Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa dạ yến thảo petunia hybrid

Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo .... 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Thí nghiệm đƣợc nghiên cứ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÁI SINH CHỒI IN VITRO TỪ ĐOẠN THÂN MANG

MẮT NGỦ CỦA HOA DẠ YẾN THẢO

(Petunia hybrid)

PHẠM KIM LUÔNG

AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2023

ii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP - TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

CHUYÊN ĐỀ TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TÁI SINH CHỒI IN VITRO TỪ ĐOẠN THÂN MANG

MẮT NGỦ CỦA HOA DẠ YẾN THẢO

(Petunia hybrid)

PHẠM KIM LUÔNG DSH192931 LỚP: DH20SH

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

DIỆP NHỰT THANH HẰNG

AN GIANG, THÁNG 05 NĂM 2023

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Chuyên đề “Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa Dạ yến

thảo Petunia hybrid” do sinh viên Phạm Kim Luông thực hiện dưới sự hướng dẫn của giảng viên Diệp Nhựt Thanh Hằng

iv

MỤC LỤC

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2 3

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ DẠ YẾN THẢO 3

2.2 LƯỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.2.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo 3

2.2.1.1 Phân loại khoa học 3

2.2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.2.1.3 Đặc điểm phân bố 4

2.2.2 Kỹ thuật vi nhân giống 5

2.2.2.1 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật vi nhân giống (in vitro) 5

2.2.2.2 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.2.3 Quy trình vi nhân giống 7

2.2.2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy 7

2.2.2.5 Điều kiện nuôi cấy 13

2.2.3 Những nghiên cứu liên quan về cây Dạ yến thảo 15

2.2.3.1 Ngoài nước 15

2.2.3.2 Trong nước 17

CHƯƠNG 3 18

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 MẪU NGHIÊN CỨU 18

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 18

3.2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

3.2.2 Môi trường nuôi cấy 18

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy 18

3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 18

3.3.1 Trang thiết bị 18

3.3.2 Hóa chất 19

3.4 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU 19

3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ javel và thời gian khử trùng đến sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu 19

3.4.2 Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo 21

3.5 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU 22

CHƯƠNG 4 24

KẾT QUẢ DỰ KIẾN 24

4.1 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ JAVEL VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN SỰ TẠO NGUỒN VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU 24

4.2 THÍ NGHIỆM 2: TÁI SINH CHỒI IN VITRO TỪ ĐOẠN THÂN MANG MẮT NGỦ CỦA DẠ YẾN THẢO 31

TÀI LIỆU KHAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 43

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần môi trường nuôi cấy 7 Bảng 2 Các nguyên tố khoáng 9 Bảng 3 Bố trí thí nghiệm khử mẫu 20 Bảng 4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đến sự

tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo 22

Bảng 5 Tỷ lệ mẫu nhiễm của đoạn thân Dạ yến thảo sau 14 ngày SKC (%) 24 Bảng 6 Tỷ lệ mẫu chết của đoạn thân Dạ yến thảo sau 14 ngày SKC (%) 27

Bảng 7 Tỷ lệ mẫu sạch in vitro của đoạn thân Dạ yến thảo ở 14 ngày SKC

(%) 29 Bảng 8 Số chồi của các đoạn thân Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC (chồi) 32 Bảng 9 Chiều cao chồi của các đoạn thân Dạ yến thảo ở 5 tuần SKC (cm) 34 Bảng 10 Đường kính cụm chồi của các đoạn thân Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC (cm) 36 Bảng 11 Số lá của các đoạn thân Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC (lá) 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Hoa Dạ yến thảo 3

Hình 2 Tủ cấy đã được chuẩn bị và chiếu tia UV 20

Hình 3 Đoạn thân Dạ yến thảo bị nhiễm khuẩn và nhiễm nấm sau 14 ngày cấy 26

Hình 4 Đoạn thân Dạ yến thảo sau 7 ngày sau khi cấy 28

Hình 5 Đoạn thân Dạ yến thảo sau 14 ngày sau khi cấy 28

Hình 6 Mô sẹo hình thành dưới đáy chồi ở 5 tuần SKC 33

Hình 7 Sự phát triển chiều cao chồi ở nghiệm thức P0 và P4 sau 3 tuần sau khi cấy 34

Hình 8 Sự phát triển mẫu cấy Dạ yến thảo sau 5 tuần SKC 39

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Dạ yến thảo (Petunia hybrida L.) còn có tên gọi khác là Yến thảo hoa hay Dã

yên thảo, là loài thực vật có hoa thuộc họ Cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu Mỹ Đây là loại cây chịu nhiệt, hoa có màu sắc đa dạng như trắng, hồng, đỏ, tím… và dáng cây phong phú Dạ yến thảo thường được trồng trong các chậu trang trí, chậu hoa treo trong nhà, trong vườn, làm viền cho khu vườn và tô điểm cho góc vườn hay căn nhà thêm thêm rực rỡ, nếu chăm sóc tốt cây có thể ra hoa quanh năm (Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Hiện nay, Dạ yến thảo được trồng chủ yếu từ hạt, tuy nhiên giá bán hạt giống

Dạ yến thảo khá cao, từ 1.000 - 3.000 đ/hạt tùy loại hoa đơn, kép hay khảm Mặt khác, Dạ yến thảo có hạt rất nhỏ, tỷ lệ nảy mầm của hạt tương đối thấp chỉ khoảng 60%, cây con có tỷ lệ chết cao, do đó mà giá bán cây giống Dạ yến thảo hiên nay khá cao Ngoài ra, Dạ yến thảo còn có thể nhân giống bằng phương pháp giâm cành, tuy nhiên phương pháp nhân giống này còn có hệ số nhân thấp, cây giâm cành có sức sống yếu hơn cây gieo bằng hạt và nhanh tàn hơn

