L
Trang 3LI C
Em xin bày t lòng bi n GS.TS P c Phong c - Trung tâm nghiên c u và phát tri n công ngh sinh h c - i h c Bách Khoa Hà Nn tình ch b o em trong su t quá trình nghiên c hoàn thành lu
Em xin chân thành cGS.TS Nguyn Gc trung tâm nghiên c u s n xu t v c xin và sinh ph m y t n tình ch b o cho em trong sut quá trình nghiên c hoàn thành lu
Em xin cn các th y, cô b môn Công ngh Sinh h c và Công ngh thc ph i h c Bách Khoa Hà Nt ki n th c cho em trong quá trình hc tp và rèn luy n
Trong th i gian h c t p và nghiên c c s d y t n tình ch y trách nhi m c a t p th cán b nghiên c u thu c Trung tâm Nghiên c u S n xu V c xin và Sinh pht m Y t , tôi xin chân thành c quý báu
Cui cùng, cho phép tôi g i l i c luôn quan tâm, c cho tôi vng h c t p và nghiên c u
Hà Ni, tháng 10 2017 Hc viên
Trang 4CÁC CH VI T TT ARN ATCC Axit Ribonucleic American Type Culture Collection (B o tàng gi ng chu n Hoa k ) BS BTP Bovine serum (huy t thanh bê) Bán thành ph m CCID50 Cell Culture Infective Dose 50 (li u gây h y ho i 50% t bào) DU D- kháng nguyên D)
FBS Fetal Bovine serum (huy t thanh bê bào thai)
GMP Good Manufacturing Practice (Th c hành s n xu t tt)
IgA Imuno globulin A
IgG Imuno globulin G
IgM K
Imuno globulin M Mi c h ng âm
MCB Master Cell Bank (ngân hàng t bào g c)
MEM ng c n thi t t i thi u) MS Master Seed (chng gi ng g c)
PB Phospate Buffer
POLYVAC Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals (Trung tâm Nghiên cu, s n xu t V c xin và Sinh ph m Y t) TCMR Tiêm ch ng m r ng
TGC Thioglycolate
SCD Soybean Casein Digest
Vero T bào n kh Cercopithecus aethiops th
Trang 5Mc lc M U 1 NG QUAN 3 1.1 Vi rút B i li t 3 1.1.1.V hình thái h c 3 1.1.2.V thành ph n hóa h c ca vi rút B i li t 3 1.1.3.V tính ch t hóa lý 4 1.1.4.V c u t o c a kháng nguyên 4 1.1.5.V tính sinh mi n d 5 ch1.2 Dch t h c b nh bi lit 5 1.2.1.Tình hình b nh b i lit Vit Nam 5 1.2.2.Tình hình b nh b i lit trên th gi i 6 1.3 Vc xin B i li t 7 1.3.1.V c xin B i li t sng gic lc (OPV) 7
1.3.2.V c xin B i li t bt hot (IPV) 7
Trang 62.2.3 nh gi hi u qu sn xut bn thnh phn vc xin IPV 26
T QU VÀ BÀN LU N 38
3.1 Kt qu nuôi thu Poliovirus 38
3.2 Kt qu tinh ch Poliovirus 40
3.2.1 Kt qu tinh ch Poliovirus bng siêu l c 40
3.2.2 Kt qu tinh ch Poliovirus bng siêu ly tâm 42
3.2.3 Kt qu tinh ch Poliovirus bng sc k 43
3.2.4 Kt qu b t ho t Poliovirus 45
3.3 Kt qu nh gi hi u qu sn xut bn thnh phm vc xin I 47 PV3.3.1 Kim tra vô trng trong c n 47
3.3.2 Kt qu th nghi m nh n d ng 49
3.3.3 King protein 49
3.3.4 Kim tra n formandehyd t 50
Trang 7Danh mc các ng b, bi
B ng 2.1: Ki m tra vô trùng m u v c xin sau ly tâm 26
Bng 2.2: Pha m u chu n BSA cc n 32
Bng 2.3: Pha m u chu n vi thuc th Bradford 1X 32
Bng 2.4: Pha dung d ch formandehyd chun 33
Bng 2.5: Thc hi n phn ng dung d ch formandehyd chun, m u th , m u tr ng vi acetylaceton 34
Bng 3.1: Kt qu nuôi thu Poliovirus 39
Bi 1: Thu nh n Poliovirus typ 1, 2 3 t , d ch nuôi 40
Bng 3.2 Kt qu tinh ch Poliovirus bng siêu lc 41
Bng 3.3 Kt qu tinh ch Poliovirus bp siêu ly tâm 42
B ng 3.4: K t qu tinh ch Poliovirus b ng s c ký 45
B ng 3.5: K t qu ki m tra virus s ng t 46
B ng 3.6: K t qu b t ho t poliovirus 47
B ng 3.7: K t qu th n 48
B ng 3.8: K t qu nh typ Poliovirus b ng th nghi m nh n d ng 49
B ng 3.9 K t qu king protein 49
B ng 3.10: K t qu ki m tra n formandehyd t 50
