Phân lập một số thành phần hóa học từ thân rễ dược liệu hàm liên Marsdenia tenacissima (Roxb.) và nghiên cứu tác dụng phòng ngừa viêm loét dạ dày trên mô hình gây loét dạ dày bằng indomethacin ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu thực vật học cây Hàm liên; Chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa thực vật từ thân rễ cây Hàm liên; Khảo sát tác dụng bảo vệ dạ dày của cao chiết từ thân rễ cây Hàm liên trên mô hình loét dạ dày bằng Indomethacin ở chuột nhắt trắng.
TỔNG QUAN
Thực vật học Hàm liên
2.1.1 Tổng quan về họ Thiên lý
Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và chi Hàm liên (Marsdenia) được phân loại như sau:[13], [7], [19]
Phân lớp Hoa môi – Lamiidae
Phân họ Thiên lý – Asclepiadaceae
Chi Hàm liên – Marsdenia Năm 1810, R Brown là người đầu tiên tách một số lớn các chi ra khỏi họ Trúc đào (Apocynaceae) để thành lập họ mới là họ Thiên lý (Asclepiadoideae) Lý do căn bản của sự thay đổi này là do sự có mặt của một cơ quan đặc biệt gọi là cơ quan truyền phấn (translator) ở các chi của họ Thiên lý phân biệt với họ Trúc đào Quan điểm của R Brown đã được đa số các nhà nghiên cứu trong thế kỷ XIX ủng hộ và tiếp tục bổ sung, hoàn thiện Từ những năm 70 của thế kỷ XX, một số tác giả đã bổ sung và điều chỉnh hai hệ thống phân loại trên cho hợp lý hơn hoặc đề xuất hệ thống phân chia khác như V H Heywood (1993), S Liede & F Albers (199) Đáng chú ý là hệ thống của S Liede & F Albers (1994), các ông đã khắc phục được những nhược điểm mà hệ thống K Schumann (1895) và các công trình trước mắc phải, cập nhật thông tin về mặt danh pháp, sử dụng nhiều phương pháp hiện đại như sinh học phân tử, các chương trình máy tính để xây dựng sơ đồ mối quan hệ phát sinh chủng loại Chính vì vậy, hệ thống của S Liede & F Albers (1994) đã trở thành một hệ thống tương đối hoàn hảo, hơn nữa nó phù hợp với việc sắp xếp các taxon của họ Thiên lý ở Việt Nam Đặc điểm hình thái của họ Thiên lý (Asclepiadaceae) qua các đại diện ở Việt Nam[14]
Cây thường leo hay trườn đôi khi đứng, thường có nhựa mủ màu trắng như sữa hay đôi khi không màu Lá thường mọc đối, đôi khi mọc vòng, hiếm khi lá tiêu giảm Thân và lá thường có mủ nhựa trắng Cụm hoa xim với nhiều dạng khác nhau, hiếm khi cụm hoa 1 hoa Hoa lưỡng tính, đều, mẫu 5 Đài hợp Tràng hợp
Bộ nhuỵ có cấu trúc đặc biệt với cơ quan truyền phấn – là cấu trúc đặc trưng của họ Thiên lý (Asclepiadaceae), đặc điểm quan trọng để phân biệt với họ Trúc đào (Apocynaceae) Các hạt phấn hợp thành 4 (tứ tử, bộ bốn) hoặc khối phấn Đầu nhuỵ thường gắn với nhị tạo thành một cấu trúc đặc biệt là cột nhị-nhuỵ (gynostegium) Bầu thượng (bầu trên) Quả của họ Thiên lý là kiểu quả đại, thường gồm 2 đại, đôi khi 1 đại tiêu giảm Quả chưa nhiều hạt, mỗi hạt thường có 1 chùm lông (mào lông) màu trắng ở đỉnh
Họ Thiên lý có khoảng 250 chi với hơn 2000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Ở Việt Nam có 48 chi với 118 loại
2.1.2 Đặc điểm thực vật và phân loại chi Marsdenia
- Tên tiếng Việt: chi Hàm liên
Marsdenia là một chi lớn bao gồm hơn 120 loài, chủ yếu ở khu vực các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, Lào và Trung Quốc Chi Marsdenia lần đầu tiên được R Brown mô tả vào năm 1810, có đặc điểm chung như sau:
Cây leo hay trườn, không có rễ phụ phát triển trên thân, có thể là dây leo hoặc đôi khi trườn dưới mặt đất Lá mọc đối không nạc, phiến lá hình trứng hoặc tim, cuống lá dài, mảnh Cụm hoa xim ở nách lá Hoa nhỏ Thuỳ đài nhỏ, thường hình trứng, đầu hơi tù, gốc đài có các tuyến mọc xen với lá đài, ít khi không có tuyến đài Tràng 5, hình cái hũ, thùy tràng không gập vào trong nụ, xoắn sang phải, họng tràng thường có lông, mặt trong thùy tràng không dày lên (không có gờ) Tràng phụ đơn, dính với cột nhị nhụy, vảy tràng phụ thường ngắn, hình tam giác Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh; hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy phẳng, gồ ghề hay tạo thành hình mỏ chim; đỉnh bầu không thót lại thành hình vòi nhụy Quả dày, nhọn, gồm 2 đại, mặt ngoài nhẵn hay có cánh, đôi khi vỏ ngoài có nước dịch Hạt nhiều, có mào lông ở đỉnh [13][99]
2.1.3 Tổng quan về cây Hàm liên
- Tên khoa học: Marsdenisa tenacissima (Roxb.)
