L
“Nghi ên c u quy trình tinh ch poliovirus ứ ế
ph c v phát tri n v c xin b i li t b t ho t ụ ụ ể ắ ạ ệ ấ ạ ” là công trình nghiên c u c a tôi cùng nhóm nghiên c u s n xu v c xin b i li t b t ho t t thuc Trung tâm nghiên c u s n
xu t v c xin và sinh ph m y t thc hi i s ng d n c P a GS.TS Quc Phong và GS NguyTS n c s ng ý cng nhóm và t t c các thành viên trong nhóm nghiên c u v vi c công b các n i dung thc hi n và k t qu c Các n i dung nghiên c u và k t qu c trình bày trong luc và rõ ràng
Hc viên
Phm Ích Tùng
Xác nh n c quan (Trung tâm Nghiên c u S n xu t V c xin và Sinh ph m Y t )
Trang 3L I C
Em xin bày t lòng bi n GS.TS P c Phong
c - Trung tâm nghiên c u và phát tri n công ngh sinh h c - i h c Bách
Khoa Hà Nn tình ch b o em trong su t quá trình nghiên c hoàn thành
lu
Em xin chân thành cGS.TS Nguyn Gc trung tâm
nghiên c u s n xu t v c xin và sinh ph m y t n tình ch b o cho em trong
sut quá trình nghiên c hoàn thành lu
Em xin cn các th y, cô b môn Công ngh Sinh h c và Công ngh thc
ph i h c Bách Khoa Hà Nt ki n th c cho em trong quá
trình hc tp và rèn luy n
Trong th i gian h c t p và nghiên c c s d y t n tình ch
y trách nhi m c a t p th cán b nghiên c u thu c Trung tâm Nghiên c u S n
xu V c xin và Sinh pht m Y t , tôi xin chân thành c quý báu
Cui cùng, cho phép tôi g i l i c
luôn quan tâm, c cho tôi vng h c t p và nghiên c u
Hà Ni, tháng 10 2017
Hc viên
Phm Ích Tùng
Trang 4CÁC CH VI T TT ARN
ATCC
Axit Ribonucleic American Type Culture Collection (B o tàng gi ng chu n Hoa k )
FBS Fetal Bovine serum (huy t thanh bê bào thai)
GMP Good Manufacturing Practice (Th c hành s n xu t tt)
IgM
K
Imuno globulin M
Mi c h ng âm MCB Master Cell Bank (ngân hàng t bào g c)
MEM ng c n thi t t i thi u)
MS Master Seed (chng gi ng g c)
POLYVAC Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals
(Trung tâm Nghiên cu, s n xu t V c xin và Sinh ph m Y t) TCMR Tiêm ch ng m r ng
Vero T bào n kh Cercopithecus aethiops th
WCB Working Cell Bank (ngân hàng t bào s n xu t)
WHO/ TCYTTG World Health Organization /T chc y t i th gi
WS Working Seed (ch ng s n xu t)
Trang 5M c l c
M U 1
NG QUAN 3
1.1 Vi rút B i li t 3
1.1.1.V hình thái h c 3
1.1.2.V thành ph n hóa h c ca vi rút B i li t 3
1.1.3.V tính ch t hóa lý 4
1.1.4.V c u t o c a kháng nguyên 4
1.1.5.V tính sinh mi n d 5 ch 1.2 Dch t h c b nh bi lit 5
1.2.1.Tình hình b nh b i lit Vit Nam 5
1.2.2.Tình hình b nh b i lit trên th gi i 6
1.3 Vc xin B i li t 7
1.3.1.V c xin B i li t sng gic lc (OPV) 7
1.3.2.V c xin B i li t bt hot (IPV) 7
1.4 Tình hình nghiên cu và s d ng v c xin IPV 8
1.4.1.Trên th gi i 8
1.4.2 Nh t Bn 10
1.4.3 Vit Nam 10
1.5 virus 11
1.6 Tiêu chu n c a vc xin IPV 13
1.6.1.Sn xut 13
1.6.2.Ki nh v c xin th nh ph m 13
T LIU 15
2.1 Vt liu 15
2.2 p nghiên c u 16
16
2.2.2 p tinh ch Poliovirus 20
Trang 62.2.3 nh gi hi u qu sn xut bn thnh phn vc xin IPV 26
T QU VÀ BÀN LU N 38
3.1 Kt qu nuôi thu Poliovirus 38
3.2 Kt qu tinh ch Poliovirus 40
3.2.1 Kt qu tinh ch Poliovirus bng siêu l c 40
3.2.2 Kt qu tinh ch Poliovirus bng siêu ly tâm 42
3.2.3 Kt qu tinh ch Poliovirus bng sc k 43
3.2.4 Kt qu b t ho t Poliovirus 45
3.3 Kt qu nh gi hi u qu sn xut bn thnh phm vc xin I 47 PV 3.3.1 Kim tra vô trng trong c n 47
3.3.2 Kt qu th nghi m nh n d ng 49
3.3.3 King protein 49