Trang 8Danh m các hìnhc
Hình 1.1: Hình thái h c Poliovirus 6 ] 3 [2
H m ca mng siêu l c[37] 11
Hnh 1.3: Phân loi mng siêu l c da vo kc cht tan [37] 12
Hình 2.1: Tuyp t bào Vero t ngân hàng t bào Polyvac 17
Hình 2.2: Thc hin siêu l c m u Poliovirus 21
Hnh 2.3: Thc hin siêu ly tâm m u Poliovirus 22 Hnh 2.4: th test c t 24 Hnh 2.5: th ng cond 9 ms/cm 25 Hnh 3.1: T bo bm kn 1 lp 38 Hnh 3.2: T bo b hy hoi do Poliovirus 39 Hình 3.3 K: t qu t gel nh i c 43
Hình 3.4: S tinh ch Poliovirus qua c t DEAE sepharose CL-6B 44
Hình 3.5: Tiêu chu n và k t qu protein toàn ph n trong m u poliovirus 50
Hình 3.6: Tiêu chu n và k t qu n formandehyd t 51
Trang 9M U
B nh b i li t do virus là m b nh truy n nhi m c p tính Th n hình c t a b nh có bi u hi n li t m l i di ch ng, có th d n t i t vong Nguyên nhân gây b nh là do virus b i lit (Poliovirus) týp 1, 2 và 3 [4]
c xin phòng b i li t u ng (OPV, v c xin s ng u ng gi c l c) V c c s d ng trên toàn th gi i 60 c các nhà khoa h và th c t ki m nghim là m t lo i v c xin phòng b nh b i li t có nhi t Chính v c xin p nhic trên th gi c b nh b i li chc Y t Th gi a vào nh ng thành t u do v c nh b i li t trên toàn th gi t nam t nh a th k th 20, tr c dùng v c xin Vi
b i li m 2000 Vi thành m t trong s c trên th gii c b nh b i li t Tuy nhiên do còn nhi c trên th gi i v c b nh b i li t nên T ch c Y t Th gi i khuy n cáo vi c phòng b nh b ng v c xin cho tr em c c ti p t c thc hin.
Vm là ch ng Sabin có ngu n g c t chng hoang dc làm gi c l c, trong quá trình phát tri n t nhiên virus Sabin có th b t bi n và quay tr l i d c l c, có th gây nên b nh b i li t li ênn vi c s d ng v c xin
V c xin IPV (v c xin b i li t b t ho t) i t r t sSalt) ch phm cao là r t an tồn, khơng gây ra hi ng b nh b i li n s d ng v c xin ch c y t th gi i khuy n cáo d ng OPV nên tc chuy n sang s d ng v c xin IPV ti n t i s d ng hoàn toàn b ng v c xin này
Trang 10ph m b o tính an toàn c a v c xin thành ph m, t yêu c u theo nh cn Vi t Nam IV và theo tiêu chu n c a WHO chúng tôi ti n hành nghiên c u tài:
“Nghiên c u quy trình tinh ch poliovirus ph c v phát tri n v c xin b i li t b t ứếụụểắạệ ấhoạt”
Mc tiêu c tài:
- Xây dc quy trình tinh ch virus b i lit sn xu t trên t bào vero N i dung nghiên c u bao g m:
- Nuôi thu Poliovirus
- Nghiên cu xây d ng quy trình tinh ch Poliovirus
Trang 11NG QUAN 1.1 Vi rút B i li t 1.1.1 V hình thái h c ềọi kính hi n t , vi rút B i li t có d ng hình kh i c ng kính kho ng 27-30nm bao g m 1 protein capsit có c u trúc b n v ng bao b c l y ARN c a vi rút Capsit bao g m 60 ti gi ng h t nhau x i x ng 20 m t, m i tig m 4 chu polypeptit là VP1; VP2; VP3; i và VP4 Bu x tia X i ta bi t chi ti t c u trúc c a h t vi rút hoàn ch nh ,7,24,26, 29]. [4 Hình 1.1: Hình thái h c Poliovirus[26 ] 1.1.2 V thành ph n hóa h ềầọc của vi rút Bại liệt
• V t li u di truy n c a Poliovirus: Là ARN m t s u dài 2,4 m, tr ng phân t 2,5 x 10 6 dalton cu n l i n m g n trong v u 5 có m n polypeptit c gi là VPg g m 11 axit amin g u 3 b polyadenyl hóa ARN c vi rút a c chia thành 3 vùng ch y u: Vùng không mã u 5bao g m 740 nucleotide, chi m kho ng 10% v t li u di truy n Khung c m m 6635 nucleotide chi m kho ng 89% v t li u di truy n Vùng bao g m 75 nucleotide, chi m kho ng 1% v t li u di truy n ] [4
