NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN HẠC VỸ (DENDROBIUM APHYLLUM (ROXB ) FISHER) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO - Full 10 điểm

i M Ụ C L Ụ C M Ở ĐẦ U 1 PH Ầ N I T Ổ NG QUAN 3 1 1 Cơ s ở khoa h ọ c v ề nhân gi ố ng lan 3 1 1 1 B ả o t ồ n hoa lan 3 1 1 2 Các k ỹ thu ậ t v ề nhân gi ố ng hoa lan 3 1 2 M ộ t vài nét v ề loài D aphyllum ngh iên c ứ u 7 1 2 1 Phân lo ạ i 7 1 2 2 M ộ t s ố đặ c điể m th ự c v ậ t chính v ề loài lan D aphyllum 7 1 2 3 Phân b ố c ủ a lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ 9 1 2 4 Giá tr ị s ử d ụ ng và th ự c tr ạ ng khai thác loài lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ c ủ a Vi ệ t Nam 9 1 3 Yêu c ầ u đi ề u ki ệ n ngo ạ i c ả nh v ớ i chi Hoàng t h ả o ( Dendrobium ) 10 1 4Tình hình s ả n xu ấ t và tiêu th ụ hoa lan Hoàng th ả o ( Dendrobium ) trên th ế gi ớ i và ở Vi ệ t Nam 11 1 4 1 Tình hình s ả n xu ấ t và tiêu th ụ hoa lan Hoàng th ả o (Dendrobium) trên th ế gi ớ i 11 Dendrobium 12 1 4 2Tình hình s ả n xu ấ t và tiêu th ụ hoa lan Hoàng th ả o (Dendrobium) ở Vi ệ t Nam 13 1 5 M ộ t s ố nghiên c ứ u v ề nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium 14 1 5 1 Tình hình nghiên c ứ u nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium th ế gi ớ i 15 1 5 2 Tình hình nghiên c ứ u nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium ở Vi ệ t Nam 16 1 6Nghiên c ứ u v ề nuôi tr ồ ng cây lan Dendrobium sau nuôi c ấ y mô 17 1 6 1 Ảnh hưở ng c ủ a giá th ể 17 1 6 2 Ảnh hưở ng c ủa dinh dưỡ ng 18 PH Ầ N II- V Ậ T LI Ệ U, N ỘI DUNGVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 19 2 1 V ậ t li ệ u 19 2 3 Phƣơng pháp nghiên c ứ u 19 2 3 1 Phương pháp khử trùng và nuôi c ấ y t ạ o v ậ t li ệ u kh ởi đầ u Lan D aphyllum 19 ii 2 3 2 Phương pháp nghiên cứ u nhân nhanh protocorms và ch ồ i 21 2 3 5 Phương pháp nghiên cứ u t ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 22 2 4 Phƣơng pháp xử lý s ố li ệ u 23 PH Ầ N III- K Ế T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N 24 3 1 Nghiên c ứ u kh ử trùng và nuôi c ấ y kh ởi độ ng m ẫ u loài lan H ạ c v ỹ 24 3 1 1 K ế t qu ả nghiên c ứu xác đị nh phương pháp khử trùng đố i v ớ i qu ả lan 24 3 1 2 Ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u ti ết sinh trưởng BA đế n giai đoạ n kh ởi độ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệu ban đầ u 25 3 2 Nghiên c ứ u kh ả năng nhân giố ng in vitro 26 3 2 1 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a BA + α NAA đ ế n quá trình nhân nhanh protocorm và ch ồ i 27 3 2 2 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n khoai tây đ ế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 28 3 2 3 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n cà r ốt đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 30 3 2 4 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a b ộ t t ả o Spirulina đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 31 3 3 Nghiên c ứ u t ạ o cây hoàn ch ỉ nh in vitro 32 3 3 1 Ảnh hưở ng c ủ a IBA t ới giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh 33 PH Ầ N 4- K Ế T LU ẬN VÀ ĐỀ NGH Ị 35 4 1 K Ế T LU Ậ N 35 4 2 ĐỀ NGH Ị 35 TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O 36 PH Ụ L Ụ C 42 iii DANH M Ụ C CÁC KÝ HI Ệ U, CÁC CH Ữ VI Ế T T Ắ T AC: Activated carbon (than ho ạ t tính) BA: Benzyladenine acid CT: Công th ứ c CTTN: Công th ứ c thí nghi ệ m CV(%): H ệ s ố bi ế n đ ộ ng (Correlation of Variants) CW : Coconut water (nướ c d ừ a) D: Dendrobium (lan Hoàng th ả o) Đ/C: Đố i ch ứ ng IBA: Indolbutyride acid α NAA : α - Naphthalene acetic acid LSD: So sánh theo giá tr ị khác bi ệt có nghĩa nhỏ nh ấ t ở m ứ c α  0,05 PLBs: Protocorm like bodies SH: Schenk and Hildebrandt T B: Trung bình TCLs: Thin cell layers TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW: Vacin and Went iv DANH MỤC CÁC BẢNG B ảng1 1 Đặc điể m th ự c v ậ t chính c ủ a loài lan nghiên c ứ u 8 B ả ng 3 1 Ảnh hưở ng c ủa phương pháp khử trùng đế n t ỷ l ệ m ẫ u s ố ng 24 và n ả y m ầ m c ủ a lan H ạ c v ỹ 24 B ả ng 3 2 Ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u ti ết sinh trưởng BA đế n kh ả năng tạ o ch ồ i t ừ m ẫ u c ấy ban đầ u 26 B ả ng 3 3 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a BA + α NAA đ ế n quá trình nhân nhanh protocorm và ch ồ i (sau 6 tu ầ n) 28 B ả ng 3 4 Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a d ị ch khoai tây nghi ềnđế n quá trình nhân nhanh protocorm và ch ồ i ( sau 6 tu ầ n) 29 B ả ng 3 5 Ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n cà r ốt đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 30 B ả ng 3 6 Ảnh hưở ng c ủ a b ộ t t ả o Spirulina đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i 31 B ả ng 3 7 Ảnh hưở ng c ủ a IBA t ới giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh 33 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 1 Lan H ạ c v ỹ 8 Hình 2 1 Qu ả lan H ạ c v ỹ đưa vào nuôi cấ y in vitro 20 Hình 3 1 S ự n ả y m ầ m c ủ a h ạ t lan H ạ c v ỹ 25 Hình 3 2 Nhân nhanh protocorm và ch ồ i 32 Hình 3 3 T ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 34 1 MỞ ĐẦU Chi Hoàng th ả o ( Dendrobium ) là m ộ t trong nh ữ ng chi l ớ n nh ấ t c ủ a h ọ Lan (Orchidaceae), ướ c tính có kho ả ng 1 184 loài (Leitch et al , 2009) và đượ c phân b ố t ừ vùng nhi ệt đớ i và c ậ n nhi ệt đới châu Á Thái Bình Dương đế n New Zealand (Govaerts et al , 2011) Lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum (Roxb ) Fisher) thu ộ c chi Hoàng th ả o ( Dendrobium ) là loài lan r ừng đẹ p, có giá tr ị y h ọ c và giá tr ị thương mạ i cao Trên th ế gi ớ i chúng phân b ố ở Ấ n Đ ộ , Nepan, Butan, Trung Qu ố c, Mianma, N epal, Sri Lanka , Thái Lan, Lào, Camphuchia, Malaixia Ở Vi ệ t Nam, H ạ c v ỹ thư ờ ng m ọ c ở m ộ t s ố vùng : Lâm Đ ồ ng, Khánh Hòa, Lào Cai, Sơn La, B ắ c C ạ n, Ninh Thu ậ n … (Averyanov et al , 2005; Sách đ ỏ Vi ệ t Nam, 2007) Theo y h ọ c c ổ truy ề n Trung Qu ố c, L an D aphyllum có tác d ụ ng ch ữ a b ệ nh như: Dùng tr ị ho, đau h ọ ng, b ỏ ng l ử a; toàn cây tr ị kinh phong tr ẻ em, ăn u ố ng b ị ng ộ đ ộ c ( Sách Đ ỏ Vi ệ t Nam, 200 7) Do nhu c ầ u s ử d ụ ng làm cây hoa c ả nh và dư ợ c li ệ u tăng m ạ nh trong th ờ i gian g ầ n đây nên loài D aphyllum đã b ị khai thác ki ệ t qu ệ M ặ t khác, t ỷ l ệ n ả y m ầ m t ừ h ạ t trong t ự nhiên r ấ t th ấ p và vùng phân b ố c ủ a D aphyllum b ị tàn phá nghiê m tr ọ ng nên loài cây này lâm vào tình tr ạ ng g ầ n như tuy ệ t ch ủ ng và đư ợ c đưa vào Sách Đ ỏ Vi ệ t Nam, 200 7 và h ạ ng m ụ c IUCN ( Romand - Monnier, 2013) c ầ n ph ả i đư ợ c b ả o v ệ Do v ậ y c ầ n có các bi ệ n pháp k ỹ thu ậ t đ ể nhân gi ố ng, b ả o t ồ n và phát tri ể n loài lan dư ợ c li ệ u có giá tr ị này c ủ a Vi ệ t Nam Nh ằ m góp ph ầ n làm phong phú ngu ồ n dư ợ c li ệ u quý c ủ a Vi ệ t Nam, làm đ ẹ p môi trư ờ ng c ả nh quan, nâng cao thu nh ậ p cho ngư ờ i tr ồ ng lan, chúng tôi th ự c hi ệ n đ ề tài: “Nghiên c ứ u nhân gi ố ng lan H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum (Roxb ) F isher) b ằ ng k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y in vitro ” 1 M ụ c tiêu c ủa đề tài Nhân nhanh đượ c loài lan H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum (Roxb ) Fisher) b ằ ng k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y in vitro , nh ằ m góp ph ầ n b ả o t ồ n và phát tri ển loài Lan dượ c li ệ u quý hi ế m c ủ a Vi ệ t Nam 2 Ý nghĩa khoa h ọ c và th ự c ti ễ n c ủa đề tài 2 1 Ý nghĩa khoa họ c 2 * K ế t qu ả c ủ a đ ề tài có th ể đư ợ c s ử d ụ ng làm tài li ệ u tham kh ả o cho vi ệ c nghiên c ứ u, gi ả ng d ạ y v ề hoa lan nói chung và chi lan Hoàng t h ả o nói riêng * Góp ph ầ n xây d ự ng quy trình nhân gi ố ng in vitro lan D aphyllum v ốn chưa đượ c nghiên c ứ u ở Vi ệ t Nam * Cung c ấ p s ố li ệ u và thông tin khoa h ọ c cho các nhà nghiên c ứ u khoa h ọ c tham kh ả o 2 2 Ý nghĩa thự c ti ễ n c ủa đề tài * Góp ph ầ n b ả o t ồ n và phát tri ển cây dượ c li ệ u, cây c ả nh có giá tr ị c ủ a Vi ệ t Nam Giúp bà con vùng núi cao xóa đói giả m nghèo, ổn đị nh cu ộ c s ố ng, không ch ặ t phá r ừ ng * Góp ph ầ n p hát tri ể n khu du l ị ch sinh thái * Đề xu ất phương pháp nhân nhanh giố ng v ớ i s ố lượ ng l ớ n, s ạ ch b ệ nh, giá thành phù h ợp, đáp ứ ng nhu c ầ u c ủ a th ị trườ ng cung c ấ p nguyên li ệ u cho ngành Dượ c ph ụ c v ụ n ộ i tiêu, nâng cao s ứ c kh ỏ e c ộng đồ ng và ti ế n t ớ i tham gia xu ấ t kh ẩ u 3 Đối tƣợ ng và ph ạ m vi nghiên c ứ u * Qu ả lan H ạ c v ỹ ( Dendrobium aphyllum ) thu th ậ p t ừ Khánh Hòa và đư ợ c đưa vào nuôi c ấ y in vitro t ạ i phòng nuôi c ấ y mô t ế bào th ự c v ậ t c ủ a Phòng thí nghi ệ m Phát tri ể n Ứ ng d ụ ng Y sinh Công ngh ệ - Vi ệ n Ứ ng d ụ ng Công ngh ệ - B ộ KH&CN * Các nghiên c ứ u đư ợ c ti ế n hành t ạ i Phòng thí nghi ệ m Phát tri ể n Ứ ng d ụ ng Y sinh Công ngh ệ - Vi ệ n Ứ ng d ụ ng Công ngh ệ - B ộ KH &CN 3 PHẦN I TỔNG QUAN 1 1 Cơ sở khoa học về nhân giống lan 1 1 1 Bảo tồn hoa lan Trên th ế gi ớ i nhi ều loài lan đang có nguy cơ tuyệ t ch ủ ng, hi ếm và đượ c li ệ t kê trong ph ụ l ụ c II c ủ a CITES, do nhi ều nguyên nhân như biến đổ i khí h ậ u, khai thác quá m ứ c, buôn bán b ấ t h ợ p pháp và l ấ n chi ếm đất đai Hoa lan đượ c bi ết đến như là cây c ả nh quan tr ọ ng ở Vi ệt Nam, đặ c bi ệ t là lan r ừ ng Các loài lan r ừ ng c ủ a Vi ệ t Nam n ổ i ti ế ng v ớ i v ẻ đẹp và tính năng riêng biệ t c ủa chúng và đang có nhu cầ u s ử d ụ ng làm c ả nh và làm thu ố c cao trên toàn th ế gi ới Do đó cầ n có các bi ệ n pháp k ỹ thu ật để nhân gi ố ng, b ả o t ồ n và phát tri ể n loài lan có giá tr ị c ủ a Vi ệ t Nam Hoa lan, có th ể đượ c duy trì trong t ự nhiên (b ả o t ồ n in situ ) và chuy ể n kh ỏ i môi trườ ng s ố ng c ủ a chúng (b ả o t ồ n ex situ ) B ả o t ồ n in situ là cách t ố t nh ất để b ả o t ồ n s ự đa dạ ng di truy ền các loài lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì trong m ộ t th ờ i gian dài và có nguy cơ bị m ấ t do b ị sâu b ệ nh, sinh h ọ c và stress phi sinh h ọ c Ngoài ra, r ấ t t ố n kém do s ử d ụng lao động và đấ t (Montakarn Pimsen, 2014) B ả o t ồ n ngu ồ n gen b ằ ng nuôi c ấ y in vitro và b ả o qu ả n l ạnh đượ c s ử d ụng để b ả o t ồn đa d ạ ng di truy ề n c ủa chúng Đây là cơ sở khoa h ọc để đề tài ứ ng d ụ ng k ỹ thu ậ t này trong công tác b ả o t ồ n loài lan Ngh ệ tâm và H ạ c v ỹ 1 1 2 Các kỹ thuật về nhân giống hoa lan 1 1 2 1 Nhân gi ố ng h ữ u tính H ạ t lan r ấ t nh ỏ , có c ấ u t ạ o không hoàn ch ỉ nh M ộ t qu ả lan có th ể ch ứ a 1 300 -4 000 000 h ạ t H ạ t lan có hình d ạng, kích thướ c và màu s ắ c r ấ t khác nhau H ầ u h ế t các h ạ t lan có chi ề u r ộ ng 0,09 - 0,27 mm và chi ề u dài 0,25 -1,2 mm Tr ọ ng lượ ng h ạ t t ừ 0,0003 - 0,0014 mg (0,3 - 1,4 μg) Các h ạ t có ch ứ a m ộ t phôi nh ỏ , thi ế u n ội nhũ, do đó muố n h ạ t n ả y m ầ m ph ả i t ạo đủ điề u ki ện dinh dưỡ ng và môi trườ ng M ặ t khác, trong t ự nhiên h ạ t lan ph ải đượ c nhi ễ m nhi