Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống và kỹ thuật ra cây sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv) nuôi cấy mô

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG VÀ KỸ THUẬT RA CÂY SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis HA et Grushv.) NUÔI CẤY MÔ” Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ THANH Mã sinh viên : 637195 Lớp :K63-CNSHB Ngành :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH : ThS VŨ THỊ HẰNG HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất thí nghiệm đề tài “Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân giống kỹ thuật sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy mô” dƣới hƣớng dẫn sát GS.TS Nguyễn Quang Thạch, với hƣớng dẫn trực tiếp Th.S Vũ Thị Hằng tơi thực Tồn số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa công bố công trình nghiên cứu trƣớc Các tài liệu tham khảo cho đề tài đƣợc trích dẫn nguồn gốc theo quy định Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh i LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, cố gắng nỗ lực thân em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo nhiệt tình của Thầy, Cơ, gia đình bạn bè Trƣớc tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nông nghiệp Trung tâm Ánh sáng phục vụ Nông nghiệp Công nghệ cao tạo điều kiện cho em thực khóa luận tốt nghiệp Đồng thời em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Công nghê Sinh học quý Thầy, Cô khoa truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Đặc biệt, thời gian vừa qua em xin gửi lời cảm ơn chân thành kính trọng đến GS.TS Nguyễn Quang Thạch ngƣời dành nhiều tình cảm yêu thƣơng quan tâm đến chúng em Em xin chân thành cảm ơn Th.S Vũ Thị Hằng ln quan tâm, chia sẻ, dành thời gian tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới anh chị, bạn làm khóa luận ln giúp đỡ, động viên, sát cánh bên em em gặp khó khăn hỗ trợ em hồn thành tốt khóa luận Cảm ơn ngƣời bạn thân thiết bên cạnh chia sẻ, ủng hộ em bƣớc đƣờng Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn tới Bố, Mẹ với em trai – ngƣời quan trọng đời đồng hành chặng đƣờng Cảm ơn Bố, Mẹ sinh thành tạo điều kiện tốt để có đƣợc nhƣ ngày hơm Bố, Mẹ nguồn động viên lớn để cố gắng ngày, điểm tựa vững giúp vƣợt qua khó khăn sống Cảm ơn Bố, Mẹ nhiều tất tốt đẹp Bố, Mẹ dành cho Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II: TỔNG QUAN 2.1 Khái quát sâm Ngọc Linh 2.1.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển 2.1.2 Hình thái thực vật 2.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố sâm Ngọc Linh 2.1.4 Thành phần hoá học 10 2.1.5 Các tác dụng sâm Ngọc Linh 12 2.1.6 Giá trị kinh tế sâm Ngọc Linh 14 2.1.7 Tình hình trồng sâm Ngọc Linh 14 2.2 Tình hình nghiên cứu nhân nhanh in vitro chi Panax giới Việt Nam 15 2.3 Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh giới Việt Nam 18 iii PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu nghiên cứu 23 3.1.1 Vật liệu 23 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 23 3.1.3 Hoá chất điều kiện nuôi cấy 23 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 24 3.3 Nội dung nghiên cứu 24 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều tiết sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn 25 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu số kỹ thuật ảnh hƣởng đến thích nghi, sinh trƣởng sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô trồng nhà vi khí hậu 28 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 30 3.5 Các tiêu theo dõi 30 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng chất điều tiết sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn 31 4.1.1 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng α-NAA BA đến khả sinh trƣởng phát triển phôi đơn 31 4.1.2 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng α-NAA Kinetin đến khả sinh trƣởng phát triển phôi đơn 34 4.1.3 