Phương pháp nhân giống bằng cây nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được áp dụng khá phổ biến trên nhiều đối tượng cây trồng Một trong số những ưu điểm nổi bật của nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô là hệ số nhân cao, trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng lớn cây giống tương đối

đồng nhất, cây giống sạch bệnh, giá thành thấp Do đó đề tài “Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa Dạ yến thảo Petunia hybrid”

được tiến hành nhằm phân tích sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh

chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ Dạ yến thảo, góp phần hoàn thiện quá

trình vi nhân giống cây Dạ yến thảo

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Tìm ra thời gian và nồng độ chất khử trùng thích hợp cho việc tạo nguồn vật liệu khởi đầu

Tìm ra được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho việc tái sinh

chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm được nghiên cứu từ đoạn thân mang mắt ngủ của cây Dạ yến thảo

Petunia hybrid khỏe mạnh, không sâu bệnh được mua từ nhà vườn Sa Đéc

2

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát thời gian và nồng độ chất khử trùng đến sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu

Khảo sát các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA NGHIÊN CỨU

Kết quả của đề tài nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin cần thiết nhằm góp phần hoàn thiện giai đoạn khử trùng và tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ Dạ yến thảo

Nghiên cứu giúp chọn được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng có hệ số tái sinh chồi tối ưu nhất dành cho Dạ yến thảo

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ DẠ YẾN THẢO

Dạ yến thảo (Petunia sp.) là cây thân cỏ mềm, loại cây dễ trồng, nở nhiều hoa

và rất phong phú về màu sắc Cây phù hợp trồng trong chậu treo trang trí trước thềm nhà hoặc trồng trong các bồn hoa trong vườn Thuộc loài thực vật có hoa

thuộc họ Cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ các nước miền Nam Châu Mỹ,

hiện nay Dạ yến thảo đã được phổ biến khắp thế giới với hàng trăm giống lai F1.Phần lớn dã yên thảo được trồng ngày nay là dã yên thảo đã được lai tạo từ

Petunia axillaris, Pentunia violacea và Pentunia inflata (Thanh Truyền, 2014)

Là loài cây chịu nhiệt, ưa sáng, hoa này sẽ điểm tô cho ban công nhà thêm tươi tắn, đặc sắc nhất là thân cây và hoa có một lớp lông tơ bao phủ thật mềm mại, ấn tượng và tao nhã (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

Dã yên thảo được chia thành 2 kiểu cây:

+ Dã yên thảo kép: cây thân leo, hoa lớn với nhiều cánh (grandiflora), đường kính của hoa có thể lên tới 13cm

+ Dã yên thảo đơn: cây bụi, có rất nhiều hoa nhưng hoa chỉ có một lớp cánh (mulitflora), đường kính của hoa khoảng 5-7,5cm, dễ trồng và ít bị ảnh hưởng bởi sâu bọ

+ Dã yên thảo khảm: cây thân leo, hình dạng giống như dã yên thảo kép, cánh hoa có 2 màu (Thanh Truyền, 2014)

2.2 LƯỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Giới thiệu về cây Dạ yến thảo

2.2.1.1 Phân loại khoa học

Loài: P hybrida Hình 1 Hoa Dạ yến thảo

(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

4

2.2.1.2 Đặc điểm hình thái

Dạ yến thảo là cây thân cỏ, sống hằng năm, cây cao 15 – 30cm Thân mềm phủ đầy lông dính, nhánh cây được phân ra từ các nách lá, một nách lá có thể phân ra thành nhiều nhánh Lá đơn, mọc cách mặt trên và mặt dưới của lá có lớp lông phủ mịn, mép nguyên không răng cưa, màu xanh bóng Hoa nhỏ, đơn độc mọc ở nách lá, trên một cọng dài 2 – 3 cm, đài hoa cao 1 – 2,5 cm Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành Cánh đài hợp ở gốc, còn lải ở quả, cánh trành hợp thành ống loe rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy Quả nang hai mảnh, nhiều hạt (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

Tốc độ sinh trưởng của hoa Dạ yến thảo nhanh Hoa có dạng hình phễu, nhưng các dạng hoa Dạ yến thảo lai có hình dáng đa dạng và phong phú hơn nhiều

Ví dụ như hoa cánh đơn, hoa kép với mép có viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng, vàng cam Dạ yến thảo rũ hồng đậm có mùi thơm dịu dàng (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

Là loài cây nhất niên thường nở hoa vào mùa hè Dạ yến thảo ưa sáng, sẽ trở nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối Cây thích hợp với điều kiện ngập úng Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng Dạ yến thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH từ 6,0 – 7,0 (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

Dạ yến thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúng liều lượng, không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ sinh và duy trì ẩm độ thích hợp Ngoài ra, Dạ yến thảo thường bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắn phá Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến cây như làm biến dạng lá, cây chậm phát triển, hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi kết dính thành cụm (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

2.2.1.3 Đặc điểm phân bố

Hoa Dạ yến thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ

với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae) Cây hoa

Dạ yến thảo có nguồn gốc từ các miền Nam Châu Mỹ, hiện nay được trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng, vườn hoa khắp nước ta Ờ miền Bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền Nam, hoa nở vào dịp Tết Cây có nhiều tên gọi khác nhau như là Dã yến thảo, Hoa cà, Đây là một loại cây lai mà tổ tiên

có từ nhiều loài khác của chi Petunia, ví dụ như P axillaris BSP (Large White

5

Petunia) hoa dạng ống dẹp, màu trắng hoặc P virolace Lindl (Vilolet –

flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím Ngày nay, các nhà vườn từ loại lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2020)

