Đang tải... (xem toàn văn)
Phân lập một số thành phần hóa học từ thân rễ dược liệu hàm liên Marsdenia tenacissima (Roxb.) và nghiên cứu tác dụng phòng ngừa viêm loét dạ dày trên mô hình gây loét dạ dày bằng indomethacin ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu thực vật học cây Hàm liên; Chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa thực vật từ thân rễ cây Hàm liên; Khảo sát tác dụng bảo vệ dạ dày của cao chiết từ thân rễ cây Hàm liên trên mô hình loét dạ dày bằng Indomethacin ở chuột nhắt trắng.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA DƯỢC BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ THÂN RỄ DƯỢC LIỆU HÀM LIÊN Marsdenia tenacissima (Roxb.) VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG PHÒNG NGỪA VIÊM LT DẠ DÀY TRÊN MƠ HÌNH GÂY LT DẠ DÀY BẰNG INDOMETHACIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG NGUYỄN THỊ THANH ĐỒNG NAI, THÁNG 07/2022 TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA DƯỢC BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ THÂN RỄ DƯỢC LIỆU HÀM LIÊN Marsdenia tenacissima (Roxb.) VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG PHỊNG NGỪA VIÊM LT DẠ DÀY TRÊN MƠ HÌNH GÂY LOÉT DẠ DÀY BẰNG INDOMETHACIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THANH Giảng viên hướng dẫn: ThS Võ Văn Lệnh ThS Đoàn Văn Viên ĐỒNG NAI, THÁNG 07/2022 i TĨM TẮT Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học – Năm học: 2021 – 2022 PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TỪ THÂN RỄ DƯỢC LIỆU HÀM LIÊN Marsdenia tenacissima (Roxb.) VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG PHÒNG NGỪA VIÊM LOÉT DẠ DÀY TRÊN MƠ HÌNH GÂY LT DẠ DÀY BẰNG INDOMETHACIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Thị Thanh Giảng viên hướng dẫn: ThS Võ Văn Lệnh, ThS Đoàn Văn Viên Mở đầu đặt vấn đề Hàm liên (Marsdenia tenacissima), thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) – loại dược liệu người đồng bào Ba Na sử dụng để điều trị viêm loét dày theo kinh nghiệm dân gian Đắk Lắk Gia Lai Ở Trung Quốc, Hàm liên đưa vào Dược điển Trung Quốc 2015 có chế phẩm chiết xuất từ Hàm liên điều trị ung thư Ở Việt Nam, Hàm liên phân bố rộng rãi tỉnh miền núi Hà Giang, Lào Cai, Đắk Lắk, Đắk Nông, Gia Lai Tuy nhiên, việc ứng dụng loại dược liệu vào sản xuất sử dụng ngành dược chưa ý nhiều, phần lớn bán qua Trung Quốc Để góp phần cung cấp vào sở liệu khoa học đặc điểm hình thái, vi phẫu, thành phần hóa thực vật tác dụng bảo vệ ngăn ngừa loét dày Hàm liên, đề tài thực với mục tiêu chính: - Nghiên cứu thực vật học Hàm liên; - Chiết xuất, phân lập số thành phần hóa thực vật từ thân rễ Hàm liên; - Khảo sát tác dụng bảo vệ dày cao chiết từ thân rễ Hàm liên mơ hình lt dày indomethacin chuột nhắt trắng Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu - Thân rễ Hàm liên thu hái vào tháng 12 năm 2021 xã Ea-Wy, huyện EaHleo, tỉnh Đắk Lắk Cây định danh theo phương pháp mơ tả hình thái xác định DNA ii - Chuột