- Tên đồng nghĩa: Asclepias echinate (Hook.f), Asclepias tenacissima (Roxb.), Asclepias tomentosa (Hook.f), Gymnema tenacissima (Roxb.) Spreng, Wight Arn, Pergularia tenacissima (Roxb.) D Dietr
- Tên thường gọi: Dây Hàm liên, Thông quan đằng
- Đặc điểm hình thái của cây Hàm liên:
Hình 2.1 Hình vẽ đặc điểm hình thái cây Hàm liên [97], [37]
Cây thân gỗ cứng, thân mọc dày, hình trụ Lá hình trứng rộng, dài và rộng 15-18 cm, sâu hình tim ở gốc, có lông ở cả hai mặt, hoặc gần như lông tơ Các bao phấn kép hình ô ở nách, dài 5-15 cm; đài hoa thuôn dài, có các tuyến bên trong; tràng hoa màu vàng tím; các thùy phụ của tràng hoa phụ ngắn hơn bao phấn, có cựa ở gốc; khối phấn hình thuôn, mỗi ô 1 cái mọc thẳng, có bột hình tam giác tuyến nhụy hình nón Quả nang hình mác dài, dài khoảng 8 cm, đường kính 1 cm, dày màu đỏ tía, đầu hạt có lông tơ màu trắng Thời kỳ ra hoa là tháng 6 và thời kỳ đậu quả là tháng 11 Có mùi thơm nhẹ, vị đắng và hậu có vị ngọt
Hàm liên thường phân bố ở độ cao 1500 m thuộc ở các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt châu Á Ở Việt Nam, đã tìm thấy ở An Giang, Đắk Nông, Gia Lai, Hà Giang Ở Trung Quốc, tìm thấy chủ yếu ở tỉnh Vân Nam, Quý Châu Ngoài ra, còn có ở Ấn Độ, Sri Lanka, Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonesia [11], [13],
Trong vài thập kỷ qua, các nghiên cứu về các chất hóa thực vật có hoạt tính sinh học từ M tenacissima đã tăng lên đáng kể và nhiều hợp chất mới đã được phát hiện Đến nay, khoảng 196 thành phần bao gồm steroid, acid hữu cơ và triterpenes đã được phân lập
Steroid được coi là nhóm chất đặc trưng và là thành phần chính của M tenacissima , có hoạt tính đảo ngược ức chế đa kháng thuốc [52], [108], [90] Hiện tại, khoảng 155 steroid đã được báo cáo từ thân, rễ và hạt của M tenacissima Dựa trên đặc điểm công thức hóa học, chúng được sắp xếp thành sáu nhóm với khung chất chính là: tenacigenin B, 17β-tenacigenin B, tenacigenin A, 17β-tenacigenin
Bên cạnh các hợp chất trên, các loại steroid cũng đã được phân lập từ M tenacissima, chẳng hạn như marstenacisside A8, marstenacisside B10, marstenacisside B11, cissogenin, tenasogenin , tenacigenin C, 17α marsdenin , isodrevogenin-P và tenacigenin D
Năm 1980, tenacigenin A được báo cáo lần đầu tiên [119], sau đó cho đến ngày nay, 9 chất tương tự tenacigenin B như tenacigenin B lần đầu tiên được phân lập từ chiết xuất ethanol [104] 11α- O -tigloyl-12β- O -acetyltenacigenin B, 11α- O - benzoyl-12β- O -acetyl-tenacigenin B, 11α- O -2- metylbutyryl-12β- O -2- acetyltenacigenin B, 17β-tenacigenin C, tenacissoside O, 12β- O -acetyl-11α- O - iso- butyryltenacigenin B Sau đó, chất 11α, 12β-di- O -acetyltenacigenin B, 32 glycoside tenacigenin B cũng được phân lập từ thân cây này [68], [28], [65], [64],
[70], [105], [29], [105], [28], [91] Mặc dù các dẫn xuất của dihydrosarcostin đã được phát hiện từ năm 1996, dihydrosarcostin không được phân lập từ M tenacissima cho đến năm 2008 [80], [101], [103], [93], [111], [100] Tất cả các chất tương tự bao gồm ba aglycones và hai mươi glycoside được tìm thấy trong thân của cây này[39], [41], [44], [45], [46] Năm 2017 Các chất được phân lập từ rễ cây này như 27 dẫn xuất 17β-marsdenin khác cùng với 23 chất tương tự của 17β-tenacigenin C [76], [77], [78]
Hình 2.2 Một số cấu trúc nhóm Steroid được phân lập trong M Tenacissima
Một số triterpenes đã được phân lập từ thân và rễ M tenacissima như 29-metyl- perhydrophenanthr-1,3-diene đã được phân lập từ rễ của M tenacissima, loại khác các hợp chất như β-amyrin, betulin, acid betulinic, lupeol và 3- O -acetyloleanane- 18-ene-3β-ol đều được tìm thấy trong thân của cây này [42], [113], [88]
M tenacissima có hai acid hữu cơ đã được phân lập từ dịch chiết của cây là amber acid và chlorogenic acid [70], [111] Tuy nhiên, các phương pháp phân lập khác đã chứng minh rằng M tenacissima chứa nhiều acid hữu cơ Bằng cách so sánh với sắc ký và dữ liệu khối phổ của các chất chuẩn, 13 acid hữu cơ đã được xác định trong quá trình tiêm Xiao-ai-ping, bao gồm acid chlorogenic, acid neochlorogenic, acid cryptochlorogenic, acid caffeic, acid sinapic, acid p - hydroxycinnamic, acid syringic, acid gallic, acid 3,4-dihydroxybenzoic, vanillic acid, acid 2,4-dihydroxybenzoic, acid 2,6-dihydroxybenzoic và acid shikimic[110]
Bên cạnh các thành phần trên, một số chất khác đã được phân lập từ M tenacissima như conduritol, dihydro-conduritol, poke-weed cerebroside, N -carboxyl-2- hydroxy-4-pyrrole, D-galactitol, marsectobiose, etyl-β-D xylopyranoside, scopoletin, daucos- terol, β-sitosterol, stigmasterol, scutellarein-40-methylether, kaempferol-40-methylether, kaempferol, acid butanedioic, acid propanoic, 3- propoxy-butyl este (193), acid propanoic, 3-etoxy- butyl este và protocatechualdehyde [103], [87], [102], [66], [95]
Sử dụng trong Y học cổ truyền
Hàm liên có vị đắng, tính hơi hàn, quy kinh phế
Công năng: Giảm ho, giảm thở khò khè, tiêu đờm, hạ sốt và loại bỏ độc tố
Chủ trị: ho, thở khò khè, nhiều đờm, không có sữa sau sinh, thấp khớp, lở loét và áp xe với liều dùng 20 – 30 g [26] Độc tính: Dân gian dùng thân cây để chữa viêm phế quản và chống ung thư, nếu uống quá nhiều sẽ bị ngộ độc Tiêm tĩnh mạch glycosid toàn phần LD50 ở chuột là 274 mg/kg, co giật trước khi chết, ngừng hô hấp trước, ngừng tim ở giai đoạn tâm trương Dịch truyền tai thỏ cô lập có tác dụng giãn mạch trực tiếp [37] Ức chế sự đa kháng thuốc