2.2.2 Kỹ thuật vi nhân giống

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng các bộ phận trên cây giống dùng làm mẫu cấy dựa trên cơ

sở tính toàn năng của tế bào và bằng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn,

2010) Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy mô trên môi trường thích hợp Ngoài ra, vi nhân giống có thể được thực hiện thông qua tạo phôi hoặc tái sinh cây trực tiếp từ mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.2.2.1 Những ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật vi nhân giống (in vitro)

 Ưu điểm

Hiện nay hàng loạt cây giống như cây lương thực, cây thực phẩm, cây dược liệu, cây hoa, cây ăn trái, cây rừng, đang được sản xuất theo quy mô công nghiệp bằng công nghệ vi nhân giống Công nghệ vi nhân giống có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối với các cây sinh sản chậm (cây rừng, cây gỗ, cây ăn trái, cây dược liệu), hoặc đối với cây cần cung cấp số lượng cây giống rất nhiều trong thời gian ngắn như cây hoa (hoa hồng, phong lan) (Nguyễn Như Hiền, 2007) Một số ưu điểm có thể kể ra như sau:

Thực hiện trong phòng thí nghiệm với các chuẩn mực ổn định, không chịu ảnh hưởng dao động thất thường của thời tiết và không phụ thuộc vào mùa vụ Có thể chủ động sản xuất giống đón đầu vụ

Hệ số nhân giống cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa quả với những cây lâu năm (Phạm Thành Hổ, 2008)

Có thể tạo được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân giống in vivo có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô

Trong nuôi cấy in vivo chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có

thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2003)

Nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính đã trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến, người ta đã sử dụng phương pháp này

6

trong công tác chọn giống cây trồng (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2003)

 Nhược điểm

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2003), việc nhân giống vô

tính in vivo có những nhược điểm sau:

- Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy

- Tạo ra những cây không hoàn toàn đúng như mong muốn

- Đối với một loài cây thân gỗ việc cảm ứng rất rễ rất khó thực hiện

- Việc chuyển cây từ trong ống ngiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây

- Phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây nuôi cấy mô in vivo thật cẩn

thận

- Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do việc cấy truyền mô sẹo và huyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần

- Đối với một số mô, việc khử trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện

- Tốn nhiều công lao động khiến giá thành của cây tăng lên

Trong một số trường hợp nuôi cấy mô tạo ra những biến dị soma Tần số biến

dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào

mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy mô chồi đỉnh (Nguyễn Quang Thạch và Nguyễn Thị Lý Anh, 2005)

Cây in vivo có sức sống yếu hơn cây trồng bên ngoài trong giai đoạn đầu để

cây thích nghi (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Để tồn tại trong in vivo, cây cần nhiều năng lượng để cung cấp từ bên ngoài

như đường Cây không tự quang hợp được, mặc dù gần đây vài tác giả đề nghị

nuôi cấy in vivo tự dưỡng (Kozai và Smith, 1995)

2.2.2.2 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật

 Định nghĩa

Nuôi cấy mô tế bảo thực vật được tiến hành thành công trên cơ sở tính năng và khả năng biệt hóa của tế bào thực vật

 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Theo Haberlandt (1902), tính toàn năng có ở mọi tế bào, mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Điều này được chứng minh

7

qua nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trường ở rễ cây hòa thảo trong 12 ngày của Kotte và Robbins (Vũ Văn Vụ và cs., 2000)

 Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phải cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó Các tế bào khi nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và chức năng Ngoài ra, những tế bào này cũng có thể trở lại trạng thái của tế bào phôi khi điều kiện thích hợp, quá trình này gọi là phản biệt hóa Tất cả các tế bào trong cùng một cơ thể đều có khả năng biệt hóa và phân biệt hóa Theo Galson (1986) và Murasshige (1974), khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của tế bào thực vật giảm theo chiều từ ngọn xuống gốc Điều này giúp việc lựa chọn mẫu cấy đạt hiệu quả hơn Đã có nhiều kết luận cho rằng những tế bào càng gần hoặc không xa với trạng thái phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy càng dễ thành công bấy nhiêu (Vũ Văn Vụ và cs., 2000)

2.2.2.3 Quy trình vi nhân giống

Vi nhân giống đã được Debergh (2006) chia thành 4 giai đoạn khác nhau (không kể giai đoạn 0) Mỗi giai đoạn có một chức năng riêng Sự thành công của việc vi nhân giống tùy thuộc vào tất cả các giai đoạn trong ống nghiệm và ngoài ống nghiệm

Theo Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2016) các giai đoạn vi nhân giống gồm 4 giai đoạn:

In vivo Giai đoạn 0 : Sự chuẩn bị của cây mẹ

In vitro Giai đoạn 1 : Vô trùng mẫu cấy

Giai đoạn 2 : Nhân – cấy chuyển Giai đoạn 3a : Kéo dài

Giai đoạn 3b : Tạo rễ và tiền thuần dưỡng

In vivo Giai đoạn 4 : Thuần dưỡng

2.2.2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy

Thành phần nuôi cấy bao gồm rất nhiều chất Thông thường được chia thành hai thành phần: thành phần cơ bản là thành phần luôn luôn có trong môi trường và thành phần tự chọn là thành phần có thể thêm hoặc không thêm vào

môi trường ở Bảng 1

Bảng 1 Thành phần môi trường nuôi cấy

8

Các nguyên tố khoáng đa, vi lượng Chất thẩm thấu

Chất điều hoà sinh trưởng

(Nguồn: Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Nước khử ion được tạo ra bằng cách cho nguồn nước tiếp xúc với các loại nhựa mang điện tích Các loại nhựa này sẽ hút và liên kết với các muối, loại

bỏ chúng ra khỏi nước Tuy đã loại bỏ hết các ion, nhưng trong nguồn nước vẫn còn chứa đựng các loại vi khuẩn và virus mà các loại nhựa mang điện tích không thể loại bỏ (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

