân bằng hàm lượng nước giữa tế bào và môi trường dẫn đến sự trương nước trong tế bào. Đây là nguyên nhân gây nên hiện tượng thủy tinh thể ở mẫu cấy. Khi gia tăng nồng độ đường trong môi trường từ 20 - 40 gl đã có sự hình thành rễ bất định, mẫu cấy mô sẹo vẫn duy trì được trạng thái ban đầu (vàng, xốp). Tỷ lệ hình thành rễ bất định (90) và số rễ bất định đạt cao nhất (6 rễmẫu) ở nồng độ 30 gl so với các nghiệm thức bổ sung 20 gl và 40 gl đường sucrose (Bảng 4). Theo Khuri và Moorby (1995), nguồn cacbon tốt nhất và phổ biến nhất trong nuôi cấy in vitro là sucrose ở nồng độ khoảng 2 - 5, chủ yếu tập trung ở rễ và hấp thụ nhanh. Trong khi đó sử dụng glucose và fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm cho sự hấp thụ hexoses không đầy đủ và sự hấp thụ hexoses không đầy đủ xuất hiện vào giai đoạn đầu tiên của quá trình nuôi cấy sẽ làm gián đoạn sự hình thành rễ và được ghi nhận bởi các nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau: Panax ginseng (Inomata et al., Nguồn gốc mô sẹo Tỷ lệ phát sinh rễ () Số rễmẫu Trực tiếp từ lá 100 20,40a Cấy chuyền nhiều lần 80 5,80b Tạp chí Công nghệ Sinh học 10 (4A): 887-897, 2012 891 1993), Catharanthus roseus (Jung et al., 2005), Datura stramonium (Holmes et al., 1997) và Erythrorhizon (Sim, Chang, 1997). Sự xuất hiện của hexoses trong môi trường thì thường liên quan đến sự gia tăng hoạt động của vách tế bào đã được mô tả trong nuôi cấy nhiều loại mô khác nhau và đặc biệt là nuôi cấy lỏng (Wendler et al ., 1990). Mối liên hệ của việc gia tăng vách tế bào cùng với sự xuất hiện của hexoses đã được chứng minh trong nuôi cấy phát sinh rễ bất định từ callus của Panax ginseng (Odnevall, Bjork, 1989). Thí nghiệm đã cho thấy rõ vai trò quan trọng của đường đối với sự hình thành và phát triển của rễ. Tuy nhiên khi nồng độ đường quá cao, khả năng phát sinh rễ trên mẫu cấy lại suy giảm, điều này phù hợp với những nghiên cứu của Hahn và đồng tác giả (2003) trên rễ của cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Meyer). Như vậy, nồng độ đường sucrose tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định là 30 gl. So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít) Sự hình thành rễ bất định là một sự biến đổi sâu sắc về hoạt động mô học, những tế bào cùng chung một tổ chức được tách ra khỏi sự kiểm soát và đi vào một chức năng khác cho phép sự hình thành cấu trúc đỉnh sinh trưởng sơ khởi. Trong đa số trường hợp nó có nguồn gốc nội sinh, tức là nó khởi đầu từ trụ giữa hoặc ở mô dẫn truyền (Võ Thị Bạch Mai, 2004). Nghiên cứu của Teisson và Alvard (1995) cho thấy khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện thoáng khí và được cung cấp dinh dưỡng liên tục thì có khả năng phát triển tốt hơn so với các mẫu cấy trên môi trường bán rắn và lỏng lắc. Mẫu cấy trên môi trường bán rắn cho thấy có khả năng hình thành rễ bất định thấp và không đồng đều, thời gian duy trì mẫu cấy lâu trên môi trường dẫn đến sự già hóa của mẫu cấy, mẫu cấy không sử dụng hết được các chất dinh dưỡng trong cùng thể tích môi trường nuôi cấy như các hệ thống khác, đây là nhược điểm của hệ thống nuôi cấy bán rắn, vì vậy phải cấy chuyền liên tục. Mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy lỏng lắc thì lại không có sự phát triển và hình thành rễ trên mẫu cấy do sự ngập chìm hoàn toàn trong môi trường, mẫu có dấu hiệu hóa nâu và chết, các rễ bất định đã hình thành trên mẫu bị đứt ra khỏi mẫu cấy và không có khả năng hình thành rễ thứ cấp. Trong 2 hệ thống bioreactor Hàn Quốc và BioPia, mẫu cấy có khả năng tăng sinh tốt hơn, hình thái rễ bất định và rễ thứ cấp tốt hơn đối với các nghiệm thức môi trường bán rắn và lỏng lắc (Hình 3b, e) (Bảng 5). Mẫu mô sẹo phát sinh rễ bất định tiếp tục phát sinh thêm ...
Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 887-897, 2012 MỘT SỐ HỆ THỐNG NUÔI CẤY TRONG NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH RỄ BẤT ĐỊNH VÀ RỄ THỨ CẤP CÂY SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Dương Tấn Nhựt1, Nguyễn Cửu Thành Nhân1, Hoàng Xuân Chiến1, Nguyễn Phúc Huy1, Nguyễn Bá Nam1, Trần Xuân Ninh2, Phạm Phong Hải2, Vũ Quốc Luận1, Phan Quốc Tâm1, Vũ Thị Hiền1, Trịnh Thị Hương1, Trần Công Luận3, Paek Kee Yoeup4 1Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Đại Học Yersin Đà Lạt, Việt Nam 3Trung tâm Sâm và Dược liệu, Việt Nam 4Khoa Cây trồng, Đại học Quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc TÓM TẮT Sinh khối rễ sâm in vitro có chứa các hợp chất saponin đã và đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu để sản xuất rộng rãi các sản phẩm về sâm trên thế giới Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện với mục đích sản xuất sinh khối rễ sâm từ nguồn nguyên liệu ban đầu là rễ bất định và rễ thứ cấp Trong nghiên cứu này, nguồn mẫu thích hợp cho sự hình thành rễ bất định ban đầu là mô sẹo có nguồn gốc trực tiếp từ lá (20,4 rễ/mẫu) Môi trường thích hợp cho quá trình hình thành rễ bất định là môi trường SH bổ sung 3 mg/l NAA và 30 g/l sucrose Rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh đã được tạo thành và so sánh thông qua nuôi cấy trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau [bình tam giác (3 lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia (2 lít)] Hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc với thể tích môi trường 2 lít và khối lượng mẫu ban đầu 11,01 g cho kết quả sinh khối rễ tăng cao nhất (103,59 g) Sắc ký lớp mỏng cho thấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro có chứa cả 3 loại saponin quan trọng của sâm Ngọc Linh tự nhiên đó là MR2, G-Rb1 và G-Rg1 Từ khóa: bioreactor Hàn Quốc, bioreactor BioPia, G-Rb1, G-Rg1, MR2, mô sẹo, Panax vietnamensis, rễ bất định, rễ thứ cấp, saponin MỞ ĐẦU cây dược liệu nhằm hướng tới việc sản xuất nguyên liệu nhân tạo (Carvalho, Curits, 1998; Choi et al., Sâm Ngọc Linh là loài sâm quý của Việt Nam đã 2000) Trên đối tượng cây sâm Triều Tiên các nhà được đồng bào dân tộc ở khu vực núi Ngọc Linh sử khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu các hệ thống nuôi dụng làm thuốc từ rất lâu với tên gọi là cây thuốc giấu, cấy bioreactor (10.000 lít) để thu nhận sinh khối rễ thứ loài sâm này đã được nghiên cứu và đánh giá là có giá cấp và đã ứng dụng hệ thống này trong sản xuất trị dược liệu tương đồng như các loài sâm quý trên thế thương mại (Carvalho, Curits, 1998) Trên đối tượng giới (Nguyễn Thượng Dong et al., 2007) Hiện nay cây sâm Ngọc Linh hiện tại chưa có những thông tin nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh còn rất hạn chế do chính thống nào nghiên cứu trên quy mô lớn sản xuất loài sâm này chỉ được trồng tập trung ở vùng núi rễ thứ cấp bằng hệ thống bioreactor có thể tích lớn Ngọc Linh và thời gian từ lúc trồng từ hạt cho đến khi Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thiết lập quy trình thu được củ lên đến 5 - 6 năm Do tình trạng khai thác nhân nhanh rễ bất định và rễ thứ cấp bằng hệ thống quá mức, sâm Ngọc Linh hiện đang nằm trong 250 bioreactor để có thể thu nhận sinh khối sâm Ngọc loài quý hiếm, đang có nguy cơ bị tuyệt chủng trong Linh trong một thời gian ngắn với số lượng lớn Sách đỏ Việt Nam Do đó, yêu cầu tìm được những kỹ thuật mới giúp thu được sinh khối sâm mang dược VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP tính nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết Vật liệu Nuôi cấy rễ bất định được xem như là phương pháp hiệu quả nhất cho việc sản xuất sinh khối vì Nguồn mẫu ban đầu chúng sinh trưởng nhanh và sản xuất hợp chất ổn định (Asaka et al., 1993) Rễ bất định thu được trong nuôi Nguồn mẫu ban đầu là mô sẹo được cảm ứng từ cấy in vitro đã được thực hiện trên nhiều đối tượng mẫu lá ex vitro của cây sâm Ngọc Linh (mô sẹo cấp 1) được trồng tại Viện Sinh học Tây Nguyên và mô 887 Dương Tấn Nhựt et al sẹo được cấy chuyền nhiều lần (mô sẹo được cấy nghiệm được lặp lại 5 lần Các chỉ tiêu như khả năng chuyền từ 2 lần trở lên với nguồn mô sẹo được cảm tạo rễ trên các mẫu cấy, số lượng rễ bất định hình ứng từ lá) trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo để thành trên mỗi mẫu được thu nhận sau 8 tuần tiến hành các thí nghiệm (Dương Tấn Nhựt et al., 2010) Mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần nhằm loại Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose bỏ các mô sẹo già và tạo nguồn mẫu đồng đều về lên khả năng phát sinh rễ bất định trên môi trường kích thước và trạng thái Mô sẹo được chọn để nuôi cấy bán rắn chuyển sang môi trường tạo rễ có màu vàng nhạt và xốp Mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá có màu xanh lá Mô sẹo được cắt theo kích thước 1,0 x 1,0 cm, và cứng Mô sẹo cấy chuyền trên môi trường tạo rễ nuôi cấy trên môi trường SH có bổ sung 3,0 mg/l có kích thước khoảng 1,0 x 1,0 cm, khối lượng tươi NAA, 8 g/l agar và bổ sung đường sucrose ở các 0,400 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,048 ± 0,001 g nồng độ từ 0 đến 40 g/l Mỗi bình nuôi cấy được cấy đối với mô sẹo đã được cấy chuyền nhiều lần; khối 3 mẫu, mỗi thí nghiệm được lặp lại 5 lần Các chỉ lượng tươi 0,320 ± 0,010 g và khối lượng khô 0,030 tiêu như khả năng hình thành rễ, số lượng rễ trên mỗi ± 0,001 g đối với mô sẹo phát sinh trực tiếp từ lá mẫu cấy được thu nhận sau 8 tuần Môi trường nuôi cấy So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định và rễ thứ cấp trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 Môi trường phát sinh rễ: môi trường khoáng SH lít), bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor (Schenk, Hildebrandt, 1972) bổ sung 3,0 mg/l NAA, BioPia (2 lít) tùy vào nuôi cấy lỏng hay bán rắn mà bổ sung thêm agar (8 g/l), đường sucrose được bổ sung theo từng Rễ bất định hình thành trên các mẫu mô sẹo nghiệm thức và pH môi trường được chỉnh ở khoảng được cấy chuyền vào các hệ thống được trình bày 5,7 - 5,8 (Nhut et al., 2006) trong bảng 1 với cùng thể tích nuôi cấy và các dạng nuôi cấy khác nhau: bán rắn, lỏng lắc và lỏng có sục Môi trường sau đó được hấp vô trùng ở 121°C, 1 khí Cách cấy mẫu