Cấu trúc và chức năng của dạ dày
2.2.1 Cấu tạo giải phẫu và mô học dạ dày
Dạ dày (ventriculus) là đoạn phình to nhất của ống tiêu hoá, nối giữa thực quản và tá tràng, nằm sát dưới vòm hoành trái, ở sau cung sườn và vùng thượng vị trái Dạ dày rất co giãn, có thể tích từ 2 lít đến 2,5 lít hoặc hơn nữa, nên không có hình dáng nhất định Dạ dày rỗng thường có hình J Hình dạng dạ dày rất thay đổi tuỳ thuộc lượng ăn vào, tư thế, kích thước lồng ngực, tuổi, giới tính, sức co bóp va tuỳ theo cả lúc quan sát
Dạ dày gồm có hai thành trước và sau, hai bờ cong vị lớn và nhỏ và hai đầu: tâm vị ở trên, môn vị ở dưới Kể từ trên xuống, dạ dày gồm có 5 phần: tâm vị, đáy vị, thân vị, phần môn vị và môn vị
2.2.1.2 Cấu trúc mô học của dạ dày [10]
Về mô học, vách dạ dày gồm 5 lớp: niêm mạc, dưới niêm mạc, lớp thanh mạc, lớp dưới thanh mạc và lớp cơ
- Lớp niêm mạc: là lớp trong cùng của thành dạ dày, bề mặt niêm mạc được bao phủ bởi các tế bào biểu mô tạo thành nhiều hố lõm xếp thành các nếp (plicae gastricae), phần lớn chạy theo chiều dọc, nhất là dọc theo bờ cong nhỏ, các nếp trông đều và liên tục hơn tạo thành rãnh gọi là ống vị (canalis ventriculi) Mặt của niêm mạc lổn nhổn vì nổi lên nhiều núm con, mỗi núm con gọi là một vùng dạ dày (areae gastricae) có kích thước thay đổi từ 1 mm đến 6 mm Trên bề mặt niêm mạc có nhiều hố dạ dày (foveolae gastricae) ngăn cách nhau bởi các nếp mao vị Hố là ống tiết của 3 đến 5 tuyến dạ dày (glandulae gastricae) Các tuyến này tiết ra khoảng 2 lít dịch vị mỗi 24 giờ, dịch vị gồm cả hai chất kiềm và acid Riêng các tuyến vùng môn vị (glandulae pyloricae) chỉ tiết ra chất kiềm Rải rác trong niêm mạc còn có các mô bạch huyết và đôi khi chúng tập trung lại thành các nang bạch huyết dạ dày (folliculi lymphatici gastrici) Độ dày của niêm mạc vào khoảng 670 – 829 àm Niờm mạc dạ dày cấu tạo bởi 3 lớp: lớp biểu mụ phủ, lớp mụ đệm và lớp cơ niêm
+ Lớp biểu mô che phủ toàn bộ mặt trong dạ dày từ tâm vị tới môn vị, gồm các tế bào chất nhầy hình trụ, nhân nhỏ nằm lệch về đáy, có chứa một số lượng lớn muxin trung tính nên dễ dàng phát hiện bằng phản ứng acid periodic Dưới kính hiển vi điện tử, các tế bào hình trụ có viền nhung mao ngắn Ở vùng ranh giới khi niêm mạc dạ dày chuyển sang dạng biểu mô Malpighi (biểu mô lát tầng) của thực quản (ở tâm vị) và biểu mô trụ đơn niêm mạc ruột của tá tràng (ở môn vị), bề mặt của dạ dày có chỗ lõm xuống gọi là các khe (crypte) Những khe này rất sâu ở hang vị và nông ở các phần còn lại của dạ dày Các tế bào biểu mô phủ tới tận đáy các khe, nơi các tuyến đổ vào
+ Lớp mô đệm là mô liên kết gồm các tế bào sợi, sợi tạo keo, những sợi cơ trơn và các mạch máu, các mạch bạch huyết nhỏ Trong mô liên kết đó có chứa nhiều tuyến bao gồm:
Tuyến tâm vị: là các tuyến ống đổ vào khe hẹp vài mm nằm giữa niêm mạc thực quản và thân vị Tế bào tuyến là các tế bào hình trụ tiết nhiều chất nhầy
Tuyến thân vị: các tuyến hình ống chạy thẳng từ bề mặt tới lớp cơ niêm thường, có 3 - 4 ống đổ vào cùng một khe Các tuyến này có lòng hẹp và có cấu tạo từ các tế bào:
Tế bào gốc có khả năng phân bào mạnh và biệt hoá tạo các loại tế bào tuyến
Do vậy, toàn bộ tế bào nhầy ở bề mặt được thay thế trong vòng 2-3 ngày, ở cổ tuyến trong vòng 7 ngày Tế bào thành và tế bào chính được thay thế toàn bộ sau
Tế bào nhầy tập trung nhiều ở phần nông nhất của cổ tuyến, hình thái giống các tế bào của hang vị chứa muxin trung tính và muxin acid
Tế bào thành tập trung ở giữa tuyến, là những tế bào hình đa diện ưa acid, có nhiều nhung mao ngắn lồi vào trong lòng tuyến, giúp tăng bề mặt tiết dịch của tế bào Các tế bào thành tiết acid HCl và phần lớn nước, các chất điện giải của dạ dày
Tế bào chính có số lượng ít hơn tế bào thành, là những tế bào hình trụ ưa kiềm và thường tập trung nhiều ở các tuyến Chúng có kích thước nhỏ hơn tế bào thành Các tế bào chính tiết ra các men thuỷ phân pepsinogen thành pepsin
Tế bào ECL (Enter-chromaphile Like) nằm dưới niêm mạc, tiết ra histamin
Tế bào D nằm rải rác trong niêm mạc, tiết ra somatostatin
Tuyến môn vị: tuyến môn vị (hang vị) là những tuyến ống cong queo chia nhánh, chủ yếu tiết nhầy Tế bào D tiết somatostatin cũng có mặt rải rác trong tuyến này ở vùng này còn có những tế bào ưa base tiết ra gastrin
+ Lớp cơ niêm: lớp mỏng đan chéo với các mạch máu, bạch mạch và dây thần kinh
- Lớp dưới niêm mạc: là tổ chức liên kết lỏng lẻo chứa nhiều mạch máu và mạch bạch huyết
- Lớp thanh mạc: là lớp bao ngoài cùng của dạ dày, rất mỏng có chứa các tế bào mỡ và mạch máu
- Lớp dưới thanh mạc: là một tổ chức liên kết rất mỏng, đặc biệt ở hai mặt trước và sau của dạ dày
- Lớp cơ: kể từ ngoài vào trong gồm có:
+ Tầng dọc: liên tục với các thớ cơ dọc của thực quản và tá tràng và dày nhất dọc theo bờ cong nhỏ
+ Tầng vòng bao kín toàn thể dạ dày, đặc biệt dày ở môn vị tạo nên cơ thắt môn vị rất chắc
+ Thớ chéo là một lớp không hoàn toàn, chạy vòng quanh đáy vị và đi chéo xuống dưới về phía bờ cong lớn
2.2.2 Chức năng và hoạt động sinh lý của dạ dày
Vai trò chính của dạ dày là nghiền cơ học thức ăn, thấm dịch vị, tiêu hoá thức ăn nhờ hệ thống enzyme tiêu hoá trong dịch vị