ề u lo ạ i n ấ m kí sinh thu ộ c chi Rhizoctonia m ớ i có th ể n ả y m ầm đượ c (Montakarn Pimsen, 2014) Phương pháp n ả y m ầ m h ạ t lan in vitro là m ộ t ph ầ n quan tr ọ ng c ủ a trương trình b ả o t ồ n và nhân gi ố ng các loài lan quý hi ế m, cung c ấ p cây con cho chương trình 4 ph ụ c h ồ i tái sinh r ừ ng 1 1 2 2 Nhân gi ố ng vô tính M ộ t s ố phương pháp nhân giố ng vô tính b ằ ng tách ch ồi vượt, giâm hom nhưng đề u cho h ệ s ố ng nhân gi ố ng th ấ p, c ầ n di ệ n tích l ớ n, c ầ n nhi ề u cây m ẹ , cây d ễ b ị b ệ nh, nhanh b ị lão hóa, kh ả năng sinh trưở ng kém, r ấ t khó s ử d ụ ng vào m ục đích thương mạ i K ỹ thu ậ t nuôi c ấy mô đang phát triể n r ộng rãi để nhân gi ố ng các loài lan, nh ờ k ỹ thu ậ t này, nh ữ ng gi ống lan quý đã có thể nhân gi ố ng d ễ dàng v ớ i h ệ s ố nhân gi ống cao, cây đồng đề u, ổn đị nh v ề m ặ t di truy ề n, s ạ ch b ệ nh, có s ứ c s ố ng cao Có th ể dùng nhi ề u b ộ ph ậ n c ủ a hoa lan làm b ộ ph ậ n nuôi c ấy như: gieo h ạ t invitro , đỉnh sinh trưở ng, m ắ t ng ủ trên thâ n, phương pháp lớ p m ỏ ng t ế bào… a) Các phương pháp nhân giố ng in vitro - Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưở ng Nuôi c ấy đỉnh sinh trưở ng là m ộ t trong nh ữ ng k ỹ thu ậ t h ữ u hi ệ u nh ằm đả m b ả o các đặ c tính di truy ề n c ủ a m ẹ trong các cây tái sinh (Morel, 1960) Khi nuôi c ấ y đỉnh sinh trưở ng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như mộ t s ố gi ố ng cây khác là hình thành c ấ u trúc protocorm để sau đó có thể bi ệ t hóa thành cây Nhân các protocorm s ẽ t ạ o thành các protocorm m ớ i g ọ i là protocorm like body (Morel, 1964) Không như trong nuôi cấ y mô s ẹ o in vitro c ủ a nh ữ ng loài th ự c v ậ t khác, vi ệ c thi ế t l ậ p gen c ủ a protocorm đượ c xác đị nh ngay t ừ protocorm hình thành ban đầ u (Neumann et al , 2009) - Th ể ti ề n ch ồ i (Protocormlike body) Protocorm like body (PLB) là thu ậ t ng ữ đề ch ỉ nh ữ ng c ấ u trúc gi ố ng v ớ i protocorm và có ngu ồ n g ố c t ừ nuôi c ấ y in vitro đỉnh sinh trưở ng hay mô phân sinh c ủ a ch ồ i b ất đị nh ở các loài lan (Joseph& Robert, 1992) Đây là cấ u trúc l ần đầ u tiên được đặ t ra b ở i Morel khi nuôi c ấy đỉ nh ch ồ i c ủ a Cymbidium để t ạ o ra nh ữ ng cây s ạ ch virus v ớ i các protocorm hình thành t ừ đỉnh sinh trưở ng mà không ph ả i là t ừ h ạt Như vậ y, nuôi c ấ y mô phân sinh h ọ Lan s ẽ hình thành các protocormlike body (Morel, 1964) K ỹ thu ậ t này v ừ a t ạ o ra cây s ạ ch b ệ nh virus , đồ ng nh ấ t v ề ki ể u gen v ừ a cho t ỷ l ệ nhân gi ố ng cao - Phương pháp nuôi c ấ y l ớ p m ỏ ng t ế bào L ớ p m ỏ ng t ế bào (TCL) bao g ồ m các m ẫu có kích thướ c nh ỏ c ắ t t ừ nh ữ ng t ổ 5 ch ứ c th ự c v ật (thân, lá, phát hoa, sơ khở i hoa hay t ổ ch ứ c hoa, lá m ầ m tr ụ trên/dướ i lá m ầm, vùng đỉ nh hay phôi) Các lát c ắ t có th ể c ắ t d ọ c (lTCL), hay c ắ t ngang (tTCL) Các 1TCL ch ỉ ch ứ a m ộ t lo ại mô như tầ ng các t ể bào bi ểu bì nhưng các tTCL l ạ i bao g ồ m các t ế bào t ừ các ki ể u mô khác nhau: t ế bào bi ể u bì, vùng v ỏ , t ầ ng phát sinh g ỗ , quanh m ạ ch và lõi, nhu mô Nuôi c ấ y các TCL có th ể phân l ậ p các t ế bào, các t ầ ng mô và ph ụ thu ộ c vào tr ạ ng thái di truy ề n, các y ế u t ố ngoài gen, các điề u ki ện sinh trưở ng có ki ể m soát (ánh sáng, nhi ệt độ , pH, ch ất điề u hòa sinh trưở ng th ự c v ậ t, các ch ấ t b ổ sung vào môi trườ ng ) d ẫ n t ớ i s ự c ả m ứ ng in vitro phát sinh hình thái Kh ả năng phát sinh hình thái c ủ a m ộ t TCL ph ụ thu ộ c các y ế u t ố như: sự nh ậ n bi ế t các d ấ u hi ệu đúng, sự truy ề n tính tr ạ ng, kh ả năng di truyền để đáp ứ ng và ph ả n ứ ng v ớ i các d ấ u hi ệ u này, tình tr ạ ng sinh lý và ngu ồ n g ố c (mô hay t ổ ch ứ c) c ủ a TCL, các y ế u t ố stress, các tr ạ ng thái im l ặ ng c ủ a gen Các t ế bào trong TCL có th ể ph ả n bi ệ t hóa d ẫn đế n vi ệ c thi ế t k ế các ki ể u hình Trong các TCL, con đườ ng phát sinh hình thái c ủ a nh ữ ng mô chuyên trách xu ấ t phát t ừ các t ế bào, các mô có th ể được điề u khi ể n và ki ể m soát rõ ràng, cho phép nghiên c ứ u v ề s ự thay đổ i phân t ử , sinh lý, sinh hóa có th ể x ảy ra Các TCL cũng sử d ụ ng trong tăng cường trao đổ i các h ợ p ch ấ t th ứ c ấp, dượ c ch ấ t qua vi ệ c nuôi c ấ y các t ổ ch ứ c chuy ể n gen, nuôi c ấ y th ự c v ậ t t ự dưỡ ng b ằ ng bioreactor ( Dương Tấ n Nh ự t, 2007) Các l ớ p t ế bào m ỏng đã đượ c s ử d ụ ng thành công trong th ể ti ề n ch ồ i ( protocorm-like body ) và t ạ o callus ở Aranda , Coelogyne cristata , Cymbidium spp , Dendrobium spp , Doritaenopsis , Paphiopedilum, Renanthera, Rhynchostylis, Spathoglottis và X enikophyton ( Jaime A Te ixeira da Silva, 2013b) b) Môi trường dinh dưỡ ng trong nuôi c ấ y in vitro Có nhi ề u lo ại môi trườ ng nuôi c ấ y thích h ợ p cho vi nhân gi ống hoa lan như: Knuson L (1946), Murashige & Skoog (MS) (1962), Vacin & Went (VW) (1949)…Mỗ i lo ại môi trường đề u có ch ất vi lượng và đa lượ ng, vitamin khác nhau Nói chung, s ự sinh trưở ng và phát tri ể n c ủ a cây in vitro đề u ph ụ thu ộ c vào môi trườ ng nuôi c ấ y - Các h ợ p ch ấ t h ữ u cơ t ự nhiên M ộ t s ố lượ ng l ớ n các ch ấ t h ữu cơ tự nh iên như: peptone, nướ c ép cà r ốt, nướ c ép cà chua, chi ế t xu ấ t t ừ th ị t bò, d ịch khoai tây, nướ c d ừ a và d ị ch chu ố i, d ị ch bí ngô, t ảo,…thường đượ c b ổ sung vào môi trườ ng nuôi c ấ y có tác d ụ ng r ấ t t ố t trong 6 vi ệ c phát tri ể n cây gi ống đã đượ c báo cáo ở nhi ề u loài lan như: Nướ c d ừa đượ c b ổ sung vào môi trườ ng nuôi c ấy hoa lan để kích thích mô s ẹ o ho ặ c hình thành protocorm và thường đượ c s ử d ụ ng là 10 - 25% Nướ c d ừ a 30% cho t ỷ l ệ phôi n ả y m ầ m t ối đa vớ i lan D ovatum (Willd ) (Thejaswini et al , 2017) D ị ch nghi ề n c ủ a khoai tây có ch ứa cacbonhydrat dướ i d ạ ng saccaroza, glucose và fructose, amino axít (21 lo ạ i bao g ồ m c ả lysine là m ột axít amin thườ ng không có trong protein th ự c v ậ t), các mu ối khoáng (K, Fe, Mg…) và đặ c bi ệ t là các vitamin (C, B1, B6) D ị ch nghi ền khoai tây thườ ng đượ c b ổ sung vào môi trườ ng vi nhân gi ố ng hoa lan và đặ c bi ệ t có hi ệ u qu ả v ớ i m ộ t s ố loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis Nướ c ép cà r ố t ch ứ a cytokinin, giàu ch ấ t khoáng (canxi và kali), vitamin (A, B1, B2, Cvà E) và glutamin đượ c s ử d ụ ng kích thích s ự phân chia t ế bào c ủ a th ự c v ậ t * B ổ sung b ộ t t ả o Spirulina ở n ồng độ 50 mg/l có tác độ ng hi ệ u qu ả đế n t ỷ l ệ s ố ng c ủ a ch ồ i và s ố ch ồi đạ t c ủ a lan Paphiopedilum delenatii Guillaumin (Nguy ễ n Th ị Cúc và cs , 2014) Than ho ạt tính đượ c b ổ sung vào môi trườ ng giúp làm gi ảm độ c t ố b ằ ng cách đào thả i các h ợ p ch ất độ c phenolic ti ế t ra trong th ờ i gian nuôi c ấ y B ổ sung than ho ạ t tính có tác d ụ ng hi ệ u qu ả lên s ự phát sinh và tăng sinh mô sẹ o, s ự phát sinh phôi và nhân phôi cũng được đề c ập trên đối tượ ng D dixanthum Lindley(Su et al , 2014) Không ch ỉ có các ch ấ t h ợ p ch ấ t h ữu cơ đượ c b ổ sung vào môi trườ ng nuôi c ấ y, các ch ất điều hòa sinh trưở ng th ự c v ật cũng đượ c s ử d ụ ng ph ổ bi ế n trong nuôi c ấ y hoa lan Có hai nhóm chính c ủa điều hòa sinh trưở ng th ự c v ậ t: cytokinin và auxin Các cytokinin thường được dùng trong môi trườ ng nuôi c ấ y mô th ự c v ậ t: BA, kinetin và TDZ để kích thích s ự phân chia t ế bào, gây ra s ự hình thành ch ồ i và s ự gia tăng chồ i nách và làm ch ậ m s ự hình thành r ễ Các Auxin (2,4-D, α NAA, IAA và IBA) thư ờ ng đư ợ c dùng trong nuôi c ấ y hoa lan đ ể kích thích s ự phân chia t ế bào, bi ệ t hoá r ễ , hình thành mô s ẹ o, kìm hãm s ự phát tri ể n ch ồ i và t ạ o ra các r ễ ph ụ Ngoài ra, Axit abscisic (ABA) đư ợ c b ổ sung đ ể ứ c ch ế ho ặ c kích thích s ự phát tri ể n mô s ẹ o, thúc đ ẩ y s ự trư ở ng thành c ủ a phôi sinh dư ỡ ng, ứ c ch ế s ự nhân phôi th ứ c ấ p, ngăn c ả n s ự n ả y m ầ m s ớ m c ủ a phôi sinh dư ỡ ng (Saad et al , 2012) - Các h ợ p ch ấ t ch ứ a carbon Carbon là thành ph ầ n r ấ t quan tr ọng trong môi trườ ng nuôi c ấ y cho s ự tăng 7 trưở ng và phát tri ể n c ủ a các mô Hi ện nay cacbon đượ c b ổ s ung vào môi trườ ng nuôi c ấ y vì thi ế u ánh sáng và n ồng độ CO 2 th ấp trong điề u ki ệ n in vitro Đường đã đượ c s ử d ụng như mộ t ngu ồn carbon và như là cơ quan quả n th ẩ m th ấ u trong môi trườ ng nuôi c ấ y Có nhi ề u lo ại đường đượ c s ử d ụ ng trong nuôi c ấ y in vitro như: sucrose, glucose, maltose, fructose, lactose và sorbitol Sucrose ở n ồng độ 20 và 30 g/l đượ c s ử d ụ ng ph ổ bi ế n nh ấ t trong nghiên c ứ u nuôi c ấ y mô hoa lan (Montakarn Pimsen, 2014) 1 2 Một vài nét về loài D aphyllum nghiên cứu Chi lan Hoàng Th ả o ( Dendrobium ) được đặ t tên vào nă m 1799, Dendrobium đượ c hi ể u là lan s ố ng trên cây, ti ế ng Vi ệ t Nam g ọ i là chi lan Hoàng Th ả o Lan Hoàng Th ả o có nhi ề u màu s ắ c và hình thái khác nhau (Tr ầ n Duy Quý,2005) Chi Hoàng th ả o (Dendrobium ) là một trong những chi lớn nhất củahọ Lan (Orchidaceae) , ướ c tính có kho ả ng 1 400 loài (Jin et al , 2009) S ố lượ ng các loài lan Hoàng th ả o Vi ệ t Nam có kho ả ng 110 loài (Leonid et al , 2013) 1 2 1 Phân loại Theo các tác gi ả (Tr ầ n H ợ p, 1998; Leltch và cs , 2009) cây lan HoàngTh ả o thu ộ c chi Dendrobium , phân lo ạ i nh ư sau: Lan H ạ c v ỹ có tên khoa h ọ c là: Dendrobium aphyllum (Roxb ) C Fisch Đ ồ ng danh: Limodorum aphyllum Roxb 1795; Dendrobium pierardii Roxb ex Hook 1822 Chi: lan Hoàng T h ả o D e nd r o b i um H ọ : Phong lan Or c h i d ac ea e B ộ : b ộ lan O r c h i d a l e s 1 2 2 Một số đặc điểm thực vật chính về loài lan D aphyllum M ộ t s ố đặc đ i ể m th ự c v ậ t chính v ề loài lan D aphyllum ( b ả n g 1 1 ) 8 Hình 1 1 Lan Hạc vỹ Bảng1 1 Đặc điểm thực vật chính của loài lan nghiên cứu Đ ặ c đi ể m Lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ Tên khoa h ọ c D e nd r o b i um aphyllum T h ân L an ph ụ sinh , t hân dài 60 - 80 cm, hình tr ụ , d ầ y 0,4 - 0,5 cm, lóng dài 2,5 - 3 cm Lá L á hình mác nh ọ n, dài 6 - 8 cm, r ộ ng 1,5 - 2 cm H o a C ụ m hoa bên, 1 - 2 hoa, m ọ c su ố t d ọ c chi ề u dài thân không còn lá Lá b ắ c hình b ầ u d ụ c, dài kho ả ng 0,3 cm, hoa màu tím nh ạ t, đư ờ ng kính kho ả ng 4 cm, cu ố ng hoa và b ầ u dài 2,0 - 2,5 cm Các lá đài hình mác h ẹ p, đ ỉ nh nh ọ n dài 2,4 - 2,7 cm, r ộ ng 0,6 - 0,7 cm Môi màu vàng nh ạ t, đôi khi pha tím r ấ t nh ạ t, hình g ầ n tròn, dài 2,7 - 3 cm, r ộ ng 2,5 - 2,6 cm, mép có lông ng ắ n, b ề m ặ t ph ủ lông thưa, có 3 đư ờ ng s ố ng ng ắ n ở ph ầ n g ố c, hai bên 9 g ố c có v ạ ch chéo màu tía C ộ t màu tr ắ ng, cao kho ả ng 0,5 cm; tuy ế n m ậ t hình bán nguy ệ t; răng c ộ t có đ ỉ nh nh ọ n N ắ p màu tr ắ ng, đ ỉ nh màu tím, ph ủ nhú m ị n Q u ả Q u ả n a n g h ì n h c h ùy , v ỏ q u ả d à y , qu ả có 4 k h ố i p h ấ n , c h ứ a r ấ t n h i ề u h ạ t n ằ m x en l ẫ n n h ữ n g s ợ i l ô n g m ả nh 1 2 3 Phân bố của lan Hoàng thảo Hạc vỹ Trên th ế gi ớ i lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ phân