3.3.4 Kim tra n formandehyd t 50
3.3.5 Kt qu tinh ch u su t, hi u qu thu n 51
3.4 xu t quy trình s n xu t IPV bán thành ph m 53
KT LUN 54
KIN NGH 55
TÀI LIU THAM KH O 56
Trang 7Danh m c các ng b , bi
B ng 2.1: Ki m tra vô trùng m u v c xin sau ly tâm 26
Bng 2.2: Pha m u chu n BSA cc n 32
Bng 2.3: Pha m u chu n vi thuc th Bradford 1X 32
Bng 2.4: Pha dung d ch formandehyd chun 33
Bng 2.5: Thc hi n phn ng dung d ch formandehyd chun, m u th , m u tr ng vi acetylaceton 34
Bng 3.1: Kt qu nuôi thu Poliovirus 39
Bi 1: Thu nh n Poliovirus typ 1, 2 3 t , d ch nuôi 40
Bng 3.2 Kt qu tinh ch Poliovirus bng siêu lc 41
Bng 3.3 Kt qu tinh ch Poliovirus bp siêu ly tâm 42
B ng 3.4: K t qu tinh ch Poliovirus b ng s c ký 45
B ng 3.5: K t qu ki m tra virus s ng t 46
B ng 3.6: K t qu b t ho t poliovirus 47
B ng 3.7: K t qu th n 48
B ng 3.8: K t qu nh typ Poliovirus b ng th nghi m nh n d ng 49
B ng 3.9 K t qu king protein 49
B ng 3.10: K t qu ki m tra n formandehyd t 50
B ng 3.11: K t qu thu hn 52
Trang 8Danh m các hình c
Hình 1.1: Hình thái h c Poliovirus 6 ] 3 [2
H m ca mng siêu l c[37] 11
Hnh 1.3: Phân loi mng siêu l c da vo kc cht tan [37] 12
Hình 2.1: Tuyp t bào Vero t ngân hàng t bào Polyvac 17
Hình 2.2: Thc hin siêu l c m u Poliovirus 21
Hnh 2.3: Thc hin siêu ly tâm m u Poliovirus 22
Hnh 2.4: th test c t 24
Hnh 2.5: th ng cond 9 ms/cm 25
Hnh 3.1: T bo bm kn 1 lp 38
Hnh 3.2: T bo b hy hoi do Poliovirus 39
Hình 3.3 K: t qu t gel nh i c 43
Hình 3.4: S tinh ch Poliovirus qua c t DEAE sepharose CL-6B 44
Hình 3.5: Tiêu chu n và k t qu protein toàn ph n trong m u poliovirus 50
Hình 3.6: Tiêu chu n và k t qu n formandehyd t 51
Hình 3.7: Kt qu tinh s n 52
Trang 9M U
B nh b i li t do virus là m b nh truy n nhi m c p tính Th n hình c t a
b nh có bi u hi n li t m l i di ch ng, có th d n t i t vong Nguyên nhân
gây b nh là do virus b i lit (Poliovirus) týp 1, 2 và 3 [4]
c xin phòng b i li t u ng (OPV, v c xin s ng
b i li m 2000 Vi thành m t trong s c trên th gii
c b nh b i li t Tuy nhiên do còn nhi c trên th gi i v
c b nh b i li t nên T ch c Y t Th gi i khuy n cáo vi c phòng
b nh b ng v c xin cho tr em c c ti p t c thc hin
Vm là ch ng Sabin có ngu n g c t chng hoang
dc làm gi c l c, trong quá trình phát tri n t nhiên virus Sabin có th b
t bi n và quay tr l i d c l c, có th gây nên b nh b i li t li ênn vi c
s d ng v c xin
V c xin IPV (v c xin b i li t b t ho t) i t r t s
Salt) ch phm cao là r t an toàn, không gây ra hi ng b nh b i
li n s d ng v c xin ch c y t th gi i
khuy n cáo d ng OPV nên tc chuy n sang s d ng v c
xin IPV ti n t i s d ng hoàn toàn b ng v c xin này
Yêu c u c a v c xin IPV c tinh khi t cao, không ch a các t p ch t, các
protein l Poliovirus tinh khic c n có hi u giá cao, sa c b t ho t
bng formandehyd t tích bán thành
Trang 10ph m b o tính an toàn c a v c xin thành ph m, t yêu c u theo
nh cn Vi t Nam IV và theo tiêu chu n c a WHO chúng tôi ti n
hành nghiên c u tài:
“ Nghiên c u quy trình tinh ch poliovirus ph c v phát tri n v c xin b i li t b t ứ ế ụ ụ ể ắ ạ ệ ấ
hoạt”
Mc tiêu c tài:
- Xây dc quy trình tinh ch virus b i lit sn xu t trên t bào vero
N i dung nghiên c u bao g m:
- Nuôi thu Poliovirus
- Nghiên cu xây d ng quy trình tinh ch Poliovirus
- Nghiên c u b t ho t Poliovirus u qu s n xu t bán thành
ph m v c xin IPV.