được tiến hành như sau: cụm rễ atm trong vòng 30 phút bất định được cấy vào bình tam giác 250 ml để chuẩn bị và được cấy chuyền vào các hệ thống nuôi Điều kiện nuôi cấy cấy Môi trường trong các hệ thống là môi trường SH có bổ sung 3,0 mg/l NAA và 30 g/l sucrose Các mẫu cấy phát sinh rễ bất định và hệ thống nuôi cấy bioreactor được đặt trong phòng tối hoàn Các chỉ tiêu như khả năng hình thành rễ thứ cấp toàn Nhiệt độ phòng nuôi cấy là 23 ± 2°C; độ ẩm trên các rễ bất định, số lượng rễ thứ cấp trên mỗi mẫu trung bình 75 - 80% cấy, tỷ lệ tăng sinh khối trong các hệ thống khác nhau được thu nhận sau thời gian nuôi cấy là 10 tuần Hệ thống nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lên Bình tam giác 3 lít cho nghiệm thức nuôi cấy khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong môi trường bán rắn và lỏng lắc Bioreactor BioPia (2 bioreactor Hàn Quốc (3 lít) lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) cho nghiệm thức nuôi cấy môi trường lỏng sục khí Thể tích môi trường nuôi cấy trong bioreactor Hàn Quốc được thay đổi từ 1 đến 2 lít, khối lượng Phương pháp mẫu cấy ban đầu là 11 ± 0,4 g Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ tăng sinh khối rễ thứ cấp sau 10 tuần nuôi cấy Khảo sát khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy vào môi chuyền trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp trong bioreactor Hàn Quốc (3 lít) Nhằm xác định nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho quá trình phát sinh rễ bất định trong cùng điều Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện nuôi cấy Trong thí nghiệm này nguồn mẫu mô kiện về thể tích nhưng khác nhau về khối lượng mẫu sẹo hình thành trực tiếp từ lá và mô sẹo đã cấy đưa vào ban đầu (Bảng 2) Chỉ tiêu theo dõi là khả chuyền nhiều lần được cắt nhỏ thành các kích thước năng tăng sinh rễ bất định và tạo rễ thứ cấp sau 10 đồng đều nhau Mẫu cấy được cấy vào môi trường tuần nuôi cấy tạo rễ bất định Mỗi bình cấy 3 - 4 mẫu, mỗi thí 888 Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 887-897, 2012 Bảng 1 Thể tích và môi trường nuôi cấy trong 2 hệ thống khác nhau STT Hệ thống nuôi cấy Khối lượng mẫu cấy (g) Tỷ lệ mẫu cấy/môi trường (%) Dạng nuôi cấy 1 Bình tam giác (3 lít) 12,03 1,2 Bán rắn 2 Bình tam giác (3 lít) 10,56 1,1 Lỏng lắc 3 Bioreactor BioPia 12,94 1,3 Lỏng, sục khí 4 Bioreactor Hàn Quốc 11,49 1,2 Lỏng, sục khí Bảng 2 Tỷ lệ mẫu cấy khác nhau trong hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc (3 lít) STT Thể tích môi trường (lít) Khối lượng mẫu ban đầu (g) Tỷ lệ mẫu/môi trường (%) 5,37 0,27 1 2 11,01 0,55 2 2 Định tính saponin trong sinh khối rễ cây sâm Ngọc sau khi chấm sắc kí tập trung cho qua cột daion để Linh được nuôi cấy trong các hệ thống bioreactor loại bỏ đường (Dịch D) Dịch chiết các chuẩn MR2, BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc (3 lít) G-Rb1, G-Rg1: hòa 2 mg các chuẩn MR2, G-Rb1, G- Rg1 trong 10 ml methanol làm dung dịch chuẩn Chuẩn bị bản mỏng silica gel Xử lý số liệu Cắt tấm silica gel với kích thước phù hợp, cách mép dưới 1 cm kẻ một đường thẳng, phía dưới Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft đường thẳng ghi tên các chất cần sắc ký, ở sát mép Excel và phương pháp Duncan’s test (Duncan, 1955) trên ghi tên dung môi, bản mỏng Silica gel 60F256 với P = 0,05 Hệ dung môi khai triển KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sử dụng 2 hệ dung môi khai triển là chloroform : Khả năng hình thành rễ bất định từ mô sẹo hình methanol : nước (65 : 35 : 10) và n-butanol : acid thành trực tiếp từ lá và mô sẹo được cấy chuyền acetic : nước (4 : 1 : 5) Thể tích chấm: 10 µl dung dịch chiết của dịch môi trường, 10 µl dung dịch chiết Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy loại mẫu từ mô sẹo sâm và 2 µl dung dịch các chất chuẩn cấy mô sẹo có ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành rễ bất định cũng như số rễ hình thành trên Phát hiện mẫu Mẫu cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có khả năng phát sinh rễ bất định cao hơn (100%) so với Phun thuốc thử H2SO4 10% trong Ethanol 96%, mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần và số rễ sấy ở 105°C đến khi xuất hiện vết và quan sát dưới bất định hình thành trên mẫu cấy từ mô sẹo cảm ứng ánh sáng thường trực tiếp từ lá (20,40 rễ/mẫu) (Hình 3a) nhiều hơn so với số rễ hình thành trên mẫu cấy mô sẹo được cấy Tiến hành chuyền nhiều lần (5,80 rễ/mẫu) (Bảng 3) Khả năng phát sinh rễ bất định đồng đều hơn trên mô sẹo có Dịch chiết của dịch môi trường: dịch môi trường nguồn gốc từ lá được cô đến cắn Hòa cắn với 100 ml nước cất, siêu âm hòa tan hết cắn Dịch nước lắc với ether ethylic, Mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá có màu trắng và loại dịch ether Dịch nước lắc tiếp với n-butanol bão xốp hơn so với mô sẹo được cấy chuyền nhiều lần hòa nước Dịch n-butanol bão hòa nước được cô đến trên cùng môi trường nuôi cấy Chính vì vậy, hình cắn Hòa cắn với 1 ml methanol làm dung dịch thử thái rễ phát sinh