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng BA Kinetin đến khả sinh trƣởng phát triển phôi đơn 37 4.1.4 Ảnh hƣởng acid humic đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn 43 4.1.5 Ảnh hƣởng PEG đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn 47 4.1.6 Ảnh hƣởng ABA đến đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn 48 iv 4.2 Nghiên cứu số kỹ thuật ảnh hƣởng đến thích nghi, sinh trƣởng sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô trồng nhà vi khí hậu 52 4.2.1 Ảnh hƣởng giảm thoát nƣớc đến tỷ lệ sống sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô tiến hành nhà vi khí hậu 52 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng loại giá thể khác đến thích nghi, sinh trƣởng sâm Ngọc Linh nuôi cấy mơ trồng nhà vi khí hậu 54 4.3 Thảo luận 58 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 67 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng α-NAA BA đến khả sinh trƣởng phát triển phôi đơn (sau tuần nuôi cấy) 32 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng α-NAA Kinetin đến khả sinh trƣởng phát triển phôi đơn (sau tuần nuôi cấy) 34 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng BA Kinetin đến khả sinh trƣởng phát triển phôi đơn (sau tuần nuôi cấy) 38 Bảng 4.4 So sánh tiêu tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng có nồng độ tối ƣu thí nghiệm 41 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng acid humic đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn (8 tuần nuôi cấy) 43 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng PEG đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn (8 tuần nuôi cấy) 47 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng ABA đến sinh trƣởng phát triển phôi đơn (8 tuần nuôi cấy) 49 Bảng 4.8 Kết khảo sát ảnh hƣởng giảm thoát nƣớc đến tỷ lệ sống sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô tiến hành nhà vi khí hậu (4 tuần sau trồng) 53 Bảng 4.9 Kết khảo sát ảnh hƣởng loại giá thể khác đến thích nghi, sinh trƣởng sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô trồng nhà vi khí hậu (3 tháng sau trồng) 55 II Tiếng Anh 66 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh Hình 4.1 Hình thái sâm Ngọc Linh mơi trƣờng bật mầm có bổ sung α-NAA BA với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 32 Hình 4.2 Sự bật mầm nhân phôi sơ cấp phôi sâm Ngọc Linh tạo mơi trƣờng có bổ sung α-NAA Kinetin với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 35 Hình 4.3 Hình thái phơi sâm Ngọc Linh tạo môi trƣờng bật mầm nhân phơi sơ cấp có bổ sung 1,5 mg/l α-NAA Kinetin với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 37 Hình 4.4 Sự bật mầm nhân phơi sơ cấp phôi sâm Ngọc Linh tạo mơi trƣờng có bổ sung BA Kinetin với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 39 Hình 4.5 Sự bật mầm nhân phơi sơ cấp phôi sâm Ngọc Linh tạo mơi trƣờng có bổ sung acid humic với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 44 Hình 4.6 Hình thái phơi sâm Ngọc Linh tạo môi trƣờng bật mầm nhân phôi sơ cấp có bổ sung acid humic với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 44 Hình 4.7 Sự bật mầm nhân phơi sơ cấp phôi sâm Ngọc Linh tạo môi trƣờng có bổ sung PEG (20 g/l) ABA với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 50 Hình 4.8 Hình thái phơi sâm Ngọc Linh tạo môi trƣờng bật mầm nhân phôi sơ cấp có bổ sung PEG (20 g/l) ABA với nồng độ khác (sau tuần nuôi cấy) 51 Hình 4.9 Hình thái sâm Ngọc Linh mọc trồng giá thể peatmoss (3 tháng sau trồng) 55 Hình 4.10 Hình thái sâm Ngọc Linh trồng giá thể có cơng thức 70% xơ dừa + 20% đất +10% trấu hun (3 tháng sau trồng) 56 Hình 4.11 Hình thái sâm Ngọc Linh trồng giá thể có cơng thức 70% xơ dừa +12% peatmoss +10% vermi + 8% perlite (3 tháng sau trồng) 57 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ ABA Abscisic acid α-NAA α- naphtalene acetic aid Kinetin 6-Furfurylaminopurine PEG Polyethylene glycol MS