Báo cáo senimar công nghệ lên men công nghệ sản xuất acetic acid (giấm)

Chúng có khảnăng phân hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại.Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sơn, dượcphẩm, … Đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm, acetic aci

TỔNG QUAN

Giới thiệu chung về vi khuẩn acetic (Acetobacter)

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae

Phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, giấm ăn, rượu, bia, hoa quả… Đặc điểm hình thái:

 Đa số dạng hình que, tuỳ điều kiện nuôi cấy (t o , thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra.

 Vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử

 Kích thước thay đổi tuỳ loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm).

 Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiên mao).

 Có khả năng chịu được độ acid cao.

 Tế bào đứng riêng lẻ hoặc kết thành từng chuỗi. Đặc điểm sinh trưởng:

 Phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-30 o C, pH 5,4-5,8.

 Tính chất đặc trưng của giống Acetobacter là khả năng oxy hóa rượu etylic thành acetic acid ở pH 4,5.

 Nhu cầu dinh dưỡng của giống Acetobacter đối với nguồn C, N và chất sinh trưởng cũng rất đa dạng Giống Acetobacter sử dụng đường, etylic và các acid hữu cơ làm nguồn C, muối amon làm nguồn N.

 Trong quá trình phát triển vi khuẩn Acetobacter có nhu cầu đối với 1 số acid amin như valin, alanin, prolin, isolosine.

 Một số chất kích thích sinh trưởng như acid nicotinine, acid amin, folic và biotin… có vai trò quan trọng trong sinh trưởng.

 Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ một tế bào, sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào.

Giới thiệu chung về giấm - ứng dụng của acetic acid

Giấm là chất lỏng có tính acid, sản xuất từ sự lên men ethanol qua quá trình lên men các nguyên liệu có chứa tinh bột và đường Ethanol là sản phẩm đầu tiên của quá trình lên men đường sau đó bị oxi hóa thành acetic acid bởi vi khuẩn acetic (Acetobacter).

Giấm gạo hay còn gọi là giấm ăn, dùng lương thực như gạo và các loại quả để làm nguyên liệu chính Hàm lượng acetic acid từ 2 – 5% Từ xưa, giấm đã là một gia vị quan trọng được sử dụng nhiều trong nền ẩm thực các nước châu Á, châu Âu.

Giấm hóa học được sản xuất dựa trên nguyên liệu chính là acetic acid tinh luyện, không có các thành phần dinh dưỡng khác Được sử dụng trong công nghiệp luyện kim hoặc sát khuẩn.

Các phương pháp sản xuất Acetic acid

Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp gồm nhiều chất khác nhau, trong đó có acetic acid với hàm lượng rất lớn Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này không còn sử dụng nữa

Dựa trên quá trình oxi hóa acetaldehyde thành acetic acid, có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50-80 o C

Hiện nay, người ta tổng hợp acetic acid từ methanol và CO bằng phản ứng carbonyl hóa

CH3OH + CO -> CH3COOH

Trước tiên, người ta tiến hành quá trình oxi hóa carbohydrate có mạch carbon ngắn như propan hay butan để tạo thành acetaldehyde, formaldehyde, methanol, acetone.

Sau đó acetaldehyde được oxi hóa để tạo thành acetic acid.

Sau đó, người ta trung hòa khối thủy phân này và tiến hành lên men để thu nhận được dung dịch chứa acetic acid

Hiện nay, người ta sản xuất acetic acid chủ yếu bằng phương pháp lên men.

So với những phương pháp khác, phương pháp lên men có nhiều ưu điểm:

Nguyên liệu sản xuất dễ tìm Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước dừa, nước mía, …), có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và cồn công nghiệp

Quy trình sản xuất đơn giản:

 Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường hoặc tinh bột thì gồm 2 giai đoạn chung là: Chuyển hóa đường thành cồn và chuyển cồn thành acetic acid Riêng sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột có thêm giai đoạn đầu là chuyển tinh bột thành đường.

 Nếu sản xuất từ nguyên liệu đã chứa cồn thì chúng ta chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi để vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acetic acid.