Trang 11 NG QUAN 1.1 Vi rút B i li t
• V t li u di truy n c a Poliovirus: Là ARN m t s u dài
2,4 m, tr ng phân t 2,5 x 10 6 dalton cu n l i n m g n trong v u
5 có m n polypeptit c gi là VPg g m 11 axit amin g u 3 b
polyadenyl hóa ARN c vi rút a c chia thành 3 vùng ch y u: Vùng không mã
u 5bao g m 740 nucleotide, chi m kho ng 10% v t li u di truy n Khung
c m m 6635 nucleotide chi m kho ng 89% v t li u di truy n Vùng
bao g m 75 nucleotide, chi m kho ng 1% v t li u di truy n ] [4
• Protein Protein capsit c vi rút B i li t bao g m 4 chu polypeptit VP1 : a i
bao g m 306 axit amin có tr ng phân t 35,5 K ; VP2 bao g m 272 axit Da
amin có tr ng phân t 30,0 kDa; VP3 g m 238 axit amin có tr ng
phân t 26,4 K và VP4 g m 69 axit amin, tr Da ng phân t 7 K Da
VP1, VP2, VP3 t o nên c u trúc b m t c vi còn VP4 n m trong v capsit và a rus
liên k t v i axit nhân (ARN) Các Protein b m t t o nên các v trí kháng nguyên
Trang 12trung hòa Ngoài ra v capsit còn có tác d ng b o v axit nhân và quy nh kh
p ph c a virus lên b m t t bào thông qua các th th c hi u [4]
• Lipit: Virus B i li t không ch a lipit nên không nh y c m v ng ca
ete, c n, phenol 1% và các thu c t ng Di ta
s d x lý b nh ph c khi phân l p vi mà không làm m rus t
hot tính ca rusvi [4]
1.1.3 V tính ch t hóa lý ề ấ
Virus B i li t r t nh y c m v i nhi 56oC vi b b t ho t hoàn toàn rus
trong vòng 30 phút nhi -2420 oC vi b b t ho t vào cu i tháng th 3 rus
nhi 37oC vius gi m hi u giá hàng ngày vào kho ng 0,15 lg ] [5
Virus B i li t u nhi t khi có m t c a c a ion canxi ho c ion
Kháng nguyên c a h virus hoàn ch nh có t kh m trùng g i là
kháng nguyên D (hay còn g i là kháng nguyên N) Khi h virus b t
-600C hình thái c a h virus b t i và kháng nguyên D chuy n thành kháng
nguyên C (hay còn g i là kháng nguyên H) Kháng nguyên D có h ng s l ng là
160S còn kháng nguyên C có h ng s l ng là 80-90S [4,24]
Kháng nguyên D là h vi hoàn ch nh bao g m c ARN và v capsit, còn t rus
kháng nguyên C ch là v capsit không có axit nhân và VP4 Kháng nguyên D và C
không có phn ng mi n d ch chéo Hai kh c phát hi n b ng
ph n ng k t h thp b và ph n ng k t ta trên thch
Kháng nguyên D có kh o kháng th c hi typ và bám u
vào c a t bào c m th , nh th th chvirus có th xâm nh p vào
bên trong t b ào cm th nhân lên
Trang 13Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho t t c các typ
Mi n d ch ch ng là s ng mi n d b nhi m vi t rus
nhiên ho c s d ng v c x ini mi n d ch quan tr t
ng d phòng b nh b ng cách dùng v c xin Khi b nhi m vir B us i li t hoang
d i ho vi v c xin c rus t o ra mi n d c hi u ch ng l virus B i li t i
Kháng th c hiu ch y u là mi n d ch dch th bao g m IgM, IgG và IgA
Kháng th IgM và IgG phát hi c sau khi nhim vi rút 2-3 ngày Hiu
giá kháng th cao nh u và h t sau 2-3 tháng Hi u giá kháng th IgG
n t i lâu nh có th t à kháng th trung hòa có
kh ng l vi rút B i li t n h i thu giá kháng th