b ố ở Ấ n Đ ộ , Nêpan, Butan, Trung Qu ố c, Mianma, Thái Lan, Lào, Malaixia Ở Vi ệ t Nam, lan Hoàng th ả o H ạ c v ỹ phân b ố t ạ i Lâm Đ ồ ng (Lang Bian, Đà L ạ t: Prenn; Đơn Dương), Khánh Hòa (Su ố i Giao, Yersin, Hòn Bà) , Lào Cai , B ắ c C ạ n, Ninh Thu ậ n ( Averyanov L , Av eryanova A, 2005 ; Sách đ ỏ Vi ệ t Nam, 2007 ) , Chúng m ọ c bám trên cây g ỗ l ớ n trong r ừ ng ở đ ộ cao 400 - 1500 m 1 2 4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác loài lan Hoàng thảo Hạc vỹ của Việt Nam V ớ i đặ c điể m r ấ t đa d ạ ng v ề ki ể u dáng,s ặ c s ỡ v ề màu s ắ c hoa và n ở hoa vàonhi ề u th ờ i điể m khác nhau nên các loài lan Hoàng th ả o b ả n đị a ở nướ c ta b ị khai thác tri ệ t để ph ụ c v ụ nhu c ầ u trang trí, thưở ng lãm Hơn th ế n ữ a, m ộ t s ố loài thu ộ c chi Hoàng Th ả o cũng là v ị thu ố c dân t ộ c c ổ truy ề n dùng để ch ữ a b ệ nh Nhi ề u loài đượ c s ử d ụ ng làm thu ố c như:D loddigesii Rolfe , D fimbriatum Hook Var oculatum Hook , D candidum Wall Ex Lindl , D chrysanthum Wall ex Lindl , D nobile Lindl (Đ ỗ Huy Bích, 2004) , D aphyllum ( Sách Đ ỏ Vi ệ t Nam , 2007) Lan H ạ c v ỹ ( D aphyllum (Roxb )Fisch ) đượ c coi là m ộ t lo ạ i cây thu ố c quý, trong s ố các ―Thầ n nông th ảo dược‖ và đượ c x ế p vào lo ạ i s ả n ph ẩ m cao c ấ p có tác d ụ ng b ổ âm thanh nhi ệ t, t ạo nướ c b ọ t có l ợ i cho d ạ dày, b ổ ph ế và gi ả m ho B ằ ng phương pháp phân tích quang phổ , các nhà khoa h ọc đã chứ ng minh các polysaccharides (đường đa) AP là Acetylglucose - O, ch ứ a liên k ế t β (l - ›4), d ạ ng vòng c ủ a m ỗ i ch ấ t c ặ n th ủ y phân có d ạ ng tháp trong đó các m ạ ch chính đư ợ c c ấ u t ạ o b ở i D - manose và D - glucose Các thí nghi ệ m lâm sàng ti ế n hành trên đ ộ ng v ậ t cho th ấ y AP có ho ạ t tính t ổ ng h ợ p ch ấ t mi ễ n d ị ch t ố t (Zhao Yong - Ling et al , 1994) 10 Zh ang, (2008) đã xác định đượ c trong thân lan H ạ c v ỹ có ch ứ a: moscatilin, gigantol, batatasin, tristin, moscatin, hircinol, salidroside và p- hydroxylbenzylacetic acid Veronika Cakova et al , (2017) cho r ằ ng ngoài polysaccharides còn có các h ợ p ch ấ t phenol n hư moscatin, moscatilin và tricetin 3'''', 4'''', 5''''-trimetyl ete 7-O-  - glucopyranoside, ứ c ch ế s ả n xu ấ t NO, có ho ạ t đ ộ ng đi ề u hòa mi ễ n d ị ch Các ch ấ t ch ống oxy hoá peptide đượ c chi ế t xu ấ t t ừ H ạ c v ỹ (D aphyllum (Roxb ) Fisch )bao g ồ m superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys ch ỉ ra r ằ ng peptit DA- P có hàm lượ ng ch ất dinh dưỡ ng cao và có ho ạt độ ng ch ố ng oxy hoá t ối ưu (Huifan Liu et al , 2017) T ừ các nghiên c ứ u trên cho th ấ y r ấ t c ầ n thi ế t ph ả i nhân gi ố ng loài lan H ạ c v ỹ ph ụ c v ụ cho s ứ c kh ỏe con người cũng như bả o t ồ n ngu ồ n gen quý 1 3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh với chi Hoàng t hảo ( Dendrobium ) Nhi ệt độ Lan Hoàng th ả o thu ộ c lo ại cây ưa nóng, sinh trưở ng t ố t ở nhi ệt độ 24-33 0 C Dướ i 12 0 C và trên 37 0 C đề u làm ch ậ m và ảnh hưở ng l ớn đế n s ự ra hoa c ủ a cây Trong th ự c t ế s ả n xu ấ t t ạ i mi ề n B ắc có mùa đông lạ nh và mùa hè nóng thì c ầ n h ạ n ch ế tác độ ng x ấ u c ủ a nhi ệt độ b ằng cách vào mùa đông thì che phủ nilon quanh nhà tr ồ ng lan ho ặ c th ắ p điện còn mùa hè che lướ i ph ả n quang, có h ệ th ố ng phun tướ i thích h ợ p và t ạo điề u ki ệ n thông thoáng trong nhà lan s ẽ đem lạ i hi ệ u qu ả rõ r ệ t (Nguy ễ n Th ị Kim Lý, 2009) Ẩm độ Độ ẩ m thích h ợp giúp cho cây đượ c phát tri ển nhanh hơn hoa tươi và lâu tàn Lan Hoàng th ả o cũng như đa số các gi ố ng lan khác ch ỉ phát tri ể n t ốt trong điề u ki ệ n không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩ m kho ả ng t ừ 40-60%, vào ban đêm độ ẩ m thích h ợ p t ừ 60-90% thì cây s ẽ phát tri ể n t ốt hơn Loạ i giá th ể quá ẩ m và úng s ẽ là điề u ki ệ n b ấ t l ợ i cho s ự sinh trưở ng c ủ a gi ố ng Dendrobium vì có th ể b ị th ố i toàn b ộ r ễ và bi ể u hi ệ n là các cây con m ọ c t ừ ph ầ n ng ọ n c ủ a thân (Bùi Th ị Thu Hi ề n, 2009) Ánh sáng 11 Lan Hoàng th ả olà gi ống ưa sáng, có thể tr ồng trong điề u ki ệ n ánh sáng tr ự c ti ế p hay khu ế ch tán Ánh sáng h ữ u hi ệ u cho gi ố ng Lan Hoàng th ả olà 70%, vì th ế giàn che v ới độ che sáng 30% dưới đấ t và 40% ở trên cao v ới cường độ ánh sáng t ừ 15 00030 000 lux r ấ t thích h ợ p cho s ự phát tri ể n c ủ a Lan Hoàng th ả o Mùa hè c ủ a mi ề n B ắc cường độ ánh sáng m ạ nh, nhu c ầ u ánh sáng c ủ a lan Hoàng Th ả o kho ả ng 70-80% ánh sáng tr ự c ti ếp Trong điề u ki ện râm mát cây thườ ng y ế u, m ọng nướ c, r ấ t d ễ nhi ễ m b ệ nh v ề mùa đông cường độ ánh sáng y ế u và th ờ i gian chi ế u sáng ng ắn, để lan Hoàng th ảo sinh trưở ng và phát tri ể n t ốt và ra hoa đượ c thì c ầ n b ổ sung ánh sáng b ằ ng cách th ắp điện cho vườ n lan (Bùi Th ị Hi ề n, 2009) Dinh dƣỡ ng Lan Hoàng th ả o yêu c ầ u m ột lượng dinh dưỡ ng nh ất định để sinh trưở ng và phát tri ển Tuy không đòi hỏ i s ố lượ ng l ớn nhưng phải đầy đủ các thành ph ầ n dinh dưỡ ng N, P, K và các nguyên t ố trung, vi lượ ng Tu ỳ t ừng giai đoạn sinh trưở ng mà nhu c ầu đố i v ớ i các thành ph ần dinh dưỡng có khác nhau (Đào Thanh Vân, Đặ ng Th ị T ố Nga, 2008) Giá th ể Giá th ể c ủ a Lan Hoàng th ả oc ầ n ch ậ u ph ả i th ật thoáng và không úng nướ c Tuy nhiên do b ản năng sinh họ c và c ấ u trúc th ự c v ậ t v ớ i gi ả hành có thân, các loài thu ộ c gi ố ng Lan Hoàng th ả oc ầ n giá th ể hơi ẩm chút ít nhưng không đượ c làm th ố i căn hành Vì thế m ộ t s ố loài Lan Hoàng th ả o có th ể phát tri ể n trên các giá th ể là xơ d ừ a hay c ả qu ả d ừa, dùng như mộ t cái ch ậ u ch ứ a s ẵ n giá th ể Tuy nhiên n ế u giá th ể là xơ dừ a ph ả i h ạ n ch ế s ố l ần tưới nướ c, n ế u ch ậ u là qu ả d ừ a nguyên ph ải cưa phầ n đáy, nế u không cây b ị th ố i vì quá ẩm Cũng có thể tr ồ ng cây lan Lan Hoàng th ả ov ới căn hành cách đáy chậ u kho ả ng 3cm, r ồ i r ả i th ật thoáng xung quanh căn hành là m ộ t s ố r ễ l ụ c bình gi ặ t s ạ ch V ớ i cách tr ồng này thì kích thướ c ch ậ u và cây ph ả i th ật tương xứ ng Tuy nhiên, giá th ể than và g ạ ch nung v ẫ n t ỏ ra hi ệ u qu ả nh ấ t đố i v ớ i các loài Lan Hoàng th ả o 1 4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) trên thế giới và ở Việt Nam 1 4 1 T ình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới 12 Hoa Lan chi ế m m ộ t ph ầ n l ớn trong thương mạ i toàn c ầ u v ề tr ồ ng hoa trong ch ậ u và hoa c ắt cành và ướ c tính kho ảng 10% hoa tươi cắt cành được thương mạ i trên th ị trườ ng qu ố c t ế Giá tr ị thương mạ i trung bình c ủ a hoa lan c ắ t cành t ừ năm 2007 đến năm 2012 là 483,000,000 $ US Trong năm 2012, trên th ế gi ớ i đã có hơn 40 nướ c xu ấ t kh ẩ u hoa lan và 60 nướ c nh ậ p kh ẩ u hoa lan và t ổ ng giá tr ị thương m ạ i toàn c ầ u là 504,740,644$ US ( Nguồn : Department of Foreign Trade, Thailand (2013) ; (Jayarama Reddy, 2016) Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39 67%), tiếp theo Th ái Lan (28,41%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%) Các n ước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) và Mỹ (6%) Tổng số lan cắt cành thương mại trên thế giới chủ yếu các loài lan Dendrobium chiếm 85% và Phalaenopsis , Cymbidium chiếm 15% (Cheamuangphan et al, 2013; L C De et al , 2014 ) Thái Lan là nướ c xu ấ t kh ẩ u l ớ n nh ấ t th ế gi ớ i c ủ a các loài lan nhi ệt đớ i Trung Qu ố c là nướ c tiêu th ụ l ớ n nh ấ t c ủ a hoa phong lan c ắ t t ừ Thái Lan 7493 t ấ n, theo sau là Nh ậ t B ả n, M ỹ , Ý, Ấn Độ, Đài Loan, Việ t Nam và Hà Lan t ạ i 4407, 2892, 2395, 1830, 983, 793 và 689 t ấ n N ăm 2012, t ạ i Thái Lan người ta ướ c tính r ằ ng 46% s ản lượng hoa lan đã đượ c tiêu th ụ trong nước và 54% đượ c xu ấ t kh ẩ u( K Thammasiri, 2015) Dendrobium là loài hoa tr ồ ng trong ch ậ u và hoa c ắ t cành ph ổ bi ế n trên toàn th ế gi ớ i, Dendrobium đư ợ c đánh giá cao vì s ự đa d ạ ng đáng kinh ng ạ c c ủ a chúng v ớ i đ ặ c đi ể m r ấ t đa d ạ ng v ề ki ể u dáng, s ặ c s ỡ v ề màu s ắ c hoa và n ở hoa vào nhi ề u th ờ i đi ế m khác nhau và đ ộ b ề n hoa kéo dài Hawaii, California và Florida là vùng tr ồ ng Dendrobium trong ch ậ u l ớ n t ạ i Hoa K ỳ Giá tr ị m ặ t hàng này ở Hawaii đã đư ợ c tìm th ấ y trong nhi ề u th ậ p k ỷ và doanh thu tăn g t ừ 2,4 tri ệ u USD năm 1991 lên 5,6 tri ệ u USD trong năm 2000 ( L C De, N G Debnath Correct, 2011 ) Ở Thái Lan có r ấ t nhi ề u Công ty l ớ n, s ở h ữ u vài ch ụ c ha lan như Công ty Thái Orchid ở Ratchaburi, Công ty Siam Taiyo ở Samut - sakhon Các công ty này ngoài di ệ n tích tr ự c ti ế p qu ả n lý 15 – 20ha, h ọ còn liên k ế t v ớ i các công ty, nông tr ạ i nh ỏ t ạ o thành h ệ th ố ng v ệ tinh; trong đó, h ọ là h ạ t nhân trong s ả n xu ấ t và xu ấ t kh ẩ u Kho ả ng 60 – 70% s ả n lư ợ ng lan c ắ t cành c ủ a Thái Lan đư ợ c xu ấ t kh ẩ u đ ế n 38 nư ớ c trên th ế gi ớ i, đ ạ t giá tr ị 104 tri ệ u USD (2009) Trong đó, xu ấ t kh ẩ u sang 13 Vi ệ t nam, trong đó: Dendrobium c ắ t cành: 22 917 059 cành, Dendrobium tr ồ ng ch ậ u: 2 502 178 ch ậ u (Ngu ồ n: B ộ Nông nghi ệ p & HTX Thái Lan ) T ạ i Hà Lan, vi ệ c s ả n xu ấ t hoa lan Dendrobium tr ồ ng trong ch ậ u hi ện tăng ph ổ bi ến đạt 40 đế n 50 tri ệu cây Thái Lan là nướ c xu ấ t kh ẩ u l ớ n nh ấ t th ế gi ớ i v ề các loài lan c ắ t cành nhi ệt đớ i và nhà cung c ấ p l ớ n th ứ hai vào th ị trườ ng EU, chi ế m 22% ngu ồ n cung vào th ị trườ ng EU Thái Lan n ắ m gi ữ m ộ t v ị th ế m ạ nh trong s ả n xu ấ t lan Dendrobium ( L C De et al, 2014) Theo Weichao Zhang et al , (2009) trên th ị trườ ng các lo ạ i th ự c ph ẩ m ch ứ c năng có nguồ n g ố c t ừ t ự nhiên t ừ lan D aphyllum, D devonianum và D oYcinale đượ c bán bán v ớ i giá r ấ t cao 2 000-4 000 USD/kg 1 4 2T ình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam Vi ệ t Nam n ằ m trong vùng nhi ệt đớ i gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên ch ủ ng lo ạ i lan r ừ ng r ấ t phong phú, có điề u ki ệ n khí h ậ u thu ậ n l ợ i có th ể thích h ợ pphát tri ể n các gi ố ng lan thu ộ c chi Dendrobium, Cattleya, Oncidium Di ệ n tích tr ồ ng hoa lan ở Vi ệ t Nam còn ở m ứ c h ế t s ứ c khiêm t ố n, ch ỉ chi ế m 10% di ệ n tích các lo ại hoa đang đượ c tr ồ ng S ả n xu ấ t hoa lan ở Vi ệ t Nam t ập trung theo 2 hướ ng chính: - S ả n xu ấ t theo quy mô công nghi ệ p các loài lan m ớ i lai t ạ o ho ặc đượ c nh ậ p n ộ i (lan công nghi ệ p) - Khai thác và nuôi tr ồ ng các loài hoa lan b ản đị a (lan r ừ ng) Lan bản địa (lan rừng) chủ yếu phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy mô hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận Xã Đông La, La Phù, La Khê – Hoài Đức – Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc và chủ yếu là chi lan Hoàng Thảo Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan bản địa, với quy mô từ 300 - 500m2,… (Hoàng Xuân Lam, 2014) 14 Ở TP H ồ Chí Minh ch ủ y ế u tr ồ ng các loài lan ( Dendrobium, Mokara, Vanda, Oncidium …) và di ệ n tích khá khiêm t ố n, kho ả ng 200ha, b ằ ng 5,4% so