Báo cáo thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly của lá vối thí nghiệm 1 chọn và khảo sát chọn dung môi

Ức chế enzym tiêu hoáXác định hàm lượng phenolic tổngNguyên tắc: Hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin-Ciocalteuhỗn hợp của oxyde tungsten và molybdenum để tạo thành hợp chất

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ SÀI GỊN KHOA: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Môn học: THỰC HÀNH CÁC KỸ THUẬT TIÊN TIẾN TRONG CHẾ BIẾN VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM BÁO CÁO THÍ NGHIỆM GVHD: TS NGIYỄN MINH HẢI HỌC VIÊN: MAI LONG KHÁNH PHẠM TUẤN ANH VÕ TUẤN PHÚC LỚP: CH21TP01 TP.HCM, ngày 24 tháng 10 năm 2022 I MƠ TẢ THÍ NGHIỆM: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới q trình trích ly LÁ VỐI Thí nghiệm 1: Chọn khảo sát chọn dung môi Thông số khảo sát: Chọn dung mơi Ethanol có giá trị nồng độ thay đổi 0; 20%; 40%; 60%; 80% 90% Thông số cố định - Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 2: 40 - Nhiệt độ: 50oC - Thời gian: 30 phút Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ trích ly tối ưu Thơng số khảo sát: nhiệt độ thay đổi 50; 60; 70; 80 90 độ C Thông số cố định - Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 2:40 - Nồng độ dung môi: chọn từ kết thí nghiệm - Thời gian: 30 phút Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian trích ly tối ưu Thông số khảo sát: thời gian thay đổi 0; 15; 30; 45; 60; 75 phút Thông số cố định - Tỉ lệ nguyên liệu dung môi: 2:40 - Nồng độ dung môi: chọn từ kết thí nghiệm - Nhiệt độ: chọn từ kết thí nghiệm Thí nghiệm 4: Cơng suất sóng siêu âm Thơng số khảo sát: cơng suất sóng siêu âm 900W chế độ 0; 20%; 40%; 60%; 80% 100% Thông số cố định - Tỷ lệ nguyên liệu dung môi: 2:40 - Thời gian xử lý siêu âm: phút - Thời gian, nhiệt độ dung mơi cố định thí nghiệm 1-2-3 Thí nghiệm 5: Thời gian xử lý siêu âm Thông số khảo sát: thời gian xử lý siêu âm: 0; 30; 45; 60; 90 120 giây Thông số cố định: - Tỷ lệ nguyên liệu dung mơi: 2:40 - Cơng suất sóng: thí nghiệm - Thời gian, nhiệt độ dung môi cố định thí nghiệm 1-2-3 Hàm mục tiêu chung: Hàm lượng phenolic tổng Hoạt tính chống oxy hóa Khả kháng khuẩn Ức chế enzym tiêu hoá Xác định hàm lượng phenolic tổng Nguyên tắc: Hợp chất phenolic bị oxy hóa thuốc thử Folin-Ciocalteu (hỗn hợp oxyde tungsten molybdenum) để tạo thành hợp chất có màu xanh Cường độ đậm màu tỉ lệ thuận với nồng độ phenolic có mẫu Sử dụng phương pháp so màu, đo độ hấp thu bước sóng 760 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo Acid gallic, ta suy hàm lượng tổng hợp chất phenolic có mẫu phân tích Chuẩn bị hóa chất Thuốc thử Folin- Ciocalteur Acid gallic Na2CO3: pha thành dung dịch 7% Dung dịch acid gallic stock: hòa tan 0.5g acid gallic nước cất định mức lên 100mL Dựng đường chuẩn Pha dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ: 20; 40; 60; 80; 100 ppm Cho 0.5 mL nước cất vào ống nghiệm Thêm 125 µL dung dich acid gallic 125 µL thuốc thử Folin- Ciocalteur, lắc