IgA phát hi n 2-6 tu n sau khi nhi m vi rút u giá thm trong 3
u sau khi nhi m vi rút và t n t ,4].[2
V d i t l m c trên toàn mi n b c là 44,99/100.000 dân , còn riêng
Hà N i t l m c là 226/100.000 dân V c xin b i lic s d u tiên
Mi n B c t p v i s ng ít T cu i
u dùng v c xin Sabin do Vi t Nam s n xu t và dùng
liên tn ngày nay [8]
Sau khi gi i phóng mi n nam th ng nh nh b i li t
xut hi n nhi c nht là cá c t nh phía nam
Trang 14T cu i th k 19 và nu th k 20 nhi u v d ch l n x y ra châu Âu
và Mc bi t sau chi n tranh th gi i l n th II b nh b i li t p th
gi i
V c xin phòng b nh b i li c s d u tiên M ( IPV-1955) và
u th c hi n
i li c M
oán b i li t trong khu v c
trình thanh toán b i li t toàn c tr i 1 tuc tiêm ch ng
v c xin phòng B i li t t c còn t cht nh ng
ngày tiêm ch ng toàn qu c cho toàn b tr i 5 tu s t trên 95% [7, 35]
th
chim 9.184 (G c , Pakistan, Bangladet) và khu v c Tây Thái
m Trung qu c, Nh t B n, Philipin) Braxin n
l m c r ca do virus hoang da Châu
M tuyên b không còn b nh b i li 1, 25] [1
Trang 15nh b i li c tuyên b i b chính th c 37 qu c gia
m c Trung Qu c và Úc [10]
Châu Âu tuyên b không còn b
i li t ch còn ph bi n 3 qu c gia là Nigeria, Pakistan,
và Afghanistan Song, trong th i gian g nh b i li t ra kh i biên
1.3.1 V c xin B ắ ạ i liệt số ng gi ảm độ c lự c (OPV)
V c xin s ng gi c lc còn g i là v c s n xu t trên t bào
thn kh tiên phát ho c th phát (Vero)[12] Ch ng c s n xu t v c
c nh n t ch ng gi c l c do Sabin c y truy n và c i t o t chng
hoang d i Vi v c xin Sabin là vi gi rus rus c l c nên virus t o
c mi n d ch t i ch và mi n d ch d ch th Vì v y OPV v n vi hoang rus
d i vào h ng th th n virus B i li t hoang d i xâm
nh p và nhân lên t ng xâm nh p OPV t o mi n d ch s m và t n t i lâu dài,
giá thành r , d s d ng nên s d ng r ng rãi trên toàn c u c bi t là các
kém phát tri n [8,10]
1.3.2 V ắ c xin ại liệ ất hoạ B t b t (IPV)
V c xin b i li t b t ho t hay còn g i là v c s n xu t trên t bào
thn kh tiên phát ho c th phát, ch ng c v c xin là ch ng hoang
d i i v i týp 1), MEF (týp 2) và Saukett (týp 3) H u h t các nhà s n
xu t trên th gi u dùng nh ng ch ng này tr Thu n h dùng ch ng
Brunenders cho týp 1 u tiên ci li t b t ho t là vi c b t ho t
hoàn toàn tính gây b nh c a virus mà không n kh
c a chúng V c xin IPV ch có th t ch th , chúng ch có th
Trang 16 a s lan to c a virus t h u h ng và ru n h th
ch không th b t ho n ng a s nhân lên c a virus h u h ng và ru t
c Khi b nhi m virus B i li t hoang d i nh c tiêm IPV v
thi virus ra ngoài và tr thành m t ngu n lây nguy hi m Hay nói cách khác IPV
ch có th b o v cho t ng cá nhân riêng l [5,12]
1.4 Tình hình nghiên c u và s d ng v c xin IPV
c hi n v i virus typ I Nghiên c u trên chu
khnh r ng virus B i li c mi n d ch trên loài g m nh
1952 ti n hành th nghi i tình nguy n cho th y kháng th
t n t i trên 6 tháng Nh ng k t qu nghiên c u này cho th y virus b t ho t b ng