nhắt trắng khỏe mạnh giống ICR1 trọng lượng 20 - 25 g, - tuần tuổi, đảm bảo sinh lý khỏe mạnh đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu, cung cấp Viện Vắc xin sinh phẩm Y tế Nha Trang Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực vật học Hàm liên - Hình thái, đặc điểm: Quan sát, phân tích, mơ tả đặc điểm hình thái phận Hàm liên (hoa, lá, thân rễ) mắt thường kính soi nổi, lưu lại hình ảnh - Vi phẫu: Chuẩn bị mẫu thân, tươi; đem cắt vi phẫu dụng cụ cắt, sau tẩy, nhuộm theo phương pháp nhuộm kép - Soi qua kính hiển vi, chụp lại đặc điểm vi phẫu, quan sát cấu tạo phận, từ mơ tả đặc điểm giải phẫu mô - Bột: Dược liệu phơi khô, xay mịn; soi bột thân rễ kính hiển vi Ghi nhận lại đặc điểm bột dược liệu - Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật Hàm liên Từ lựa chọn định hướng nhóm chất phân lập Chiết xuất, phân lập số thành phần hóa thực vật từ thân rễ Hàm liên - Khảo sát dung môi chiết cao toàn phần qua nồng độ ethanol (30%, 70%, 90%), tính hiệu suất chiết cao nồng độ cồn Sau kiểm tra SKLM xem nồng độ cồn nhiều vết đậm Từ đưa định lựa chọn dung mơi thích hợp để chiết quy mô lớn - Tiến hành chiết ngấm kiệt 6,4 kg bột thân rễ Hàm liên, cô thành cao đặc bếp cách thủy 60 oC - Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng Kiểm tra cao phân đoạn SKLM, từ lựa chọn cao phân đoạn để phân lập hợp chất sắc ký cột cổ điển - Phân lập hợp chất sắc ký cột cổ điển - Tiến hành tinh khiết hóa kiểm tra độ tinh khiết trước xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết iii Khảo sát tác dụng bảo vệ dày cao chiết từ rễ Hàm liên mô hình loét dày indomethacin chuột nhắt trắng Thực nghiên cứu 10 ngày Chia thành lơ (n=8): - Lơ 1: (Sinh lí): cho chuột uống nước cất - Lơ 2: (Mơ hình): cho chuột uống nước cất, đến ngày thứ 10 nghiên cứu uống liều indomethacin 20 mg/kg - Lô 3: (đối chứng): cho chuột uống esomeprazol liều 20mg/kg Ngày thứ 10 nghiên cứu, sau cho uống esomeprazol, cho chuột uống liều indomethacin liều 20 mg/kg - Lô 4, 5, 6, 7, 8: cho chuột uống cao thử với mức liều là: 100mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg; 400 mg/kg 500 mg/kg Ngày thứ 10 nghiên cứu, sau cho uống cao với liều tương ứng, cho chuột uống liều indomethacin liều 20 mg/kg Sau uống indomethacin, chuột bộc lộ dày, đánh giá mức độ loét, số loét So sánh, thống kê số liệu phần mềm Minitab 19 Từ đưa kết luận tác dụng bảo vệ phòng ngừa loét dày cao thử Kết Nghiên cứu thực vật học Hàm liên Tổng quan hình ảnh, mơ tả chi tiết đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu phận Hàm liên (rễ, thân, lá, hoa) Định danh xác tên khoa học đối tượng nghiên cứu phương pháp đo ADN với phần trăm đồng ADN mẫu đạt 100% Tên khoa học Hàm liên nghiên cứu Marsdenia tenacissima (Roxb.) Xác định bột thân rễ, lá, thân Hàm liên có số thành phần tinh bột, mảnh mạch điểm, mảnh mạch xoắn, tinh thể canxi oxalat, lông che chở đa bào… Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật thân rễ Hàm liên: thành phần hóa học chính: saponin, triterpenoid, alkaloid Từ đó, phân lập triterpenoid alkaloid định hướng iv Chiết xuất, phân lập số thành phần hóa thực vật từ thân rễ Hàm liên Chiết xuất ethanol 70% cho vết rõ nhúng với thuốc thử Dragendoff VS Phân lập chất phân đoạn chloroform (MT1) với độ tinh khiết 96% (HPLC) Khảo sát tác dụng bảo vệ dày cao chiết từ thân rễ Hàm liên mô hình loét dày indomethacin chuột nhắt trắng Xác định liều Dmax cao toàn phần 10.000 mg/kg Tác dụng bảo vệ dày, ức chế loét cao toàn phần thân rễ Hàm liên mức liều 200 mg/kg; 300 mg/kg; 400 mg/kg 500 mg/kg có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình Đề nghị - Tiếp tục tinh khiết MT1 để xác định cấu trúc phương pháp phổ NMR; - Phân lập hợp chất hai phân đoạn cao n-hexan cao ethyl acetat; - Khảo sát tác dụng bảo vệ dày cao phân đoạn chiết từ thân rễ Hàm liên (n-hexan, cloroform, ethyl acetat cao nước) chuột gây loét indomethacin; - Tiến hành nghiên cứu tác dụng điều trị viêm loét dày cao toàn phần chiết từ thân rễ Hàm liên chuột gây loét indomethacin; - Tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng cao thân rễ Hàm liên trung hòa acid dày, khả diệt H.pylori thực nghiệm v MỤC LỤC TÓM TẮT i MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xii LỜI CẢM ƠN xiv Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 2.1 Thực vật học Hàm liên 2.1.1 Tổng quan họ Thiên lý 2.1.2 Đặc điểm thực vật phân loại chi Marsdenia 2.1.3 Tổng quan Hàm liên 2.1.3.1 Đặc điểm thực vật 2.1.3.2 Phân bố, sinh thái 2.1.3.3 Thành phần hoá học 2.1.3.4 Tác dụng sinh học 2.2 Cấu trúc chức dày 14 2.2.1 Cấu tạo giải phẫu mô học dày 14 2.2.1.1 Cấu tạo giải phẫu 14 2.2.1.2 Cấu trúc mô học dày 14 2.2.2 Chức hoạt động sinh lý dày 17 2.3 Nguyên nhân tổn thương dày thường gặp 18 2.3.1 Tổn thương dày thuốc lá, rượu, stress 18 2.3.2 Tổn thương dày H pylori 18 2.3.3 Tổn thương dày thuốc kháng viêm không steroid 19 2.3.4 Các nguyên nhân khác 20 2.4 Một số xét nghiệm phát tổn thương dày 20 2.4.1 Nhóm xét nghiệm xâm lấn 21 vi 2.4.1.1 Sinh thiết 21 2.4.1.2 Xét nghiệm urease nhanh 21 2.4.1.3 Nuôi cấy 21 2.4.2 Nhóm xét nghiệm không xâm lấn 22 2.4.2.1 Xét nghiệm ure thở (UBT) 22 2.4.2.2 Tìm kháng nguyên phân 22 2.4.2.3 Xét nghiệm huyết học 22 2.5 Điều trị viêm loét dày 23 2.5.1 Mục tiêu điều trị 23 2.5.2 Điều trị không dùng thuốc 23 2.5.3 Điều trị dùng thuốc 23 2.6.3.1 Điều trị tiệt trừ H pylori 23 2.6.3.2 Điều trị loét dày – tá tràng NSAIDS 26 2.6 Một số mơ hình gây loét dày động vật thực nghiệm 27 2.6.1 Mơ hình gây lt dày căng thẳng 28 2.6.2 Mơ hình gây loét dày NSAIDSs 28 2.6.3 Mơ hình gây lt dày chuột ethanol HCl 29 2.6.4 Mơ hình gây loét thắt môn vị 29 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30 3.1.1 Nguyên vật liệu 30 3.1.1.1 Dược liệu 30 3.1.1.2 Động vật nghiên cứu 30 3.1.2 Dung mơi – hố chất 30 3.1.3 Trang thiết bị 31 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.2.1 Nghiên cứu thực vật học Hàm liên 33 3.2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật 33 3.