trên 2 loại mẫu mô sẹo cũng có sự (Dịch A) Dịch A sau khi chấm sắc kí tập trung cho khác biệt rõ rệt Rễ hình thành trên mô sẹo cảm ứng qua cột daion để loại bỏ đường (Dịch C) trực tiếp từ lá có khả năng duy trì trạng thái cảm ứng và tiếp tục kéo dài, rễ có màu trắng từ khi phát sinh Dịch chiết từ sinh khối rễ sâm: rễ sâm được sấy cho đến cuối giai đoạn thu nhận sinh khối Bên cạnh khô trong tủ sấy ở 50°C đến khô Rễ sâm được nghiền nát và sấy khô trong methanol và lọc Dịch lọc cô còn 1 ml làm dung dịch thử (Dịch B) Dịch B 889 Dương Tấn Nhựt et al đó, rễ phát sinh từ mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền rễ bất định cũng mạnh hơn Các mẫu cấy thường nhiều lần lại có con đường phát triển khác biệt, rễ có phản ứng khác nhau dưới tác động của auxin ngoại dấu hiệu của sự già hóa (chuyển sang màu vàng) và sinh, nhưng đa phần đều chịu ảnh hưởng bởi loại phát sinh thêm rễ thứ cấp Điều này có thể được giải mẫu, tuổi của mẫu, dạng auxin sử dụng và thời gian thích là do mô sẹo khi cấy chuyền nhiều lần, tiếp xúc (Nemeth, 1986) hormone nội sinh suy giảm do quá trình hấp thu hormone ngoại sinh từ môi trường nuôi cấy, từ đó đã Nguyễn Thị Liễu và đồng tác giả (2011) đã nuôi làm giảm khả năng biệt hóa và kéo dài rễ bất định cấy thành công rễ bất định trên nguồn mẫu là mô sẹo khi cảm ứng từ mẫu cấy mô sẹo này Mặt khác, mẫu hình thành từ củ ex vitro, tuy nhiên khi so sánh thì số cấy mô sẹo cảm ứng trực tiếp từ lá ex vitro, hormone rễ hình thành (16,5 rễ/mẫu) không cao so với nghiên nội sinh vẫn còn được duy trì, tế bào mô sẹo cảm cứu này (20,40 rễ/mẫu) ứng trực tiếp từ lá vẫn còn khả năng cảm ứng biệt hóa mạnh hơn, vì vậy khả năng phát sinh và kéo dài Như vậy, nguồn gốc mẫu mô sẹo phù hợp cho khả năng hình thành rễ bất định là mô sẹo hình thành trực tiếp từ lá Bảng 3 Ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu cấy mô sẹo lên khả năng phát sinh rễ bất định của cây sâm Ngọc Linh Nguồn gốc mô sẹo Tỷ lệ phát sinh rễ (%) Số rễ/mẫu Trực tiếp từ lá 100 20,40a* Cấy chuyền nhiều lần 80 5,80b *Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả Ở các nghiệm thức khi bổ sung sucrose ở nồng năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi độ 10 g/l và đối chứng không đường cho thấy mẫu cấy bán rắn cấy không có khả năng cảm ứng tạo rễ bất định Ngoài ra, mẫu cấy có hiện tượng thủy tinh thể, điều Đường là cơ chất quan trọng trong các con này có thể được giải thích là khi mẫu cấy không đường biến dưỡng ở thực vật, tùy vào mỗi giai đoạn được cung cấp năng lượng cho các hoạt động trao phát triển khác nhau của thực vật mà nó được sử đổi chất của tế bào, các kênh dẫn truyền và trao đổi dụng nhiều hay ít Rễ là cơ quan đặc biệt ở thực vật các chất không hoặc giảm hoạt động, chúng mất đi hầu như không có diệp lục tố, vì vậy nhu cầu về khả năng tự cân bằng hàm lượng nước giữa tế bào và đường của chúng thường là cao hơn ở các cơ quan môi trường dẫn đến sự trương nước trong tế bào khác Mặt khác, nồng độ đường trong môi trường Đây là nguyên nhân gây nên hiện tượng thủy tinh thể còn ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu và khả năng ở mẫu cấy hút chất dinh dưỡng và nước ở thực vật (Bùi Trang Việt, 2002) Khi gia tăng nồng độ đường trong môi trường từ 20 - 40 g/l đã có sự hình thành rễ bất định, mẫu cấy Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả mô sẹo vẫn duy trì được trạng thái ban đầu (vàng, năng phát sinh rễ bất định trên môi trường nuôi cấy bán rắn xốp) Tỷ lệ hình thành rễ bất định (90%) và số rễ bất từ mẫu cấy là mô sẹo định đạt cao nhất (6 rễ/mẫu) ở nồng độ 30 g/l so với các nghiệm thức bổ sung 20 g/l và 40 g/l đường Sucrose (g/l) Tỷ lệ phát sinh rễ Số rễ/mẫu sucrose (Bảng 4) bất định (%) 0 0 0 Theo Khuri và Moorby (1995), nguồn cacbon tốt 10 0 0 nhất và phổ biến nhất trong nuôi cấy in vitro là 20 50 2,20b* sucrose ở nồng độ khoảng 2 - 5%, chủ yếu tập trung 30 90 6,00a ở rễ và hấp thụ nhanh Trong khi đó sử dụng glucose 40 0 0 và fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm cho sự hấp thụ hexoses không đầy đủ và sự hấp thụ hexoses *Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý không đầy đủ xuất hiện vào giai đoạn đầu tiên của nghĩa ở mức P=0,05 bằng phép thử Duncan quá trình nuôi cấy sẽ làm gián đoạn sự hình thành rễ và được ghi nhận bởi các nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau: Panax ginseng (Inomata et al., 890 Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 887-897, 2012 1993), Catharanthus roseus (Jung et al., 2005), Trong 2 hệ thống bioreactor Hàn Quốc và Datura stramonium (Holmes et al., 1997) và BioPia, mẫu cấy có khả năng tăng sinh tốt hơn, hình Erythrorhizon (Sim, Chang, 1997) Sự xuất hiện của thái rễ bất định và rễ thứ cấp tốt hơn đối với các hexoses trong môi trường thì thường liên quan đến nghiệm thức môi trường bán rắn và lỏng lắc (Hình sự gia tăng hoạt động của vách tế bào đã được mô tả 3b, e) (Bảng 5) Mẫu mô sẹo phát sinh rễ bất định trong nuôi cấy nhiều loại mô khác nhau và đặc biệt tiếp tục phát