Các phương pháp lên men

Lên men acetic acid là quá trình oxi hóa cồn thành acetic acid, nhờ vi khuẩn acetic, trong điều kiện hiếu khí.

Phương trình tổng quát: o C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 117 kcal

Phản ứng này xảy ra trong tế bào vi khuẩn Muốn phản ứng được xảy ra,

C2H5OH và O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào Khi đó các enzyme oxi hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxi hóa rượu tạo CH3COOH CH3COOH được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan trong dung dịch môi trường.

Phương pháp chậm còn gọi là phương pháp Pháp do được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là phương pháp truyền thống của người Pháp

Phương pháp này dùng nước hoa quả làm nguyên liệu với giống vi khuẩn là

Phương pháp này cho hiệu suất thấp, cần thời gian lên men dài nhưng thích hợp cho việc làm giấm ở gia đình hoặc quy mô công ty nhỏ dùng rượu, dịch đường, nước hoa quả, rượu vang kém chất lượng để lên men.

Phương pháp này còn gọi là phương pháp Đức do người Đức thực hiện theo quy mô công nghiệp.

Giống vi sinh vật dùng ở đây là Acetobacter schiitzenbachii hoặc

Acetobacter curvum được nhiễm phoi bào.

Sử dụng các thùng lên men bằng gỗ hình trụ.

Cho hiệu suất cao và giúp tiết kiệm thời gian lên men

1.5.3 Phương pháp lên men chìm kiểu hiện đại

Sử dụng các nồi lên men đặc biệt được thông khí mạnh gọi là Acetator.Chủng vi sinh vật thích hợp là Acetobacter suboxydans.

QUY TRÌNH SẢN XUẤT ACETIC ACID (GIẤM)

Sơ đồ khối

Lọc Lên men Chuẩn bị môi trường

10 - 13 % và các loại nước hoa quả (nếu có)

Hình 2 1 Sơ đồ quy trình sản xuất Acetic acid

Giải thích qui trình

Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho quá trình lên men Việc bổ sung môi trường giúp cung cấp đầy đủ nguồn C, N, khoáng và các yếu tố sinh trưởng cho vi khuẩn Acetobacter sinh trưởng và lên men acid acetic.

 Nguyên liệu dùng để sản xuất là các loại nước hoa quả (chưa hoặc đã lên men rượu), rượu và bia kém chất lượng, các loại dịch đường,

… trong đó nước nho là nguyên liệu sản xuất giấm có chất lượng cao Các loại quả chín được ép lấy nước và các loại dịch đường có lẫn nấm men rượu sẽ xảy ra quá trình lên men rượu, biến các loại đường thành rượu etylic

 Rượu etylic là nguồn nguyên liệu được sử dụng phổ biến trong công nghiệp lên men acetic acid Nồng độ thích hợp là 10 – 13%, trường hợp nồng độ cao hơn sẽ ức chế các giống vi khuẩn Acetobacter phát triển và một phần rượu sẽ không bị oxi hóa thành giấm (acetic acid) khiến thời gian lên men lâu hơn, trường hợp rượu quá thấp sẽ xảy ra hiện tượng oxi hóa triệt để biến giấm thành

 Nguồn carbon ở đây có thể là đường; nguồn nitrogen là các acid amin, peptone hoặc muối amon Các chất khoáng ở dạng muối vô cơ hoặc hợp chất hữu cơ Nước mạch nha, bia, nước quả, dịch nấm men, là những nguồn dinh dưỡng rất tốt với vi khuẩn lên men acetic Nhưng khi sử dụng các nguồn này phải cẩn thận, vì khi dùng với liều lượng quá cao sẽ làm cho vi khuẩn phát triển mạnh, kém khả năng lên men hoặc tạo điều kiện cho các vi sinh vật khác phát triển

 Vật lý: Tăng về thể tích và khối lượng của môi trường lên men.

 Hoá học: Thành phần hoá học của môi trường thay đổi.

Trong sản xuất với quy mô công nghiệp:

 Thiết bị: Tiến hành phối trộn trong các bồn phối trộn làm bằng thép không rỉ.