Trang 12trung hòa Ngoài ra v capsit còn có tác d ng b o v axit nhân và quy nh kh p ph c a virus lên b m t t bào thông qua các th th c hi u [4]
• Lipit: Virus B i li t không ch a lipit nên không nh y c m v ng ca ete, c n, phenol 1% và các thu c t ng Di ta s d x lý b nh ph c khi phân l p vi mà không làm m rus t hot tính ca rusvi [4]
1.1.3 V tính ch t hóa lý ềấ
Virus B i li t r t nh y c m v i nhi 56oC vi b b t ho t hoàn toàn rus trong vòng 30 phút nhi -2420 oC vi b b t ho t vào cu i tháng th 3 rus nhi 37oC vius gi m hi u giá hàng ngày vào kho ng 0,15 lg ] [5
Virus B i li t u nhi t khi có m t c a c a ion canxi ho c ion mag nie 1M Virus B i li t b n v ng v i d i pH r ng t 2- p nh t t i pH 6,5-7,2 Ngoài ra virus B i li t b b t ho t hoàn toàn b i formandehyd kháng nguyên v n b o t n nguyên v n [2] 1.1.4 V c ề ấu tạ ủo c a kháng nguyên
Kháng nguyên c a h virus hoàn ch nh có t kh m trùng g i là kháng nguyên D (hay còn g i là kháng nguyên N) Khi h virus b t -600C hình thái c a h virus b t i và kháng nguyên D chuy n thành kháng nguyên C (hay còn g i là kháng nguyên H) Kháng nguyên D có h ng s l ng là 160S còn kháng nguyên C có h ng s l ng là 80-90S [4,24]
Kháng nguyên D là h vi hoàn ch nh bao g m c ARN và v capsit, còn t rus kháng nguyên C ch là v capsit không có axit nhân và VP4 Kháng nguyên D và C không có phn ng mi n d ch chéo Hai kh c phát hi n b ng ph n ng k t h thp b và ph n ng k t ta trên thch
Trang 13Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho t t c các typth t o ra kháng th k t h p b th ch t o kháng huyt thanh thì s c kháng th trung hòa [4,5,24] 1.1.5 V ềtính sinh miễn dịchMi n d ch th c truy n t m sang con Kháng th này ch xu t hi n tr m d n và bi n m t khi tr c 6 tháng tu i
Mi n d ch ch ng là s ng mi n d b nhi m vi t rus nhiên ho c s d ng v c x ini mi n d ch quan tr t ng d phòng b nh b ng cách dùng v c xin Khi b nhi m vir B us i li t hoang d i ho vi v c xin c rus t o ra mi n d c hi u ch ng l virus B i li t i Kháng th c hiu ch y u là mi n d ch dch th bao g m IgM, IgG và IgA
Kháng th IgM và IgG phát hi c sau khi nhim vi rút 2-3 ngày Hiu giá kháng th cao nh u và h t sau 2-3 tháng Hi u giá kháng th IgG n t i lâu nh có th t à kháng th trung hòa có kh ng l vi rút B i li t n h i thu giá kháng th IgA phát hi n 2-6 tu n sau khi nhi m vi rút u giá thm trong 3 u sau khi nhi m vi rút và t n t ,4].[21.2 D ch t c b hnh b i li t 1.2.1.Tình hình bệnh bại liệt ở Việt Nam d ch b i li t l c phát hi n Hà N i có kho ng i m x y ra 3 v d ch l n Hà N i và Mi n b c Vi t Nam v i m-90% là tr < 3tu i V d i t l m c trên toàn mi n b c là 44,99/100.000 dân , còn riêng Hà N i t l m c là 226/100.000 dân V c xin b i lic s d u tiên Mi n B c t p v i s ng ít T cu i u dùng v c xin Sabin do Vi t Nam s n xu t và dùng liên tn ngày nay [8]
Trang 14t Nam ti i 1 tun c m r ng trên ph m vi c ng v c xin phòng B i li c k t qu cao Trong nh t 87% và trong nht trên 90% K t cht nh ng ngày tiêm ch ng toàn qu c cho tr i 5 tu i u ng 2 li u v c xin b i li t trên c b nh b i li t gi u chi n d ch nh ng ngày TCTQ, có 152 ca b i li t trong toàn qu c n 1996 ch còn 1 ca 2000 Vi c b nh b i li n thêm ca mc mi nào [8] 1.2.2.Tình hình bệnh bại liệt trên thế ớ gi i t v d ch l n s y ra Stôckhôm ây là v d ch b i li u i ta bin
T cu i th k 19 và nu th k 20 nhi u v d ch l n x y ra châu Âu và Mc bi t sau chi n tranh th gi i l n th II b nh b i li t p th gi i.