nuôi c y t bào th n kh c b t ho t b ng Formandehyd có kh ng
mi n d ch Hi u l c b o v c a c 3 typ v c xin b t ho t b ng Formandehyd
c ch ng minh qua m t th nghi m l n trên th a c
1954 K t qu c a th nghi m này cho th y v c xin có hi u l c b o v t 80-90%
-70%, typ II và typ III là 90 và trên 90% S khác bi t gi a các
typ và hi u l c th i d ki n là do s có m t c a Thimerosal m t ch t
dùng làm ch t b o qu ng c a ch t này trong typ I l
Trang 17và typ III V c ch ng minh m i ta thay th
chai nh ( Chai d t, dung tích 1,2- c nuôi c y trên
nh ng bình l n (Tank) v i nh ng v t mang vi th (Microcarier) [31,33] c ti p
theo c a qui trình s n xu c n i, tinh ch và b t ho t b ng
for lo i b tính gây b nh c a virus mà v n gi c tính kháng
nguyên [35]u tiên c a v c xin b i li t b t ho t là vi c b t ho t hoàn toàn
tính gây b nh c a vir mà không us n kh ng mi n d ch
c t qu c a quá trình nghiên c u quá trình virus b b t ho t t i
nh ng nhi i các n formandehyd khác nhau Vi
kháng sinh này s c làm gi n m c không th chu c v c xin
thành phng nh formandehyd và 2-phenoxyethamol còn l i trong v c xin
t b o qu n
Hin nay h u h s n xu c Châu
Âu s d ng ch ng virus hoang d i [35]
Trang 181.4.2 Ơ Nhât Ban
Xut pht t vi c s dng v n c cc v d ch ln
- 1961 t ng hp b b i li t xung cng h
cc bo c ch ra rng b nh b i li t c liên
n virus vc xin, vi c s dng vc xin an to không cn virus vc
nh l yêu cu cp thit Nhng nghiên ci ta nh n thy s
dng chng virus hoang d sn xut vc xin bt hot th hi u qu bo v
t d ng chng gic lc ca Sabin Song vi c s dng ch c l
sn xut l rt nguy him vi c sn xu m bo, d d
virus hoang d i ra ngoi c ng [19, 22, 23] Xut pht t tnh hnh trên t cui
nh n nghiên cu b i li t Nh t B s d ng chng gic lc
c sn xut vc xin b i li t bt ho t [14,15, 18, 21]
Vc xin ca Nh t Bn s d ng t bo Vero nuôi theo h th ng bnh ln
c nhng h t rt nh mang t bo ( microcarrier system- celligen plus) chng 3 typ
c c gây nhi m trên t bo Vero nuôi cy trong h thng nu cho
hi u gi cao Ph thu h i poliovirus tnh theo nn khng nguyên D qua
c n c, siêu ly tâm, chy qua c t sc k i ion v bt ho t
l 30-50% [33]
Hi n nay Nh t Bn vc xin b i li t bt ho t ch yu dng dng vc xin
phi hp DTaP- c s dng vo tiêm chng t [25]
1.4.3 t Nam Ở Việ
Vit Nam là m t trong nh c s n xu ng gi c l c t
nhng ch c nh ng v d ch l c b nh
B i li n nay Vi t n xu xin
B i li t b t ho t Theo khuy n cáo c a TCYTTG (WHO) trong th i gian t i Vi t
Nam ph xin B i li t b t ho t Trong khi n u nh c
kinh phí Chính vì v y vi c nghiên c u và s n xu t IPV là r t c n thi t
cho s c kho c ng , 17, 20] [1
Trang 19Trung tâm khoa h c và s n xu t v c xin Sabin B Y t c s tài tr c a
B Khoa H c Công Ngh và B Y T u nghiên c u ng d ng qui trình
công ngh s n xu t v c xin B i li t b t ho t t chng Sabin t 2003
i ta phân chia cho l c, siêu l c d a vào kích t c c a phân t ch t tan,
virus Tính ch t c a siêu l c quynh b i màng l c và m i