Bình thường dạ dày có các yếu tố huỷ hoại và các yếu tố bảo vệ:
- Lớp nhầy: phủ trên bề mặt niêm mạc Do tồn tại ở dạng gel và do mang tính kiềm nên không thích hợp cho sự tiêu huỷ của pepsin, đồng thời không cho phép acid từ dịch vị tự do khuếch tán sâu vào trong niêm mạc
- Tế bào biểu mô niêm mạc: tái sinh rất nhanh mỗi khi tổn thương, đồng thời sản xuất được một số ion bicarbonate (trung hoà H + của acid, nếu nó qua được lớp gel)
- Prostaglandin: được sản xuất tại chỗ, prostaglandin có tác dụng khuếch đại và điều phối các yếu tố bảo vệ nói trên, giúp cho quá trình tái tạo xảy ra lập tức HCl tiết vào lòng dạ dày do nồng độ quá cao có xu hướng thấm ngược vào vách dạ dày Lớp chất nhầy ngăn cản được 9/10 HCl, chính pepsin tạo điều kiện cho 1/10 HCl thấm qua lớp nhầy nhưng phần lớn bị biểu mô trung hoà (tiết NaHCO3), số còn lại sẽ bị lưới mao mạch thu nhận chuyển đi Tế bào biểu mô bị phá huỷ sẽ được nhanh chóng tái tạo Prostaglandin có tác dụng kích thích sản xuất NaHCO3 giúp tái sinh tế bào và phát triển lưới mao mạch
- Sự tái tạo và hàn gắn:
Những tổn thương do yếu tố tấn công gây ra cho niêm mạc dạ dày được hàn gắn tức thì, kể cả khi nồng độ H + trong dịch vị tăng gấp 5 lần
Nguyên nhân tổn thương dạ dày thường gặp
2.3.1 Tổn thương dạ dày do thuốc lá, rượu, stress
Thuốc lá và rượu đã được khẳng định là yếu tố nguy cơ gây loét dạ dày tá tràng Stress được coi là yếu tố nguy cơ, thông qua việc tiết adrenalin gây co mạch niêm mạc và thông qua ACTH – cortisol gây tăng tiết HCl
2.3.2 Tổn thương dạ dày do H pylori
Việc phát hiện vi khuẩn H pylori đã đem lại sự thay đổi lớn trong hiểu biết và quan niệm về viêm loét dạ dày tá tràng Đây là vi khuẩn có hình xoắn, gram (-), di chuyển được, sống kí sinh ở niêm mạc dạ dày Nó có nhiều biện pháp hữu hiệu để chống lại môi trường acid của dịch vị: đó là do vi khuẩn này có urease nội sinh rất mạnh, tạo ra một lượng lớn NH4OH có khả năng trung hoà acid ở môi trường quanh chúng trong khi pH của dịch vị rất thấp H pylori có vai trò chính trong phần lớn loét tá tràng và dạ dày H pylori được phát hiện ở 90% - 96% người loét dạ dày tá tràng và ít nhất 70% ở người loét dạ dày
Cơ chế gây loét của H pylori:
Enzym urease của H pylori tạo ra amoniac giúp vi khuẩn tạo ra vi môi trường trung tính quanh nó, đồng thời làm tổn thương niêm mạc dạ dày HP có nhiều cơ chế làm tăng tiết acid đã được chứng minh, qua đó tạo điều kiện cho loét
Các enzym tiêu huỷ protein (protease) có vai trò trong bệnh sinh của loét dạ dày- tá tràng Đặc biệt một loại protein được gọi là độc tố tế bào gây hốc: Vaculating cytotoxin – VaC), gây ra các không bào trong tế bào biểu mô niêm mạc Gen liên quan với protein này là Vac-A Ngoài ra, một sản phẩm của gen A liên kết với độc tố tế bào của một protein khác (cytotoxin associated gen A: Cag-A) cũng có vai trò trong bệnh sinh của loét dạ dày tá tràng Những yếu tố này gây tổn thương niêm mạc, gây viêm tại chỗ, với sự thu hút bạch cầu đơn nhân và đại thực bào Ngoài ra, nhiều bằng chứng còn cho thấy HP gây tổn thương dạ dày qua sự kích thích lympho bào tiết IgE, hoạt hoá tế bào mastocyt
2.3.3 Tổn thương dạ dày do thuốc kháng viêm không steroid
Các thuốc kháng viêm không steroid (non-steroid anti inflammatỏy drugs: NSAIDS), là yếu tố nguy cơ gây loét dạ dày – tá tràng nổi bật hiện nay
- Gây tổn thương trực tiếp niêm mạc dạ dày: do tính chất acid yếu của NSAIDS, đặc biệt aspirin nên chúng không bị ion hoá trong môi trường acid cao (ở trong dạ dày) mà phát huy ái tính với lipid, vì thế chúng dễ dàng thâm qua lớp nhầy để tiếp cận với biểu mô, nhưng do pH tương đối cao nên chúng có điều kiện ion hoá để phá huỷ niêm mạc Mặt khác, NSAIDS có khả năng làm giảm tính kị nước của lớp nhày giúp acid khuếch tán tiếp cận với biểu mô niêm mạc
- Một cơ chế khác nữa là khi vào máu NSAIDS được phân huỷ tại gan và hệ võng nội mô để tạo ra các sản phẩm chuyển hoá và được bài tiết theo mật, từ đó gây tổn thương cho niêm mạc ruột (nơi tiếp thu mật)
Cơ chế gây tổn thương gián tiếp cho niêm mạc dạ dày: NSAIDS làm suy giảm hàng rào phòng ngự bằng cách ức chế sự tổng hợp prostaglandin và NO, từ đó gây giảm lưu lượng vi tuần hoàn ở niêm mạc và ngăn cản quá trình tái tạo sửa chữa Trong một số trường hợp cụ thể NSAIDS từ vai trò yếu tố nguy cơ trở thành nguyên nhân gây loét (do tai biến điều trị)
Thuốc lá: Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định vai trò của thuốc lá trong viêm, loét dạ dày Tuy nhiên cơ chế bệnh sinh vẫn chưa rõ ràng
Tuổi: Tỉ lệ viêm loét dạ dày tăng theo tuổi
Di truyền trong bệnh thiếu máu Biermer
Nội tiết: Phối hợp thiếu máu ác tính với viêm tuyến giáp Hashimoto, thiểu năng giáp, đái tháo đường, bệnh Addison Viêm teo dạ dày thường gặp trong các bệnh nội tiết dù không có thiếu máu ác tính Hoặc tiết nhiều hoặc sử dụng nhiều ACTH, cortisol gây suy giảm hàng rào bảo vệ do ức chế tiết dịch dạ dày Glucose máu giảm cũng làm tăng tiết dịch vị, tăng toan
Thần kinh: Cường phó giao cảm gây tăng co bóp và tiết dịch dạ dày, đồng thời rối loạn vận mạch (co thắt mao mạch ở niêm mạc) đưa đến thiểu dưỡng niêm mạc dạ dày Tình trạng này tạo điều kiện cho HCl, pepsin tiêu huỷ niêm mạc dạ dày Tâm lý (lo lắng, buồn bực) có thể có một vai trò nhất định.