 Cứ 100 lít cồn tuyệt đối thêm 25g superphosphate, 25g amon sulfate, 0.9g kali carbonat, 500g glucose hoặc dịch đường thủy phân từ tinh bột tính tương đương với lượng glucose Có thể dùng sacrose thay cho glucose

 Trong đó, phosphate và nitơ đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học Glucose đóng vai trò là nguồn cung cấp glucid để cung cấp năng lượng bổ sung cho cơ thể vi sinh vật Ngoài ra, còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào.

Mục đích: Chuyển hóa ethanol thành acid acetic nhờ vi khuẩn Acetobacter.

+ Nhiệt độ: Tăng do quá trình trao đổi chất của vi sinh vật toả nhiệt. + Khối lượng cơ chất giảm, khối lượng sản phẩm tăng.

+ Chuỗi phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào để chuyển hoá rượu thành acid acetic.

+ Sự chuyển hoá rượu thành acid acetic là sự oxy hoá dạng bậc thang Acetaldehyde, chất trung gian chính, được hình thành trước khi sự chuyển hoá thành acid acetic được thực hiện

+ Thành phần các hợp chất trong môi trường thay đổi: Nhận thêm các chất là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi sinh vật trong đó chủ yếu là sự tăng vọt hàm lượng của acid acetic.

Từ đó dẫn đến sự thay đổi pH của môi trường Hàm lượng ethanol và một số hợp chất ban đầu cung cấp cho nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Acetobacter giảm đáng kể.

+ Thành phần không khí thay đổi: Vi sinh vật giải phóng khí

CO2 trong quá trình lên men.

Gia tăng số lượng của vi khuẩn Acetobacter trong quá trình lên men Đồng thời trong giai đoạn đầu của quá trình lên men số lựơng của các vi sinh vật tạp nhiễm cũng gia tăng Nhưng càng về sau khi nồng độ acid acetic trong dịch lên men ngày càng tăng thì một số vi sinh vật tạp nhiễm cũng bị ức chế và giảm số lượng.

Cơ chế phản ứng và bản chất của quá trình lên men Acetic acid:

 Lên men trong điều kiện hiếu khí.

 Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình len men acetic acid là quá trình tách hydro nhờ enzyme dehydrogenase.

 Quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật Trong quá trình lên men giấm, rượu etylic được oxi hóa thành acetic acid Sự tách hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP Hydro liên kết với NADP tạo NADPH2 và được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng Song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn nên gọi là quá trình oxi hóa không hoàn toàn

 Rượu được chuyển hóa thành acetic acid theo quá trình sau:

1 CH3CH2OH + ẵ O2 -> CH3CHO + H2O

2 CH3CHO + H2O -> CH3CH(OH)2

3 CH3CH(OH)2 + ẵ O2 -> CH3COOH + H2O

 Acetic acid tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào vi khuẩn và đi vào môi trường Khi môi trường hết rượu thì acetic acid sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O theo phương trình sau:

CH3COOH + 2O2 -> 2CO2 + 2H2O Đây là quá trình oxi hóa có hại cho quá trình lên men giấm Vì vậy, trong dịch lên men phải còn dư một lượng rượu khoảng 0.3 – 0.5%.

Các điều kiện của quá trình lên men:

 Nồng độ rượu tốt nhất: 10 – 13%

 Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu 30 – 34 o C

 Sự thoáng khí: Quá trình oxi hóa chỉ xảy ra khi vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxi tự do.

 Môi trường: Phải đầy đủ các nguồn C, P, N, … để đảm bảo sự phát triển tốt nhất của vi khuẩn

 Thời gian lên men: 8 – 10 ngày

Mục đích: Bảo quản và hoàn thiện cho sản phẩm.

Dịch sau lên men thu được thường bị nhiễm những vi khuẩn tự do và các kim loại như sắt đồng nhiễm vào từ thiết bị và dụng cụ Những vi khuẩn này có khả năng sử dụng acetic acid tạo ra trong dịch sau lên men làm cơ chất Vì vậy sẽ làm giảm hàm lượng acetic acid thu được, làm giảm hiệu suất quá trình lên men.

Do đó chúng ta cần tiến hành quá trình lọc để loại những chất cặn bẩn, vi sinh vật còn sót lại trong dịch sau lên men.