s d ng N c thì thu l i t i bình ch a m i, n u l y dung
dc làm s ch gi l i các gel, h ng thì s n ph m thu h i là dung d ch
ng th i
Trang 20H nh 1.3: Phân lo i m ng siêu l c d a v o k c ch t tan [37]
S dng màng siêu lc loi 100KDa c l màng 0,01 µm c
Poliovirus Poliovirus c kc 27- -
v y mng siêu lc kc 0,01 phù h p cho th c hi n siêu l c Poliovirus µm
[13]
1.5.2 Siêu ly tâm
d ng máy siêu ly tâm v i s vòng quay r t l n,
s quay t o ra l ng khác nhau vào các thành ph khác nhau, các n
cht có trng khác nhau trong dung d ch c n ly tâm Công d ng c a siêu ly
tâm là tách hn h p các ch t có trng phân t khác nhau[13]
1.5.3 S ắ c ký
S c ký có nhi c ký l c gel, s c ký gi y, s c
i tách các t p ch t trong m t h n h p Nguyên t c chung
cc ký là cho m u ch a ch t c ng di
chuy phân tách ph thuc vào b n ch t c c ký
nó ph thung phân t n c a các ch t c n phân tách
n s chuy ng c a các thành ph n trong m u, khi các ch t này
di chuy n qua h ng v i t th khác nhau, chúng s c nhau theo thi
gian
Trang 211.6 Tiêu chu c a v c xin IPV n
1.6.1 S a n xuât
Chng sn xut: S n xu c d a trên h ng ch ng gi ng g c (Master th
seed) c a virus hoang d i ho c virus gi c l c c y truy n không quá 2 l n
bc phê chu n c a Vi n ki nh qu c gia v c xin và sinh
ph m y t (NICVB) Chc bo qu n nhi i -60oC
T bào s n xu t: T bào s d ng cho s n xu t có ngu n g c t t bào th n
kh tiên phát ho c t bt các yêu c u c a T chc Y t gi i Có th s th
d ng huy ng vt trong nuôi c y t bào [3, 9, 16, 29]
Qui trình s n xu t và ki nh s n xu t: Qui trình s n xu t v c xin ph i
theo các quy trình c a T chc Y t gi i Chth c nhân lên trên t bào
thn kh tiên phát ho c t bào Vero và s d ng thích h p cho virus phát
trin Sau khi g t, h n d n, ly tâm b c n, l c vô trùng,
c và tinh khic ti p theo là qui trình
b t ho t virus b ng formaldehyd và trung hòa formaldehyd Sau cùng, h n d ch
virus c ch thành v c xin b t ho t, tam liên Ph i th c hi n ki nh trong sut
quá trình s n xu t n: V t li u ngu n (t ng nuôi c
bán thành ph m thô, bán thành ph c khi b t ho t, sau khi
b t ho nh m ki m tra tác nhân ngo nh hi u giá v c khi bt
ho tinh khi t c s ng
ta virus sau khi bt ho [3t , 11, ] 32
1.6.2 Ki ê m đi nh văc xin thanh phâm
C m quan: V c xin b i li t bt ho t là m t dung d ch lng, trong
Th nghi m nh n d ng: V c xin b i li t b t hot khi tiêm cho kh hoc chut
lang, ph i t c kháng th trung hòa c hiu typs
Th nghi m vô khu n: V c xin b i li t b t ho t ph i vô khu n khi ki m tra
vô khu n sau 14 ngày theo dõi
Trang 22Th nghi m an toàn chung: V c xin b i li t b t ho t ph i an toàn khi th
nghi m trên chu t lang và chu t nh t Chu t kh e m ng
sau 7 ngày theo dõi
Th nghi m công hi nh n kháng nguyên D c a v c xin b i
li t b t ho t t ch ng hoang d i v
i v i v i týp 3 V i v c xin
b i li t b t ho t t ch i v i týp
v i v i v i týp 3 [3]
N protein toàn ph n: Không qu 0,1 µg protein trên 1 li u s d ng [3]