Một số xét nghiệm phát hiện tổn thương dạ dày
Nội soi thực quản – dạ dày – tá tràng (oesophago-gastroduodenoscopy – OGD) là biện pháp cần thiết để xác định tình trạng loét, mức độ loét cũng như vị trí loét Nội soi cũng cung cấp mẫu sinh thiết niêm mạc tại vết loét để làm xét nghiệm tìm
Chẩn đoán H pylori được tiến hành thông qua nội soi (nhóm xét nghiệm xâm lấn) hoặc không thông qua nội soi (nhóm xét nghiệm không xâm lấn) [9], [73]
2.4.1 Nhóm xét nghiệm xâm lấn
Nguyên tắc: nhuộm mẫu sinh thiết, sau đó quan sát đặc điểm mô học và tế bào Việc xét nghiệm các mẫu sinh thiết niêm mạc dạ dày vẫn là tiêu chuẩn vàng để phát hiện H pylori, với độ nhạy là 95% và độ đặc hiệu là 98%
Do việc sử dụng rộng rãi các chất ức chế bơm proton (PPI) có thể dẫn đến biểu hiện viêm dạ dày không điển hình hoặc sự thay đổi mật độ vi khuẩn tại các vị trí khác nhau, độ chính xác của chẩn đoán mô học nhiễm H pylori có thể được cải thiện bằng cách sử dụng các kỹ thuật nhuộm đặc biệt, vết miễn dịch đặc hiệu, hoặc bệnh lý kỹ thuật số
Không được ưu tiên trong chẩn đoán ban đầu
Nguyên tắc: Phương pháp này tận dụng lợi thế từ sự hiện diện của men urease được tạo ra bởi H pylori và trong môi trường có ure, enzyme giải phóng amoniac, làm tăng độ pH và dẫn đến sự thay đổi màu sắc của môi trường
Xét nghiệm urease nhanh dễ thực hiện, độ đặc hiệu và độ nhạy cao (> 90%), cho kết quả nhanh và chi phí thấp Tuy nhiên, xét nghiệm này cần yêu cầu mật độ vi khuẩn cao (Ví dụ: trong bộ dụng cụ tiêu chuẩn, cần có ít nhất 104 vi khuẩn trong bệnh phẩm dạ dày) Ngoài ra, kết quả âm tính giả có thể xảy ra khi sử dụng thuốc kháng sinh ức chế H pylori, Bismuth và PPI
Nguyên tắc: Nội soi thu thập các mẫu bệnh phẩm dạ dày để nuôi cấy vi khuẩn, kiểm tra tính nhạy cảm và cuối cùng và xác định kiểu gen của vi khuẩn
Xét nghiệm này được ưu tiên để đánh giá hiệu quả diệt H pylori Tuy xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (100%), nhưng có độ nhạy thấp vì H pylori rất khó nuôi cấy và cần có phòng thí nghiệm có kinh nghiệm nuôi cấy
Nuôi cấy H pylori chỉ thực hiện sau khi điều trị thất bại và cho phép làm kháng sinh đồ
2.4.2 Nhóm xét nghiệm không xâm lấn
2.4.2.1 Xét nghiệm ure hơi thở (UBT)
Nguyên tắc: Tương tự như xét nghiệm urease nhanh, xét nghiệm này dựa vào men urease do vi khuẩn tạo ra, phân hủy ure thành CO2 và amoniac Bệnh nhân được cho uống dung dịch ure có C 13 hoặc C 14 CO2 trong khí thở ra cho biết kết quả dương tính
Xét nghiệm ưu tiên để đánh giá hiệu quả diệt H pylori Độ nhạy và độ đặc hiệu cao khoảng 95% Tuy nhiên, kết quả âm tính giả có thể xảy ra khi sử dụng thuốc kháng sinh ức chế H pylori, Bismuth và PPI
2.4.2.2 Tìm kháng nguyên trong phân
Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao khoảng 95% Việc sử dụng xét nghiệm kháng nguyên phân (hoặc UBT) để chẩn đoán ban đầu nhiễm H pylori và sau điều trị (khi không cần nội soi), đã được khuyến nghị bởi một nhóm 11 chuyên gia tại Hội nghị Đồng thuận Houston
Về mặt lý thuyết và thực tế, xét nghiệm UBT và kháng nguyên phân là những phương pháp tốt nhất để phát hiện nhiễm H pylori đang hoạt động Tuy nhiên, bất kỳ loại thuốc nào làm giảm số lượng H pylori dưới ngưỡng phát hiện có thể gây ra kết quả âm tính giả, đặc biệt là PPI, kháng sinh diệt H pylori và Bismuth 2.4.2.3 Xét nghiệm huyết thanh học
Nguyên tắc: Tìm kháng thể IgG của H pylori trong máu Việc phát hiện IgG huyết thanh chống lại H pylori thường dựa trên các xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA)
Xét nghiệm huyết thanh học không phân biệt được nhiễm H pylori đang hoạt động hay đã qua vì IgG có thể tồn tại đến 6 – 12 tháng sau khi đã diệt H pylori Nên xét nghiệm này không khuyến cáo dùng để đánh giá hiệu quả diệt H pylori
Thường không bị ảnh hưởng bởi PPI, kháng sinh hay Bismuth
Lưu ý: Đối với các xét nghiệm tìm H pylori dạng hoạt động (như các xét nghiệm xâm lấn, UBT, tìm kháng nguyên trong phân), để đảm bảo kết quả đáng tin cậy, cần ngưng PPI ít nhất 2 tuần và ngưng kháng sinh, Bismuth ít nhất 4 tuần trước khi làm xét nghiệm tìm H pylori.