sinh thêm các rễ bất định mới trong hệ là nuôi cấy lỏng (Wendler et al., 1990) Mối liên hệ thống bioreactor, đồng thời các rễ bất định cũ kéo của việc gia tăng vách tế bào cùng với sự xuất hiện dài và hình thành các rễ thứ cấp trên đó (Hình 3d, e) của hexoses đã được chứng minh trong nuôi cấy phát sinh rễ bất định từ callus của Panax ginseng So với môi trường nuôi cấy bán rắn, mẫu cấy chỉ (Odnevall, Bjork, 1989) Thí nghiệm đã cho thấy rõ hấp thu được các chất dinh dưỡng của môi trường ở vai trò quan trọng của đường đối với sự hình thành vùng gần, thì đối với hệ thống bioreactor mẫu cấy có và phát triển của rễ Tuy nhiên khi nồng độ đường khả năng tiếp xúc với các chất dinh dưỡng trong môi quá cao, khả năng phát sinh rễ trên mẫu cấy lại suy trường nuôi cấy hầu như toàn phần, đây chính là điều giảm, điều này phù hợp với những nghiên cứu của làm tăng hiệu quả trong việc nuôi cấy tăng sinh khối Hahn và đồng tác giả (2003) trên rễ của cây sâm mô thực vật (Hình 3c) Cùng với điều kiện nuôi cấy Triều Tiên (Panax ginseng C.A Meyer) lỏng, nhưng mẫu cấy trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc không có khả năng tăng sinh mạnh như hệ thống Như vậy, nồng độ đường sucrose tốt nhất cho sự bioreactor, điều này được giải thích là chế độ sục khí hình thành rễ bất định là 30 g/l có một vai trò quan trọng cho sự phát triển của mẫu ở điều kiện nuôi cấy ngập chìm trong môi trường So sánh khả năng tăng sinh của rễ bất định trong lỏng Mặc dù mẫu cấy ngập chìm hoàn toàn trong 3 hệ thống nuôi cấy: bình tam giác (3 lít), môi trường nhưng nhờ có sục khí mà mẫu cấy vẫn có bioreactor Hàn Quốc (3 lít) và bioreactor BioPia khả năng trao đổi O2 và CO2 với không khí, đây là (2 lít) các thành phần quan trọng trong quá trình đồng hóa và dị hóa của mẫu cấy, giúp mẫu cấy không xảy ra Sự hình thành rễ bất định là một sự biến đổi sâu các hiện tượng rối loạn chuyển hóa bên trong tế bào sắc về hoạt động mô học, những tế bào cùng chung một tổ chức được tách ra khỏi sự kiểm soát và đi vào Kết quả giải phẫu cho thấy, nguồn gốc của rễ thứ một chức năng khác cho phép sự hình thành cấu trúc cấp là từ nội sinh, tức là nó được khởi đầu từ trụ giữa đỉnh sinh trưởng sơ khởi Trong đa số trường hợp nó hoặc ở mô dẫn truyền của rễ bất định phát sinh từ mô có nguồn gốc nội sinh, tức là nó khởi đầu từ trụ giữa sẹo (Hình 3f) Sự phân chia ngang hình thành một hoặc ở mô dẫn truyền (Võ Thị Bạch Mai, 2004) phát thể, ở vùng ngọn và bề mặt, sự tạo vách song song với bề mặt của khối mô phân sinh dẫn đến sự Nghiên cứu của Teisson và Alvard (1995) cho tạo thành vùng vỏ và biểu bì của rễ thứ cấp sau này, thấy khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện thoáng chúng sẽ có các chức năng hoàn thiện của một cấu khí và được cung cấp dinh dưỡng liên tục thì có khả trúc rễ bất định ban đầu năng phát triển tốt hơn so với các mẫu cấy trên môi trường bán rắn và lỏng lắc Như vậy, hệ thống bioreactor Hàn Quốc là thích hợp nhất cho sự tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp Mẫu cấy trên môi trường bán rắn cho thấy có cây sâm Ngọc Linh khả năng hình thành rễ bất định thấp và không đồng đều, thời gian duy trì mẫu cấy lâu trên môi trường Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng dẫn đến sự già hóa của mẫu cấy, mẫu cấy không sử tăng sinh rễ bất định trong bioreactor Hàn Quốc dụng hết được các chất dinh dưỡng trong cùng thể (3 lít) tích môi trường nuôi cấy như các hệ thống khác, đây là nhược điểm của hệ thống nuôi cấy bán rắn, vì vậy Với cùng tỷ lệ tương đương mẫu cấy ban đầu, thể phải cấy chuyền liên tục Mẫu cấy trong môi trường tích môi trường nuôi cấy lại có ảnh hưởng lớn đến khả nuôi cấy lỏng lắc thì lại không có sự phát triển và năng tăng sinh sinh khối rễ bất định và rễ thứ cấp cây hình thành rễ trên mẫu cấy do sự ngập chìm hoàn sâm Ngọc Linh, điều này cho thấy ưu điểm của hệ toàn trong môi trường, mẫu có dấu hiệu hóa nâu và thống nuôi cấy bioreactor là khả năng sử dụng các chết, các rễ bất định đã hình thành trên mẫu bị đứt ra chất dinh dưỡng trong môi trường một cách hiệu quả khỏi mẫu cấy và không có khả năng hình thành rễ thứ cấp Hình thái của mẫu cấy trong 2 thể tích môi trường khác nhau được thu nhận là hoàn toàn giống 891 Dương Tấn Nhựt et al nhau, điều khác biệt ở 2 nghiệm thức là tỷ lệ tăng Về hình thái của cụm rễ cho thấy mẫu cấy vẫn sinh khối khác nhau trong 2 nghiệm thức: 428,11% đang trong quá trình kéo dài và hình thành thêm các cho nghiệm thức 1 lít và 940,90% cho nghiệm thức 2 cấu trúc rễ thứ cấp cao hơn Trong các thí nghiệm lít Giải thích cho sự khác biệt về tỷ lệ tăng sinh khác này, có thể thời gian thu nhận sinh khối quá sớm nhau có thể là do lượng chất dinh dưỡng trong 2 thể nên chưa thể thấy được các cấu trúc rễ thứ cấp bậc tích là khác nhau Thể tích nghiệm thức 2 là 2 lít 3 trở lên (gấp 2 lần so với nghiệm thức 1), chúng ta cũng thu nhận được kết quả tỷ lệ tăng sinh sinh khối cũng cao Từ mẫu rễ thứ cấp bậc 1, trong quá trình nuôi hơn (tương đương 2 lần) (Bảng 6) Kết quả này phù