v ớ i hoa Lan Thái Ở mi ề n B ắ c, m ộ t s ố cơ quan nghiên c ứ u như Vi ệ n Di truy ề n Nông nghi ệ p, Vi ệ n Nghiên c ứ u Rau qu ả , H ọ c vi ệ n Nông nghi ệ p Vi ệ t Nam, Vi ệ n Ứ ng d ụ ng công ngh ệ , trong nh ữ ng năm v ừ a qua đã t ậ p trung nghiên c ứ u phương pháp nhân gi ố ng vô tính in vitro K ế t qu ả đã s ả n xu ấ t m ỗ i năm đư ợ c hàng v ạ n cây con gi ố ng hoa lan có giá tr ị trong đó có lan Hoàn g th ả o N ăm 2015 Vi ệ n Di truy ề n Nông nghi ệ p đã xây d ự ng mô hình nhân gi ố ng các gi ố ng hoa lan Dendrobium di ệ n tích 1 000 m 2 quy mô 30 000 cây/năm, mô hình s ả n xu ấ t hoa thương ph ẩ m di ệ n tích 15 000 m 2 , s ả n xu ấ t đư ợ c 60 000 cây gi ố ng D oanh thu đ ạ t 280 tri ệ u/1 000 m 2 … Đ ố i v ớ i th ị trư ờ ng trong nư ớ c, s ả n lư ợ ng hoa phong lan cũng chưa đáp ứ ng đư ợ c nhu c ầ u c ủ a ngư ờ i tiêu dùng Các cơ s ở s ả n xu ấ t hoa lan cũng ch ỉ đáp ứ ng đư ợ c 30 – 40% nhu c ầ u lan c ắ t cành còn l ạ i ph ả i nh ậ p t ừ các nư ớ c khác Hi ệ n nay, m ỗ i năm V i ệ t Nam v ẫ n ph ả i chi hàng t ỷ đ ồ ng đ ể nh ậ p phong lan t ừ các nư ớ c láng gi ề ng cho nhu c ầ u n ộ i đ ị a Th ị trư ờ ng nh ậ p kh ẩ u lan c ắ t cành chính c ủ a Vi ệ t Nam trong th ờ i gian qua là Thái Lan v ớ i g ầ n 90% lư ợ ng lan c ắ t cành ( Dendrobium ) và lan ch ậ u ( Cattleya, Oncidium ) Hiện nay, các loài lan Hoảng thảo bản địa đang b ị khai thác ồ ạ t, chúngkhông ch ỉ đượ c tiêu th ụ trong n ướ c mà còn đượ c các th ươ ngláing ườ iTrungQu ố cthugomvàxu ấ t kh ẩu theo con đườ ng ti ể ung ạ ch Giábán c ủ acáccâylan nàyđượ cthugombán trên th ị trườ ngth ườ ngt ừ 700- 900 000đồ ng/kg cây tươi Như vậ y, v ấn đề s ả n xu ấ t, kinh doanh, hoa lan ở Vi ệ t Nam t ừ trước đế n nay v ẫ n ở d ạ ng ti ềm năng Trong khi đó, sứ c c ạ nh tranh trên th ị trườ ng th ế gi ớ i là r ấ t l ớ n Nh ữ ng ho ạt độ ng kinh doanh và xu ấ t kh ẩ u trong th ờ i gian qua ch ỉ m ớ i có ý nghĩa khởi độ ng, h ứ a h ẹ n m ộ t s ự phát tri ển trong tương lai dự a trên nh ững điề u ki ệ n thu ậ n l ợ i s ẵ n có cho s ự phát tri ể n ngành tr ồ ng lan 1 5 M ộ t s ố nghiên c ứ u v ề nhân gi ố ng và b ả o t ồ n lan Dendrobium 15 1 5 1 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium thế giới Trong nh ững năm gần đây, trên thế gi ới đã có nhiều cơ sở nghiên c ứ u tìm các bi ệ n pháp nhân gi ố ng, b ả o t ồ n và lưu gi ữ các loài Lan quí hi ế m có nguy cơ b ị tuy ệ t ch ủ ng Dutta et al , ( 2011) s ử d ụ ng h ạ t c ủ a D aphyllum 15 tu ầ n tu ổ i đư ợ c n ả y m ầ m trên môi trư ờ ng MS H ạ t gi ố ng hình thành protocorm sau 5 tu ầ n nuôi c ấ y Các PLBs cho t ỷ l ệ n ả y m ầ m, s ố ch ồ i và r ễ nhi ề u hơn trên môi trư ờ ng MS b ổ sung IAA + KN Dake Zhao et al , (2013) nghiên c ứ u nhân gi ố ng và t ạ o hoa trong ố ng nghi ệ m loài lan D wangliangii G W Hu, C L Long & X H Jin Xin Qian et al , (2014) nghiên c ứ u s ả n xu ấ t hoa và h ạ t gi ố ng loài lan D officinale Kimura et Migo trong ố ng nghi ệm đã tạo đượ c calluses t ừ các đỉ nh ch ồi trên môi trườ ng MS b ổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l α NAA, nhi ề u ch ồ i đư ợ c tái sinh t ừ các m ẫ u PLBs khi c ấ y trong môi trư ờ ng MS + 1 mg/l α NAA Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có kh ả năng ra hoa cao (83,2%) v ớ i t ỷ l ệ hoa bình thư ờ ng 73,6% khi c ấ y trên môi trư ờ ng MS + 15% nư ớ c d ừ a + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tu ầ n Mohammad Musharof Hossain et al , (2013) nghiên c ứ u nhân gi ố ng lan H ạ c v ỹ cho r ằng môi trườ ng Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho h ạ t n ả y m ầ m t ố t trong lúc h ệ s ố nhân protocorm trên môi trườ ng Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l α NAA khá cao Đ ố i v ớ i loài l an D jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al , 2016) cho r ằ ng môi trư ờ ng MS thích h ợ p cho nuôi c ấ y t ừ hoa, môi trư ờ ng KC phù h ợ p v ớ i nuôi c ấ y t ừ lá, môi trư ờ ng VW phù h ợ p v ớ i nuôi c ấ y t ừ đ ố t thân Tapash Kumar Bhowmik et al , (2017) k ế t lu ận: môi trườ ng Phytamax (PM) có b ổ sung 20 g/l sucro đem lạ i t ỷ l ệ h ạ t n ả y m ầ m loài D palpebra Lindley , cao hơn so v ớ i gluco và fructo Thejaswini et al , (2017) cho r ằng nước ép cà chua và nướ c d ứ a 15% cho t ỷ l ệ n ả y m ầ m t ố t nh ấ t khi gieo h ạ t in vitro lan D ovatum (Willd ) Theo Edy Setiti WidaUtami et al , (2017), b ổ sung 2 g/l peptone trong môi trườ ng VW đã đượ c ch ứng minh là hàm lượ ng thích h ợ p cho s ự n ả y m ầ m c ủ a h ạ t, hình thành ch ồ i v ớ i s ự phát tri ể n c ủ a protocorm Nghiên c ứ u v ề nuôi c ấ y c ắ t lát m ỏng đã đượ c các tác gi ả th ự c hi ệ n trên m ộ t s ố đối tượ ng: nuôi c ấ y c ắ t lát m ỏ ng ngang thân cây con in vitro lan D chrysotoxum Lindley(chi ề u dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al , 16 (2018) nhân gi ố ng lan D aphyllum (Roxb ) Fisch t ừ các l ớ p t ế bào lát m ỏ ng c ắ t ngang (t - TCL); Parthibhan et al , (2018) nghiên c ứ u tái sinh phôi soma đư ợ c hình thành t ừ các l ớ p t ế bào lát m ỏ ng c ắ t ngang (tTCL) c ủ a lan D aqueum Lindley 1 5 2 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium ở Việt Nam Ở Vi ệ t Nam hi ện nay đã có mộ t s ố tác gi ả nghiên c ứ u nhân gi ố ng các loài lan Hoàng th ả o quý nh ằ m b ả o t ồ n và phát tri ể n ngu ồn gen có nguy cơ tuyệ t ch ủ ng: Nguy ễn Thanh Tùng và cs , 2010)đã nuôi cấ y nh ữ ng lát m ỏ ng theo chi ề u ngang (tTCL) c ủ a D aduncum v ới kích thướ c kho ả ng 1,0 - 1,5 mm Lát m ỏ ng t ế bào đượ c c ấy lên môi trườ ng t ối ưu cả m ứ ng protocorm - like bodies là môi trườ ng ½ MS b ổ sung 0,5 mg/l BAP cho 29,85 protocorm - like bodies/lát m ỏ ng sau 8 tu ầ n nuôi c ấ y Nghiên c ứ u nhân gi ố ng lan d ượ c li ệu Kim Điệ p ( D chrysotoxum ), Long nhãn (D Fimbriatum Hook ) b ằng phương pháp gieo hạ t in vitro v ớ i m ục đích bả o t ồ n và phát tri ể n loài lan quý (Nguy ễn Văn Song và cs, 2011 ); Nguy ễ n Th ị Sơn và cs, 2012) Vũ Ngọ c Lan, Nguy ễ n Th ị Lý Anh (2013), đã nghiên cứ u nhân gi ố ng gieo h ạ t in vitro Lan D nobile Lindl , s ử d ụ ng qu ả 5 tháng tu ổi; môi trườ ng gieo h ạ t là MS + (10% CW + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít môi trườ ng Trong nhân in vitro kinh điển, môi trườ ng nhân nhanh protocorm t ối ưu là KC+ 10% CW + 10g/l saccharose + 6,0g/l agar; nhân nhanh c ụ m ch ồ i t ố t nh ấ t là MS + (10% CW + 10g/l saccharose + 6,0g/l agar) Trong nhân in vitro c ả i ti ế n: nuôi c ấ y l ỏ ng l ắ c nút bông và l ỏ ng l ắc màng thoáng khí đã tăng hệ s ố nhân protocorm đạ t 1,9 và 2,3 l ầ n so v ớ i nhân in vitro kinh điể n Nuôi c ấy đặ c thoáng khí giúp gi ảm 25% lượ ng saccharose b ổ sung vào môi trường và tăng hệ s ố nhân protocorm lên g ấ p 1,4 l ầ n so v ớ i nuôi c ấy kinh điể n Nhân nhanh c ụ m ch ồ i b ằ ng k ỹ thu ậ t bioreactor gi ả m ½ th ờ i gian nhân gi ống Môi trườ ng t ối ưu tạ o cây hoàn ch ỉ nh là RE + (10g saccharozase + 0,5g THT)/lít, cường độ ánh sáng 2300lux Nguy ễ n Th ị Sơn và cs, (2014)nghiên cứ u nhân gi ố ng b ằ ng gieo h ạ t in vitro loài lan D officinale trên môi trườ ng VW+ 10% CW + 10g/l sucrose + 6g/l agar + 10% CW, nhân nhanh c ụ m ch ồ i t ố t nh ất trên môi trườ ng MS + 10% CW + 20g/l sucrose + 6g/l agar + 60g/l chu ố i chín Nhân gi ố ng vô tính thông qua nuôi c ấ y 17 đoạ n thân mang m ắ t ng ủ s ử d ụng đoạ n thân in vitro mang 2 m ắ t ng ủ và nuôi c ấ y trên môi trườ ng MS + 20g/l sucrose + 10% CW + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α - NAA + 6g/l agar Môi trư ờ ng t ạ o cây hoàn ch ỉ nh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l α - NAA 1 6 Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 1 6 1 Ảnh hƣởng của giá thể Giá th ể có ý nghĩa quan trọng đố i v ớ i nuôi tr ồng cây lan, đặ c bi ệ t là trong giai đoạn vườm ươm Sử d ụ ng giá th ể phù h ợ p s ẽ gi ữ am giúp cho cây sinh trưở ng, phát tri ể n t ố t Nhi ề u tác gi ả Trung qu ốc đã quan tâm nghiên cứ u v ề ảnh hưở ng c ủ a giá th ể đến sinh trưở ng, phát tri ể n c ủ a cây lan Dendrobium Theo Pan Chun-xiang et al , (2009) các lo ạ i giá th ể v ỏ cây, mùn cưa, gạ ch v ụn đã ảnh hưởng đế n c ấ u trúc r ễ c ủ a cây D chrysanthum K ế t qu ả cho th ấ y các cây tr ồ ng trên giá th ể g ạ ch v ụ n có s ố t ế bào chóp r ễ nhi ều hơn và thành củ a các t ế bào nhu mô t ủ y và nhu mô m ạ ch c ủ a r ễ l ại dày hơn so vớ i tr ồ ng trên các lo ạ i giá th ể khác Bijaya Pant et al , ( 2012) cho răng giái thể thích h ợ p cho loài lan D primulinum Lindlgiá th ể g ạ ch: rêu v ớ i t ỷ l ệ 2: 1 T ỷ l ệ cây s ống sót đạ t 70% ở ngoài vườn ươm Mohammad Musharof Hossain et al , ( 2013) cho r ằ ng giá th ể thích h ợ p tr ồ ng cây con D aphyllum h ỗ n h ợ p m ả nh g ạ ch , than, xơ dừ a và ch ấ t khoáng (1: 1: 0,5: 0,5) Selvaraju Parthibhan et al , (2015) cho r ằ ng tr ồ ng cây D aqueum Lindley trên giá th ể m ả nh g ạ ch và than c ủi (1:1), để rêu trên b ầ u và ch ụ p túi polyethylene giúp làm ẩ m, cho cây t ỷ l ệ cây con s ố ng cao Abdul Aziz Mirani et al , (2017a) đã nghiên ảnh hưở ng các giá th ể đế n t ỷ l ệ s ống và sinh trưở ng c ủ a lan D nobile Lindley, tác gi ả cho r ằng cây con đượ c c ấ y trên môi trườ ng MS + 3 mg/l α NAA, sau đó cây đư ợ c tr ồ ng trên giá th ể h ỗ n h ợ p than bùn x ừ a: cát: đá trân ch âu (1,0: 1,0: 0,2) là t ố t nh ấ t cho t ỉ l ệ s ố ng 100% sau 120 ngày 18 1 6 2 Ảnh hƣởng của dinh dƣỡng Trong giai đoạn vườn ươm, cây lan cấy mô đượ c cung c ấp dinh dưỡng dướ i d ạ ng phun dung d ị ch phân bón lên toàn b ộ b ề m ặ t cây Dinh dưỡng NPK đóng mộ t vai trò quan tr ọ ng trong s ự tăng trưở ng và phát tri ể n c ủ a cây lan Ở giai đoạn vườ n ươm, cây lan cấy mô đượ c cung c ấp dinh dưỡng dướ i d ạ ng phun dung d ị ch phân bón lên toàn b ộ b ề m ặt cây Dwiyani (2012) đã kế t lu ậ n, s ử d ụ ng Hyponex làm tăng chiề u cao cây và s ố lá c ủ a Dendrobium sp Kabir et al , (2012) đã xác đị nh trên loài lan Dendrobium sp, xu hướng tăng chi ề u dài lá, chi ề u r ộ ng lá, di ệ n tích lá, s ố lá và t ổ ng di ệ n tích lá là cao nh ấ t khi phun N: P: K v ớ i t ỷ l ệ 10:25:30 phun 1tu ầ n/l ầ n Chi ều cao cây và đườ ng kính thân đạ t t ối đa khi phun dinh dưỡ ng N: P: K t ỷ l ệ 15:20:20 phun 1tu ầ n/l ầ n 19 PHẦN II - VẬT LIỆU , NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu * V ậ t li ệ u th ự c v ậ t: V ậ t li ệ u nuôi c ấ y in vitro là qu ả c ủ a loài cây D Aphyllum đượ c thu th ậ p ở Hòn Bà-Khánh Hòa * Hóa ch ấ t : - Ch ấ t kh ử trùng dùng trong thí nghi ệ m H 2 O 2 , HgCl 2, NaOCl * Môi trƣ ờ ng nuôi c ấ y: - Murashige & Skoog (MS), các ch ấ t đi ề u ti ế t sinh trư ở ng, N6 - benzyladenine (BA), Indolbutyride acid (IBA), sucrose, activated carbon ( AC), , đư ợ c b ổ sung vào tùy m ụ c đích thí nghi ệ m * Trang thi ế t b ị : - Bu ồ ng c ấ y vô trùng (Bioiogical safety Cabinets) - N ồ i h ấ p kh ử trùng (Auto Clave) c ủ a hãng Tomy Nh ậ t B ả n - Cân điệ n t ử c ủa Đứ c - Má y đo pH - T ủ s ấ y - Bình tam giác có kích thướ c t ừ 250ml - 500ml, pipet lo ạ i 1ml, d ụ ng c ụ nuôi c ấ y 2 2 N ộ i dung