Murashige & Skoog CT Công thức ĐC Đối chứng NXB Nhà xuất CRD Completely Randomized Design 10 CV (%) Coefficient of Variation 11 LSD Least significance difference viii TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm xác định ảnh hƣởng chất điều tiết sinh trƣởng đến khả bật mầm nhân phôi phôi đơn nuôi cấy; ảnh hƣởng điều kiện trồng nhà vi khí hậu đến khả thích nghi sinh trƣởng sâm Ngọc Linh cấy mơ Từ đó, giúp hồn thiện quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) kỹ thuật trồng từ in vitro Các phôi đơn hình thành rõ đầu rễ, đầu đƣợc sử dụng để nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng i: auxin; ii: loại cytokinin Kết cho thấy: mơi trƣờng ½ MS có bổ sung 1,5 mg/l α-NAA + 0,1 mg/l BA +30 g/l đƣờng +5 g/l agar cho hình thái chất lƣợng bật mầm từ phôi tốt sau (46,67%) tuần ni cấy Mơi trƣờng có bổ sung auxin: 1,0 mg/l kinetin nhƣng không bổ sung BA cho tỷ lệ phôi bật mầm thành cao (58,33%) Axit humic 0,7 g/l cho số lƣợng phôi tạo thành cao (74,05 phôi/mẫu), phôi tạo thành chắc, to khỏe hình thái tạo thành tốt sau tuần ni cấy Ngồi ra, PEG ABA cho tác động đến tỷ lệ nhân phôi, phôi đơn sau tuần nuôi cấy môi trƣờng kết hợp 20 g/l PEG 0,2 mg/l ABA (axit absisic), mơi trƣờng ½ MS +30 g/l đƣờng +5 g/l agar cho tỷ lệ tạo phôi cao 62,71 phôi/mẫu Cây sâm Ngọc Linh in vitro phát triển hoàn thiện, đƣợc trồng nhà vi khí hậu để đánh giá khả thích nghi sinh trƣởng sau Kết quả, sau tuần theo dõi cho thấy sâm ngọc linh cấy mô bị nƣớc nhanh chết hồn tồn khơng có biên pháp giữ ẩm Biện pháp giữ ẩm cho úp cốc nhựa với thời gian 20 ngày cho tỷ lệ sống cao (100%) Trong loại giá thể nghiên cứu , giá thể peatmoss cho tỷ lệ sống cao (86,67%) tỷ lệ mọc cao ( 53,85% ) sau tháng trồng ix khả bật mầm từ phôi đơn, kết thu đƣợc tốt mơi trƣờng có bổ sung 1,0 mg/l kinetin mà không bổ sung BA với tỷ lệ bật mầm 58,33% Theo nghiên cứu lồi khác, acid humic chất kích thích rễ, có vai trị quan trọng việc tạo rễ cho Tuy nhiên, nghiên cứu chúng tôi, acid humic đƣợc sử dụng kết hợp với chất điều tiết sinh trƣởng khác để đánh giá ảnh hƣởng đến khả tạo phôi từ phôi đơn, nhƣ khả bật mầm thành phôi vơ tính Kết đạt đƣợc cho thấy rằng, kết hợp 0,7 g/l acid humic với 1,0 mg/l BA, 0,5 mg/l α-NAA 30 g/l đƣờng cho số lƣợng phơi đơn cao (74,05 phơi/mẫu), phơi tạo thành có hình thái to, chắc, màu xanh Tỷ lệ bật mầm 48,33%, tạo thành phát triển tốt, có mở phát triển, củ to Trong nghiên cứu Dƣơng Tấn Nhựt năm 2010 trồng thử nghiệm vƣờn ƣơm sâm Ngọc Linh in vitro, sau tháng trồng 1000 cho thấy tốc độ sinh trƣởng vƣờn ƣơm nhanh so với sâm Ngọc Linh gieo hạt với tỷ lệ sống sót 87% Nhƣng in vitro trồng đƣợc khu vực phân bố sâm Ngọc Linh vốn có tự nhiên (tại tỉnh Kon Tum Lâm Đồng) Cho đến chƣa có cơng trình nghiên cứu nghiên cứu sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô đƣợc trồng địa điểm khác vùng phân bố tự nhiên chúng Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu phịng vi khí hậu, nơi có điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm thay đổi trì phù hợp với điều kiện sinh thái sâm Ngọc Linh Trong nghiên cứu này, nghiên cứu bƣớc đầu kỹ thuật trồng sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô điều kiện nhân tạo Kỹ thuật úp cốc nhằm giảm thoát nƣớc qua nuôi cấy mô giúp làm tăng tỷ lệ sống lên mức tối ƣu kỹ thuật quan trọng bƣớc đầu cây, kết nghiên cứu cho thấy với thời gian úp cốc 20 ngày cho tỷ lệ sống sau trồng cao (sau tuần theo dõi) Thí nghiệm loại giá thể khác sau tháng trồng cho thấy, giá thể peatmoss loại giá thể tốt cho thích nghi, sinh trƣởng của sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô 59 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa vào kết thu đƣợc từ thí nghiệm tiến hành, tơi đƣa kết luận sau: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng αNAA, BA kinetin cho thấy: - Mơi trƣờng ½ MS có bổ sung 1,5 mg/l α-NAA + 0,1 mg/l BA +30 g/l đƣờng +5 g/l agar cho hình thái chất lƣợng