cấy chúng bị đứt khỏi cụm rễ và vẫn tiếp tục hình hợp với lý thuyết về khả năng chuyển hóa và bảo thành những cấu trúc rễ thứ cấp khác Kết quả giải toàn vật chất phẫu cũng cho thấy các rễ thứ cấp bậc 2 này vẫn có nguồn gốc từ nội sinh, tức là được khởi đầu từ trục Các cụm rễ phát triển mạnh trong hệ thống giữa của rễ thứ cấp bậc 1 (Hình 3f) bioreactor cho thấy đây là hệ thống nuôi cấy phù hợp để tăng sinh khối trong nuôi cấy mô thực vật nói Qua thí nghiệm chúng tôi nhận thấy thể tích môi chung và cây sâm Ngọc Linh nói riêng trường thích hợp cho nuôi cấy rễ sâm trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc là 2 lít Bảng 5 Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy lên khả năng tăng sinh rễ bất định và rễ thứ cấp cây sâm Ngọc Linh Hệ thống nuôi cấy Sau 8 tuần nuôi cấy Tỷ lệ tăng Tỷ lệ sinh khối (%) chất khô (%) Bình tam giác (Bán rắn) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) Bình tam giác (Lỏng lắc) 144,20 9,71 Bioreactor BioPia 17,34c* 1,684c 158,80 9,54 Bioreactor Hàn Quốc 253,40 10,06 16,77c 1,60c 428,11 11,95 32,79b 3,30b 49,19a 5,88a *Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan Bảng 6 Ảnh hưởng của thể tích môi trường lên khả năng tăng sinh rễ bất định trong bioreactor Hàn Quốc Thể tích môi Sau 8 tuần nuôi cấy Tỷ lệ tăng Tỷ lệ chất khô (%) trường (lít) sinh khối (%) Khối lượng tươi Khối lượng khô (g) 11,95 1 (g) 428,11 12,53 2 940,90 49,19b* 5,88b 103,59a 12,98a *Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy vào môi trường lên điểm dòng khí được bơm vào và chưa kịp phân tán khả năng tăng sinh rễ bất định trong bioreactor đều ra trong môi trường nuôi cấy, vì vậy khả năng sử Hàn Quốc (3 lít) dụng dòng khí sục vào môi trường hiệu quả không cao, làm giảm hiệu quả tăng sinh của sinh khối Đối Kết quả thu nhận cho thấy, cùng với thể tích môi với nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy ban đầu cao hơn, trường nuôi cấy, thì tỷ lệ mẫu cấy ban đầu cao hơn toàn sinh khối liên kết với nhau và nổi lên trên, như cho tỷ lệ tăng sinh cao hơn (940,90%) so với đã giải thích ở trên, vị trí này là nơi không khí được (578,03%) (Bảng 7) Điều này có thể được giải thích phân tán đều nhất trong môi trường nuôi cấy, khả là khi tỷ lệ mẫu cấy ban đầu quá nhỏ thì chúng năng trao đổi khí của toàn sinh khối rễ tốt hơn làm không có khả năng kết hợp với nhau để có thể nổi gia tăng hệ số tăng sinh lên trên bề mặt thoáng của môi trường nuôi cấy Trong nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy thấp hơn, các Hình thái rễ của nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy mẫu cấy đều chìm ở dưới đáy của bioreactor, đây là thấp hơn có dấu hiệu của sự già hóa, rễ thứ cấp có 892 Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 887-897, 2012 hình thành trên rễ bất định nhưng không có khả năng cấy, điều này được chứng minh là nhờ hiện tượng kéo dài hoặc là bị đứt gãy sau đó Mô sẹo có rễ bất tạo bọt ở mặt thoáng môi trường, đối chiếu lại với định ban đầu không có khả năng phát sinh thêm rễ nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy thấp thì không thấy như nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy cao hơn có hiện tượng này Cụm rễ thứ cấp ở nghiệm thức có tỷ lệ mẫu Kết quả giải phẫu cho thấy, có một số rễ thứ cấp cấy cao hơn có khả năng hình thành thêm các rễ bậc 2 đang được hình thành và có nguồn gốc nội bất định trên mô sẹo và rễ thứ cấp trên các rễ bất sinh, điểm sơ khởi rễ kéo dài từ trục giữa của rễ thứ định, các rễ bất định và thứ cấp tiếp tục được kéo cấp bậc 1 Qua ảnh chụp soi nổi và ảnh giải phẫu cho dài Môi trường trong nghiệm thức có tỷ lệ mẫu thấy trên cùng một mặt cắt ở rễ thứ cấp bậc 1 có đến cấy thấp hơn không có hiện tượng đục; tuy nhiên, 2 điểm sơ khởi rễ cấp 2 Điều này chứng tỏ khả năng môi trường trong nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy hình thành rễ thứ cấp bậc 2 trên các rễ thứ cấp bậc 1 cao hơn lại bị đục, điều này được giải thích là do là rất cao Như vậy, trong 2 tỷ lệ mẫu cấy ban đầu trong bình có tỷ lệ mẫu cấy thấp hơn không có sự (0,27% và 0,55%) thì tỷ lệ mẫu cấy ban đầu lớn tiết saponin từ sinh khối và bình có tỷ lệ mẫu cấy (0,55%) cho khả năng tăng sinh tốt hơn cao hơn bị đục là do có sự tiết saponin của mẫu Bảng 7 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy lên khả năng tăng sinh sinh khối rễ cây sâm Ngọc Linh Khối lượng mẫu cấy ban Khối lượng tươi Khối lượng khô Tỷ lệ tăng sinh khối Tỷ lệ chất khô (%) đầu (g) (g) (g) (%) 5,37 31,04b* 3,30b 578,03 10,63 11,01 103,59a 12,98a 940,90 12,53 *Những ký tự khác nhau (a, b,…) biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P = 0,05 bằng phép thử Duncan Định tính saponin trong sinh khối rễ cây sâm hàm lượng của saponin trong các loại sinh khối Ngọc Linh được nuôi cấy trong các hệ thống callus, chồi và rễ cây sâm Ngọc Linh Trong 3 loại bioreactor BioPia (2 lít) và bioreactor Hàn Quốc sinh khối thì chồi được xác định là có hàm lượng (3 lít) saponin cao nhất, tiếp đến là sinh khối callus và