th ự c hi ệ n c ủa đề tài: Để đạt đượ c m ục đích nghiên cứu, đề tài th ự c hi ệ n các n ộ i dung chính sau đây: 2 2 1 Nghiên c ứ u t ạ o v ậ t li ệ u kh ởi đầ u cho nuôi c ấ y in vitro 2 2 2 Nghiên c ứ u nhân nhanh protocorms và ch ồ i 2 2 3 Nghiên c ứ u t ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 2 3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2 3 1 Phƣơng pháp khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu Lan D aphyllum Qu ả lan được thu hái khi đạ t kho ả ng 10 tháng tu ổ i sau khi th ụ ph ấ n Qu ả đượ c r ử a s ạ ch b ằng nướ c xà phòng, sau đó khử trùng15%H 2 O 2 , 0,1%HgCl 2 , 20 hypochlorite - Na ( 3% NaOCl) , trong 10 phút r ồ i r ử a l ạ i nhi ề u l ầ n b ằ ng nư ớ c c ấ t vô trùng, sau đó c ắ t, r ạ ch qu ả và gieo h ạ t trên môi trư ờ ng Vacin Went (VW) + 20 g /l đư ờ ng + 100ml/l nư ớ c d ừ a + 5,5 g/l th ạ ch , pH 5,5, b ổ sung ch ấ t kích thích s inh trư ở ng Benzyladenine acid (BA) n ồ ng đ ộ dao đ ộ ng t ừ 0,1 – 3,0mg/ l Các thí nghi ệ m ti ế n hành: Thí nghi ệ m 1: Nghiên c ứ u ả nh hư ở ng c ủ a ch ấ t kh ử trùng H 2 O 2 , HgCl 2 và NaOCl, t ớ i t ỷ l ệ s ố ng vô trùng c ủ a m ẫ u c ấ y + CT1: Kh ử trùng qu ả trong H 2 O 2 15 % trong 10 phút + CT2: Kh ử trùng qu ả trong HgCl 2 0,1% trong 10 phút + CT3: Kh ử trùng qu ả trong 3%NaOCl 0,1% trong 10 phút Thí nghi ệ m trên m ẫ u qu ả v ớ i 3 công th ứ c, b ố trí 3 l ầ n l ặ p l ạ i, m ỗ i l ầ n l ặ p l ạ i trên 3 qu ả /công th ứ c Hình 2 1 Quả lan Hạc vỹ đưa vào nuôi cấy in vitro Thí nghi ệ m 2 : Ả nh hư ở ng c ủ a ch ấ t đi ề u ti ế t sinh trư ở ng BA đ ế n giai đo ạ n kh ở i đ ộ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệ u ban đ ầ u CT1(Đ/C): Nề n (VW + 20g/l đườ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nướ c d ừ a, pH 5,5 ) CT2: N ề n + 0,5mg/l BA CT3: N ề n + 1,0mg/l BA CT4: N ề n + 1,5mg/l BA CT5: N ề n + 2,0mg/l BA Gieo h ạ t lan trên 5 công th ứ c, m ỗ i công th ứ c b ố trí trên 3 bình, 03 l ầ n l ặ p l ạ i 21 2 3 2 Phƣơng pháp nghiên cứu nhân nhanh protocorms và chồi H ạ t lan n ả y m ầ m có th ể s ả n xu ấ t ra m ộ t kh ố i t ế bào chưa phân hoá rõ ràng đư ợ c g ọ i là protocorm C ắ t các c ụ m th ể sinh ch ồ i protocorm thu đư ợ c trong môi trư ờ ng nuôi c ấ y ban đ ầ u đư ợ c chuy ể n sang môi trư ờ ng nhân nhanh ch ồ i VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5,5g/ l th ạ ch pH 5,5 và b ổ sung các ch ấ t kích thích sinh trư ở ng Benzyladenine acid (BA), Naphtyl axetic axit ( α NAA) n ồ ng đ ộ dao đ ộ ng t ừ 0,1 – 3 ,0mg/ l tùy theo m ụ c đích thí nghi ệ m Ngoài ra trong mô i trư ờ ng nuôi c ấ y còn b ổ sung h ợ p ch ấ t h ữ u cơ t ự nhiên như d ị ch nghi ề n khoai tây , táo, b ộ t t ả o Spirulina Các thí nghi ệ m ti ế n hành c ấ y vào m ỗ i bình 5 c ụ m protocorm có đườ ng kính 5mm, m ỗ i công th ứ c c ấ y 05 bình, thí nghi ệ m 03 l ầ n l ặ p l ạ i Thí nghi ệ m 3: Ảnh hưở ng c ủ a t ổ h ợ p ch ất điề u ti ết sinh trưở ng (BA + α NAA ) đ ế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i Đề tài tìm hi ể u ảnh hưở ng c ủa Auxin đế n quá trình phát sinh ch ồ i có s ự tương tác với BA Đề tài ti ế n hành b ổ sung α NAA v ớ i các n ồ ng đ ộ khác nhau vào môi trư ờ ng là VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5,5 g/ l th ạ ch + 1,5 mg/BA, pH 5,5 (môi trư ờ ng này xác đ ị nh là môi trư ờ ng kh ở i đ ộ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệ u ban đ ầ u t ố t nh ấ t ở thí nghi ệ m 2 ), n ồ ng đ ộ α NAA thay đ ổ i là: CT1(Đ/C): Nề n (VW + 20g/l đườ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nướ c d ừ a + 1,5 mg/l BA, pH 5,5 ) CT2: N ề n + 0,5mg/l α NAA CT3: N ề n + 1,0mg/l α NAA CT4: N ề n + 1,5mg/l α NAA CT5: N ề n + 2,0mg/l α NAA Thí nghi ệ m 4 : Ả nh hư ở ng c ủ a d ị ch nghi ề n khoai tây đ ế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5 ,5g/ l th ạ ch + 1,5 mg/ l BA + 0,5 mg /l α NAA , pH 5,5) CT2: N ề n + 20g/ l khoai tây CT3: N ề n + 40g/l khoai tây CT4: N ề n + 60g/l khoai tây 22 CT5: N ề n + 80g/l khoai tây CT6: N ề n + 100g/lkhoai tây N ề n là công th ứ c t ố t nh ấ t c ủ a thí nghi ệ m 3 Thí nghi ệ m 5: Ảnh hưở ng c ủ a d ị ch nghi ề n cà r ố t đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5 ,5g/ l th ạ ch + 1,5 mg/ l BA + 0,5 mg/ l α NAA + 60g/ lkhoai tây ) CT2: N ề n + 10g/l cà rốt CT3: N ề n + 20g/l cà rốt CT4: N ề n + 30g/l cà rốt CT5: N ề n + 40g/l cà rốt CT6: N ề n + 50g/l cà rốt N ề n là công th ứ c t ố t nh ấ t c ủ a thí nghi ệ m 4 Thí nghi ệ m 6: Ảnh hưở ng c ủ a t ả o Spirulina đế n kh ả năng nhân nhanh protorcom và ch ồ i CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/ l đư ờ ng + 100ml/ l nư ớ c d ừ a + 5 ,5g/ l th ạ ch + 1,5 mg/ l BA + 0,5 mg/ l α NAA + 60g/ l khoai tây + 30g/ l cà rốt ) CT2: N ề n + 0,5 g/ l b ộ t tảo Spirulina CT3: N ề n + 1,0 g/ l b ộ t tảo Spirulina CT4: N ề n + 1,5 g/ l b ộ t tảo Spirulina CT5: N ề n + 2,0 g/ l b ộ t tảo Spirulina N ề n là công th ứ c t ố t nh ấ t c ủ a thí nghi ệ m 5 2 3 5 Phƣơng pháp nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh Khi các ch ồi đạ t chi ề u cao kho ả ng 3-5cm v ớ i kho ả ng 3-4 lá thì chuy ể n sang giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh Ti ế n hành các thí nghi ệm xác đị nh ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u ti ết sinh trưở ng IBA(0,5 – 2,0mg/l), t ới giai đoạ n t ạ o cây hoàn ch ỉ nh Theo dõi, đánh giá theo các chỉ tiêu như: về kh ả năng sinh trưở ng c ủ a cây, chi ề u cao trung bình (cm), s ố lá trung bình (lá/cây), s ố r ễ trung bình (r ễ /cây), sau 8 tu ầ n nuôi c ấ y Thí nghi ệ m 7: Ảnh hưở ng c ủ a IBA đế n kh ả năng t ạ o cây in vitro hoàn ch ỉ nh 23 CT 1(Đ/C):Nề n ( VW + 20g/l đư ờ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nư ớ c d ừ a + 1 g/l than hoạt tính, pH 5,5 ) CT2: N ề n + 0,5 mg/lIBA CT3: N ề n + 1,0 mg/l IBA CT4: N ề n + 1,5 mg/l IBA CT5: N ề n + 2,0 mg/lIBA Các thí nghi ệm đượ c b ố trí theo kh ố i ng ẫ u nhiên hoàn toàn, 3 l ầ n nh ắ c l ạ i Các thí nghi ệm đượ c ti ế n hành t ạ i phòng nuôi c ấ y mô Phòng thí nghi ệ m Phát tri ể n Ứ ng d ụ ng Y sinh Công ngh ệ - Vi ệ n Ứ ng d ụ ng Công ngh ệ Điề u ki ệ n nuôi c ấ y : Nhi ệt độ phòng 25±2 0 C, ẩm độ 60-70%, th ờ i gian chi ế u sáng 16gi ờ /ngày , cường độ ánh sáng 1 500 - 2 300 lux 2 4 Phƣơng pháp xử lý số liệu - Nh ậ p và x ử lý s ố li ệu thông thườ ng b ằng chương trình Microsoft Excel - X ử lý th ố ng kê b ằng chương trình IRRISTAT 5 0 24 PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3 1 Nghiên cứu khử trùng và nuôi cấy khởi động mẫu loài lan Hạc vỹ 3 1 1 Kết quả nghiên cứu x ác định phƣơng pháp khử trùng đối với quả lan H ạ t lan r ấ t nh ỏ , có c ấ u t ạ o không hoàn ch ỉ nh, do đó muố n h ạ t n ả y m ầ m ph ả i t ạo đủ điề u ki ện dinh dưỡng và môi trườ ng Ở nhi ều nướ c trên th ế gi ới, phương th ứ c n ả y m ầ m h ạ t lan in vitro là m ộ t ph ầ n quan tr ọ ng c ủa trương trình bả o t ồ n và nhân gi ố ng các loài lan quý hi ế m, cung c ấp cây con cho chương trình ph ụ c h ồ i tái sinh r ừ ng Dutta et al , (2011) đã sử d ụ ng h ạ t c ủ a H ạ c v ỹ 15 tu ầ n tu ổi đượ c n ả y m ầ m trên môi trườ ng MS H ạ t gi ố ng hình thành protocorm sau 5 tu ầ n nuôi c ấ y Các PLBs cho t ỷ l ệ n ả y m ầ m, s ố ch ồ i và r ễ nhi ều hơn trên môi trườ ng MS b ổ sung IAA + KIN Chính vì th ế , chúng tôi ti ế n hành nghiên c ứ u cách kh ử trùng qu ả lan làm ngu ồ n v ậ t li ệ u trong nhân gi ố ng in vitro các k ế t qu ả đư ợ c th ể hi ệ n t ạ i b ả ng 3 1 Bảng 3 1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống và n ảy mầm của lan Hạc vỹ Ch ỉ tiêu theo dõi Công th ứ c thí nghi ệ m T ỷ l ệ m ẫ u s ố ng và phát sinh protocorm (%) T ỷ l ệ m ẫ u s ố ng và phát sinh ch ồ i (%) CT1 Kh ử trùng qu ả trong H 2 O 2 15 % trong 10 phút 95 5 CT2 Kh ử trùng qu ả trong HgCl 2 0,1% trong 10 phút 96 4 CT3 Kh ử trùng qu ả trong 3%NaOCl 0,1% trong 10 phú t 9 8 2 T ừ k ế t qu ả thu đư ợ c cho chúng tôi th ấ y: Sau 4 tu ầ n gieo h ạ t ở c ả 03 công th ứ c thí nghi ệ m đ ề u cho t ỷ l ệ n ẩ y m ầ m cao đ ạ t 100% Tuy nhiên, chúng tôi l ự a ch ọ n công th ứ c 3 đ ể kh ử trùng m ẫ u qu ả c ủ a loài lan r ừ ng này, b ở i công th ứ c 3 ít t ố n kém, ít đ ộ c h ạ i 25 Sau khi gieo h ạ t, có 9 8 % h ạ t phát sinh th ể s inh ch ồ i (protocorm ), 2 % n ả y c ụ m ch ồ i trên môi trư ờ ng cơ b ả n (N ề n VW + 20g/l đư ờ ng + 5,5g/l th ạ ch + 100ml/l nư ớ c d ừ a , pH 5,5) Hình 3 1 Sự nảy mầm của hạt lan Hạc vỹ 3 1 2 Ảnh hƣởng của chất điều tiết sinh trƣởng BA đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật liệu ban đầu BA là m ộ t ch ất điề u ti ết sinh trưở ng nhân t ạ o thu ộ c nhóm Cytokinin, là nhóm đượ c s ử d ụ ng r ộ ng rãi nh ấ t trong k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y mô hi ệ n nay Tác d ụ ng ch ủ y ế u c ủ a nó là kích thích s ự phân chia t ế bào, thúc đẩ y s ự ho ạt độ ng c ủ a ch ồ i bên N ồng độ s ử d ụng khác nhau tùy đối tượ ng th ự c v ậ t nuôi c ấ y, các k ế t qu ả nghiên c ứ u cho th ấ y: ở n ồng độ 22μM thích h ợ p v ớ i s ự phát tri ể n ch ồ i ở Cymbidium aloifolium , nhưng đố i v ớ i D aphyllum và D moschatum n ồng độ thích h ợ p nh ấ t cho s ự phát tri ế n c ủ a ch ồ i l ạ i là 44μM (N R Nayak et al , 1997) Để tìm n ồng độ phù h ợ p c ủ a BA đế n giai đoạ n kh ởi độ ng m ẫ u t ạ o v ậ t li ệu ban đầ u cho cây lan H ạ c v ỹ , trong thí nghi ệ m này chúng tôi b ố trí 5 n ồ n g độ khác nhau: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0mg/l Sau 4 tu ầ n nuôi c ấ y k ế t qu ả đượ c trình bày ở b ả ng 3 2 Qua k ế t qu ả thu đư ợ c ở b ả ng 3 2 cho th ấ y: h ệ s ố nhân protocorm đ ạ t cao nh ấ t ở n ồ ng đ ộ 1,5 mg/ l BA đ ạ t 3,9 l ầ n, s ố ch ồ i 4, 20 l ầ n Trong khi đó ở công th ứ c không b ổ sung (Đ/C) có h ệ s ố nhân protocorm đ ạ t th ấ p nh ấ t là 2, 3 0 l ầ n, s ố ch ồ i 1,4 0 l ầ n Đố i v ớ i ch ỉ tiêu chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồ i cho th ấ y: T ấ t c ả các công th ứ c có b ổ sung BA đề u cho k ế t qu ả cao hơn công thứ c không b ổ sung BA vào môi trườ ng nuôi c ấ y Chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồi dao độ ng t ừ 1,20 cm đế n 2,43cm Trong 26 đó: Ở n ồng độ 1,5 – 2,0 mg/l có chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồi đạ t cao nh ấ t là 2,31 – 2,43cm; công th ức (Đ/C) không bổ sung BA có chi ề u cao trung bình c ủ a ch ồ i th ấ p nh ấ t là 0,30cm Ở n ồng độ BA t ừ 1,5 đế n 2,0 mg/l ch ồ i m ậ p, lá xanh th ẫ m Bảng 3 2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban đầu Nồng độ BA (mg/l ) Hệ số nhân protocorm (lần) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) 0 (Đ/C) 2, 3 0 1,4 0 0,3 0 0,5 2, 80 2, 2 0 1, 20 1,0 3, 2 0 2, 40 1,8 5 1,5 3 , 9 0 4, 20 2,4 3 2,0 3 , 1 0 3,4 0 2,3 1 CV(%) 4,3 4,7 3,0 LSD 0,05 0,24 0,57 0,70 Ghi chú : Đ/C: Nền môi trườ ng VW + 20g/l đườ ng + 5,5 g/l th ạ ch + 100ml/l nướ c d ừ a , pH 5,5 Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA vượ t quá 2,0mg/l ch ất lượ ng ch ồ i có xu hướ ng gi ả m, ch ồ i g ầ y, lá xanh nh ạ t và b ị d ị d ạ ng (lo ạ i kém) T ừ ph

