Ức chế enzym tiêu hoáXác định hàm lượng phenolic tổngNguyên tắc: Hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteuhỗn hợp của oxyde tungsten và molybdenum để tạo thành hợp chất
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Môn học: THỰC HÀNH CÁC KỸ THUẬT TIÊN TIẾN TRONG CHẾ BIẾN VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
GVHD: TS NGIYỄN MINH HẢI
HỌC VIÊN:
MAI LONG KHÁNH
PHẠM TUẤN ANH
VÕ TUẤN PHÚC
LỚP: CH21TP01
TP.HCM, ngày 24 tháng 10 năm 2022
Trang 2I MÔ TẢ THÍ NGHIỆM:
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly của LÁ VỐI
Thí nghiệm 1: Chọn và khảo sát chọn dung môi
Thông số khảo sát:
Chọn dung môi là Ethanol và có các giá trị nồng độ thay đổi lần lượt là 0; 20%; 40%; 60%; 80% và 90%
Thông số cố định
- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi: 2: 40
- Nhiệt độ: 50oC
- Thời gian: 30 phút
Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ trích ly tối ưu
Thông số khảo sát: nhiệt độ được thay đổi lần lượt là 50; 60; 70; 80 và 90 độ C Thông số cố định
- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi: 2:40
- Nồng độ dung môi: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 1
- Thời gian: 30 phút
Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian trích ly tối ưu
Thông số khảo sát: thời gian được thay đổi lần lượt là 0; 15; 30; 45; 60; 75 phút Thông số cố định
- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi: 2:40
- Nồng độ dung môi: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 1
- Nhiệt độ: được chọn từ kết quả của thí nghiệm 2
Thí nghiệm 4: Công suất sóng siêu âm
Thông số khảo sát: công suất sóng siêu âm 900W ở các chế độ 0; 20%; 40%;
60%; 80% và 100%
Thông số cố định
- Tỷ lệ nguyên liệu dung môi: 2:40
- Thời gian xử lý siêu âm: 1 phút
- Thời gian, nhiệt độ và dung môi được cố định ở thí nghiệm 1-2-3
Trang 3Thí nghiệm 5: Thời gian xử lý siêu âm
Thông số khảo sát: thời gian xử lý siêu âm: 0; 30; 45; 60; 90 và 120 giây
Thông số cố định:
- Tỷ lệ nguyên liệu dung môi: 2:40
- Công suất sóng: ở thí nghiệm 4
- Thời gian, nhiệt độ và dung môi được cố định ở thí nghiệm 1-2-3
Hàm mục tiêu chung: Hàm lượng phenolic tổng
1. Hoạt tính chống oxy hóa
2. Khả năng kháng khuẩn
3. Ức chế enzym tiêu hoá
Xác định hàm lượng phenolic tổng
Nguyên tắc: Hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteu
(hỗn hợp của oxyde tungsten và molybdenum) để tạo thành hợp chất có màu xanh Cường độ đậm của màu tỉ lệ thuận với nồng độ phenolic có trong mẫu Sử dụng phương pháp so màu, đo độ hấp thu bước sóng 760
nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo Acid gallic, ta suy ra được hàm lượng tổng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích
Chuẩn bị hóa chất
1. Thuốc thử Folin- Ciocalteur
2. Acid gallic
3. Na2CO3: pha thành dung dịch 7%
4. Dung dịch acid gallic stock: hòa tan 0.5g acid gallic trong nước cất và định mức lên 100mL
Dựng đường chuẩn
Pha dung dịch chuẩn acid gallic ở các nồng độ: 20; 40; 60; 80;
100 ppm Cho 0.5 mL nước cất vào ống nghiệm
Thêm 125 µL dung dich acid gallic và 125 µL thuốc thử Folin- Ciocalteur, lắc đều
Sau 6 phút, thêm 1.25 mL dung dịch Na2CO3 7% và 1 mL nước cất vào ống nghiệm Để ở nhiệt độ phòng trong bóng tối trong 90 phút
Mẫu trắng thực hiện tương tự như trên, nhưng thay dung dịch acid gallic bằng nước cất Đo độ hấp thụ ở 760 nm
Dựng đường chuẩn của độ hấp thụ A theo nồng độ acid gallic chuẩn
Tiến hành phân tích
Các bước thực hiện tương tự như trên, nhưng thay 125 µL mẫu (đã được
Trang 4pha loãng theo tỷ lệ thích hợp) cho dung dịch acid gallic.
Sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 760 nm
Tính toán: từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được hàm lượng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích
Trang 5Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)
Nguyên tắc: Gốc tự do DPPH• (màu tím) bị khử thành hydrazine (màu
vàng) khi nó phản ứng với những chất cho hydro (chất chống oxy hóa)
DPPH• (màu tím) + H-A → DPPH-H (màu vàng) + A•
DPPH là gốc tự do bền ở nhiệt độ phòng, có thể nhận một điện tử hay gốc hydro để trở thành phân tử bền Vì DPPH có một điện tử lẻ nên có màu tím đậm trong MeOH và hấp thu mạnh ở bước sóng cực đại 515 nm
Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch DPPH 150 μM: hòa tan 0.0059g DPPH với methanol và định mức lên 100
mL
Vitamin C dạng khan
Dựng đường chuẩn
Pha dung dịch chuẩn Vitamin C bằng methanol ở các nồng độ: 200; 400; 600; 800;
1000 μM
Cho 150 μL dung dịch Vitamin C vào ống nghiệm
Thêm 2.85 mL dung dịch DPPH vào ống nghiệm, lắc đều Để ở nhiệt độ phòng trong
bóng tối trong 30 phút
Mẫu chuẩn thực hiện tương tự như trên, nhưng thay dung dịch Vitamin C bằng methanol
Mẫu trắng là methanol
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm
Dựng đường chuẩn của phần trăm bất hoạt (% I) theo nồng độ chuẩn
Tiến hành phân tích
Cho 150 μL mẫu (được pha loãng theo tỷ lệ thích hợp) vào ống nghiệm thay cho dung
dịch chuẩn Vitamin C, các bước tiếp theo thực hiện tương tư như trên Sau đó đo
độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm
Tính toán
Phần trăm bất hoạt DPPH:
Trong đó: Achuẩn: độ hấp thu của mẫu chuẩn Amẫu: độ hấp thu của mẫu
Từ đồ thị đường chuẩn, ta xác định được hoạt tính chống oxy hóa của mẫu
Thí nghiệm 7: Xác định tham số động học của enzyme amyloglucosidase:
Trang 6a Hóa chất sử dụng
- Dung dịch đệm acetate pH 4,5: pha chế dung dịch có nồng độ 6,8 mg/mL CH3COONa.3H2O bằng nước cất và hiệu chỉnh về pH 4,5 bằng HCl 1M
- NaOH 0,1 N
- Tinh bột 1%: cân chính xác 1g tinh bột vào 50 mL dung dịch đệm pH 4,5, hồ hóa hoàn toàn bằng cách khuấy liên tục ở nhiệt độ 80-90 oC, định mức thành 100 mL với đệm acetate pH 4,5
- Enzyme amyloglucosidase: AMG 300L pha loãng 100X
- Bộ kit xác định glucose GOD-PAP
b Quy trình thực nghiệm
- Pha loãng tinh bột 1% thành dãy nồng độ như sau: 0%; 0,0333333%; 0,05%; 0,0666666%; 0,1% và 0,2%
- Mỗi nồng độ hút ra 10 mL để làm phản ứng enzyme - Ổn nhiệt trong bể lắc 55 oC
- Bổ sung vào mỗi mẫu 100 μL enzyme đã pha loãng
- Cho thực hiện phản ứng, tại các thời điểm 3, 5 và 7 phút lần lượt hút trong mỗi mẫu phản ứng ra 0,5 mL và cho vào eppendorf có chứa sẵn 0,5 mL dung dịch NaOH 0,1N để làm dừng phản ứng enzyme
- Xác định hàm lượng đường sinh ra bằng bộ kit Glucose GOD-PAP
- Dựa vào lượng đường sinh ra, xác định vận tốc phản ứng tức thời tại mỗi thời điểm tương ứng với các nồng độ tinh bột khác nhau Xác định vận tốc phản ứng ở thời điểm ban đầu
- Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa 1/V và 1/S bằng cách sử dụng phần mềm Excel với đồ thị XY Scatter không có điểm uốn (linear)
- Xác định được VMax và KM
b Xác định hàm lượng đường glucose bằng phương pháp GOD-PAP
Glucose sẽ được oxy hóa đặc hiệu bởi enzyme Glucose Oxidase (GOD) thành gluconate và H2O2 Sự xuất hiện của H2O2 được phát hiện bằng hợp chất nhận O2 là phenol và 4- Aminophenazone (4-AP), phản ứng này hình thành nên hợp chất quinone có màu đỏ Hàm lượng đường glucose sẽ được xác định bằng cách
so sánh cường độ màu của mẫu với cường độ màu của một mẫu đường đã biết nồng độ bằng cách đo độ hấp thu ánh sáng của phức màu ở bước sóng 505nm
Cách xác định hàm lượng đờng trong mẫu được thực hiện như sau:
Trang 7Lắc đều, để ổn định ở 37oC trong 10 phút hoặc 20 phút ở nhiệt độ phòng Sử dụng máy quang phổ hấp thu đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 505 nm Màu của mẫu ổn định ở 37 oC trong 15-20 phút sau đó sẽ giảm chậm Cách tính hàm lượng đường glucose trong mẫu:
Cglucose=Amẫu*Cchuẩn/Achuẩn
Cglucose: hàm lượng đường glucose (g/L) trong mẫu đo
Amẫu: độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 505 nm của mẫu cần đo
Cchuẩn: Hàm lượng đường glucose chuẩn (1 g/L)
Achuẩn: độ hấp thu ở bước sóng 505 nm của mẫu đường glucose chuẩn
II.BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM:
1 Xây dựng đường chuẩn:
DPPH
Trung
20,72
400 0,707 0,709 0,708 0,708 46,36
600 0,477 0,472 0,473 0,475 64,05
88,08
1000 0,084 0,087 0,088 0,086
Trang 893,46
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
-
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
f(x) = 0.0935984848484849 x + 6.37626262626265 R² = 0.967694803573918
Chart Title
Phenolic tổng
Trung bình
Trang 910 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
f(x) = 0.00340166666666667 x + 0.0192999999999998 R² = 0.984077326147397
Chart Title
2. Kết quả khảo sát thông số để chọn nồng độ dung môi:
Phenolic tổng
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
Chart Title
DPPH
Trang 10C dm Lần 1 Lần 2 Lần 3
Trung
0 0,785 0 0,695 0,740
18,23
20 0,67 0,602 0,686 0,653
27,88
40 0,644 0,601 0 0,623
31,22
60 0,586 0,596 0,713 0,632
30,20
80 0,738 0,741 0,825 0,768
15,14
90 0,823 0,779 0 0,801
11,49
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
Chart Title
Chọn dung môi ở 40% là dung môi tối ưu để trích ly Lá vối
3 Kết quả khảo sát chọn thông số nhiệt độ:
DPPH
Trung
Trang 1140 1,223 1,25 1,24 1,232
20,75
23,87
60 1,202 1,143 1,138 1,173 24,55
70 1,153 1,109 1,21 1,157 25,53
27,05
24,71
30 40 50 60 70 80 90 100
-
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
Chart Title
Phenolic tổng
Trang 1290 0,196 0,177 0,184 0,187
30 40 50 60 70 80 90 100 0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0.180
0.200
Chart Title
Chọn nhiệt độ 80 độ là tối ưu để trích ly Lá vối
4 Kết quả khảo sát chọn thời gian:
Phenolic tổng
Trung bình
Trang 130 10 20 30 40 50 60 70 80 0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
Chart Title
DPPH
Trung
-
15 0,116 0,109 0,118 0,114 94,43
30 0,068 0,085 0,113 0,077 96,28
94,34
95,25
94,50
Trang 140 10 20 30 40 50 60 70 80
-
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
Chart Title
Chọn thời gian 30 phút là tối ưu để trích ly Lá vối
5 Khảo sát công suất Vi sóng:
DPPH
Vi sóng
Trung
7,25
7,63
14,56
60 1,254 1,234 1,175 1,221 22,38
80 1,111 1,173 0 1,142 27,40
22,63
Trang 150 20 40 60 80 100 120
-
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
f(x) = 0.205794205794205 x + 6.68422486604307
R² = 0.828817422295682
Chart Title
Phenolic tổng
Trung bình
0 20 40 60 80 100 120 0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0.400
Chart Title
Trang 16 Chọn công suất Vi sóng là 80% (900W) là tối ưu để trích ly Lá vối
6 Khảo sát thời gian Vi sóng:
DPPH
30 1,686 1,634 0 1,660 17,54
11,28
21,29
9,31
5,54
20 40 60 80 100 120 140
-
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
f(x) = − 0.127975629671503 x + 21.8208797985508 R² = 0.529483312010265
Chart Title
Phenolic tổng
Trang 1720 40 60 80 100 120 140
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
Chart Title
Chọn thời gian của Vi sóng là 60s, tối ưu để trích ly Lá vối
7 Động học của enzyme amyloglucosidase:
8. Kết quả khả năng kháng khuẩn của Phenolic trong Lá vối so với Cồn 40 độ với kháng sinh:
Kết luận: Khảo sát sau 03 ngày thì Vi Khuẩn E.coli phát triển mạnh ở vị trí của Kháng Sinh và rất ít ở 02 Mẫu và hầu như không xuất hiện ở vị trí cồn 40 độ