Điều trị viêm loét dạ dày
2.5.1 Mục tiêu điều trị Điều trị viêm loét dạ dày tá tràng cần thiết là làm giảm các triệu chứng và làm lành vết loét, ngăn ngừa biến chứng cũng như ngăn ngừa tái phát [9], [74].
Ngoài ra, mục tiêu điều trị còn phụ thuộc vào tác nhân gây bệnh:
- Loét dạ dày – tá tràng có H pylori (+): Diệt H pylori
- Liên quan đến sử dụng NSAIDS: Ngưng hoặc tối ưu hóa lựa chọn NSAIDS
2.5.2 Điều trị không dùng thuốc
Bệnh nhân loét dạ - dày tá tràng nên tránh tiếp xúc với các yếu tố làm trầm trọng thêm triệu chứng hoặc gây tái phát Bệnh nhân nên giảm căng thẳng và tránh hút thuốc lá, rượu bia, sử dụng NSAIDS hoặc aspirin nếu có thể
Ngoài ra bệnh nhân loét dạ dày – tá tràng cần ăn uống điều độ, không bỏ bữa và tránh các loại thực phẩm cay nóng, caffein…
Các can thiệp phẫu thuật thường dành cho bệnh nhân loét dạ dày – tá tràng có biến chứng
2.6.3.1 Điều trị tiệt trừ H pylori
Bảng 2.1 Tổng hợp các phác đồ điều trị H pylori theo Đồng thuận ASEAN 2016
Tên phác đồ Phối hợp thuốc Thời gian
Cổ điển PPI liều cao + 2 trong 3 kháng sinh sau:
+ Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày + Clarithromycin 500mg x 2 lần/ngày + Metronidazol 500mg x 2 lần/ngày
Có quinolon * PPI liều cao 14 ngày
+ Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày + Levofloxacin 500 mg x 1 lần/ngày Hoặc Moxifloxacin 400mg x 1 lần/ngày Các phát đồ 4 thuốc Đồng thời PPI liều cao
+ Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày + Clarithromycin 500mg x 2 lần/ngày + Metronidazol 500mg x 2 lần/ngày
PPI liều cao + Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày
PPI liều cao + Clarithromycin 500mg x 2 lần/ngày + Metronidazol 500mg x 2 lần/ngày
PPI liều cao + Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày
PPI liều cao + Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày + Clarithromycin 500mg x 2 lần/ngày + Metronidazol 500mg x 2 lần/ngày
PPI liều cao + Bismuth x 4 lần/ngày + Tetracyclin 500 mg x 4 lần/ngày + Metronidazol 500 mg x 2 lần/ngày
PPI liều cao + Bismuth x 4 lần/ngày + Amoxicillin 1g x 2 lần/ngày + Metronidazol 500 mg x 2 lần/ngày
Các phác đồ cứu vãn
PPI liều cao + Bismuth x 4 lần/ngày + Tetracyclin 500 mg x 4 lần/ngày + Furazolidon 500 mg x 3 lần/ngày
PPI liều cao + Bismuth x 4 lần/ngày + Amoxicillin 1g x 3 lần/ngày + Furazolidon 500 mg x 3 lần/ngày
Pantoprazol 80 mg mỗi 8 giờ (hoặc PPI khác liều tương đương)
+ Rifabutin 150 mg x 1 lần/ngày + Amoxicillin 1,5 g mỗi 8 giờ
PPI và amoxicillin liều cao
Rabeprazol 20 mg hoặc Esomeprazol 40 mỗi 6 giờ + Amoxicillin 500-750 mg mỗi 6 giờ
(* phác đồ 3 thuốc có levofloxacin được xem là phác đồ cứu vãn theo hướng dẫn sử dụng kháng sinh của Bộ Y tế 2015)
Lựa chọn phác đồ điều trị H pylori
Hình 2.3 Chọn lựa phác đồ điều trị H pylori lần đầu
Hình 2.4 Lựa chọn phác đồ diệt H pylori sau khi thất bại với phác đồ lần 1
2.6.3.2 Điều trị loét dạ dày – tá tràng do NSAIDS
Lựa chọn điều trị loét dạ dày – tá tràng do NSAIDS phụ thuộc vào bệnh nhân có đồng thời nhiễm H pylori hay không và có giải pháp điều trị thay thế NSAIDS hay không Cần cố gắng tìm giải pháp thay thế để ngưng NSAIDS cho bệnh nhân, nhưng nếu không có giải pháp thay thế và bệnh nhân vẫn phải dùng NSAIDS thì cần cố gắng giảm liều NSAIDS hoặc thay thế bằng thuốc ức chế chọn lọc COX-2 hơn để hạn chế tối đa tác hại của thuốc trên dạ dày
Loét dạ dày – tá tràng H pylori (+)
Khu vực H pylori đề kháng
Khu vực H pylori đề kháng Clarithromycin > 15% Đề kháng Metronidazol < 15% Đề kháng Metronidazol >15%
Phác đồ 3 thuốc cổ điền
Hoặc phác đồ đồng thời Phác đồ 3 thuốc cổ điền
Hoặc phác đồ 4 thuốc có Bi
Phác đồ 3 thuốc cổ điển
Phác đồ 4 thuốc không có Bi
Phác đồ 4 thuốc có Bi
Phác đồ 4 thuốc có Bi
Hình 2.5 Lựa chọn điều trị loét dạ dày – tá tràng do NSAIDS Để điều trị lành vết loét do NSAIDS có thể dùng các thuốc kháng tiết acid hay sucralfat Trong đó, PPI được ưu tiên chọn lựa hơn vì tác dụng giảm tiết acid mạnh và thúc đẩy lành vết loét nhanh hơn.