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 33 vii 3.2.1.3 Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu 34 3.2.1.4 Định danh tên khoa học Hàm liên phương pháp xác định ADN loài 34 3.2.1.5 Khảo sát thành phần hoá thực vật thân rễ HL 36 3.2.2 Chiết xuất, phân lập số thành phần hóa thực vật từ thân rễ Hàm liên 40 3.2.2.1 Khảo sát điều kiện chiết cao toàn phần 40 3.2.2.2 Tiến hành chiết lô lớn phương pháp ngấm kiệt 40 3.2.2.3 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần 41 3.2.2.4 Phân lập hợp chất kĩ thuật sắc ký cột 41 3.2.2.5 Tinh khiết hóa 42 3.2.2.6 Kiểm tra độ tinh khiết 42 3.2.2.7 Xác định cấu trúc 43 3.2.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ cao chiết từ thân rễ Hàm liên mơ hình lt dày indomthacin chuột nhắt trắng 43 3.2.3.1 Xác định liều tối đa liều độc cấp tính cao tồn phần chiết từ rễ Hàm liên chuột 43 3.2.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ dày esomeprazol chuột nhắt trắng gây loét indomethacin 44 3.2.3.3 Tiến hành thực thử tác dụng chống loét dày cao chiết từ thân rễ Hàm liên chuột 46 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48 4.1 Khảo sát thực vật học 48 4.1.1 Đặc điểm hình thái 48 4.1.2 Đặc điểm vi phẫu Hàm liên 53 4.1.3 Đặc điểm bột dược liệu Hàm liên 57 4.1.4 Định danh tên khoa học Hàm liên phương pháp xác định ADN loài 59 4.1.5 Khảo sát thành phần hoá thực vật Hàm liên 63 4.2 chiết xuất, phân lập số thành phần hóa thực vật từ thân rễ hàm liên 64 viii 4.2.1 Khảo sát quy trình chiết cao tồn phần 64 4.2.2 Tiến hành chiết cao toàn phần phương pháp ngấm kiệt 65 4.2.3 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần 66 4.2.4 Phân lập hợp chất kĩ thuật sắc ký cột 67 4.2.5 Tinh khiết hóa 69 4.2.6 Kiểm tra độ tinh khiết 71 4.2.6.1 Kiểm tra MT1 tinh khiết SKLM 71 4.2.6.2 Kiểm tra độ tinh khiết MT1 HPLC 72 4.2.7 Xác định cấu trúc MT phổ NMR 72 4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ dày cao chiết từ thân rễ Hàm liên mơ hình Lt dày indomethacin chuột nhắt trắng 75 4.3.1 Xác định liều tối đa liều độc cấp tính cao toàn phần chiết từ rễ Hàm liên chuột 75 4.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ dày Esomeprazol chuột nhắt trắng gây loét Indomethacin 76 4.3.3 Kết đánh giá tác dụng chống loét dày cao chiết từ thân rễ Hàm liên chuột 82 4.3.3.1 Đánh giá theo thang điểm Shay 82 4.3.3.2 Theo phương pháp Desai et.al 87 4.3.3.3 Đặc điểm hình ảnh đại thể dày chuột lô 91 4.4 Bàn luận 96 4.4.1 Thực vật học 96 4.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa thực vật thân rễ Hàm liên 96 4.4.3 Tách phân đoạn 97 4.4.4 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ dày cao chiết từ thân rễ Hàm liên mơ hình Lt dày indomthacin chuột nhắt trắng 98 4.4.4.1 Lí lựa chọn mơ hình gây loét dày IND chuột 99 4.4.4.2 Ảnh hưởng cao chiết từ thân rễ Hàm liên lên đặc điểm tổn thương viêm loét cải thiện số ổ loét trung bình mức độ tổn thương dày 100