rễ So sánh với kết quả sắc kí đồ của Nhựt và đồng tác Dựa vào vị trí và màu sắc các vết trên bản mỏng giả (2010) trên sinh khối rễ sâm Ngọc Linh cho thấy thu được chúng tôi xác định Rf của các vết chất Kết hàm lượng của saponin trong thí nghiệm này thấp quả cho thấy trong các sinh khối có cả 3 vết màu hơn Điều này được giải thích là do thời gian nuôi hồng tím tương ứng với 3 vết của chất chuẩn MR2, cấy sinh khối rễ của Nhựt và đồng tác giả (2010) dài G-Rb1 và G-Rg1 với giá trị Rf lần lượt là 0,61; 0,59; hơn thời gian nuôi cấy của sinh khối được thí 0,27 với hệ I (Hình 1a) và 0,75; 0,72; 0,35 với hệ II nghiệm Tuy nhiên sinh khối rễ của Nhựt và đồng tác (Hình 1b) giả (2010) được nuôi cấy trên môi trường bán rắn nên saponin được tổng hợp hoàn toàn được giữ lại Qua hình ảnh sắc kí đồ cho thấy sự hiện diện của bên trong sinh khối, trái lại sinh khối rễ trong thí saponin toàn phần của sinh khối rễ sâm Ngọc Linh nghiệm này được nuôi cấy trong điều kiện lỏng và được nuôi cấy trong hệ thống bioreactor với các sục khí nên một phần saponin được tổng hợp đã tiết phương pháp sắc kí khác nhau và các hệ dung môi ra trong dịch nuôi cấy Vì vậy khi tiến hành sắc kí đồ khác nhau (Hình 1) với dịch nuôi cấy, vẫn xác định là có sự hiện diện của saponin (Hình 2) Nhựt và đồng tác giả (2010) đã xác định được 893 Dương Tấn Nhựt et al Hình 1 Sắc kí đồ của dịch nuôi cấy và sinh khối rễ sâm trước khi qua daion khử đường a Hệ dung môi 1: Chloroform : methanol : nước (65 : 35 : 10); b Hệ dung môi 2: n-Butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 5) Hình 2 Sắc kí đồ của dịch nuôi cấy và sinh khối rễ sâm sau khi qua daion khử đường a Hệ dung môi 1: Chloroform : methanol : nước (65 : 35 : 10); b Hệ dung môi 2: n-Butanol : acid acetic : nước (4 : 1 : 5) 894 Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 887-897, 2012 Hình 3 Rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro a Rễ bất định hình thành trên mô sẹo có nguồn từ lá; b Rễ thứ cấp; c Hệ thống bioreactor Hàn Quốc (3 lít); d, e Rễ bất định và rễ thứ cấp hình thành trong hệ thống bioreactor Hàn Quốc; f Rễ thứ cấp hình thành trên rễ bất định KẾT LUẬN thông qua sắc ký lớp mỏng chúng tôi cũng đã nhận thấy rễ bất định và rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi Nguồn mẫu thích hợp cho hình thành rễ bất cấy in vitro có chứa cả 3 loại saponin quan trọng của định ban đầu là mô sẹo có nguồn gốc trực tiếp từ lá sâm Ngọc Linh tự nhiên đó là MR2, G-Rb1, G-Rg1 (20,40 rễ/mẫu) Môi trường thích hợp cho quá trình hình thành rễ bất định là môi trường SH bổ sung 3 Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin cảm ơn đề tài cấp mg/l NAA và 30 g/l sucrose Hệ thống nuôi cấy nhà nước:“Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tóc sâm bioreactor Hàn Quốc với thể tích môi trường 2 lít và Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv.) làm khối lượng mẫu ban đầu 11,02 g cho kết quả tạo vật liệu cho nuôi cấy bioreactor” đã hỗ trợ kinh phí thành rễ bất định và rễ thứ cấp tốt nhất Ngoài ra cho chúng tôi thực hiện nghiên cứu này 895 Dương Tấn Nhựt et al TÀI LIỆU THAM KHẢO Jung HK, Eun JC, Hoon-Il O (2005) Saponin production in submerged adventitious root culture of Panax ginseng as Asaka I, Li L, Hirotani M, Asada Y, Furuya T (1993) affected by culture conditions and elicitors Asia-Pac J Production of ginsenoside saponin by culturing ginseng Mol Biol 13(2): 87-91 (Panax ginseng) embryonic tissues in bioreactors Biotechnol Lett 15: 1259-1264 Khuri S, Moorby J (1995) Investigation into the role of sucrose in potato: Estima microtuber production in vitro Bùi Trang Việt (2002) Sinh lý thực vật đại cương - Phần Ann Botany 75: 295-303 II: Phát triển Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh: 328-329 Nemeth G (1986) Induction of rooting In Bajaj YPS eds Biotechnology in Agriculture and Forestry, Tree I Carvalho EB, Curtis WR (1998) Characterization of fluid Springer, Berlin Heidelberg New York Tokyo, 1: 49-64 flow resistance in root cultures with a convective flow tubular bioreactor Biotechnol Bioeng 60: 375-384 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011) Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Choi SM, Son SH, Yun SR, Kwon OW, Seon JH, Paek Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong nuôi cấy in KY (2000) Pilot-scale culture of adventitious roots of vitro Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và ginseng in a bioreactor system Plant Cell Tiss Org 62: Công nghệ 27: 30-36 187-193 Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Duncan DB (1955) Multiple range and multiple F test Hương (2007) Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Biometrics 11: 1-42 Nhân sâm Nxb Khoa học và Kỹ thuật 109-110 Dương Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nhut DT, Huy BN, Phong PT, Hai NT, Luan TC (2006) Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Primary study on multiplication of adventitious roots of Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Panax