bật mầm từ phôi tốt sau tuần ni cấy - Mơi trƣờng có bổ sung 1,0 mg/l kinetin nhƣng không bổ sung BA mơi trƣờng ½ MS có bổ sung +30 g/l đƣờng +5 g/l agar cho tỷ lệ phôi bật mầm thành cao (58,33%), tạo thành có chồi mập, mở phát triển đều, xanh tốt, thân to, cứng cáp, củ to, xuất rễ sau thời gian theo dõi tuần Kết nghiên cứu bổ sung 0,7 g/l acid humic vào môi trƣờng nuôi phôi cho số lƣợng phôi tạo thành cao (74,05 phôi/mẫu) , phôi tạo thành chắc, to khỏe hình thái tạo thành tốt sau tuần nuôi cấy Đối với kết nghiên cứu kỹ thuật cây: - Cây in vitro sâm Ngọc Linh cần giữ ẩm cách úp cốc nhựa Thời gian giữ ẩm úp cốc thích hợp 20 ngày Cây đƣợc giữ ẩm 20 ngày có tỷ lệ sống 100% đối chứng không đƣợc úp cốc để giữ ẩm chết hoàn toàn Thời gian giữ ẩm cho tăng từ đến 5, 10, 20 ngày cho tỷ lệ sống tăng tỷ lệ theo tử 0; 13,33%; 46,67 % đến 100% - Trong loại gíá thể nghiên cứu, giá thể peatmoss giá thể tốt cho thích nghi sinh trƣởng sâm Ngọc Linh 60 QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY SÂM NGỌC LINH Giai đoạn tạo mô sẹo từ nguồn mẫu Giai đoạn nhân nhanh mô sẹo Giai đoạn phát sinh phơi từ mơ sẹo Giai đoạn hình thành (bật mầm) mơi trƣờng ½ MS có bổ sung 1,5 mg/l α-NAA + 0,1 mg/l BA +30 g/l đƣờng +5 g/l agar Giai đoạn sinh trƣởng hoàn thiện sâm Ngọc Linh nuôi cấy mô Giai đoạn cây: Cây in vitro sâm Ngọc Linh cần giữ ẩm cách úp cốc nhựa Thời gian giữ ẩm úp cốc thích hợp 20 ngày giá thể peatmoss giá thể tốt cho thích nghi sinh trƣởng sâm Ngọc Linh 61 5.2 Kiến nghị Tiến hành nghiên cứu tạo phôi trực tiếp từ lá, cuống để rút ngắn quy trình tạo phơi Tiếp tục nghiên cứu kỹ thuật trồng in vitro sâm Ngọc Linh nhà vi khí hậu dinh dƣỡng tƣới Tiếp tục nghiên cứu khảo sát thích nghi sinh trƣởng sâm Ngọc Linh sau trồng với thời gian theo dõi dài Định tính định lƣợng saponin sâm Ngọc Linh in vitro sâm Ngọc Linh giai đoạn với thời gian khác 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tiếng Việt Đỗ Hữu Bích, Từ điển thuốc động vật làm thuốc Việt Nam II, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2003 Hồng Xn Chiến, Ngơ Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xn Tình, Lâm Bích Thảo, Trần Cơng Luận, Dƣơng Tấn Nhựt, Nghiên cứu số yếu tố tạo củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro xác định hàm lƣợng saponin tạo từ củ trồng thử nghiệm núi Ngọc Linh, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2011, 9(3), 325-339 Lê Kim Cƣơng, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hƣơng, Dƣơng Tấn Nhựt, Ảnh hƣởng số yếu tố lên khả tăng sinh mô sẹo “xốp” bƣớc đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Sinh học, 2012, 34(3SE), 265-276 Nguyễn Thƣợng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Sâm Việt Nam số thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội,2007 Trịnh Thị Hƣơng, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dƣơng Tấn Nhựt, Ảnh hƣởng nguồn mẫu, kích thƣớc mẫu số loại auxin lên khả tái sinh rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2012, 10(4), 877- 886 Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn Thế Vinh, Thái Xuân Du, Dƣơng Tấn Nhựt 2014 Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống thân rễ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Sinh học, 36(1SE): 277-282 Vũ Thị Hiền (2018), “Nghiên cứu trình tái sinh nhân giống in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grush.) kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào”, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Bá Hoạt, Nguyễn Văn Thuận, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Xuân Trƣờng, Đào Mạnh Hùng, Nguyễn Văn Bút, Nguyễn Văn 63 Mậy Mang Ngọc Tiến (2006), Nghiên cứu kỹ thuật trồng quy hoạch phát triển sâm Ngọc Linh Kon Tum, Tạp chí phát triển Dƣợc liệu Đông dƣợc Việt Nam, Chủ biên: Viện Dƣợc Liệu, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.564-576 Lê Thị Nụ (2021) Nghiên cứu hồn thiệm quy trình ni cấy