Th nghi m ch t gây s t: V c xin b i li t b t ho t ph i an toàn v m t ch t
gây s t Khi tiêm cho th , t ng s nhi a 3 th không quá 1,3oC [3]
Trang 23cung cp Ch ng có ngu n g c t ch c c y truy n 2 l n (SO+2)
Hiu giá: 108,3 CCID50/ml
us B i li t typ II: WHO- -90A do Vi n nghiên c u B i li t Nh t B
cung cp Ch ng có ngu n g c t ch c c y truy n 2 l n (SO+2)
Hiu giá: 108 CCID50/ml
us B i li t typ III: WHO- -79A do Vi n nghiên c i li t Nh t B
cung c p Ch ng có ngu n g c t ch c c y truy n 3 l n (SO+3)
và 2 l n ch n l c b ng cách t i t (SO+3+2 plaque) Hay còn g i là
chng RSO+2 Hi u giá: 10 8,3 CCID50/ml
➢ M u chu n v c xin 3 typ Polyvac
- Gel DAEA sepharose CL6B GE
- Kháng huyc hi u Polio typ I, II, II (20 UI / 0,1ml) (Nh t)
- T bào Hep2C kín 1 l p tr ên chai nha 75cm2 Polyvac
Trang 24- Các lo ng và dung dch dùng cho tách (Trypsin), nuôi cy
(DMEM) và gây nhim t bào (M199) do Polyvac s n xu t
- Tuyp 15 vô trng Corning
- Tuyp 2 vô trng Corning
2.2 u
Trang 25Gây nhim virus
Thu Poliovirus ➢ Khi t bo b hy ho i 90%, l c k cc chai nuôi Ht
ht hn d ch trong cc chai vo 1 bnh cha
Chia chai ly tâm 4000 vng/ pht, trong 40 pht
L c vô trng ➢ c lc vô trng 0,22µm
Hình 2.1: Tuyp t bào Vero t ngân hàng t bào Polyvac
Trang 26Quy trnh nuôi t bc thc hi sau :
Tuyp t bo Vero
P138
P139
➢ Tuyp t bc ly t ngân hng t bo Polyvac
i P138 c l ly tâm 4oC trong 10 pht thu c n t bo
➢ Pha long cn chia ra chai nuôi P139 (chai tng di n tích
b m t nuôi 636 cm 2 ), nuôi c nh 37oC trong 7 ngy
P140
+ Sau 7 ngy nuôi cy t bo pht trin bm kn 1 lp trên b
m t chai, chai t bc ra bng dung d ch Hank (-) + Tch t bo bng dung d ch Trypsin -EDTA
+ Pha long h n d ch t bo
➢ Chia chai nuôi P140, nuôi trong 4 ngy 37oC
P141
+ Sau 4 ngy nuôi cy t bo pht trin bm kn 1 lp trên b
m t chai, chai t bc ra bng dung d ch Hank(-) + Tch t bo bng dung d ch Trypsin-EDTA
+ Pha long h n d ch t bo
➢ Chia chai nuôi P141, nuôi trong 4 ngy 37oC
P142
+ Sau 4 ngy nuôi cy t bo pht trin bm kn 1 lp trên b
m t chai, chai t bc ra bng dung d ch Hank(-) + Tch t bo bng dung d ch Trypsin
Sau 4 ngy nuôi t bo i P142 t bo bm kn 1 lp trên b m t chai nuôi c
th s d gây nhim virus
Trang 27Chng virus s dng l chng Sabin
Typ 1 WHO- -90C : IS
Typ 2: WHO- -90A IIS
Typ 3: WHO-IIIS-79A
Quy trnh gây nhim virus c thc hi sau:
P142
➢ T bo kn 1 lp Ra t bo bng dung d ch Hank (-), hút b ng ra
Sau 72 h nuôi poliovirus kim tra c hy ho i trên 90% c th g t
thu poliovirus H n thu poliovirus cc chai nuôi riêng l vo trong 1 tank cha
➢ Chia chai ly tâm
Ly tâm 4oC, 4000 vng/ pht trong 40 pht, thu d ch ni
H n chung d ch ni cc chai ly tâm vo tank cha
Lc vô trng ➢ S dng mng l c 0,22 µm
Trang 282.2.2 Phương a ph p tinh chê Poliovirus
p tinh ch Po c th c hi n qua c c,
siêu ly tâm, sc k v bt ho t qua cu ly m kim tra hi u gi
nh gi hi u sut thu hi c n Kim tra protein ton phn trong m u sau
sc k, kim tra n formandehyt t nh gi kt qu sn xut vc xin