V c xin phòng b nh b i li c s d u tiên M ( IPV-1955) và u th c hi n i li c M oán b i li t trong khu v c trình thanh tốn b i li t tồn c tr i 1 tuc tiêm ch ng v c xin phòng B i li t t c còn t cht nh ng ngày tiêm ch ng toàn qu c cho toàn b tr i 5 tu s t trên 95% [7, 35]
gi ng h
Trang 15nh b i li c tuyên b i b chính th c 37 qu c gia m c Trung Qu c và Úc [10]
Châu Âu tuyên b không còn b
i li t ch còn ph bi n 3 qu c gia là Nigeria, Pakistan, và Afghanistan Song, trong th i gian g nh b i li t ra kh i biên gi i c a 3 qu c gia này và ti c láng gi ng Có t i 7 qu t ng "xóa s " b nh b i li t ghi nh n nhi ng h p m c b nh tr l i sau nhi u ng hy v ng có th công b xóa s b nh b i li t trên toàn c t m c này chuy n thành 2005, 2008, 2012, 2015 và gi là 2018[6] 1.3 V c xin Bi lit
1.3.1 V c xin B ắại liệt sống giảm độc lực (OPV)
V c xin s ng gi c lc còn g i là v c s n xu t trên t bào thn kh tiên phát ho c th phát (Vero)[12] Ch ng c s n xu t v c c nh n t ch ng gi c l c do Sabin c y truy n và c i t o t chng hoang d i Vi v c xin Sabin là vi gi rus rus c l c nên virus t o c mi n d ch t i ch và mi n d ch d ch th Vì v y OPV v n vi hoang rusd i vào h ng th th n virus B i li t hoang d i xâm nh p và nhân lên t ng xâm nh p OPV t o mi n d ch s m và t n t i lâu dài, giá thành r , d s d ng nên s d ng r ng rãi trên toàn c u c bi t là các kém phát tri n [8,10]
1.3.2 V ắc xin ại liệ ất hoạ Bt bt (IPV)
Trang 16 a s lan to c a virus t h u h ng và ru n h th ch không th b t ho n ng a s nhân lên c a virus h u h ng và ru t c Khi b nhi m virus B i li t hoang d i nh c tiêm IPV vthi virus ra ngoài và tr thành m t ngu n lây nguy hi m Hay nói cách khác IPV ch có th b o v cho t ng cá nhân riêng l [5,12]
Trang 17và typ III V c ch ng minh m i ta thay th Thimerosal b ng ch t khác V c xin b t ho t còn g i là v c s n xut trên t bào th n kh tiên phát, b t ho t virus b ng formandehyd có n cui cùng là 1/4000 [32,34].Tháng 4/1955, v c xin B i li t b t ho c s d ng tr c mùa d ch B i li t t i M tr m c b nh gi m xu ng t i 90% so v n c khi dùng v c xin K t qu c khi 54% dân s 3 ho c u v c xin b t ho t ch y u là tr [35] emc s n xu t và s d ng nhi c trên th giTi i, n xu t, tinh ch , ki nh v c xin b i li t b t ho u ti n b i so vc s d ng trong thu.u v c c s n xu t trên NCTB th n kh tiên phát trong nh ng
chai nh ( Chai d t, dung tích 1,2- c nuôi c y trên nh ng bình l n (Tank) v i nh ng v t mang vi th (Microcarier) [31,33] c ti p theo c a qui trình s n xu c n i, tinh ch và b t ho t b ng for lo i b tính gây b nh c a virus mà v n gi c tính kháng nguyên [35]u tiên c a v c xin b i li t b t ho t là vi c b t ho t hoàn toàn tính gây b nh c a vir mà không us n kh ng mi n d ch c t qu c a quá trình nghiên c u quá trình virus b b t ho t t i nh ng nhi i các n formandehyd khác nhau Vi nhu ki n thích h p kháng nguyên v n còn tính mi n d ch t m mà virus b t ho t 2,35] [3 tránh nhi m trùng trong quá trình s n xu t m t s c s d các kháng sinh này s c làm gi n m c không th chu c v c xin thành phng nh formandehyd và 2-phenoxyethamol còn l i trong v c xin t b o qu n
Trang 181.4.2 Ơ Nhât Ban
Xut pht t vi c s dng v n c cc v d ch ln - 1961 t ng hp b b i li t xung cng h cc bo c ch ra rng b nh b i li t c liên n virus vc xin, vi c s dng vc xin an to không cn virus vc nh l yêu cu cp thit Nhng nghiên ci ta nh n thy s dng chng virus hoang d sn xut vc xin bt hot th hi u qu bo v t d ng chng gic lc ca Sabin Song vi c s dng ch c l sn xut l rt nguy him vi c sn xu m bo, d dvirus hoang d i ra ngoi c ng [19, 22, 23] Xut pht t tnh hnh trên t cui nh n nghiên cu b i li t Nh t B s d ng chng gic lc c sn xut vc xin b i li t bt ho t [14,15, 18, 21]
Vc xin ca Nh t Bn s d ng t bo Vero nuôi theo h th ng bnh ln c nhng h t rt nh mang t bo ( microcarrier system- celligen plus) chng 3 typ c c gây nhi m trên t bo Vero nuôi cy trong h thng nu cho hi u gi cao Ph thu h i poliovirus tnh theo nn khng nguyên D qua c n c, siêu ly tâm, chy qua c t sc k i ion v bt ho t l 30-50% [33]