i

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1.1 Cơ sở khoa học về nhân giống lan 3

1.1.1 Bảo tồn hoa lan 3

1.1.2 Các kỹ thuật về nhân giống hoa lan 3

1.2 Một vài nét về loàiD aphyllum nghiên cứu 7

1.2.1 Phân loại 7

1.2.2 Một số đặc điểm thực vật chính về loài lan D aphyllum 7

1.2.3 Phân bố của lan Hoàng thảo Hạc vỹ 9

1.2.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác loài lan Hoàng thảo Hạc vỹ của Việt Nam 9

1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh với chi Hoàng thảo (Dendrobium) 10

1.4Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam 11

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới 11 Dendrobium 12

1.4.2Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam 13

1.5 Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium 14

1.5.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium thế giới 15

1.5.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium ở Việt Nam 16

1.6Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô 17

1.6.1 Ảnh hưởng của giá thể 17

1.6 2 Ảnh hưởng của dinh dưỡng 18

PHẦN II- VẬT LIỆU, NỘI DUNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu Lan D aphyllum 19

ii

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh protocorms và chồi 21

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu tạo cây in vitrohoàn chỉnh 22

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 23

PHẦN III- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Nghiên cứu khử trùng và nuôi cấy khởi động mẫu loài lan Hạc vỹ 24

3.1.1 Kết quả nghiên cứu xác định phương pháp khử trùng đối với quả lan 24

3.1.2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến giai đoạn khởi động mẫu tạo vật liệu ban đầu 25

3.2 Nghiên cứu khả năng nhân giống in vitro 26

3.2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của BA + αNAA đến quá trình nhân nhanh protocorm và chồi 27

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây đến khả năng nhân nhanh protorcom và chồi 28

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền cà rốt đến khả năng nhân nhanh protorcom và chồi 30

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của bột tảoSpirulina đến khả năng nhân nhanh protorcom và chồi 31

3.3 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh in vitro 32

3.3 1 Ảnh hưởng của IBA tới giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 33

PHẦN 4- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

4.1 KẾT LUẬN 35

4.2 ĐỀ NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 42

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AC: Activated carbon (than hoạt tính)

CTTN: Công thức thí nghiệm

CV(%): Hệ số biến động (Correlation of Variants)

CW : Coconut water (nước dừa)

D: Dendrobium(lan Hoàng thảo)

Đ/C: Đối chứng

IBA: Indolbutyride acid

αNAA : α - Naphthalene acetic acid

LSD: So sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức α  0,05

PLBs: Protocorm like bodies

SH: Schenk and Hildebrandt

TB: Trung bình

TCLs: Thin cell layers

TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW: Vacin and Went

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Lan Hạc vỹ 8

Hình 2.1 Quả lan Hạc vỹ đưa vào nuôi cấy in vitro 20

Hình 3.1 Sự nảy mầm của hạt lan Hạc vỹ 25

Hình 3.2 Nhân nhanh protocorm và chồi 32

Hình 3.3 Tạo cây in vitro hoàn chỉnh 34

1

MỞ ĐẦU

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất của họ Lan (Orchidaceae), ước tính có khoảng 1.184 loài (Leitchet al., 2009) và được phân bố

từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương đến New Zealand

(Govaerts et al., 2011) Lan Hoàng thảo Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là loài lan rừng đẹp, có giá trị y học và

giá trị thương mại cao Trên thế giớichúng phân bố ở Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Nepal, Sri Lanka,Thái Lan, Lào, Camphuchia, Malaixia Ở Việt Nam, Hạc vỹ thường mọc ở một số vùng:Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Sơn La,

Bắc Cạn, Ninh Thuận…(Averyanov et al., 2005; Sách đỏ Việt Nam, 2007).Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Lan D aphyllum có tác dụng chữa bệnh như: Dùng trị

ho, đau họng, bỏng lửa; toàn cây trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách

Đỏ Việt Nam, 2007)

Do nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh trong thời gian

gần đây nên loài D aphyllumđã bị khai thác kiệt quệ.Mặt khác, tỷ lệ nảy mầm từ hạt trong tự nhiên rất thấp và vùng phân bố của D aphyllumbị tàn phá nghiêm

trọng nên loài cây này lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào

Sách Đỏ Việt Nam, 2007 và hạng mục IUCN (Romand-Monnier, 2013) cần phải

được bảo vệ Do vậy cần có các biện pháp kỹ thuật để nhân giống, bảo tồn và phát triển loài lan dược liệu có giá trị này của Việt Nam Nhằm góp phần làm phong phú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao

thu nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”

1 Mục tiêu của đề tài

Nhân nhanh được loài lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum(Roxb.) Fisher) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, nhằm góp phần bảo tồn và phát triển loài Lan dược

liệu quý hiếm của Việt Nam

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2.1.Ý nghĩa khoa học

2

* Kết quả của đề tài có thể được sử dụng làm tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu, giảng dạy về hoa lan nói chung và chi lan Hoàng thảo nói riêng

* Góp phần xây dựng quy trình nhân giống in vitrolan D aphyllum vốn chưa

được nghiên cứu ở Việt Nam

* Cung cấp số liệu và thông tin khoa học cho các nhà nghiên cứu khoa học tham khảo

2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

* Góp phần bảo tồn và phát triển cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt Nam Giúp bà con vùng núi cao xóa đói giảm nghèo, ổn định cuộc sống, không chặt phá rừng

* Góp phần phát triển khu du lịch sinh thái

* Đề xuất phương pháp nhân nhanh giống với số lượng lớn, sạch bệnh, giá thành phù hợp, đáp ứng nhu cầu của thị trường cung cấp nguyên liệu cho ngành Dược phục vụ nội tiêu, nâng cao sức khỏe cộng đồng và tiến tới tham gia xuất khẩu

3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

* Quả lan Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum) thu thập từ Khánh Hòa và được đưa vào nuôi cấy in vitro tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật của Phòng thí nghiệm

Phát triển Ứng dụng Y sinh Công nghệ- Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ KH&CN

* Các nghiên cứu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Phát triển Ứng dụng Y sinh Công nghệ - Viện Ứng dụng Công nghệ- Bộ KH&CN

3

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Cơ sở khoa học về nhân giống lan

1.1.1 Bảo tồn hoa lan

Trên thế giới nhiều loài lan đang có nguy cơ tuyệt chủng, hiếm và được liệt kê trong phụ lục II của CITES, do nhiều nguyên nhân như biến đổi khí hậu, khai thác quá mức, buôn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai Hoa lan được biết đến như

là cây cảnh quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là lan rừng Các loài lan rừng của Việt Nam nổi tiếng với vẻ đẹp và tính năng riêng biệt của chúng và đang có nhu cầu sử dụng làm cảnh và làm thuốc cao trên toàn thế giới Do đó cần có các biện pháp kỹ thuật để nhân giống, bảo tồn và phát triển loài lan có giá trị của Việt Nam

Hoa lan, có thể được duy trì trong tự nhiên (bảo tồn in situ) và chuyển khỏi môi trường sống của chúng (bảo tồn ex situ) Bảo tồn in situ là cách tốt nhất để bảo tồn

sự đa dạng di truyền các loài lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì trong một thời

gian dài và có nguy cơ bị mất do bị sâu bệnh, sinh học và stress phi sinh học

Ngoài ra, rất tốn kém do sử dụng lao động và đất (Montakarn Pimsen, 2014) Bảo

tồn nguồn gen bằng nuôi cấy in vitro và bảo quản lạnh được sử dụng để bảo tồn đa

dạng di truyền của chúng Đây là cơ sở khoa học để đề tài ứng dụng kỹ thuật này trong công tác bảo tồn loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