Siêu ly tâm
➢ c thc hi c + ly tâm 36.000 vng/ pht trong 4 gi, 4-6oC (thu
c n) + ly tâm 15.000 vng/ pht trong 30 pht, 4-6oC (thu
c n i) Ch y sc k
12 ngày 37 oC ( l c 0,22µm vào ngày th
trung hòa formandehyde tc xin IPV BTP
Trang 29Cc thc hi n siêu l c
Ra lc:
- Kt ni h thng l c vi chai chc c c lc vô tr loi
b cc cht bo qun trong mng l c v h thng lc
m u trong quá trình ch y không quá 33 oC
- H thng l c lm s ch, kt ni vi chai cha Polivirus
- Chy m u nh m lo i b c v c ng thi v thu hi
c trong chai cha, ly m u ki m tra hi u gi sau siêu l c
poliov c trong nhi -70oC
2.2.2.2 p siêu ly tâm
Thc: 1) ly tâm t 36.000 vng/ pht trong 4 gi, 4-6oC
2) ly tâm t 15.000 vng/ pht trong 30 pht, 4-6oC
Trang 30H nh 2.3: Th c hi n siêu ly tâm m u Poliovirus a) Ly tâm c 1 nhm thu Poliovirus b lng ng ly tâm, lo i b cc
protein c trng phân t nh tr ng phân t c
mnh v t bo không b lng [13]
C c ha tan b m PB 0,1M lc nh 4-6o dng
s nh tan c n v tch ri cc h t virus
b) Ly tâm c 2 nhm lo i b nhng protein c tr ng phân t l
tr ng phân t ca Poliovirus b lng ng ly tâm, thu phn d ch ni cha
Poliovirus[13] Ly m u ki m tra hi u gi cc khi chy sc k
nh gi hi u sut thu hi cp
2.2.2.3 p s c k
S dg ph p sc k i ion, nhm gi li trên c t cc protein
t p, Poliovirus không bm vo h t sc k i v thu cc n
m trong kho ng cho phép c a h t sc k và không gây bin tnh
protein có th g c lên h t sc k, ít nh t pH ph i
cách 0,5 ho c t so v i pI c i v i anionit, th p
i cationit) pH cách quá xa s t o ra s liên k t quá m nh v
Trang 31bi n tính và hi u su t th p Protein không mang n tích khi pH = pI, tuy nhiên,
n u pH th rotein s c l
protein s n tích âm D u này chng tôi ch n h i ion:
DEAE sepharose CL 6B là 1 anion y u (d pH: 2-9), t i n PI c a
Poliovirus, Poliovirus là anion s c tách ra và th hi n trên s c ký và thu
Ra s ch c t m PB vo ng p mng lc 1-2 cm, nh nhng trnh t o bt kh
Khuy nh nhng cng h t sc k cho t t vo c t trnh t o b t kh, n khi
b) Test t : c
Kim tra hiu qu ca qu trnh nhi ct, kh m vic ca ct sc k
S d m ch cân bng c t l NaCl n khi c c cân bng (
th c 33 ms/cm)
Trang 33c) Ch y mu:
Sau khi test c t c n phi cân bng l i ct b m PB 0,1M n khi th ca
ng Cond nh 9 ms/cm
H nh 2.5: th ng cond 9 ms/cm Dùng xilanh hút m u c n tinh ch ( m b o khi hút không sinh b t khí bên
trong xilanh), tiêm m u qua van tiêm m u trên máy tinh ch , th tích m u b ng 6%
th tích c t.
t thông s ch y máy quan s th trên my t thu
Poliovirus
2.2.2.4 p b t ho t
Theo khuy n cáo c a WHO thì hóa ch t b t ho t vi rút là formandehyd c
phép s d ng trong s n xu t v t quá n cho phép
(n theo th t quá 0,1% b t k lúc nào trong quá trình b t
hong formandehyd tt quá 0,02%
i vi poliovirus s d ng formandehyd bt ho t v i t l 0,025% trong
12 ngy 37oC Vo ngy th 6, v ngy th 12 k t thúc b t ho l t y m kim
tra poliovirus sng t Sau khi b t ho t formandehyd tc trung ha
bng Sodium bisulfit l c vi mng 0,22µm