Một số mô hình gây loét dạ dày trên động vật thực nghiệm
Do mức độ phổ biến của bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng cũng như các biến chứng nghiêm trọng của nó mà từ lâu nhiều mô hình gây bệnh thực nghiệm được tiến hành nhằm tìm ra các thuốc điều trị mới cho căn bệnh này
Một số mô hình gây loét thường được sử dụng như [39]
- Loét do NSAIDS (Indomethacin, aspirin, ibuprofen)
- Loét do thắt môn vị
- Loét do thiếu máu cục bộ
Loét dạ dày – tá tràng ở bệnh nhân dùng NSAID
Làm lành vết loét (PPI/kháng histamin
Thay thế NSAID ức chế chọn lọc COX-2 Làm lành vết loét
- Loét do sắt – acid ascorbic
Tùy vào mục đích từng nghiên cứu, cũng như điều kiện cơ sở vật chất mà mỗi tác giả lại chọn một mô hình khác nhau
2.6.1 Mô hình gây loét dạ dày bằng căng thẳng
Nhiều loại tác nhân gây căng thẳng về thể chất và tâm lý gây ra viêm loét dạ dày, và các mô hình thực nghiệm đã được phát triển để bắt chước tình trạng bệnh ở người Quy trình gây loét bằng nước - mô hình loét do căng thẳng do ngâm nước, bao gồm: động vật nhịn ăn trong khoảng thời gian 24 – 36 giờ trước khi thí nghiệm Sau đó cho động vật quay cuồng trong lồng hạn chế và nhúng chúng theo chiều thẳng đứng trong bể nước (15 – 20 o C) dần dần đến mức ngực trong 17 giờ trong trường hợp "mô hình ngâm trong nước", hoặc 2 – 4 giờ trong nước lạnh khi sử dụng “mô hình ngâm nước lạnh” hoặc trong tủ lạnh thông gió lạnh hạn chế ở nhiệt độ 2 – 3 o C trong 2 – 4 giờ trong trường hợp “mô hình lạnh kiềm chế căng thẳng”
[34], [41], [45] Loét do căng thẳng gây ra biểu hiện đơn lẻ hoặc nhiều vị trí niêm mạc Sinh lý bệnh do căng thẳng gây ra các vết loét rất phức tạp Các vết loét được tạo ra do tăng nồng độ của histamine, dẫn đến tăng tiết axit, giảm sản xuất chất nhầy [44], trào ngược dịch tụy và giảm lưu lượng máu dạ dày [75] Căng thẳng cũng gây ra tăng nhu động đường tiêu hóa dẫn đến các nếp gấp ở dạ dày [69] dễ bị tổn thương hơn khi tiếp xúc với acid [27] Hơn nữa, căng thẳng cũng được phát hiện là làm giảm chất lượng và số lượng chất nhầy dính vào niêm mạc dạ dày Có ý kiến cho rằng, trong điều kiện căng thẳng về cảm xúc, không chỉ phá hủy chất nhầy và giảm tổng hợp thành phần của nó, mà còn là sự thay đổi về chất lượng chất nhầy [69]
2.6.2 Mô hình gây loét dạ dày bằng NSAIDSs
NSAIDS như indomethacin, aspirin và ibuprofen được biết là gây loét dạ dày, đặc biệt là khi bị lạm dụng Mô hình này rất quan trọng trong việc nghiên cứu tác dụng của các chất chống tiết và bảo vệ tế bào vì sinh lý bệnh cơ bản liên quan đến acid dịch vị bài tiết và tổng hợp prostaglandin niêm mạc Nó là mô hình loét được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu chất chống loét Do NSAIDS là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây ra loét dạ dày tá tràng sau Helicobaceter pylori Aspirin và indomethacin được sử dụng thường xuyên nhất trong nhóm mô hình này
2.6.3 Mô hình gây loét dạ dày chuột bằng ethanol và HCl
Ethanol tuyệt đối ăn mòn niêm mạc dạ dày gây tổn thương niêm mạc dạ dày cấp tính do khả năng hòa tan lớp nhầy bảo vệ và để niêm mạc tiếp xúc với các hoạt động phân giải protein và thủy phân của axit clohydric và pepsin [18], gây ra tổn thương cho màng [40] Hơn nữa, nó kích thích tiết acid và giảm lưu lượng máu dẫn đến chấn thương vi mạch thông qua sự gián đoạn của mạch máu nội mô và tạo điều kiện thuận lợi cho tính thấm thành mạch; nó cũng làm tăng hoạt động của xanthine oxidase Ethanol tạo ra các tổn thương hoại tử trong niêm mạc dạ dày của động vật do tác dụng độc trực tiếp làm giảm sự bài tiết của bicarbonat và làm cạn kiệt chất nhầy trong dạ dày ở động vật
Tác hại của ethanol đã được ứng dụng trong mô hình gây viêm loét dạ dày - tá tràng cấp tính không phụ thuộc vào sự tiết axit dạ dày Mô hình này có thể không thích hợp hoặc không hữu ích cho việc đánh giá tác dụng của thuốc giảm tiết Thay vào đó rất hữu ích để nghiên cứu hiệu quả của thuốc có tác dụng bảo vệ tế bào và/hoặc các hoạt động chống oxy hóa
2.6.4 Mô hình gây loét bằng thắt môn vị
Thắt môn vị gây ra tình trạng tích tụ acid dịch vị trong dạ dày từ đó dẫn đến tổn thương niêm mạc dạ dày Những vết loét này là do niêm mạc dạ dày tự tiêu dẫn đến phá vỡ hàng rào niêm mạc dạ dày Vì vậy, về cơ bản, sự gia tăng tích tụ acid pepsin do tắc nghẽn môn vị có thể gây ra quá trình tiêu hóa niêm mạc tiếp theo
Mô hình này phù hợp để đánh giá tác dụng của thuốc ức chế bài tiết acid dạ dày, cũng như thuốc làm tăng chất nhầy bảo vệ dạ dày
Trong nghiên cứu này tiến hành nghiên cứu trên mô hình gây loét bằng indomethacin nhằm đánh giá khả năng bảo vệ và tăng tiết chất nhầy theo cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày – tá tràng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Hàm liên được thu hái vào tháng 12 năm 2021 tại xã Ea-Wy, huyện Ea-Hleo, tỉnh Đắk Lắk Dược liệu được định danh bằng phương pháp mô tả hình thái tại Bộ môn Thực vật dược, Khoa Dược, Đại học Lạc Hồng và phương pháp DNA