Mục đích: Khai thác để thu nhận acetic acid có hàm lượng cao hơn.

Thông thường chúng ta sẽ sử dụng phương pháp chưng cất bằng muối vì nó đem lại nhiều ưu điểm.

 Sử dụng muối có khả năng phân ly mạnh làm thay đổi trạng thái cân bằng lỏng – hơi Trong chưng cất có sự tham gia của muối CaCl2 hoặc CH3COONa hiệu suất thu nhận acetic acid thường rất cao.

 Sản phẩm đạt độ tinh khiết cao.

SẢN PHẨM

Phân loại sản phẩm

3.1.1 Giấm trắng (Giấm tinh luyện) Đặc điểm: Giấm trắng được sử dụng rất nhiều để tẩy rửa và khử mùi trong nhà Giấm trắng đã được sản xuất từ quá trình lên men của thực phẩm như: Củ cải đường, khoai tây, mật ong đường Bởi vì được chế biến từ 5% axit axetic loãng và 95% nước nên giấm trắng có mùi khá nồng so với các loại giấm gia vị khác, màu trắng, hương nồng.

Công dụng của giấm trắng:

 Khử mùi tanh của thịt cá, làm đồ chua trộn salad

 Khử mùi hôi trong nhà, phòng ngủ, tẩy rửa các vết bẩn tủ lanh và máy giặt.

 Giấm gạo là loại giấm khá phổ biến được sử dụng nhiều trong lúc chế biến món ăn Giấm gạo được nhiều quốc gia của Châu Á yêu thích như Hàn Quốc, Trung Quốc…và trong đó có cả Việt Nam.

 Người ta sử dụng rượu gạo, rượu nếp để nấu lên, trong quá trình lên men thì sẽ tạo ra giấm gạo nên không có vị nồng như giấm tinh luyện

 Giấm gạo được chế biến từ nhiều loại gạo khác nhau nên có màu sắc khác nhau Nếu được chế biến từ rượu gạo, rượu nếp thì có màu trong suốt, vị chua dịu, không gắt Nếu từ gạo đỏ thì có vị chua nồng hơn giấm trắng Còn làm từ gạo đen thì có vị chua ít nhưng mùi hơi nồng.

Công dụng của giấm gạo:

 Được sử dụng để làm nguyên liệu nêm nếm cho các món ăn về rau củ quả

 Bảo quản thịt, cá bằng cách tẩm giấm gạo rồi gói giấy lại bảo quản

3.1.3 Giấm táo Đặc điểm: Giấm táo được chế biến từ nguyên liệu chính là táo Sau quá trình lên men từ rượu táo thì sẽ biến đổi thành giấm táo nên có độ chua nhẹ, màu vàng nhạc và có mùi vị táo.

Công dụng của giấm táo:

Trong chế biến món ăn

 Dùng làm gia vị tẩm ướp để tăng mùi vị đặc trưng

 Bánh nướng sữ thêm giòn xốp có mùi vị thơm ngon nếu cho thêm chút giấm táo.

 Ngâm chua, rửa rau củ quả được sạch và sáng hơn

 Dùng làm món salad trộn

 Thêm chút giấm táo khi luộc trứng giúp trứng chín và không bị nứt vỏ.

 Trị mụn: pha loang giấm táo với nước rồi bôi lên vùng da bị mụn sẽ làm giảm đi làn da bị mụn.

 Thu nhỏ lỗ chân lông: Thành phần axit trong giấm giúp làm da bạn săn chắc, se khít lỗ chân lông.

 Chăm sóc móng: dùng giấm táo có thể giữ màu móng và bảo vệ móng ta không bị xước, gãy.

 Giảm cân: Pha giấm và nước loãng, uống trước 2-3 lần/ ngày trước khi ăn cùng kết hợp ăn uống sẽ giúp bạn có vóc dáng mơ ước.

 Giấm rượu được chế biến từ các loại rượu như nâu Pháp, vang đỏ, champaigne…Giấm rượu có mùi vị thơm nhẹ, vị chua dịu ngọt nhe

Hình 3.3 Giấm táo được sử dụng rất nhiều trong chế biến nhất là làm ra các nước sốt cho món ăn.