nhân giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grush.), Báo cáo khóa luận tốt nghiệp, tr 54-61 10 Trần Cơng Luận (2003) Kết nghiên cứu hóa học sâm Việt Nam, Hội thảo bảo tồn phát triển sâm Ngọc Linh tỉnh Quảng Nam: 62-75 11 Nguyen Thi Nhat Linh, Hoang Thanh Tung, Vu Thi Hien, Vu Quoc Luan, Nguyen Phuc Huy, Nguyen Hoang Loc, Duong Tan Nhut, Effect of metal nanoparticles on the growth of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) lateral roots cultured in vitro, Tap chí Đại học Huế, 2017, 126(1C), 47-55 12 Trần Thị Liên (2011) Nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật góp phần xây dựng quy trình sản xuất giống dƣợc liệu sâm Việt Nam(Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp: 6-35 13 Dƣơng Tấn Nhựt, Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu tái sinh, nhân giống chuyển gene thực vật, NXB Nông Nghiệp, 2006 14 Dƣơng Tấn Nhựt, Lâm Thị Mỹ Hằng, Bùi Thế Vinh, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Lê Nữ Minh Thùy, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Văn Bình, Vũ Quốc Luận, Trần Cơng Luận, Đồn Trọng Đức, Xác định hàm lƣợng saponin dƣ lƣợng số chất điều hòa sinh trƣởng callus, chồi rễ sâm Ngọc Linh ni cấy in vitro, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2010, 8(2), 189-202 15 Dƣơng Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hƣơng, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thƣơng Hiền, Nguyễn Thành Hải, Nhân giống vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2010, 8(3B), 1211-1219 16 Nguyễn Trung Thành (2008) Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm Panax Ginseng C.A Meyer: ảnh hƣởng số nhân tố lý hóa lên tăng trƣởng sinh khối sản phẩm trao đổ chất ginsenosides, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên 64 Công nghệ 24: 318-323 17 Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Nam, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Dƣơng Tấn Nhựt, Nghiên cứu tác động ánh sáng đèn LED lên khả tăng sinh mô sẹo hình thành hồn chỉnh từ phơi vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Kỷ yếu Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội, 2013, 10381042 18 Hồ Thanh Tâm, Trịnh Thị Hƣơng, Hà Thị Mỹ Ngân, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Lê Kim Cƣơng, Bùi Thế Vinh, Trần Cơng Luận, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Dƣơng Tấn Nhựt, Ảnh hƣởng IBA, NAA IAA lên khả hìnhthành tích lũy saponin rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro, Kỷ yếu hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội, 2013, 1043-1048 19 Nguyễn Thị Tình, Dƣơng Thị Liên, Vũ Thị Thanh Hằng, Đinh Thị Kim Hoa, Vi Đại Lâm, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Tiến Dũng (2018), “Nghiên cứu nhân giống in vitro nhân sâm ( Panax ginseng C.A.Meyer)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ-Đại học Thái nguyên, 188(12/1), tr,45-50 20 Mai Trƣờng, Trần Thị Ngọc Hà, Phan Tƣờng Lộc, Lê Tấn Đức, Trần Trọng Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Phạm Đức Trí, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ, Nghiên cứu ni cấy mơ sẹo có khả sinh phôi mô phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Sinh học, 2013,35(3SE), 145-157 21 TT y tế Quảng Nam- Đà Nẵng, Báo cáo điều tra trữ lượng, khoanh vùng sâm K5 Tỉnh Quảng Nam - Đà Nẵng, 1979 22 Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thƣơng Hiền, Đỗ Khắc Thịnh, Dƣơng Tấn Nhựt, Nghiên cứu hình thái giải phẫu cấu trúc phơi q trình phát sinh phơi vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Khoa học Phát triển, 2015, 7(12), 1140-1148 65 II Tiếng Anh Langhansová, L., Konrádová, H & Vaněk, T Polyethylene glycol and abscisic acid improve maturation and regeneration of Panax ginseng somatic embryos Plant Cell Rep 22, 725–730 (2004) K Claire, N Le Gal, M Monteiro, J Dommes, T Gaspar, Somatic embryogenesis of panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and