 Các nguyên tố khoáng

Có nhiều nguyên tố khóang được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mỗi nguyên tố có một vai trò riêng Các nguyên tố khóang được chia thành hai

nhóm: đa lượng và vi lượng (Bảng 2)

9

Bảng 2 Các nguyên tố khoáng

Các nguyên tố khoáng đa lượng Các nguyên tố khoáng vi lượng

Nitrogen (dạng ammonium và nitrare) Chlorine (Cl)

sử dụng phụ thuộc rất nhiều vào loại và tuổi mẫu cây (Nguyễn Quang Thạch

và cs., 2009)

Luu ý, đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu (sẫm màu)

và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino (phản ứng Millard), ức chế sự phát triển của tế bào (Dương Công Kiên, 2003) Khi hàm lượng đường cao,

mô nuôi cấy khó hút nước Hàm lượng đường quá thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng mọng nước (thủy tinh thể, vitrification) ở mẫu nuôi cấy Đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm (Debergh, 2006)

10

 Vitamin

Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Vitamin được sử dụng như là coenzyme với một lượng rất nhỏ (Nguyến Bảo Toàn, 2010)

Vitamin thường được sử dụng nhất là nicotinic acid (PP), thiamine (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), pyridoxine (vitamin B6), biotin (vitamin H), acid folic (vitamin M), acid ascorbic (vitamin C, thường sử dụng như là chất chống oxy hoá)

inositol thường sử dụng với hàm lượng 100mg/L môi trường inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển giống như các vitamin, trong nhiều trường hợp có vai trò như nguồn carbon của môi trường nuôi cấy Hiện nay, trong quá trình pha chế môi trường, người ta thường thêm các dung dịch vitamin vào môi trường trước khi hấp khử trùng

Myo-Tuy nhiên, trong các nghiên cứu về vitamin, người ta nhận thấy tốt nhất là nên lọc khử trùng các dung dịch vitamin và sau đó thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

 Chất tạo gel

Có 2 chất tạo môi trường nuôi cấy rắn hoặc bán rắn là agar và gelrite

Gelrite: một gellan gum (hetero-polysaccharide) đuợc tạo ra bởi vi khuẩn

Pseudomonas elodea

Agar (thạch): sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo, là một polysaccharide

Hàm lượng sử dụng 0,5-10% tùy theo chất lượng của chúng và loại môi trường được sử dụng Trong đó, agar thường được sử dụng nhất để tạo môi trường rắn hoặc bán rắn để nuôi cấy mô thực vật Agar được hòa tan với nước tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60-100°C, và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống còn 45°C Agar và đặc tính gel tuỳ thuộc vào thương hiệu của nhà sản xuất trong đó cần lưu ý đến: độ tinh khiết, hàm lượng ẩm độ chứa trong agar,

sự sinh trưởng của mẫu cấy trong môi trường có agar

Môi trường lỏng không chứa ít chất tạo gel Trong quá trình sử dụng môi trường lỏng để nuôi cấy mô thực vật thường phải lắc nhẹ các bình nuôi cấy trên máy lắc Ngoài ra, có thể sử dụng các thành phần hỗ trợ như cầu giấy lọc, tấm polyethylene Cầu giấy lọc có một đầu nhúng vào môi trường, đầu kia chứa mẫu Tấm polyethylene nổi trên môi trường lỏng và cho các chất dinh dưỡng thấm qua (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

11

 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường

nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu

quả tác động của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt tính của chất điều hòa sinh trưởng, mẫu nuôi cấy

Chất điều hòa sinh trưởng gồm: chất kích thích sinh trưởng và chất ức chế sinh trưởng (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

Nhóm auxin

Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứmg phát sinh phôi vô tính Do đó, nó được

áp dụng trong vi nhân giống và tạo rễ của cành giâm (Nguyễn Thị Mỹ Duyên

và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) Nó hiện diện ở nồng độ cao ở vùng mô phân sinh của thực vật và được chứng minh là có liên quan đến nhiều đáp ứng sinh lý IAA được bổ sung vào môi trường nghiên cứu thường ở nồng độ khá cao (0,1 - 30 mg/L) Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, hiệu quả chính của nó là trên sự phân chia tế bào và quá trình giảm phân Một trong những tác dụng chính của auxin là kích thích quá trình tạo rễ Do đó, chúng thường được ứng dụng trong vi nhân giống và tạo rễ của cành giâm (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Auxin tổng hợp được sử dụng rộng rãi nhất là: IBA (indole-3-butyric acid), NAA (Alpha-naphthaleneacetic acid), 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) Các auxin này thường được sử dụng kết hợp với cytokinine Chúng ổn định với nhiệt độ và ánh sáng hơn IAA Do đó, chúng có thể được hấp khử trùng Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, hàm lượng được sử dụng phổ biến

từ 0,1 - 2 mg/L Tùy theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là tác động kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus)

Chất ngăn cản auxin

TIBA (2,3,5-Tri-iodobenzoic acid) được sử dụng như chất cản auxin do tính chất ngăn cản con đường vận chuyển auxin ở một số vùng tế bào trong cây

Nhóm cytokinin

Cytokinin là adenine được thay thế N-6 kết hợp với auxin gây ra sự phân chia

tế bào ở thực vật Kinetin và benzyl adenine (BA) được tổng hợp đầu tiên, nhưng gần đây người ta chứng minh là chúng có thể được tạo ra tự nhiên ở vài loại cây Ngày nay, cả hai được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô Cytokinin