Hi n nay Nh t Bn vc xin b i li t bt ho t ch yu dng dng vc xin phi hp DTaP- c s dng vo tiêm chng t [25]
1.4.3 t Nam ỞViệ
Trang 19Trung tâm khoa h c và s n xu t v c xin Sabin B Y t c s tài tr c a B Khoa H c Công Ngh và B Y T u nghiên c u ng d ng qui trình công ngh s n xu t v c xin B i li t b t ho t t chng Sabin t 2003 hi u qu còn th p 1.5 virus 1.5.1 Siêu l ọc c s d ng c, làm s ch, m, lo i b các t p ch t có tr ng phân t thc màng l Siêu l c là quá trình c l c dòng ch y ti p tuy n, công ngh s d ng màng l c có tính th m th c, nh ng ch c gi l i quay tr v bình ch a m u, ch t th c thi ra ngoài H nh 1 m c a m ng siêu l c[37]
Trang 20H nh 1.3: Phân lo i m ng siêu l c d a v o k c ch t tan [37]
S dng màng siêu lc loi 100KDa c l màng 0,01 µm c Poliovirus Poliovirus c kc 27- - v y mng siêu lc kc 0,01 phù h p cho th c hi n siêu l c Poliovirus µm [13]
1.5.2 Siêu ly tâm
d ng máy siêu ly tâm v i s vòng quay r t l n, s quay t o ra l ng khác nhau vào các thành ph khác nhau, các n cht có trng khác nhau trong dung d ch c n ly tâm Công d ng c a siêu ly tâm là tách hn h p các ch t có trng phân t khác nhau[13]
1.5.3 S ắc ký
Trang 211.6 Tiêu chu c a v c xin IPV n
1.6.1 S an xuât
Chng sn xut: S n xu c d a trên h ng ch ng gi ng g c (Master th seed) c a virus hoang d i ho c virus gi c l c c y truy n không quá 2 l n bc phê chu n c a Vi n ki nh qu c gia v c xin và sinh ph m y t (NICVB) Chc bo qu n nhi i -60oC
T bào s n xu t: T bào s d ng cho s n xu t có ngu n g c t t bào th n kh tiên phát ho c t bt các yêu c u c a T chc Y t gi i Có th s th d ng huy ng vt trong nuôi c y t bào [3, 9, 16, 29]
Qui trình s n xu t và ki nh s n xu t: Qui trình s n xu t v c xin ph i theo các quy trình c a T chc Y t gi i Chth c nhân lên trên t bào thn kh tiên phát ho c t bào Vero và s d ng thích h p cho virus phát trin Sau khi g t, h n d n, ly tâm b c n, l c vô trùng, c và tinh khic ti p theo là qui trình b t ho t virus b ng formaldehyd và trung hòa formaldehyd Sau cùng, h n d ch virus c ch thành v c xin b t ho t, tam liên Ph i th c hi n ki nh trong sut quá trình s n xu t n: V t li u ngu n (t ng nuôi cbán thành ph m thô, bán thành ph c khi b t ho t, sau khi b t ho nh m ki m tra tác nhân ngo nh hi u giá v c khi bt ho tinh khi t c s ng ta virus sau khi bt ho [3t , 11, ] 32
1.6.2 Kiê m đi nh văc xin thanh phâm
C m quan: V c xin b i li t bt ho t là m t dung d ch lng, trong
Th nghi m nh n d ng: V c xin b i li t b t hot khi tiêm cho kh hoc chut lang, ph i t c kháng th trung hòa c hiu typs
Trang 22Th nghi m an toàn chung: V c xin b i li t b t ho t ph i an toàn khi th nghi m trên chu t lang và chu t nh t Chu t kh e m ng sau 7 ngày theo dõi
Th nghi m công hi nh n kháng nguyên D c a v c xin b i li t b t ho t t ch ng hoang d i v i v i v i týp 3 V i v c xin b i li t b t ho t t ch i v i týp v i v i v i týp 3 [3]
Trang 23T LIU 2.1 Vt liu ➢ Chng virus: us B i li t typ I: WHO- -90C do Vi n nghiên c u B i li t Nh t B n Vir IS
cung cp Ch ng có ngu n g c t ch c c y truy n 2 l n (SO+2) Hiu giá: 108,3 CCID50/ml
us B i li t typ II: WHO- -90A do Vi n nghiên c u B i li t Nh t B
Vir IIS n
cung cp Ch ng có ngu n g c t ch c c y truy n 2 l n (SO+2) Hiu giá: 108 CCID50/ml
us B i li t typ III: WHO- -79A do Vi n nghiên c i li t Nh t B
Vir IIIS u B n
cung c p Ch ng có ngu n g c t ch c c y truy n 3 l n (SO+3) và 2 l n ch n l c b ng cách t i t (SO+3+2 plaque) Hay còn g i là chng RSO+2 Hi u giá: 10 8,3 CCID50/ml
➢ T bo Vero ATCC
➢ M u chu n v c xin 3 typ Polyvac➢ ng - PB 0,1M Polyvac - PB 0,1M + NaCl 1,5M Polyvac - Trypsin Polyvac - EDTA Gibco- Formandehyd Sigma - Sodium bisulfit Sigma - BS Gibco- FBS Gibco- Thioglycolat Polyvac
- Soybean sca ein Polyvac
- Gel DAEA sepharose CL6B GE