their metabolic pathways, Plant Growth Regulation, 2000, 31, 209-214 Y Shoyama, X.X Zhu, R Nakai, S Shiraishi, H Kohda, Micropropagation of Panax notoginseng by somatic embryogenesis and RAPD analysis of regennerated plantlets, Plant Cell Reports, 1997, 16, 450-453 N.T Thanh, N.V Ket, K.Y Paek, Effecting of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 2007, 23, 269274 N.T Thanh, H.T Anh, K.Y Paek, Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 2008, 24, 248-252 K Yobimoto, K Matsumoto, N.T.T Huong, R Kasai, K Yamasaki H Watanabe, Suppressive effects of Vietnamese ginseng saponin and its major component majonoside–R2 on psychological stress–induced enhancement of lipid peroxidation in the mouse brain, Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2000, 66(3), 661-665 Jun-Ying Zhang, Hyeon-Jin Sun, Suk-Min Ko, Hong-Guy Kang, Gwon- Jung Choi, In-Ja Song, Key-Zung Riu, Pyung-Ok Lim, Hyo-Yeon Ly (2014), “Plan regeneration of Korean wild giseng (Panax ginseng Mayer) mutant lines induced by irradiation (60Co) of adventitous root”, Journal of ginseng research, 38(3),pp.220-225 III Internet https://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh 66 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) gồm thành phần sau Nguyên tố đa lƣợng  NH4NO3 1650 mg/l  KNO3 1900 mg/l  MgSO4.7H2O 370 mg/l  Ca(NO3).4H2O 400 mg/l  KH2PO4 170 mg/l Nguyên tố vi lƣợng  H3BO4 6.3 mg/l  ZnSO4.7H2O 8.6 mg/l  MnSO4.4H2O 22.3 mg/l  KI 0.83 mg/l  Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/l  CuSO4.5H2O 0.025 mg/l  CoCl2.7H2O 0.025 mg/l Vitamine  Pyridoxine (B6) mg/l  Thiamine (B1) mg/l  Nicotinic acid mg/l  m – Inositol 100 mg/l  Biotine 0.01 mg/l  D-Pantothnic acid mg/l FeEDTA  FeSO4.7H2O 27.8 mg/l  NaEDTA.2H2O 37.3 mg/l 67 Phụ lục 2: Kết xử lý số liệu Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng α-NAA BA đến khả sinh trưởng phát triển phôi đơn BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE TN1 1/ 6/22 15:26 :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 1035.27 345.090 ****** 0.000 * RESIDUAL 799991 999988E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 1036.07 94.1881 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN1 1/ 6/22 15:26 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SPD/M 20.5333 37.5667 3 16.3667 13.7000 SE(N= 3) 0.182573 5%LSD 8DF 0.595353 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 1/ 6/22 15:26 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SPD/M GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 12) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 9.7051 0.31623 12 22.042 C OF V |CT % | | | | | | 1.4 0.0000 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng α-NAA Kinetin đến khả sinh trưởng phát triển phôi đơn BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE TN22 1/ 6/22 15:54 :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF 68 MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 983.054 327.685 * RESIDUAL 4.40007 550009 595.78 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 11 987.454 89.7686 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN22 1/ 6/22 15:54 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SPD/M 22.4667 24.0667 3 37.7833 43.8500 SE(N= 3) 0.428178 5%LSD 8DF 1.39625 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN22 1/ 6/22 15:54 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SPD/M GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 12) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 9.4746 0.74163 12 32.042 C OF V |CT % | | | | | | 2.3 0.0000 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng BA Kinetin đến khả sinh trưởng phát triển phôi đơn BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE TN3 1/ 6/22 15:34 :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT * RESIDUAL 653.202 130.640 12 7.34335 611946 213.48 