12

được tổng hợp ở rễ, từ đó vận chuyển lên chồi Chúng đóng vai trò chính trong

sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cây mô

Các loại cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy bao gồm: Zeatin hydroxy-3 -metyl-but-2-eny lamino] purine), Kinetin (6 furfurylamino purine), BAP (bezy lamino purine), TDZ (thidiazuron được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô hiện nay (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

(6-[4-Ngoài ra còn có DPU (diphenylurea) được trích từ nước dừa, được sử dụng như là thành phần thêm vào trong vi nhân giống DPU này được chứng minh

là cytokinin chính trong nước dừa Sự khám phá tình cờ dẫn đến sự phát triển một nhóm chất điều hoà sinh trưởng mới giống cytokinin là thidiazuron

Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo, nhưng có ảnh hưởng rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Cytokinin thường được sử dụng với mục đích kích thích sự sinh trưởng chồi trong nuôi cấy mô Hàm lượng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1-2mg/L Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến

sự hình thành chồi bất định (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai, đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ hợp tỷ lệ khác nhau (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

 Tính thẩm thấu của môi trường

Sự hấp thu nước của tế bào và mô thực vật trong môi trường nuôi cấy bị chi phối bởi thế năng của nước trong dịch bào và trong môi trường dinh dưỡng Các thành phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm: hàm lượng đường (thông thường đường 2% được cho là có hiệu quả thẩm thấu), hàm lượng agar, một số thành phần muối khoáng Do đó, tính thẩm thấu của môi trường sẽ liên quan đến sự hấp thu dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy đến tế bào thực vật Nếu tính thẩm thấu tốt, tế bào thực vật hấp thu đủ lượng nước và dinh dưỡng giúp mẫu nuôi cấy sẽ phát triển tốt (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

Điều chỉnh pH bằng cách dùng HCl hay NaOH 1N hoặc 0,1N và nhỏ từng giọt vào môi trường, khuấy đều môi trường rồi mới đo (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

 Thành phần của một số loại môi trường nuôi cấy thông dụng

Để tiến hành công việc nuôi cấy mô trên một số đối tượng nhất định, điều cần quan tâm là chọn môi trường nào là phù hợp Trên cơ sở tham khảo các tài liệu

có liên quan, có thể điều chỉnh, cải tiến qua một số thí nghiệm khảo sát ban đầu, để cuối cùng chọn ra được môi trường nuôi cấy thích hợp nhất Có rất nhiều môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều đối tượng thực vật khác nhau, nhưng tựu trung có thể phân ra làm 3 loại: Môi trường nghèo dinh dưỡng (White, Knop ), môi trường có hàm lượng dinh dưỡng trung bình (B5-Gamborg ), môi trường giàu chất dinh dưỡng (MS - Murashige-Skoog)

Môi trường MS là môi trường giàu dinh dưỡng, có hàm lượng muối khoáng cao, các nguyên tố vi lượng đầy đủ, nên môi trường này thích hợp với hầu hết các loại và đối tượng nuôi cấy Trong khi đó môi trường B5 và N6 có hàm lượng dinh dưỡng đa vi lượng thấp hơn, nhưng có hàm lượng muối nitrat kali cao Nhóm môi trường này thích hợp cho các mục đích nuôi cấy tăng cường cảm ứng hình thành mô sẹo và phân hóa chồi Nhóm môi trường WPM và DKW thích hợp để nuôi cấy các cây thân gỗ (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

 Thành phần hữu cơ không xác định

Việc sử dụng kích thích tố đòi hỏi nhiều kinh nghiệm vì nồng độ tối hảo thay đổi tùy loại cây, tùy độ nhạy cảm của mô và thời gian nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2003) Theo Lê Văn Hoàng (2008), nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5 - 20%; bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng vào khoảng 40g bột khô/L; nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nấm men (yeast extract), casein thuỷ phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng để làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

2.2.2.5 Điều kiện nuôi cấy

 Nhiệt độ

14

Nhiệt độ chung cho tất cả các phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh 25

± 2°C (vì nhiệt độ sống thích hợp đối với cây nhiệt đới là từ 24 - 26°C) Đồng thời, tại điều kiện nhiệt độ này giúp ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại cho mẫu cấy Một vài lưu ý:

- Ban đêm nhiệt độ thường thấp hơn ban ngày

- Nhiệt độ trong các keo lọ nuôi cấy thường cao hơn nhiệt độ phòng vài độ do hiệu ứng nhà kính

- Một trong các vấn đề chủ yếu là giữ nhiệt độ phòng ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy

- Cần cài đặt một dụng cụ ổn định nhiệt độ (thermostat) Khi nhiệt độ phòng quá cao có thể kiểm soát bằng cách tắt bớt đèn, vì cây có thể sống trong điều kiện tối chứ không thể sống trong điều kiện nhiệt độ cao (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

 Ánh sáng

Ánh sáng sử dụng trong nuôi cây mô thực vật thường là ánh sáng nhân tạo, cường độ ánh sáng từ 1000 đến 5000 lux Chu kỳ chiếu sáng thông thường là 16h sáng, 8h tối Sự cảm ứng và phát triển mô sẹo và rễ không cần chiếu sáng, nhưng cảm ứng chồi bất định lại cần sự chiếu sáng Yêu cầu chiếu sáng về cường độ và màu sắc ánh sáng sẽ ảnh hưởng khác nhau đối với từng loại thực vật, và tùy vào các giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật Ví dụ như quang chu kỳ thích hợp nhất cho cúc phát sinh rễ là 12h chiếu sáng, cho sự sinh chồi của thuốc lá, măng tây là 16h, với cường độ ánh sáng là 1000 lux (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009)