Trang 24- Các lo ng và dung dch dùng cho tách (Trypsin), nuôi cy (DMEM) và gây nhim t bào (M199) do Polyvac s n xu t ➢ Thit b v dng c - Chai nuôi cy Corning- Máy li tâm Nh t Bn - Ht vô trùng Hn Quc - H thng my tinh ch GE(ÄKTAprime plus) - T m Nh t Bn - B n nhi t c - ng Minipore- My siêu l c Minipore- Pipet man c - Pipet AID c - Xilanh Vi t Nam - Trung Qu c - C Trung Quc
- Tuyp 15 vô trng Corning- Tuyp 2 vô trng Corning
2.2 u
Trang 25 quy trnh
T bo Vero
➢ T bo t ngân hàng t bào, ly tâm thu c n chia ra các chai nuôi cy 37o n khi t bào kín 1 l c tách và nuôi i P142 Gây nhim virus ➢ 3 typ virus Polio c gây nhi m riêng r trên các lo t t bào khác nhau T bào sau khi nhi m virus ph c nuôi c y t i m t nhi nh 33o C ng c a nhi <0,50C Thi gian nuôi c 72 gi y
Thu Poliovirus ➢ Khi t bo b hy ho i 90%, l c k cc chai nuôi Ht ht hn d ch trong cc chai vo 1 bnh cha
Chia chai ly tâm 4000 vng/ pht, trong 40 pht L c vô trng ➢ c lc vơ trng 0,22µm
2.2.1.1 o Vero
Trang 26Quy trnh nuôi t bc thc hi sau : Tuyp t bo Vero
P138
P139
➢ Tuyp t bc ly t ngân hng t bo Polyvac i P138 c l ly tâm 4oC trong 10 pht thu c n t bo
➢ Pha long cn chia ra chai nuôi P139 (chai tng di n tích b m t nuôi 636 cm 2 ), nuôi c nh 37oC trong 7 ngy
P140
+ Sau 7 ngy nuôi cy t bo pht trin bm kn 1 lp trên b m t chai, chai t bc ra bng dung d ch Hank (-)
+ Tch t bo bng dung d ch Trypsin -EDTA + Pha long h n d ch t bo
➢ Chia chai nuôi P140, nuôi trong 4 ngy 37oC
P141
+ Sau 4 ngy nuôi cy t bo pht trin bm kn 1 lp trên b m t chai, chai t bc ra bng dung d ch Hank(-)
+ Tch t bo bng dung d ch Trypsin-EDTA + Pha long h n d ch t bo
➢ Chia chai nuôi P141, nuôi trong 4 ngy 37oC
P142
+ Sau 4 ngy nuôi cy t bo pht trin bm kn 1 lp trên b m t chai, chai t bc ra bng dung d ch Hank(-)
+ Tch t bo bng dung d ch Trypsin + Pha long h n d ch t bo
➢ Chia chai nuôi P142, nuôi trong 4 ngy 37oC 2.2.1.2 Gây nhi m virus lên t b o
Trang 27Chng virus s dng l chng Sabin Typ 1 WHO- -90C : IS
Typ 2: WHO- -90A IISTyp 3: WHO-IIIS-79A
Quy trnh gây nhim virus c thc hi sau: P142 ➢ T bo kn 1 lp Ra t bo bng dung d ch Hank (-), hút b ng ra.Gây nhim ➢ B sung 10 ml chng virus Polio vo m t ng chai i nuôi Hp ph trong 1gi , 33oC B sung môi ng duy tr
➢ S d b sung vo cc chai nuôi Th tch nuôi trong m i chai t 140 n 150 ml Nuôi c nh 33oC± 0,5oC trong 72 gi t bào b h y ho i trên 90% tin hành thu Poliovirus
2.2.1.3 Thu poliovirus
Sau 72 h nuôi poliovirus kim tra c hy ho i trên 90% c th g t thu poliovirus H n thu poliovirus cc chai nuôi riêng l vo trong 1 tank cha chung 2.2.1.4 ng Quy trnh l c thc hi quy trnh sau Polivirus
➢ Chia chai ly tâm
Ly tâm 4oC, 4000 vng/ pht trong 40 pht, thu d ch ni
Trang 282.2.2 Phương aphp tinh chê Poliovirus
p tinh ch Po c th c hi n qua c c, siêu ly tâm, sc k v bt ho t qua cu ly m kim tra hi u gi nh gi hi u sut thu hi c n Kim tra protein ton phn trong m u sau sc k, kim tra n formandehyt t nh gi kt qu sn xut vc xin bn thnh phm. quy trnh Poliovirus ➢ Poliovirus sau khi l c vô trng vi mng 0,22µm Siêu l c
➢ c v c xin b ng h th ng siêu l c Millipore Pellicon màng 100KDa, c l màng 0,01 m
Nhm loi b cc ion, mu l i poliovirus bình ch u, t 400-500ml/ phút, áp su t <5 bar Siêu ly tâm ➢ c thc hi c + ly tâm 36.000 vng/ pht trong 4 gi, 4-6oC (thu c n) + ly tâm 15.000 vng/ pht trong 30 pht, 4-6oC (thu c n i) Ch y sc k ➢ Dp sc k i ion, h t sc k DEAE Sepharose CL-6B, h c ml/ phút
+ Thu d ch sau tinh ch l c vô trng 0,22µm
Bt hot ➢ Bt ho t bng formandehyde t l 0,025%, trong 12 ngày 37 oC ( l c 0,22µm vào ngày th trung hòa formandehyde tc xin IPV BTP
Trang 29Cc thc hi n siêu l c Ra lc:
- Kt ni h thng l c vi chai chc c c lc vô tr loi b cc cht bo qun trong mng l c v h thng lc Hình 2.2: Th c hi n siêu l c m u Poliovirus - Ra mng v h thng b tip tc chy loi b ton b m ra khi h thng v mng lc Ch y mu: - u ki400 500 ml/phút, áp su t t , nhim u trong quá trình ch y không quá 33 oC
- H thng l c lm s ch, kt ni vi chai cha Polivirus
- Chy m u nh m lo i b c v c ng thi v thu hi c trong chai cha, ly m u ki m tra hi u gi sau siêu l c poliov c trong nhi -70oC.