vietnamensis – A valuable material source for Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ saponin isolation Biotechnol Agron Plant Prot 118-121 Nga, Thái Thương Hiền, Nguyễn Thành Hải (2010) Nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha Odnevall A, Bjork L (1989) Differentiated tissue cultures et Grushv.) Tạp chí công nghệ sinh học 8(3B): 1211-1219 of Panax ginseng and their response to various carbon sources Biochem Physiol Pfl 185: 403-413 Dương Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền, techniques for induction and growth of monocotyledonous Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Công Luận, Đoàn and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot Rev Can Trọng Đức (2010) Xác định hàm lượng saponin và dư Bot 50: 199-204 lượng một số chất điều hòa sinh trưởng trong callus, chồi và rễ sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Tạp chí Công nghệ Sim SJ, Chang HN (1997) Shikonin production by hairy- Sinh học 8(2): 189-202 roots of Lithospermum erythrorhizon in bioreactors with in situ separation In Doran PM ed Hairy-roots Culture Hahn EJ, Kim YS, Yu KW, Joeng CS, Paek KY (2003) and Applications Harwood Academic Publishers, Adventitious root cultures of Panax ginseng C.A Meyer Australia: 219-225 and ginsenoside production through large scale bioreactor system J Plant Biotechnol 5(1): 1-6 Teisson C, Alvard D (1995) A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion In Holmes P, Li SL, Green KD, Ford-Lloyd BV, Thomas NH Terzi M et al Eds Current Issues in Plant Molecular and (1997) Drip-tube technology for continuous culture of Cellular Biology, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: hairy-roots with integrated alkaloid extraction, In Doran 105-110 PM ed Hairy-roots culture and applications Harwood Academic Publishers: 201-208 Võ Thị Bạch Mai (2004) Sự phát triển chồi và rễ Nxb Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh: 28-125 Inomata S, Yokoyama M, Gozu Y, Shimizu T, Yanagi M (1993) Growth pattern and ginsenoside production of Wendler R, Veith R, Dacer J, Stitt M, Komor E (1990) Agrobacterium-transformed Panax ginseng roots Plant Sucrose storage in cell-suspension cultures of Sacharum Cell Rep 12: 681-686 sp (sugarcane) is regulated by a cycle of synthesis and degradation, Planta 183: 31-39 896 Tạp chí Công nghệ Sinh học 10(4A): 887-897, 2012 SOME CULTURE SYSTEMS IN RAPID PROLIFERATION OF ADVENTITIOUS- AND SECONDARY ROOTS OF NGOC LINH GINSENG (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) Duong Tan Nhut1, , Nguyen Cuu Thanh Nhan1, Hoang Xuan Chien1, Nguyen Phuc Huy1, Nguyen Ba Nam1, Tran Xuan Ninh2, Pham Phong Hai2, Vu Quoc Luan1, Phan Quoc Tam1, Vu Thi Hien1, Trinh Thi Huong1, Tran Cong Luan3, Kee-Yoeup Paek4 1Tay Nguyen Institute of Biology, Vietnam Academy of Science and Technology 2Yersin University of Dalat, Vietnam 2Research Center of Ginseng and Medicinal Materials, Vietnam 4Reseach Center for the Development of Advanced Horticultural Technology, Chungbuk National University, Republic of Korea SUMMARY Ginseng in vitro root biomass has been reported to contain saponins so that it is being used worldwide as an important alternative source for production of these compounds Recent progress in plant cell cultures suggest that a large number of plant-derived active ingredients were able to be produced by biomass technology, and many studies have been conducted to produce ginseng root biomass from adventitious- and secondary roots In the present study, adventitious- and secondary roots cultured in various kinds of bioreactors for production of biomass was investigated After 8 weeks of culture, leaf-derived callus showed to be the most suitable material for adventitious root formation (20.40 roots per explant) SH medium supplemented with 3 mg/l NAA, 8 g/l agar and 30 g/l sucrose showed the best results for adventitious root induction (adventitious root formation rate of 90%, and 6 roots per explant) Adventitious root growth and secondary roots induction were obtained when callus-derived adventitious root were cultured in three-liter Erlenmeyer Flasks, three-liter bioreactor (Biotron, Inc Korea) and two-liter bioreactor (Biopia Co., Ltd., Yeongi, Republic of Korea) Among the culture systems used, three-liter bioreactor containing initially 11.01 g of adventitious root material and 2 liters of culture medium resulted in the highest amount of root biomass after 8 weeks of culture (103.59 g fresh weight, and 12.98 g dry weight) Thin layer chromatography diagram showed that in vitro adventitious- and secondary roots of Ngoc Linh ginseng contained three important saponins - MR2, G-Rb1, and G-Rg1 - the same as those of the native roots Keywords: Adventitious root, BioPia bioreactor, callus, G-Rb1, G-Rg1, Korea bioreactor, MR2, Panax vietnamensis, saponin, secondary root Author for correspondence: Tel.: +84-63-3831056; Fax: +84-63-3831028; E-mail: duongtannhut@gmail.com 897