Sau phút, thêm 1.25 mL dung dịch Na2CO3 7% mL nước cất vào ống nghiệm Để nhiệt độ phịng bóng tối 90 phút Mẫu trắng thực tương tự trên, thay dung dịch acid gallic nước cất Đo độ hấp thụ 760 nm Dựng đường chuẩn độ hấp thụ A theo nồng độ acid gallic chuẩn Tiến hành phân tích Các bước thực tương tự trên, thay 125 µL mẫu (đã pha lỗng theo tỷ lệ thích hợp) cho dung dịch acid gallic Sau đo độ hấp thụ bước sóng 760 nm Tính tốn: từ đồ thị đường chuẩn ta xác định hàm lượng hợp chất phenolic có mẫu phân tích Xác định hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DPPH (1,1- diphenyl-2- picrylhydrazyl) Nguyên tắc: Gốc tự DPPH• (màu tím) bị khử thành hydrazine (màu vàng) phản ứng với chất cho hydro (chất chống oxy hóa) DPPH• (màu tím) + H-A → DPPH-H (màu vàng) + A• DPPH gốc tự bền nhiệt độ phịng, nhận điện tử hay gốc hydro để trở thành phân tử bền Vì DPPH có điện tử lẻ nên có màu tím đậm MeOH hấp thu mạnh bước sóng cực đại 515 nm Chuẩn bị hóa chất Dung dịch DPPH 150 μM: hòa tan 0.0059g DPPH với methanol định mức lên 100 mL Vitamin C dạng khan Dựng đường chuẩn Pha dung dịch chuẩn Vitamin C bằng methanol ở nồng độ: 200; 400; 600; 800; 1000 μM Cho 150 μL dung dịch Vitamin C vào ống nghiệm Thêm 2.85 mL dung dịch DPPH vào ống nghiệm, lắc đều Để ở nhiệt độ phịng bóng tới 30 phút Mẫu chuẩn thực hiện tương tự như trên, nhưng thay dung dịch Vitamin C bằng methanol Mẫu trắng methanol Đo độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm Dựng đường chuẩn của phần trăm bất hoạt (% I) theo nồng độ chuẩn Tiến hành phân tích Cho 150 μL mẫu (được pha lỗng theo tỷ lệ thích hợp) vào ớng nghiệm thay cho dung dịch chuẩn Vitamin C, bước tiếp theo thực hiện tương tư như Sau đo độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm Tính tốn Phần trăm bất hoạt DPPH: Trong đó: Ach̉n: độ hấp thu của mẫu chuẩn Amẫu: độ hấp thu của mẫu Từ đồ thị đường chuẩn, ta xác định được hoạt tính chớng oxy hóa của mẫu Thí nghiệm 7: Xác định tham số động học của enzyme amyloglucosidase: a Hóa chất sử dụng - Dung dịch đệm acetate pH 4,5: pha chế dung dịch có nồng độ 6,8 mg/mL CH3COONa.3H2O bằng nước cất và hiệu chỉnh về pH 4,5 bằng HCl 1M - NaOH 0,1 N - Tinh bột 1%: cân chính xác 1g tinh bột vào 50 mL dung dịch đệm pH 4,5, hồ hóa hoàn toàn bằng cách khuấy liên tục ở nhiệt độ 80-90 oC, định mức thành 100 mL với đệm acetate pH 4,5 - Enzyme amyloglucosidase: AMG 300L pha loãng 100X - Bộ kit xác định glucose GOD-PAP b Quy trình thực nghiệm - Pha loãng tinh bột 1% thành dãy nồng độ như sau: 0%; 0,0333333%; 0,05%; 0,0666666%; 0,1% và 0,2% - Mỗi nồng độ hút 10 mL để làm phản ứng enzyme - Ổn nhiệt bể lắc 55 oC - Bổ sung vào mỗi mẫu 100 μL enzyme đã pha loãng - Cho thực hiện phản ứng, tại các thời điểm 3, và phút lần lượt hút mỗi mẫu phản ứng 0,5 mL và cho vào eppendorf có chứa sẵn 0,5 mL dung dịch NaOH 0,1N để làm dừng phản ứng enzyme - Xác định hàm lượng đường sinh bằng bộ kit Glucose GOD-PAP - Dựa vào lượng đường sinh ra, xác định vận tốc phản ứng tức