 Mỗi loại giấm rượu đều có hương vị riêng biệt nên được áp dụng cho nhiều món ăn khác nhau Nếu làm nước sốt chấm có mayonnaise thì dùng giấm vang trắng, còn tẩm ướp các loại thịt gà, vịt thì dùng giấm vang đỏ….

Công dụng của giấm rượu: được dùng để làm tăng hương vị trong tẩm ướp cũng như các món ăn về rau

3.1.5 Giấm mạch nha (giấm bia) Đặc điểm:

 Giấm mạch nha thường được sử dụng ở các nước phương Tây Giấm mạch nha được chế biến từ lọại bia không mùi, sản xuất từ việc nảy mầm lúa mạch, biến thành men rượu, tác động lên các vi khuẩn axit axetic có trong rượu rồi tạo thành giấm.

 Trong lúc chế biến, người ta sẽ thêm đường caramel vào để giấm mạch nha có màu nâu đỏ sẫm Giấm mạch nha có vị hơi đắng và thơm mùi chanh nên thường được áp dụng để ngâm chua.

Công dụng của giấm mạch nha: ngâm chua rau củ quả và trái cây.

Hình 3.5 Giấm vang trắng Hình 3.4 Giấm vang đỏ

 Giấm dừa được chế biến từ quá trình lên men của nước dừa, là đặc sản của người Philippines Phải mất gần 8-12 tháng thì giấm dừa mới được hoàn thành chuẩn vị nhất.

 Giấm dừa len men trong thời gian dài nên có nguồn vi khuẩn tự nhiên với nhiều dưỡng chất và vitamin như A, C, Kali rất tốt cho sức khỏe của con người.

 Có có màu trắng đục, vị nhạt

Công dụng của giấm dừa: o Được sử dụng để tăng hương vị cho món ăn o Đối với sức khẻo con người:

 Làn da: ngăn ngừa sự lão hóa da, giảm bớt các làn da bị mụn, nếp nhăn. Mang lại sự căng mịn, sáng bóng cho làn da của bạn.

 Giảm cân: cũng như giấm táo, giấm dừa giúp làm giảm mức độ thèm ăn, lại không chứa nhiều calo nên sẽ giúp bạn giảm cân một cách hiệu quả.

 Tràn đầy năng lượng: giấm dừa có thành phần kích thích khả năng trao đổi chất, chuyển hóa năng lượng từ các chất dinh dưỡng như vitamin B, C bổ sung cho cơ thể một cách tốt nhất.

 Bảo vệ dạ dày: trong giấm dừa có chứa enxyme và các thức ăn lợi khuẩn giúp cân bằng quá trình miễn dịch, kích thích hoạt động hệ tiêu hóa tốt hơn, tạo nên môi trường hoạt động hiệu quả trong dạ dày.

 Kiểm soát đường huyết: axit trong giấm dừa có tác dụng kiểm soát lượng đường huyết nếu tiêu thụ quá nhiều chất đường bột.

 Cải thiện tim: chỉ cần 1-2 muỗng canh giấm dừa mỗi ngày là bạn có thể giảm mỡ bụng và lượng triglyceride làm giảm nguy cơ bị bệnh tim.

Giấm balsamic được chế biến từ quá trình len men tự nhiên của những chùm nho và được ủ từ 12 năm trở lên Ủ càng nhiều thì giấm sẽ có vị ngon, đậm đà hơn. Phải sử dụng 100 lít nước nho tươi thì mới làm ra được 1 lít giấm balsamic nên giá trị của nó rất cao Có vị chua ngọt dịu và màu đen đặc trưng.

Công dụng của giấm balsamic: Tăng hương vị cho món ăn.

Giấm vải là một loại gia vị đến từ thương hiệu Việt Nam Giấm vải được chế biến trong quá trình lên men tự nhiên của hai nguyên liệu chính là vải và mật ong. Giấm vải có mùi thơm nhẹ tự nhiên cùng độ chua dịu của vại nên được sử dụng khá nhiều trong chế biến món ăn.