Trước đây người ta hay sử dụng đèn huỳnh quang (đèn néon) đặt song song với kệ, ngày nay người ta thường sử dụng đèn led để tránh sự gia tăng nhiệt trong phòng đồng thời giảm chi phí điện năng

Các thông số ánh sáng rất quan trọng bao gồm số giờ chiếu sáng (quang kỳ) và cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng được xác định bằng dụng cụ đo Có thể đo bằng đơn vị PAR = số moles photon/m2/giây (s) hoặc đơn vị Lux Quang phổ ánh sáng ảnh hưởng đến hình thái (chiều cao, sự phát triển lá), nên lưu ý tỷ lệ của phổ ánh sáng xanh dương, đỏ, Quang phổ còn tùy thuộc vào loại đèn

+ Quang kỳ (photoperiod): Thường sử dụng ngày dài là 16 giờ chiếu sáng + Cuờmg độ ánh sáng (light intensity): Cường độ ánh sáng thích hợp là khoảng 30 µmol/m²/s Dưới điều kiện này, sự nuôi cấy còn trong giai đoạn tạp dưỡng (mixotrophic); đối với mô tự dưỡng (autotrophic tissue culture) cường

độ ánh sáng lên đến 250 µmol m²s; Tùy thuộc vào nắp đậy của keo nuôi cấy

mà có thể làm giảm cường độ ánh sáng (Nguyễn Thị Mỹ Duyên và Diệp Nhựt Thanh Hằng, 2021)

2.2.3 Những nghiên cứu liên quan về cây Dạ yến thảo

2.2.3.1 Ngoài nước

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây

Dạ yến thảo nhằm tạo ra số lượng lớn phục vụ sản xuất

Năm 2004, Kortessa Dimasi-Theriou và cs đã nghiên cứu tái sinh cây Dạ yến

thảo (Petunia hybrida L.) in vitro bằng ethylene Nghiên cứu cho thấy giảm

ethylene sản xuất nội sinh bằng ethysorb (KMnO4), một chất hấp thụ ethylene, làm giảm số lượng chồi Mặc khác, việc bổ sung ethylene (0,01 - 10 ppm) vào môi trường nuôi cấy làm tăng đáng kể số lượng chồi mà không ảnh hưởng đến chiều dài và trọng lượng tươi Phương pháp xử lý ethylene (1 ppm) được cho

là có hiệu quả nhất khi chúng được áp dụng vào tuần thứ hai của quá trình nuôi cấy mẫu Dạ yến thảo Việc bổ sung CO2+ vào môi trường dẫn đến giảm ethylene nội sinh và đồng thới làm sự hình thành chồi Tương tự, bổ sung Ag+, một chất ức chế hoạt động của ethylene, dẫn đến sự hình thành chồi kém Ethylene dường như cũng đóng một vai trò nào đó đối với sự ra rễ của các cây

Dạ yến thảo in vitro tronng môi trường không có auxin Ethylene ở nồng độ 10

ppm gây ra sự hình thành rễ nhanh chóng đáng kể, trong khi ở nồng độ thấp (0,0 - 1 ppm) nó không ảnh hưởng đến sự ra rễ

Năm 2007, Moshe Reuveni và Dalia Evenor đã nghiên cứu về ảnh hưởng của

ánh sáng đến sự tái sinh chồi ở cây Dạ yến thảo (Petunia hybrida L.) Nghiên

cứu tiến hành trên lá cây Dạ yến thảo đã được khử trùng trên môi trường MS

bổ sung 5,7 µM IAA và 2,25 µM zeatin Mô lá được khảo sát với các chu kỳ

sáng hoặc tối khác nhau và sự tái sinh chồi đã được ghi lại Giống Petunia hybrida R không tái sinh trong tối trong khi P axillaris tái sinh trong tối P hybrida và P axillaris tái sinh trong sáng Lá P hybrida tái sinh chồi trên môi

trường MS được chiếu sáng tối thiểu 6 ngày

Năm 2011, Danuta Kulpa và Natalia Nowak đã nghiên cứu về sự ra hoa in vitro của Petunia × atkinsiana D Don Mục đích của nghiên cứu này là để xác

định ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng – auxin, cytokinin và gibberellic

acid – về sự ra hoa và phát sinh hình thái của 'Flash Red' Petunia × atkinsiana

16

D Don trong ống nghiệm Kết quả tốt nhất ở giai đoạn nhân giống thu được trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg.dm-3 GA3 Các cây Dạ yến thảo được nhân giống trong những điều kiện này đã phát triển chồi chính cao và nhiều lá Cây có bộ rễ phát triển tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,5 và 1,0 m.dm-3 IAA Cây ra hoa trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg.dm-3 KIN

Năm 2019, Rebaz Rasul Habas, Musa Turker và Fethi Ahmet Ozdemir đã

nghiên cứu tái tạo chồi in vitro từ Dạ yến thảo (Petunia hybrida) Nghiên cứu

tiến hành trên quy trình tái sinh thực vật hiệu quả đã được phát triển từ hạt nảy

mầm in vitro của Petunia hybrida, một loại cây trang trí quan trọng trong họ Solanaceae Petunia hybrida được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ

sung các nồng độ và sự kết hợp của Benzyl amino purine (BAP), acid Naphthaleneacetic (NAA), Indole-3-butyric acid (IBA) và acid Gibberellic (GA3) Chiều dài chồi cao nhất thu được từ môi trường MS bổ sung 1 mg/l BAP + 1 mg/l NAA Số chồi cao nhất (3 chồi/mẫu) thu được từ môi trường