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 17 660.545 38.8556 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 1/ 6/22 15:34 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT 69 CT NOS SPD/M 23.1000 24.9667 3 30.1833 41.2667 27.2667 33.2167 SE(N= 3) 0.451643 5%LSD 12DF 1.39167 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 1/ 6/22 15:34 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SPD/M GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 18) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 6.2334 0.78227 18 30.000 C OF V |CT % | | | | | | 2.6 0.0000 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng acid humic đến sinh trưởng phát triển phôi đơn BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE 16/ 6/22 20:10 :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT * RESIDUAL 4447.07 1111.77 10 23.6334 2.36334 470.42 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 14 4470.71 319.336 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 16/ 6/22 20:10 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SPD/M 24.8000 31.7667 3 42.4000 74.0500 51.9667 70 SE(N= 3) 0.887569 5%LSD 10DF 2.79676 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 16/ 6/22 20:10 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) NO OBS SPD/M 15 44.997 DEVIATION BASED ON BASED ON TOTAL SS RESID SS 17.870 1.5373 C OF V |CT % | | | | | | 3.4 0.0000 Thí nghiệm 5:Ảnh hưởng PEG đến sinh trưởng phát triển phôi đơn BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE TN5 1/ 6/22 15:39 :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 290.367 96.7889 * RESIDUAL 1.57334 196667 492.15 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 11 291.940 26.5400 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 1/ 6/22 15:39 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SPD/M 11.9500 15.7167 3 24.8500 14.0833 SE(N= 3) 0.256039 5%LSD 8DF 0.834916 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 1/ 6/22 15:39 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 71 VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 12) NO OBS SPD/M 12 16.650 DEVIATION BASED ON BASED ON TOTAL SS RESID SS 5.1517 0.44347 C OF V |CT % | | | | | | 2.7 0.0000 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng ABA đến sinh trưởng phát triển phôi đơn BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE 52 16/ 6/22 20:56 :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT * RESIDUAL 3610.30 902.574 10 12.1220 1.21220 744.57 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 14 3622.42 258.744 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE 52 16/ 6/22 20:56 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SPD/M 23.8000 21.2663 3 33.6220 47.6000 62.7113 SE(N= 3) 0.635663 5%LSD 10DF 2.03000 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE 52 16/ 6/22 20:56 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SPD/M GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 16.086 1.1010 15 37.800 72 C OF V |CT % | | | | | | 2.9 0.0000 Bảng so sánh tiêu tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng có nồng độ tối ưu thí nghiệm 1, thí nghiệm thí nghiệm BALANCED ANOVA FOR VARIATE SPD/M FILE BS 7/ 7/22 23: :PAGE VARIATE V003 SPD/M LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 59.8439 29.9219 * RESIDUAL 2.05833 343055 87.22 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 61.9022 7.73778 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BS 7/ 7/22 23: :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SPD/M 37.5667 43.8500 3 41.2667 SE(N= 3) 0.338159 5%LSD 6DF 1.16975 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BS 7/ 7/22 23: :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SPD/M GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 9) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 2.7817 0.58571 40.894 73 C OF V |CT % | | | | | | 1.4 0.0001