Công dụng của giấm vải

Tăng hương vị cho các món ăn Đối với sức khỏe

Chất lượng giấm thành phẩm đạt tiêu chuẩn

Dịch trong suốt, không bị mờ đục, không cặn, không có dịch nhày và lươn giấm.

Màu sắc: Không màu hoặc màu vàng nhẹ

Mùi vị: Mùi đặc trưng của giấm làm từ rượu, không có mùi chua, hắc, mùi kim loại, …

Không chứa các acid vô cơ tự do, không chứa phẩm màu.

BÀI BÁO KHOA HỌC

Bảng 4 1 Bài báo khoa học

Tên bài báo Mixed culture of Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter pasteurianus for acetic acid production

Nhóm tác giả Zhi Wang, Mei Yan, Xiong Chen, Dongsheng Li, Li Qin,

Zhijun Li, Juan Yao, Xinle Liang

Link bài báo https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/

%3Dihub&fbclid=IwAR0QKZl2LbYoBwECHdBQr52bNPKU apbZ2AGeG7ei9n8uaY13_xpEPLK246M

Hình 4.1 Sơ đồ quy trình sản xuất Acetic acid từ nấm men Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter pasteurianus

Chuẩn bị nguyên liệu: Vi khuẩn Acetobacter pasteurianus và

Saccharomyces cerevisiae được lấy từ Trung tâm nghiên cứu

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường nuôi cấy Acetobacter pasteurianus chứa: ehtanol 4% (v/v), chiết suất nấm men 1%, MgSO4.7H2O, K2HPO4 0.1%

+ Môi trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae chứa: glucose 9%, chiết suất nấm men 1%, MgSO4.7H2O 0.02%, natri glutamate 0.4%

+ Acetobacter được cấy vào bình 250 mL chứa 50 mL seedmedium, được nuôi cấy tĩnh ở 30 0 C trong 48h Sau đó, cấy ra bình 1000 mL chứa 500 mL môi trường seedmedium nuôi cấy tĩnh 30 0 C trong 48h  Acetobacter mẫu có thể sử dụng cho các đợt nuôi cấy mẫu tiếp theo.

+ 3% gulucose và 2% Saccharomyces cerevisiae nuôi cấy trong bể khuấy ở

30 0 C từ 30-50 phút, khuấy ở tốc độ 100 vòng/phút cho đến khi xuất hiện bọt khí  Saccharomyces cerevisiae mẫu có thể sử dụng cho các đợt nuôi cấy tiếp theo.

Nuôi cấy trong bể khuấy: gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu tiên: Sự phát triển của S cerevisiae và sản xuất ethanol, nhiệt độ lên men và tốc độ sục khí được kiểm soát ở 32 0 C.

+ Giai đoạn 2: S cerevisiae đã phát triển ở giai đoạn đầu tiếp tục đem nuôi cấy cùng với A pasteurianus nhiệt độ lên men và tốc độ sục khí được kiểm soát ở 34 0 C.

+ Giai đoạn 3: Sau khi A pasteurianus phát triển đem lên men để sản xuất acid acetic ở nhiệt độ và tốc độ sục khí được kiểm soát ở 32 0 C.

Thu được sản phẩm acid acetic.

Kết luận: Đối với phương pháp nuôi cấy hỗn hợp này có thể rút ngắn thời gian lên men, giảm tổn thất lên men và tăng sản lượng acid acetic.

Quá trình lên men truyền thống để sản xuất giấm bao gồm ba quá trình độc lập, bao gồm đường hóa gạo hoặc các nguyên liệu tinh bột khác bằng các enzyme có sẵn từ nấm mốc, lên men ethanol bằng nấm men và lên men acid acetic bằng acetobacter Trên thực tế, ba vi sinh vật khác nhau, chẳng hạn như nấm mốc, nấm men và acetobacter được sử dụng trong các giai đoạn sinh hóa độc lập này để hoàn thành quá trình đường hóa tinh bột, lên men ethanol và lên men acid acetic Ba quy trình hóa học sinh học này có các điều kiện tối ưu khác nhau, dẫn đến việc quản lý quy trình phức tạp và lâu dài trong sản xuất.