1.1.2 Các kỹ thuật về nhân giống hoa lan

1.1.2.1 Nhân giống hữu tính

Hạt lan rất nhỏ, có cấu tạo không hoàn chỉnh Một quả lan có thể chứa 1.300 -4.000.000 hạt Hạt lan có hình dạng, kích thước và màu sắc rất khác nhau Hầu hết các hạt lan có chiều rộng 0,09 - 0,27 mm và chiều dài 0,25 -1,2 mm Trọng lượng hạt từ 0,0003 - 0,0014 mg (0,3 - 1,4 µg) Các hạt có chứa một phôi nhỏ, thiếu nội nhũ, do đó muốn hạt nảy mầm phải tạo đủ điều kiện dinh dưỡng và môi trường Mặt khác, trong tự nhiên hạt lan phải được nhiễm nhiều loại nấm kí sinh

thuộc chi Rhizoctonia mới có thể nảy mầm được (Montakarn Pimsen, 2014) Phương pháp nảy mầm hạt lan in vitro là một phần quan trọng của trương trình

bảo tồn và nhân giống các loài lan quý hiếm, cung cấp cây con cho chương trình

4

phục hồi tái sinh rừng

1.1.2.2 Nhân giống vô tính

Một số phương pháp nhân giống vô tính bằng tách chồi vượt, giâm hom nhưng đều cho hệ sống nhân giống thấp, cần diện tích lớn, cần nhiều cây mẹ, cây dễ bị bệnh, nhanh bị lão hóa, khả năng sinh trưởng kém, rất khó sử dụng vào mục đích thương mại Kỹ thuật nuôi cấy mô đang phát triển rộng rãi để nhân giống các loài lan, nhờ kỹ thuật này, những giống lan quý đã có thể nhân giống dễ dàng với hệ số nhân giống cao, cây đồng đều, ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, có sức sống cao Có thể dùng nhiều bộ phận của hoa lan làm bộ phận nuôi cấy như: gieo hạt

invitro, đỉnh sinh trưởng, mắt ngủ trên thân, phương pháp lớp mỏng tế bào…

a) Các phương pháp nhân giống in vitro

- Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảo các đặc tính di truyền của mẹ trong các cây tái sinh (Morel, 1960) Khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như một số giống cây khác

là hình thành cấu trúc protocorm để sau đó có thể biệt hóa thành cây Nhân các protocorm sẽ tạo thành các protocorm mới gọi là protocorm like body (Morel, 1964) Không như trong nuôi cấy mô sẹo in vitro của những loài thực vật khác, việc thiết lập gen của protocorm được xác định ngay từ protocorm hình thành ban đầu (Neumann et al., 2009)

- Thể tiền chồi (Protocormlike body)

Protocorm like body (PLB) là thuật ngữ đề chỉ những cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh

của chồi bất định ở các loài lan (Joseph& Robert, 1992) Đây là cấu trúc lần đầu

tiên được đặt ra bởi Morel khi nuôi cấy đỉnh chồi của Cymbidium để tạo ra những cây sạch virus với các protocorm hình thành từ đỉnh sinh trưởng mà không phải là

từ hạt Như vậy, nuôi cấy mô phân sinh họ Lan sẽ hình thành các protocormlike body (Morel, 1964) Kỹ thuật này vừa tạo ra cây sạch bệnh virus, đồng nhất về

kiểu gen vừa cho tỷ lệ nhân giống cao

- Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu có kích thước nhỏ cắt từ những tổ

5

chức thực vật (thân, lá, phát hoa, sơ khởi hoa hay tổ chức hoa, lá mầm trụ trên/dưới

lá mầm, vùng đỉnh hay phôi) Các lát cắt có thể cắt dọc (lTCL), hay cắt ngang (tTCL) Các 1TCL chỉ chứa một loại mô như tầng các tể bào biểu bì nhưng các tTCL lại bao gồm các tế bào từ các kiểu mô khác nhau: tế bào biểu bì, vùng vỏ, tầng phát sinh gỗ, quanh mạch và lõi, nhu mô Nuôi cấy các TCL có thể phân lập các tế bào, các tầng mô và phụ thuộc vào trạng thái di truyền, các yếu tố ngoài gen, các điều kiện sinh trưởng có kiểm soát (ánh sáng, nhiệt độ, pH, chất điều hòa sinh

trưởng thực vật, các chất bổ sung vào môi trường ) dẫn tới sự cảm ứng in vitro

phát sinh hình thái Khả năng phát sinh hình thái của một TCL phụ thuộc các yếu

tố như: sự nhận biết các dấu hiệu đúng, sự truyền tính trạng, khả năng di truyền để đáp ứng và phản ứng với các dấu hiệu này, tình trạng sinh lý và nguồn gốc (mô hay

tổ chức) của TCL, các yếu tố stress, các trạng thái im lặng của gen Các tế bào trong TCL có thể phản biệt hóa dẫn đến việc thiết kế các kiểu hình Trong các TCL, con đường phát sinh hình thái của những mô chuyên trách xuất phát từ các tế bào, các mô có thể được điều khiển và kiểm soát rõ ràng, cho phép nghiên cứu về

sự thay đổi phân tử, sinh lý, sinh hóa có thể xảy ra Các TCL cũng sử dụng trong tăng cường trao đổi các hợp chất thứ cấp, dược chất qua việc nuôi cấy các tổ chức chuyển gen, nuôi cấy thực vật tự dưỡng bằng bioreactor (Dương Tấn Nhựt, 2007) Các lớp tế bào mỏng đã được sử dụng thành công trong thể tiền chồi

(protocorm-like body) và tạo callus ở Aranda, Coelogyne cristata, Cymbidium spp., Dendrobium spp., Doritaenopsis, Paphiopedilum, Renanthera, Rhynchostylis, Spathoglottis và Xenikophyton (Jaime A Teixeira da Silva, 2013b)

b) Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro

Có nhiều loại môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi nhân giống hoa lan như: Knuson L (1946), Murashige & Skoog (MS) (1962), Vacin & Went (VW) (1949)…Mỗi loại môi trường đều có chất vi lượng và đa lượng, vitamin khác nhau

Nói chung, sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro đều phụ thuộc vào môi

trường nuôi cấy

- Các hợp chất hữu cơ tự nhiên

Một số lượng lớn các chất hữu cơ tự nhiên như: peptone, nước ép cà rốt, nước

ép cà chua, chiết xuất từ thịt bò, dịch khoai tây, nước dừa và dịch chuối, dịch bí ngô, tảo,…thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng rất tốt trong

và đặc biệt có hiệu quả với một số loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis.Nước ép

cà rốt chứa cytokinin, giàu chất khoáng (canxi và kali), vitamin (A, B1, B2, Cvà E)

và glutamin được sử dụng kích thích sự phân chia tế bào của thực vật

* Bổ sung bột tảo Spirulina ở nồng độ 50 mg/l có tác động hiệu quả đến tỷ lệ

sống của chồi và số chồi đạt của lan Paphiopedilum delenatiiGuillaumin (Nguyễn

Thị Cúc và cs., 2014)

Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường giúp làm giảm độc tố bằng cách đào thải các hợp chất độc phenolic tiết ra trong thời gian nuôi cấy Bổ sung than hoạt tính có tác dụng hiệu quả lên sự phát sinh và tăng sinh mô sẹo, sự phát sinh

phôi và nhân phôi cũng được đề cập trên đối tượng D dixanthumLindley(Su et al.,

2014)

Không chỉ có các chất hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy hoa lan Có hai nhóm chính của điều hòa sinh trưởng thực vật: cytokinin và auxin Các cytokinin thường được dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật: BA, kinetin và TDZ để kích thích sự phân chia tế bào, gây ra sự hình thành chồi và sự gia tăng chồi nách và làm chậm sự hình thành rễ Các Auxin (2,4-D, αNAA, IAA

và IBA) thường được dùng trong nuôi cấy hoa lan để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ Ngoài ra, Axit abscisic (ABA) được bổ sung để ức chế hoặc kích thích sự phát triển mô sẹo, thúc đẩy sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, ức chế sự nhân

phôi thứ cấp, ngăn cản sự nảy mầm sớm của phôi sinh dưỡng (Saad et al., 2012)

- Các hợp chất chứa carbon

Carbon là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi cấy cho sự tăng

7

trưởng và phát triển của các mô Hiện nay cacbon được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vì thiếu ánh sáng và nồng độ CO2 thấp trong điều kiện in vitro Đường đã

được sử dụng như một nguồn carbon và như là cơ quan quản thẩm thấu trong môi

trường nuôi cấy Có nhiều loại đường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro như:

sucrose, glucose, maltose, fructose, lactose và sorbitol Sucrose ở nồng độ 20 và 30 g/l được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu nuôi cấy mô hoa lan (Montakarn Pimsen, 2014)

1.2 Một vài nét về loàiD aphyllum nghiên cứu

Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium

được hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan Hoàng Thảo Lan Hoàng Thảo có nhiều màu sắc và hình thái khác nhau (Trần Duy Quý,2005)

Chi Hoàng thảo(Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất củahọ Lan (Orchidaceae), ước tính có khoảng 1.400 loài (Jin et al., 2009) Số lượng các loài lan Hoàng thảo Việt Nam có khoảng 110 loài (Leonid et al.,2013)

1.2.1 Phân loại

Theo các tác giả (Trần Hợp, 1998; Leltch và cs., 2009) cây lan HoàngThảo

thuộc chi Dendrobium, phân loại như sau:

Lan Hạc vỹ có tên khoa học là:Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch

Đồng danh: Limodorum aphyllum Roxb 1795; Dendrobium pierardii Roxb ex

Hook 1822

Chi:lan Hoàng Thảo Dendrobium

Họ:Phong lan Orchidaceae

Bộ:bộ lan Orchidales

1.2.2 Một số đặc điểm thực vật chính về loài lan D aphyllum

Một số đặc điểm thực vật chính về loài lan D aphyllum (bảng1.1)

8

Hình 1 1 Lan Hạc vỹ Bảng1.1.Đặc điểm thực vật chính của loài lan nghiên cứu

Thân Lan phụ sinh, thân dài 60-80 cm, hình trụ, dầy 0,4-0,5 cm,

cm Các lá đài hình mác hẹp, đỉnh nhọn dài 2,4-2,7 cm, rộng 0,6-0,7 cm Môi màu vàng nhạt, đôi khi pha tím rất nhạt, hình gần tròn, dài 2,7-3 cm, rộng 2,5-2,6 cm, mép có lông ngắn, bề mặt phủ lông thưa, có 3 đường sống ngắn ở phần gốc, hai bên

9

gốc có vạch chéo màu tía Cột màu trắng, cao khoảng 0,5 cm; tuyến mật hình bán nguyệt; răng cột có đỉnh nhọn Nắp màu trắng, đỉnh màu tím, phủ nhú mịn

Quả Quả nang hình chùy, vỏ quả dày,quả có 4 khối phấn, chứa rất

nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh

1.2.3 Phân bố của lan Hoàng thảo Hạc vỹ

Trên thế giới lan Hoàng thảo Hạc vỹ phân bố ở Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, Malaixia

Ở Việt Nam, lan Hoàng thảo Hạc vỹphân bố tại Lâm Đồng (Lang Bian, Đà Lạt: Prenn; Đơn Dương), Khánh Hòa (Suối Giao, Yersin, Hòn Bà), Lào Cai, Bắc

Cạn, Ninh Thuận (Averyanov L., Averyanova A, 2005; Sách đỏViệt Nam, 2007),

Chúng mọc bám trên cây gỗ lớn trong rừng ở độ cao 400-1500 m

1.2.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác loài lan Hoàng thảo Hạc vỹ của Việt Nam

Với đặc điểm rất đa dạng về kiểu dáng,sặc sỡ về màu sắc hoa và nở hoa vàonhiều thời điểm khác nhau nên các loài lan Hoàng thảo bản địa ở nước ta bị khai thác triệt để phục vụ nhu cầu trang trí, thưởng lãm Hơn thế nữa, một số loài thuộc chi Hoàng Thảo cũng là vị thuốc dân tộc cổ truyền dùng để chữa bệnh

Nhiều loài được sử dụng làm thuốc như:D loddigesii Rolfe., D fimbriatum Hook Var.oculatum Hook., D candidum Wall Ex Lindl., D.chrysanthum Wall ex Lindl., D.nobile Lindl (Đỗ Huy Bích, 2004) , D aphyllum (Sách Đỏ Việt Nam,

2007)

Lan Hạc vỹ (D aphyllum(Roxb.)Fisch.) được coi là một loại cây thuốc quý,

trong số các ―Thần nông thảo dược‖ và được xếp vào loại sản phẩm cao cấp có tác dụng bổ âm thanh nhiệt, tạo nước bọt có lợi cho dạ dày, bổ phế và giảm ho Bằng phương pháp phân tích quang phổ, các nhà khoa học đã chứng minh các polysaccharides (đường đa) AP là Acetylglucose - O, chứa liên kết β (l-›4), dạng vòng của mỗi chất cặn thủy phân có dạng tháp trong đó các mạch chính được cấu tạo bởi D-manose và D-glucose Các thí nghiệm lâm sàng tiến hành trên động vật

cho thấy AP có hoạt tính tổng hợp chất miễn dịch tốt (Zhao Yong-Linget al.,

1994)

10

Zhang, (2008) đã xác định được trong thân lan Hạc vỹ có chứa: moscatilin, gigantol, batatasin, tristin, moscatin, hircinol, salidroside và p-

hydroxylbenzylacetic acid Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng ngoài

polysaccharides còn có các hợp chất phenol như moscatin, moscatilin và tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete 7-O--glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hòa miễn dịch

Các chất chống oxy hoá peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D aphyllum(Roxb.) Fisch.)bao gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione

peroxidase Các axit amin: Ala, Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra rằng peptit DA-P có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy

hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017)

Từ các nghiên cứu trên cho thấy rất cần thiết phải nhân giống loài lan Hạc vỹ phục vụ cho sức khỏe con người cũng như bảo tồn nguồn gen quý

1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh với chi Hoàng thảo (Dendrobium)

Ẩm độ

Độ ẩm thích hợp giúp cho cây được phát triển nhanh hơn hoa tươi và lâu tàn Lan Hoàng thảocũng như đa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong điều kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần độ ẩm khoảng từ 40-60%, vào ban đêm độ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn Loại giá thể

quá ẩm và úng sẽ là điều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobiumvì

có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân (Bùi Thị Thu Hiền, 2009)

Ánh sáng

11

Lan Hoàng thảolà giống ưa sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho giống Lan Hoàng thảolà 70%, vì thế giàn che với độ che sáng 30% dưới đất và 40% ở trên cao với cường độ ánh sáng

từ 15.00030.000 lux rất thích hợp cho sự phát triển của Lan Hoàng thảo

Mùa hè của miền Bắc cường độ ánh sáng mạnh, nhu cầu ánh sáng của lan Hoàng Thảo khoảng 70-80% ánh sáng trực tiếp Trong điều kiện râm mát cây thường yếu, mọng nước, rất dễ nhiễm bệnh về mùa đông cường độ ánh sáng yếu và thời gian chiếu sáng ngắn, để lan Hoàng thảo sinh trưởng và phát triển tốt và ra hoa được thì cần bổ sung ánh sáng bằng cách thắp điện cho vườn lan (Bùi Thị Hiền, 2009)