2.2.2.2 p siêu ly tâm
Trang 30H nh 2.3: Th c hi n siêu ly tâm m u Poliovirus
a) Ly tâm c 1 nhm thu Poliovirus b lng ng ly tâm, lo i b cc protein c trng phân t nh tr ng phân t c mnh v t bo không b lng [13]
C c ha tan b m PB 0,1M lc nh 4-6o dng s nh tan c n v tch ri cc h t virus
b) Ly tâm c 2 nhm lo i b nhng protein c tr ng phân t ltr ng phân t ca Poliovirus b lng ng ly tâm, thu phn d ch ni cha Poliovirus[13] Ly m u ki m tra hi u gi cc khi chy sc k nh gi hi u sut thu hi cp
2.2.2.3 p s c k
S dg ph p sc k i ion, nhm gi li trên c t cc protein t p, Poliovirus không bm vo h t sc k i v thu cc n
Trang 31bi n tính và hi u su t th p Protein không mang n tích khi pH = pI, tuy nhiên, n u pH th rotein s c lprotein s n tích âm D u này chng tôi ch n h i ion: DEAE sepharose CL 6B là 1 anion y u (d pH: 2-9), t i n PI c a Poliovirus, Poliovirus là anion s c tách ra và th hi n trên s c ký và thu c d a vào s c ký Cc thc hi p sc k: a) Nhi c t: Chai gel 500ml (ch a 20% c n là ch t bo qu n) C t s c ký XK 50 ➢ gel: Lc nh nhàng chai h t s u h t s c ký l ng xu ng, dùng pipet ho nhàng hút c n ra (kho ng 60ml) m PB, khu y nh nhàng tránh t o b t khí, ch l ng Hút h m ra (khong 100ml) m PB vào, khu y nh nhàng, tránh t o b t khí ➢ Ct sc k :
Ra s ch c t m PB vo ng p mng lc 1-2 cm, nh nhng trnh t o bt kh Khuy nh nhng cng h t sc k cho t t vo c t trnh t o b t kh, n khi ht h t sc k chun b ➢ Nn ct : Ch y my vi t 15ml/ ph nn gel, p sut qua c t gel không qu 0,4 bar ( hin th trên bn t ca my) Nén h t s n v trí t u cao ht trong c t nh không b i b) Test t : c
Kim tra hiu qu ca qu trnh nhi ct, kh m vic ca ct sc k
Trang 33c) Ch y mu:
Sau khi test c t c n phi cân bng l i ct b m PB 0,1M n khi th ca ng Cond nh 9 ms/cm
H nh 2.5: th ng cond 9 ms/cm
Dùng xilanh hút m u c n tinh ch ( m b o khi hút không sinh b t khí bên trong xilanh), tiêm m u qua van tiêm m u trên máy tinh ch , th tích m u b ng 6% th tích c t.