1-MS bổ sung 0,6 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA Chồi được chuyển sang môi trường cơ bản MS có bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau (0,05; 0,2; 0,5 và

1 mg/l) để kéo dài chồi Chiều dài chồi cao nhất (5,75 cm) được ghi nhận từ môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l GA3 + 0,2 mg/l BAP Chồi hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,1-1 mg/l IBA và NAA Chồi có rễ phát triển tốt đã được thuần hóa và phát triển trong chậu chứa rêu, than bùn khử trùng và được trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm với tỷ lệ sống 70% Năm 2019, Vakili, Bagheri và Azadi đã nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp của

ba cây Dã yên thảo Các mẫu lá của 3 giống Alvan, Alvan Hoa Lớn (LF Alvan)

và Mahalat của Petunia hybrida được nuôi cấy riêng biệt trên môi trường MS,

bao gồm các nồng độ khác nhau của TDZ và BA mà không có auxin, để đánh giá tái sinh chồi trực tiếp Giống Alvan cho thấy tần suất tái sinh chồi cao nhất (100%) và số chồi trung bình trên mỗi mẫu cấy là cao nhất (25,33) trên môi trường MS chứa 2 mg/l TDZ Đối với giống LF Alvan, tỷ lệ phần trăm phát sinh chồi cao nhất (100%) và số chồi trung bình trên mỗi chồi đạt 18,20 chồi được quan sát trên môi trường MS chứa 1 mg/l BA Với giống Mahalat, tốc độ tái sinh trực tiếp tối đa là thu được trên MS bổ sung 0,5 và 1 mg/l BA là 80%

Số chồi trung bình trên mỗi mẫu đạt 9,63 khi sử dụng môi trương MS bổ sung

2 mg/l TDZ Các chồi tái sinh đã được kéo dài thành công (2 đến 3 cm) và được chuyển vào MS1/2 bổ sung 0,1 mg/l NAA để tạo rễ Các chồi đã ra rễ thành công, được thuần hóa và chuyển vào trồng trong nhà kính

17

2.2.3.2 Trong nước

Năm 2021, Nguyễn Tiến Long và cộng sự đã nghiên cứu tạo nguồn vật khởi

đầu trong nhân giống in vitro cây hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida L.)

Nghiên cứu này đã xác định được phương pháp khử trùng và môi trường dinh dưỡng trong các giai đoạn khác nhau: tái sinh chồi, nhân nhanh chồi và các cơ

quan sinh dưỡng của cây in vitro sử dụng để nhân nhanh Kết quả cho thấy, sử

dụng đoạn thân mang mắt ngủ làm nguồn nguyên liệu khởi đầu và khử trùng bằng dung dịch HgCl2 nồng độ 0,1% trong thời gian 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất (tỷ lệ mẫu sống đạt 60%) Môi trường tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ tốt nhất là môi trường MS + 1 mg BAP/l + 6,5 g agar/l + 30 g sacarose/l (tỷ lệ mẫu tạo chồi 100%, số chồi trung bình/mẫu đạt 2,73); môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất là MS + 1 mg BA/l + 0,2 mg IBA/l + 6,5 g

agar/l + 30 g sacarose/l Mô lá của cây in vitro là cơ quan sinh dưỡng phù hợp nhất để nhân nhanh, 100% các chồi in vitro tái sinh thông qua hình thức mô

sẹo, tỷ lệ số chồi/mẫu đạt tỷ lệ cao

Bùi Thị Thu Cúc, Đồng Huy Giới và Bùi Thị Thu Hương (2017) đã nghiên

cứu nhân nhanh in vitro cây Dạ yến thảo hoa hồng sọc tím (Petunia hybrida L.) Trong nghiên cứu này, các chất điều tiết sinh trưởng gồm TDZ, BA và

NAA được sử dụng độc lập hoặc phối hợp với các nồng độ khác nhau trong

nuôi cấy mô in vitro cây Dạ yến thảo hoa hồng sọc tím Nghiên cứu đã xác

định môi trường thích hợp nhât cho việc tái sinh chồi là từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo là môi trường MS bổ sung 30g/l succrose, 6 g agar/l

và 0,25 mg/l TDZ, cho đường kính cụm chồi đạt 1,95 cm, chiều cao trung bình

chồi đạt 1,67 cm và có 3,36 chồi cao trên 1 cm Chồi Dạ yến thảo in vitro cao

1 - 15 cm được sử dụng làm vật liệu để nhân nhanh Hệ số nhân chồi đạt giá trị cao nhất sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 30 g/l succrose, 6 g agar/, 0,1 NAA, cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%

18

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU

Đoạn thân mang mắt ngủ của hoa Dạ yến thảo Petunia hybrid

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

3.2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Đề tài được thực hiện trong phòng thí nghiệm dành riêng cho Nuôi cấy mô thực vật của trường Đại học An Giang

Thời gian thực hiện thí nghiệm: tháng 2/2023 - tháng 5/2023

3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Tất cả các nghiệm thức đều sử dụng môi trường nuôi cấy cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962) gồm: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin theo Moerl (1951), Fe-EDTA, chất hữu cơ Myo-inositol 0,1 g/l Ngoài ra có

bổ sung đường saccarose (30 g/L), agar (9 g/L), pH = 5,6 - 5,8, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, NAA và TDZ được bổ sung vào môi trường tùy theo mục đích thí nghiệm Môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C, trong thời gian 20 phút

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy: các keo nuôi mẫu được đặt trong phòng nuôi cấy với nhiệt

độ từ: 24 o

C - 26 oC Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày

3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU

3.3.1 Trang thiết bị

Dụng cụ:

+ Micropipet và các dụng cụ liên quan

+ Chai lọ, cốc thủy tinh, ca nhựa có chia vạch, ống đong, đũa thủy tinh, đĩa petri,

+ Dao, kéo cắt mẫu, kẹp giấy, giấy tiệt trùng, bông gòn, đèn cồn, găng tay, nước cất, bình xịt…

+ Viết, sổ, thước đo chia vạch cm, thước kẹp, máy chụp hình, bảng nghiệm thức

Thiết bị:

+ Nồi hấp thanh trùng

+ Cân điện tử

Các hóa chất sử dụng cho môi trường MS cơ bản gồm các chất:

Khoáng đa lượng: NH4NO3, KNO3, MgSO4.7H₂O, CaCl2, KH2PO4

Khoáng vi lượng: H3PO3, MnSO4, ZnSO4.7H₂O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.2H2O, KI, CoCl2

Các vitamin: Thiamin - HCl, Nicotinic acid, Pyridoxine - HCl, Glycin, inositol

Myo-Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA, NAA và TDZ ở các nồng độ khác nhau

Các chất khử trùng: cồn 70 và 90, dung dịch Javel của nhãn hiệu Mỹ Hảo Thành phần khác: Agar 9 g/L, đường 30 g/L

3.4 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU

3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ javel và thời gian khử trùng đến sự tạo nguồn vật liệu khởi đầu

- Mục đích: xác định được nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp của Javel

đến khả năng tạo vật liệu khởi đầu

- Mẫu thí nghiệm: Đoạn thân mang mắt ngủ của hoa Dạ yến thảo

Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường Murashige & Skoog (1962), có bổ sung thêm 9g/L agar và 30g/L đường Môi trường được hấp thanh trùng ở

1210C, trong thời gian 20 phút

- Phương pháp thực hiện

+ Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 keo, mỗi keo chứa 1 mẫu

Kế tiếp mẫu cấy được khử trùng trong tủ cấy đã được chiếu tia UV Ngâm mẫu trong cồn 70o trong 30 giây Rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần Nhỏ vài giọt Tween vào mẫu và cho mẫu vào ngâm trong dung dịch khử trùng là Javel với nồng độ và thời gian tương ứng (Bảng 3) Sau đó rửa sạch lại mẫu nhiều lần với nước cất vô trùng

Hình 2 Tủ cấy đã được chuẩn bị và chiếu tia UV

Dùng dao mổ tiệt trùng cắt bỏ phần mô bị tổn thương do khử trùng Dùng kẹp chuyển mẫu vào keo có chứa 20ml môi trường MS có bổ sung thêm 9 g/L agar

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ nhiễm = Số mẫu bị nhiễm/ tổng số mẫu cấy

+ Tỷ lệ mẫu sống và sạch = Số mẫu sống và sạch / tổng số mẫu cấy

+ Tỷ lệ mẫu chết = Số mẫu bị chết/ tổng số mẫu cấy

- Thời gian lấy chỉ tiêu: 7, 14 ngày sau khi cấy

3.4.2 Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ

yến thảo

Mục đích: Tìm được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo

Vật liệu nghiên cứu:

+ Mẫu thí nghiệm: Những mẫu cấy không bị nhiễm thu được ở thí nghiệm 1 + Dụng cụ: keo thủy tinh 350 ml, dao, kéo, pence…

Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường Murashige & Skoog (1962) có bổ sung thêm 9 g/L agar, 30 g/L đường và các loại chất điều hòa sinh trưởng như TDZ, BA và NAA ở những nồng độ khác nhau tùy theo từng nghiệm thức Môi trường được chỉnh về pH = 5,7 Môi trường được hấp thanh trùng ở

1210C, 1 atm trong thời gian 20 phút

Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 5 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo tương đương với 1 mẫu cấy

Các mẫu sống in vitro có chiều cao 1 - 1,5 cm từ thí nghiệm 1 được cấy sang

thí nghiệm 2 trên các môi trường MS có bổ sung thêm 30 g/L đường, 9 g/L agar và các loại chất điều hòa sinh trưởng như TDZ, BA và NAA khác nhau

theo Bảng 3

22

Bảng 4 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đến

sự tái sinh chồi in vitro từ đoạn thân mang mắt ngủ của Dạ yến thảo

Chọn các mẫu sống in vitro có chiều cao 1 - 1,5 cm từ thí nghiệm 1 cấy vào

môi trường có bổ sung nồng độ TDZ, BA và NAA khác nhau để xác định ảnh

hưởng của chất điều hòa sinh trưởng sự tái sinh chồi in vitro và chất lượng

mẫu cấy

Các chỉ tiêu theo dõi:

Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi = (Số mẫu tái sinh chồi/Tổng số mẫu cấy) x 100

+ Số chồi (chồi): đếm số chồi phát sinh trên mẫu cấy

+ Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt môi trường đến đỉnh chồi

+ Số lá (lá): đếm số lá mới tạo thành trên chồi

+ Đường kính cụm chồi (cm): đo chiều ngang của cụm chồi

Đặc điểm hình thái (chất lượng chồi): thực thiện bằng quan sát cảm quan + Chồi tốt (+++): chồi phát triển tốt, đồng đều, khỏe mạnh và có màu xanh + Chồi trung bình (++): chồi phát triển chậm, không đồng đều (nhiều chồi có kích thước trung bình), có màu xanh

+ Chồi xấu (+): chồi không hoặc chậm phát triển, kích thước nhỏ, màu vàng nhạt hoặc trắng

Thời gian lấy chỉ tiêu: 2, 3, 4, 5 tuần sau khi cấy

3.5 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

Các số liệu thu thập được xử lý phần mềm Microsoft Excel và phân tích thống

kê bằng phần mềm SPSS