Dinh dƣỡng

Lan Hoàng thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất định để sinh trưởng và phát triển Tuy không đòi hỏi số lượng lớn nhưng phải đầy đủ các thành phần dinh dưỡng N, P, K và các nguyên tố trung, vi lượng Tuỳ từng giai đoạn sinh trưởng

mà nhu cầu đối với các thành phần dinh dưỡng có khác nhau (Đào Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga, 2008)

Giá thể

Giá thể của Lan Hoàng thảocần chậu phải thật thoáng và không úng nước Tuy nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc giống Lan Hoàng thảocần giá thể hơi ẩm chút ít nhưng không được làm thối căn hành Vì thế một số loài Lan Hoàng thảo có thể phát triển trên các giá thể là xơ dừa hay cả quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể Tuy nhiên nếu giá thể

là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa nguyên phải cưa phần đáy, nếu không cây bị thối vì quá ẩm Cũng có thể trồng cây lan Lan Hoàng thảovới căn hành cách đáy chậu khoảng 3cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành là một số rễ lục bình giặt sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả nhất

đối với các loài Lan Hoàng thảo

1.4Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới

12

Hoa Lan chiếm một phần lớn trong thương mại toàn cầu về trồng hoa trong chậu và hoa cắt cành và ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được thương mại trên thị trường quốc tế Giá trị thương mại trung bình của hoa lan cắt cành từ năm

2007 đến năm 2012 là 483,000,000 $ US Trong năm 2012, trên thế giới đã có hơn

40 nước xuất khẩu hoa lan và 60 nước nhập khẩu hoa lan và tổng giá trị thương

mại toàn cầu là 504,740,644$ US (Nguồn: Department of Foreign Trade, Thailand

(2013); (Jayarama Reddy, 2016)

Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39 67%), tiếp theo Thái Lan (28,41%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%) Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%) và Mỹ (6%) Tổng số lan cắt cành thương mại trên thế giới chủ yếu các loài

lan Dendrobiumchiếm 85% và Phalaenopsis, Cymbidium chiếm 15%

(Cheamuangphan et al, 2013; L.C Deet al., 2014)

Thái Lan là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới của các loài lan nhiệt đới Trung Quốc là nước tiêu thụ lớn nhất của hoa phong lan cắt từ Thái Lan 7493 tấn, theo sau là Nhật Bản, Mỹ, Ý, Ấn Độ, Đài Loan, Việt Nam và Hà Lan tại 4407,

2892, 2395, 1830, 983, 793 và 689 tấn Năm 2012, tại Thái Lan người ta ước tính rằng 46% sản lượng hoa lan đã được tiêu thụ trong nước và 54% được xuất khẩu(

trồng Dendrobium trong chậu lớn tại Hoa Kỳ Giá trị mặt hàng này ở Hawaii đã

được tìm thấy trong nhiều thập kỷ và doanh thu tăng từ 2,4 triệu USD năm 1991

lên 5,6 triệu USD trong năm 2000(L.C De, N.G Debnath Correct, 2011)

Ở Thái Lan có rất nhiều Công ty lớn, sở hữu vài chục ha lan như Công ty Thái Orchid ở Ratchaburi, Công ty Siam Taiyo ở Samut-sakhon Các công ty này ngoài diện tích trực tiếp quản lý 15 – 20ha, họ còn liên kết với các công ty, nông trại nhỏ tạo thành hệ thống vệ tinh; trong đó, họ là hạt nhân trong sản xuất và xuất khẩu Khoảng 60 – 70% sản lượng lan cắt cành của Thái Lan được xuất khẩu đến

38 nước trên thế giới, đạt giá trị 104 triệu USD (2009) Trong đó, xuất khẩu sang

13

Việt nam, trong đó: Dendrobium cắt cành: 22.917.059 cành, Dendrobium trồng chậu: 2.502.178 chậu (Nguồn: Bộ Nông nghiệp & HTX Thái Lan.)

Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium trồng trong chậu hiện tăng

phổ biến đạt 40 đến 50 triệu cây Thái Lan là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới về các loài lan cắt cành nhiệt đới và nhà cung cấp lớn thứ hai vào thị trường EU, chiếm 22% nguồn cung vào thị trường EU Thái Lan nắm giữ một vị thế mạnh

trong sản xuất lan Dendrobium( L.C Deet al,2014)

Theo Weichao Zhang et al.,(2009) trên thị trường các loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ tự nhiên từ lan D.aphyllum, D devonianum và D oYcinale

được bán bán với giá rất cao 2.000-4.000 USD/kg

1.4.2Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm cho nên chủng loại lan rừng rất phong phú, có điều kiện khí hậu thuận lợi có thể thích

hợpphát triển các giống lan thuộc chi Dendrobium, Cattleya, Oncidium Diện tích

trồng hoa lan ở Việt Nam còn ở mức hết sức khiêm tốn, chỉ chiếm 10% diện tích các loại hoa đang được trồng Sản xuất hoa lan ở Việt Nam tập trung theo 2 hướng chính:

- Sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp)

- Khai thác và nuôi trồng các loài hoa lan bản địa (lan rừng)

Lan bản địa (lan rừng) chủ yếu phát triển nhỏ lẻ và được nuôi trồng ở quy

mô hộ gia đình, tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận Xã Đông La,

La Phù, La Khê – Hoài Đức – Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan, đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc và chủ yếu là chi lan Hoàng Thảo Bên cạnh Đông La, một số địa phương như Gia Lâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên) cũng đang có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất

và nuôi trồng phong lan bản địa, với quy mô từ 300- 500m2,…(Hoàng Xuân Lam, 2014)

14

Ở TP Hồ Chí Minh chủ yếu trồng các loài lan (Dendrobium, Mokara, Vanda, Oncidium…) và diện tích khá khiêm tốn, khoảng 200ha, bằng 5,4% so với

hoa Lan Thái

Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu Rau quả, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Ứng dụng công nghệ, trong những năm vừa qua đã tập trung nghiên cứu phương pháp nhân

giống vô tính in vitro Kết quả đã sản xuất mỗi năm được hàng vạn cây con giống

hoa lan có giá trị trong đó có lan Hoàng thảo

Năm 2015 Viện Di truyền Nông nghiệp đã xây dựng mô hình nhân giống

các giống hoa lan Dendrobiumdiện tích 1.000 m2 quy mô 30.000 cây/năm, mô hình sản xuất hoa thương phẩm diện tích 15.000m2, sản xuất được 60.000 cây giống Doanh thu đạt 280 triệu/1.000m2…

Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng Các cơ sở sản xuất hoa lan cũng chỉ đáp ứng được 30 – 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác Hiện nay, mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của Việt Nam

trong thời gian qua là Thái Lan với gần 90% lượng lan cắt cành (Dendrobium) và lan chậu (Cattleya, Oncidium)

Hiện nay, các loài lan Hoảng thảo bản địa đang bị khai thác ồ ạt,

thươngláingườiTrungQuốcthugomvàxuất khẩu theo con đường tiểungạch.Giábán

700-900.000đồng/kg cây tươi

Như vậy, vấn đề sản xuất, kinh doanh, hoa lan ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn ở dạng tiềm năng Trong khi đó, sức cạnh tranh trên thị trường thế giới là rất lớn Những hoạt động kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua chỉ mới có ý nghĩa khởi động, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai dựa trên những điều kiện thuận lợi sẵn có cho sự phát triển ngành trồng lan

1.5 Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium

15

1.5.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium thế giới

Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứu tìm các biện pháp nhân giống, bảo tồn và lưu giữ các loài Lan quí hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng

Dutta et al., (2011) sử dụng hạt của D aphyllum 15 tuần tuổi được nảy mầm trên môi trường MS Hạt giống hình thành protocorm sau 5 tuần nuôi cấy Các PLBs

cho tỷ lệ nảy mầm, số chồi và rễ nhiều hơn trên môi trường MS bổ sung IAA +

KN

Dake Zhao et al., (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm loài lan D wangliangii G.W.Hu, C.L.Long & X.H.Jin Xin Qian et al., (2014) nghiên cứu sản xuất hoa và hạt giống loài lan D officinale Kimura et Migo trong

ống nghiệm đã tạo được calluses từ các đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAA, nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy

trong môi trường MS + 1 mg/l αNAA Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, có khả

năng ra hoa cao (83,2%) với tỷ lệ hoa bình thường 73,6% khi cấy trên môi trường

MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần

Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ

cho rằng môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA giúp cho hạt nảy mầm tốt

trong lúc hệ số nhân protocorm trên môi trường Phytamax + 1 mg/l BA + 1 mg/l αNAA khá cao Đối với loài lan D jerdonianum Wight (Sagaya Mary et al., 2016)

cho rằng môi trường MS thích hợp cho nuôi cấy từ hoa, môi trường KC phù hợp với nuôi cấy từ lá, môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân

Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) kết luận: môi trường Phytamax (PM) có

bổ sung 20 g/l sucro đem lại tỷ lệ hạt nảy mầm loài D palpebra Lindley, cao hơn

so với gluco và fructo Thejaswini et al., (2017) cho rằng nước ép cà chua và nước dứa 15% cho tỷ lệ nảy mầm tốt nhất khi gieo hạt in vitro lan D ovatum (Willd.) Theo Edy Setiti WidaUtami et al., (2017), bổ sung 2 g/l peptone trong môi trường

VW đã được chứng minh là hàm lượng thích hợp cho sự nảy mầm của hạt, hình

thành chồi với sự phát triển của protocorm

Nghiên cứu về nuôi cấy cắt lát mỏng đã được các tác giả thực hiện trên một số

đối tượng: nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D chrysotoxum Lindley(chiều dày 2 mm) Saranjeet Kaur, (2017); Paromik Bhattacharyya et al.,

16

(2018) nhân giống lan D aphyllum(Roxb.) Fisch từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL); Parthibhan et al., (2018) nghiên cứu tái sinh phôi soma được hình thành từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL) của lan D aqueum Lindley

1.5.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống và bảo tồn lan Dendrobium ở Việt

Nam

Ở Việt Nam hiện nay đã có một số tác giả nghiên cứu nhân giống các loài lan Hoàng thảo quý nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen có nguy cơ tuyệt chủng: Nguyễn Thanh Tùng và cs., 2010)đã nuôi cấy những lát mỏng theo chiều ngang

(tTCL) của D aduncum với kích thước khoảng 1,0 - 1,5 mm Lát mỏng tế bào

được cấy lên môi trường tối ưu cảm ứng protocorm - like bodies là môi trường ½

MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho 29,85 protocorm - like bodies/lát mỏng sau 8 tuần nuôi cấy

Nghiên cứu nhân giống lan dược liệu Kim Điệp (D chrysotoxum), Long

nhãn (D Fimbriatum Hook) bằng phương pháp gieo hạt in vitro với mục đích bảo

tồn và phát triển loài lan quý (Nguyễn Văn Song và cs, 2011 ); Nguyễn Thị Sơn và

cs, 2012)

Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), đã nghiên cứu nhân giống gieo

hạt in vitro Lan D.nobile Lindl., sử dụng quả5 tháng tuổi; môi trường gieo hạt là

MS + (10% CW + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít môi trường Trong nhân in vitro kinh điển, môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC+ 10% CW + 10g/l saccharose + 6,0g/l agar; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (10% CW + 10g/l

saccharose + 6,0g/l agar) Trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy lỏng lắc nút bông

và lỏng lắc màng thoáng khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với

nhân in vitro kinh điển Nuôi cấy đặc thoáng khí giúp giảm 25% lượng saccharose

bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm ½ thời gian nhân giống Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE + (10g saccharozase + 0,5g THT)/lít, cường độ ánh sáng 2300lux

Nguyễn Thị Sơn và cs, (2014)nghiên cứu nhân giống bằng gieo hạt in vitro loài lan D officinale trên môi trường VW+ 10% CW + 10g/l sucrose + 6g/l agar +

10% CW, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 10% CW + 20g/l sucrose + 6g/l agar + 60g/l chuối chín Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy

17

đoạn thân mang mắt ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g/l sucrose + 10% CW + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α-NAA + 6g/l agar Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l α-NAA

1.6 Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô

1.6.1 Ảnh hưởng của giá thể

Giá thể có ý nghĩa quan trọng đối với nuôi trồng cây lan, đặc biệt là trong giai đoạn vườm ươm Sử dụng giá thể phù hợp sẽ giữ am giúp cho cây sinh trưởng, phát triển tốt

Nhiều tác giả Trung quốc đã quan tâm nghiên cứu về ảnh hưởng của giá thể

đến sinh trưởng, phát triển của cây lan Dendrobium

Theo Pan Chun-xiang et al.,(2009) các loại giá thể vỏ cây, mùn cưa, gạch

vụn đã ảnh hưởng đến cấu trúc rễ của cây D.chrysanthum Kết quả cho thấy các

cây trồng trên giá thể gạch vụn có số tế bào chóp rễ nhiều hơn và thành của các tế bào nhu mô tủy và nhu mô mạch của rễ lại dày hơn so với trồng trên các loại giá thể khác

Bijaya Pant et al.,(2012) cho răng giái thể thích hợp cho loài lan D primulinum Lindlgiá thể gạch: rêu với tỷ lệ 2: 1 Tỷ lệ cây sống sót đạt 70% ở

ngoài vườn ươm

Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) cho rằng giá thể thích hợp trồng cây con D aphyllumhỗn hợp mảnh gạch , than, xơ dừa và chất khoáng (1: 1:

0,5: 0,5)

Selvaraju Parthibhan et al., (2015) cho rằng trồng cây D aqueum Lindley trên

giá thể mảnh gạch và than củi (1:1), để rêu trên bầu và chụp túi polyethylene giúp làm ẩm, cho cây tỷ lệ cây con sống cao

Abdul Aziz Mirani et al., (2017a) đã nghiên ảnh hưởng các giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của lan D nobileLindley, tác giả cho rằng cây con được cấy

trên môi trường MS + 3 mg/l αNAA, sau đó cây được trồng trên giá thể hỗn hợp than bùn xừa: cát: đá trân châu (1,0: 1,0: 0,2) là tốt nhất cho tỉ lệ sống 100% sau

120 ngày

18

1.6 2 Ảnh hưởng của dinh dưỡng

Trong giai đoạn vườn ươm, cây lan cấy mô được cung cấp dinh dưỡng dưới dạng phun dung dịch phân bón lên toàn bộ bề mặt cây Dinh dưỡng NPK đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của cây lan Ở giai đoạn vườn ươm, cây lan cấy mô được cung cấp dinh dưỡng dưới dạng phun dung dịch phân bón lên toàn bộ bề mặt cây Dwiyani (2012) đã kết luận, sử dụng Hyponex làm

tăng chiều cao cây và số lá của Dendrobium sp

Kabir et al., (2012) đã xác định trên loài lan Dendrobium sp, xu hướng tăng

chiều dài lá, chiều rộng lá, diện tích lá, số lá và tổng diện tích lá là cao nhất khi phun N: P: K với tỷ lệ 10:25:30 phun 1tuần/lần Chiều cao cây và đường kính thân đạt tối đa khi phun dinh dưỡng N: P: K tỷ lệ 15:20:20 phun 1tuần/lần