thời tại mỗi thời điểm tương ứng với các nồng độ tinh bột khác Xác định vận tốc phản ứng ở thời điểm ban đầu - Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa 1/V và 1/S bằng cách sử dụng phần mềm Excel với đồ thị XY Scatter không có điểm uốn (linear) - Xác định được VMax và KM b Xác định hàm lượng đường glucose bằng phương pháp GOD-PAP Glucose sẽ được oxy hóa đặc hiệu bởi enzyme Glucose Oxidase (GOD) thành gluconate và H2O2 Sự xuất hiện của H2O2 được phát hiện bằng hợp chất nhận O2 là phenol và 4- Aminophenazone (4-AP), phản ứng này hình thành nên hợp chất quinone có màu đỏ Hàm lượng đường glucose sẽ được xác định bằng cách so sánh cường độ màu của mẫu với cường độ màu của một mẫu đường đã biết nồng độ bằng cách đo độ hấp thu ánh sáng của phức màu ở bước sóng 505nm Cách xác định hàm lượng đờng mẫu được thực hiện như sau: Lắc đều, để ổn định ở 37oC 10 phút hoặc 20 phút ở nhiệt độ phòng Sử dụng máy quang phổ hấp thu đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 505 nm Màu của mẫu ổn định ở 37 oC 15-20 phút sau đó sẽ giảm chậm Cách tính hàm lượng đường glucose mẫu: Cglucose=Amẫu*Cchuẩn/Achuẩn Cglucose: hàm lượng đường glucose (g/L) mẫu đo Amẫu: độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 505 nm của mẫu cần đo Cchuẩn: Hàm lượng đường glucose chuẩn (1 g/L) Achuẩn: độ hấp thu ở bước sóng 505 nm của mẫu đường glucose chuẩn II.BÁO CÁO KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM: Xây dựng đường chuẩn: DPPH C 1,32 Trung C dm Lần Lần Lần bình % 200 1,048 1,045 1,045 1,047 20,72 400 0,707 0,709 0,708 0,708 46,36 600 0,477 0,472 0,473 0,475 64,05 800 0,158 0,158 0,156 0,157 88,08 1000 0,084 0,087 0,088 0,086 93,46 100.00 Chart Title 900 1000 1100 90.00 80.00 f(x) = 0.0935984848484849 x + 6.37626262626265 70.00 R² = 0.967694803573918 60.00 50.00 200 300 400 500 600 700 800 40.00 30.00 20.00 10.00 - 100 Phenolic tổng C dm Lần Lần Lần Trung 20 0,07 0,072 0,071 bình 40 0,175 0,177 0,174 0,071 60 0,226 0,227 0,228 0,175 80 0,293 0,292 0,293 0,227 100 0,35 0,353 0,353 0,293 0,352 Chart Title 0.400 0.350 f(x) = 0.00340166666666667 x + 0.0192999999999998 0.300 R² = 0.984077326147397 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Kết khảo sát thông số để chọn nồng độ dung môi: Phenolic tổng Lần Lần Lần Trung 20 0,132 0,142 0,161 bình 40 0,181 0,172 0,191 0,147 60 0,201 0,206 0,183 0,181 80 0,171 0,18 0,179 0,204 90 0,136 0,135 0,149 0,177 0,162 0,125 0,127 0,140 0.250 0,144 Chart Title 0.200 0.150 0.100 0.050 0.0000 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 DPPH 0,905 C C dm Lần Lần Lần Trung % 0,785 0,695 bình 18,23 0,67 0,686 27,88 20 0,644 0,602 0,740 31,22 40 0,586 0,601 0,713 30,20 60 0,738 0,596 0,825 0,653 15,14 80 0,823 0,741 11,49 90 0,779 0,623 0,632 0,768 0,801 Chart Title 35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 - 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100  Chọn dung môi 40% dung mơi tối ưu để trích ly Lá vối Kết khảo sát chọn thông số nhiệt