t thông s ch y máy quan s th trên my t thu Poliovirus
2.2.2.4 p b t ho t
Theo khuy n cáo c a WHO thì hóa ch t b t ho t vi rút là formandehyd c phép s d ng trong s n xu t v t quá n cho phép (n theo th t quá 0,1% b t k lúc nào trong quá trình b t hong formandehyd tt quá 0,02%
Trang 342.2.3 Phương ap đaphnh gia hiêu qua san xuât ban thanh phân văc xin IPV
2.2.3.1 Ki m tra vô tr ng trong c n
Nhm pht hi n v loi b cc lot t bo, cc lo t bn thnh phm thô, cc lo t bn thnh phm b nhi m vi khu n v nm ➢ ng s d ng - ng phát hi n vi khu n: M ng trong các tuýp 20, mi týp ch a 15 ng - ng phát hi n n c ng trong các tuýp 20, m i tuýp 15 ml ➢ M u th
- Mc ni nuôi t bo - M u thu Poliovirus (BTP thô) - M u b n thnh phm vc xin IPV
Quy trình th nghi c thc hin theo b ng sau
Trang 35➢ nh gi kt qu - n cu i quá trình theo dõi mà t t c các ng th u trong su t, m u c a c coi là âm tính 2.2.3.2 Cách tính hi u su t thu h n siêu l c, siêu ly tâm10c x 100% .10c C: 2.2.3.3 u gi b p chu ng M i m u pha loãng b c 10 và b c 10 0,.5 v i 11 n : t 10 -1 10 -8 c n 11 l pha loãng / 1 m u
Trang 36Mc pha loãng s c nh phi n 96 gi sau : - 5,5 - 6 - 6,5 - 7 - 7,5 - 8 - 8 - 7,5 - 7 - 6,5 - 6 - 5,5 A B C D E F G H M u 1 M u 2 ➢ Nh t bào - Pha hn dch t có n 105 t bào / 1 ml - Pha hn dch t bào bng MEM 2% FBS
- Nh 100 l h ch n d t bào/ gi ng và nh vào t t c các ging - u típ nha 200 nh t bào - Dán kín phi n b➢ Nuôi 36oc k t qu Kt qu c tính theo công th c Karber : 0,5log50NSDLCCID
- L là log c pha loãng cao nh t có 100% có s gi ng hu ho i.
Trang 37- S là t ng s gi ng hu hoi pha lỗng khơng có 100% s gi ng hu ho i.
- N là s gi ng gây nhi m cho m pha loãng.
2.2.3.4 u gi ng kháng nguyên D) b p
ELISA
p ELISA c s d kim tra hi u gi (DU) m u Polioviru s c v sau khi bt ho t nh gi hi u qu bt ho t ❖ Cc ha cht s dng: - Kháng th kháng IgG g m ph , m r a, dung d ch pha kháng th , dung d ch nn, dung dch dng ph n ng. ❖ Cc thc hin - G n kháng th nh t (kháng th th - Pha loãng kháng th th nh t (Mouse McAb) 1:20000 G n b n, 3gi / 36 °C - Ra bng dung dm cho t ng gi ng, l p l i 3 ln - Thêm 150 L dung d ch pha loãng kháng th vào các gi ng - 1gi 36 °C
Trang 38nguyên) v i dung d ch pha loãng kháng th
- Hút dung d ch pha loãng kháng th và lo i b hoàn toàn, thêm 50 L dung dch pha loãng kháng th
- Thêm 50 L c a m i kháng nguyên pha loãng (m u, kháng nguyên chu n, m u chu n kháng nguyên và th c hi n m t lo t pha loãng (x2, x4, x8, ), x16, x32) vào các gisau.
Ging không s d ng- 4 °C
- G n Kháng th hai (Kháng th th
- Pha loãng kháng th th hai b ng dung d ch pha loãng kháng th Kháng nguyên D typ1 và typ 3, pha loãng 1:1000 Kháng nguyên D typ 2 pha loãng 1:2000
- Hút dung dch và ra bng dung dm, l p l i 3 ln
- Lo i b hoàn toàn các ch t l ng còn l i t t t c các gi ng, thêm 50 L kháng th th ng
Trang 39- C ng h p - n 1:30000 b ng dung d ch pha loãng kháng th - Hút và ra các gi ng b ng dung d m, l p l i 3 ln - Lo i b hon ton các ch t l ng còn l i t t t c các gi ng Thêm 50 L HPRO vào m i gi ng - 1 gi 36 °C - Thêm 100 L dung d t vào các gi ng - 20 phút 36 °C, tránh ánh sáng - Thêm 50 L dung d ch d ng ph n ng - c kt qu b ng micro-plate reader tc sóng 492/630 nm - ng D-antigen (Du/mL) bng ph n m cho k thu ng song song (B n quy n Saikin Seizai Kyoukai) 2.2.3.5 Ki ng protein
X nh hng protein s dp Bradford D a trên s k t h p gi a thu c nhu m Coomasie v i protein trong môi tr ng axit hp th nh sng ca dung d ch cha hn d ch protein v thuc nhum c sng 595 nm hp th nh sng t l vi hng protein trong m u H ng protein trong mc x nh da vng chun BSA
➢ Pha dung d ch thuc nhum Bradford
Bradford 5X: Ha tan 100 mg Coomasie trong 50 ml ethanol (tuy i) b sung 100 ml axit photphoric (85%) khuy trong 10 pht, b c ct v 200ml Bradford 1X: Ly 10 ml dung d ch Bradford 5X + 40 ml H2O
➢ Pha dung d ch BSA chun
Trang 40Bng 2.2 Pha m u chu: n BSA cc n Ha cht ng eppendorf 1 2 3 4 5 6 BSA- 10mg/ml (µl) 60 50 40 50 * ** H2O (µl) 420 450 460 950 * ** th tch (µl) 480 500 500 1000 * ** N protein (mg/ml) 1,25 1,0 0,8 0,5 0,25 0,125