độ: DPPH C 1,554 Trung Lần Lần Lần bình % 40 1,223 1,25 1,24 1,232 20,75 1,183 23,87 50 1,19 1,189 1,17 1,173 24,55 1,157 25,53 60 1,202 1,143 1,138 1,134 27,05 1,170 24,71 70 1,153 1,109 1,21 80 1,122 1,205 1,074 90 1,14 1,2 1,09 Chart Title 30.00 60 70 80 90 100 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 -30 40 50 Phenolic tổng Lần Lần Lần Trung bình 40 0,11 0,118 0,134 0,121 50 0,139 0,137 0,14 0,139 60 0,151 0,144 0,153 0,148 70 0,169 0,149 0,159 80 0,166 0,185 0,167 0,173 90 0,196 0,177 0,184 0,187 Chart Title 0.200 0.180 0.160 0.140 0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.00030 40 50 60 70 80 90 100  Chọn nhiệt độ 80 độ tối ưu để trích ly Lá vối Kết khảo sát chọn thời gian: Phenolic tổng T Lần Lần Lần Trung bình 0,000 1,339 15 1,359 1,294 1,365 1,491 1,376 30 1,554 1,427 1,383 1,429 1,449 45 1,39 1,376 1,375 60 1,487 1,416 1,383 75 1,38 1,518 1,38 Chart Title 1.600 10 20 30 40 50 60 70 80 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.0000 DPPH 2,054 Trung C Lần Lần Lần bình % 15 0,116 0,000 - 30 0,068 0,109 0,118 45 0,119 0,085 0,113 0,114 94,43 60 0,086 0,117 0,113 75 0,107 0,077 96,28 0,12 0,1 0,122 0,097 0,116 94,34 0,098 95,25 0,113 94,50 Chart Title 120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 - 10 20 30 40 50 60 70 80  Chọn thời gian 30 phút tối ưu để trích ly Lá vối Khảo sát cơng suất Vi sóng: DPPH 1,573 Trung Lần C Lần Lần bình % Vi sóng % 1,545 1,373 1,459 7,25 20 1,43 1,476 1,453 1,453 7,63 40 1,382 1,306 1,18 1,344 14,56 60 1,254 1,234 1,175 1,221 22,38 80 1,111 1,173 1,142 27,40 100 1,225 1,209 1,217 22,63 Chart Title 80 100 120 30.00 f(x) = 0.205794205794205 x + 6.68422486604307 25.00 R² = 0.828817422295682 20.00 15.00 10.00 5.00 - 20 40 60 Phenolic tổng Công suất (%) Lần Lần Lần Trung 0,11 0,106 0,124 bình 20 0,073 0,103 0,102 0,113 40 0,112 0,143 0,115 0,093 60 0,114 0,123 0,108 0,128 80 0,134 0,122 0,88 0,116 0,123 0,113 0,08 0,379 100 0,118 Chart Title 0.400 0.350 40 60 80 100 120 0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.0000 20  Chọn công suất Vi sóng 80% (900W) tối ưu để trích ly Lá vối Khảo sát thời gian Vi sóng: DPPH C 2,013 Trung T (s) Lần Lần Lần bình % 30 1,686 1,634 1,660 17,54 45 1,778 1,794 1,786 11,28 60 1,603 1,566 1,585 21,29 90 1,787 1,864 1,826 9,31 120 1,808 1,995 1,902 5,54 25.00 Chart Title 20.00 f(x) = − 0.127975629671503 x + 21.8208797985508 15.00 R² = 0.529483312010265 10.00 5.00 -20 40 60 80 100 120 140 Phenolic tổng T (s) Lần Lần Lần Trung bình 30 0,11 0,115 0,113 45 0,124 60 0,116 0,122 0,131 0,127 90 0,131 0,124 0,122 0,132 0,124 120 0,12 0,115 Chart Title 0.140 0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.00020 40 60 80 100 120 140  Chọn thời gian Vi sóng 60s, tối ưu để trích ly Lá vối Động học của enzyme amyloglucosidase: Kết khả kháng khuẩn Phenolic Lá vối so với Cồn 40 độ với kháng sinh: Kết luận: Khảo sát sau 03 ngày Vi Khuẩn E.coli phát triển mạnh vị trí Kháng Sinh 02 Mẫu khơng xuất vị trí cồn 40 độ