Phần thân rễ của dược liệu được cắt để riêng, cạo sạch vỏ ngoài, rửa sạch, thái phiến 0,5-2 cm, sấy khô ở nhiệt độ 60 o C, xay thành bột mịn (500)
Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, giống đực, chủng ICR, trọng lượng 28 – 35 g, 7 – 8 tuần tuổi, đảm bảo sinh lý khỏe mạnh đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và sinh phẩm Y tế Nha Trang và được nuôi bằng thức ăn do viện cung cấp Chuột được nuôi ổn định một tuần tại phòng thí nghiệm dược lý trường Đại học Lạc Hồng trước khi tiến hành thử nghiệm Chuột được nuôi trong những bocal nhựa có nắp lưới inox được thiết kế đặc biệt để chuột có thể dễ dàng tiếp xúc với thức ăn và nước uống Thời gian thử nghiệm trong nghiên cứu tác dụng bảo vệ dạ dày từ ngày 27/03/2022 đến ngày 25/7/2022
Hóa chất phân lập và nghiên cứu dược lí
STT Dung môi- hóa chất Xuất xứ n-Hexan Trung Quốc
STT Tên thiết bị Xuất xứ
1 Bình ngấm kiệt kích thước 8 x 15 x 50cm và 20 x 40 x
2 Cân phân tích Sartorius BP-221S Đức
3 Cân kỹ thuật EW-600-2M độ nhạy 0,1 g Merck
4 Cân hồng ngoại MA 45 Sartorius Đức
5 Cột thủy tinh dành cho sắc ký cột cổ điển (đường kính 3,5 cm, chiều dài cột 67 cm)
6 Cột thủy tinh dành cho rây phân thử Đức
7 Đèn soi UV 254 nm và 365 nm Vilber Lourmat CN-15-LC Pháp
Biệt dược: Mekoindocin25; Công ty
Mekophar-lô 19008CN; Sản xuất ngày:
Esomeprazol 40mg; viên nén bao phim
Biệt dược: Nexium mups 40- Astrazeneca – lô NA19034; Sản xuất: 2/1/2021;
Nước muối sinh lí Việt Nam Đá CO2 Việt Nam
Silica gel kích thước 0,040-0,063mm Merck
Bản sắc ký tráng sẵn silica gel F254 Merck
8 Bình hút ẩm với chất hút ẩm là silica gel Duran- Đức
9 Tủ sấy hiệu Memmert Đức
11 Máy cô quay IKA Đức
12 Bếp cách thủy Memmert ULM-500 Đức
13 Bể siêu âm Elma S180 tần số 37 kHz Đức
14 Máy khuấy Heidolph RZR 2010 Đức
15 Máy bơm nhu động Mỹ
16 Máy hút chân không Mỹ
17 Hệ thống HPLC-PDA của Agilent Mỹ
18 Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) BRUKER-AV-
19 Máy đo khối phổ Micromass Quattro microTM API -
20 Kính hiển vi quang học CH20 BIMF200 Olympus Nhật Bản
21 Kính soi nổi Nhật Bản
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Nghiên cứu thực vật học cây Hàm liên
Mẫu tươi sau khi thu hái, rửa sạch bụi bẩn, để khô ráo tự nhiên trong bóng râm Một phần thân, lá, rễ được bảo quản còn tươi để làm vi phẫu thực vật Một phần được bảo quản trong túi nilon sạch, để quan sát đặc điểm hình thái Phần còn lại được đem đi sấy khô, nghiền mịn để soi đặc điểm bột dược liệu (lá, thân, rễ) 3.2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật
- Mô tả đặc điểm thực vật của mẫu nghiên cứu theo tài liệu [2]
- Quan sát, mô tả đặc điểm bằng mắt thường, chụp hình ảnh chi tiết từng bộ phận của cây
3.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu
Chuẩn bị mẫu thân, lá tươi; đem cắt vi phẫu bằng dụng cụ cắt, sau đó tẩy, nhuộm theo phương pháp nhuộm kép
Soi qua kính hiển vi, chụp lại đặc điểm vi phẫu, quan sát cấu tạo các bộ phận, từ đó mô tả đặc điểm giải phẫu các mô
- Phương pháp cắt vi phẫu: cầm mẫu vật cần cắt trên tay hay đặt trên bàn Dùng dao lam cắt ngang (hay cắt dọc) thành những lát mỏng cho vào chén đựng vi phẫu Đối với thân cây, cắt ở phần lóng, không cắt sát và ngay mấu Đối với phiến lá, cắt ở khoảng 1/3 phía dưới nhưng không cắt sát đáy phiến
- Phương pháp nhuộm vi phẫu: sử dụng phương pháp nhuộm kép son phèn và lục iod để nhuộm vi phẫu Mẫu được cắt ngang thành những lát mỏng và được ngâm với Javel trong khoảng thời gian 15 – 20 phút để tẩy mẫu, rửa sạch mẫu với nước cất từ 3 – 4 lần, sau đó ngâm tiếp với acid acetic 5 % để trung hòa lượng Javel còn dư, tiếp tục loại bỏ acid và ngâm trong dung dịch son phèn trong khoảng 15 phút Sau khi đủ thời gian, mẫu được rửa sạch với nước và ngâm nước cất để bảo quản mẫu trong quá trình quan sát
Sau khi nhuộm, vách tế vào bằng cellulose (tế bào biểu bì, mô mềm, mô dày và mô libe) sẽ có màu hồng hay màu hồng tím, vách tế bào tẩm chất gỗ (mô cứng, gỗ) hay chất bần (bần, tầng bần suberin và tầng suberoid) sẽ có màu xanh nước biển, màu xanh rêu hay màu vàng chanh, quan sát và ghi nhận lại hình ảnh dưới kính hiển vi lần lượt ở các vật kính 10X và 40X
3.2.1.3 Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu
Dược liệu được phơi khô, xay mịn; soi bột thân và rễ dưới kính hiển vi Ghi nhận lại các đặc điểm của bột dược liệu
3.2.1.4 Định danh tên khoa học Hàm liên bằng phương pháp xác định ADN của loài [32], [46], [54], [83], [33], [47], [55], [63]
Nơi thực hiện phân tích: Phòng Thí nghiệm Di truyền và Chọn giống Cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ
Người thực hiện: Ks Nguyễn Văn Mạnh
Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi RbcL sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tm
(Ghi chú: Tm, nhiệt độ gắn mồi)
Phương pháp ly trích DNA
DNA của mẫu lá được ly trích theo phương pháp CTAB (Doyle & Doyle, 1990) Quy trình ly trích DNA được thực hiện như sau:
Trước tiên cân 100 mg mẫu cho vào cối và tiến hành nghiền mịn trong 1 ml dung dịch CTAB 2X đó được ủ ở 65 0 C trong 15 phỳt, sau đú thờm vào từng tuýp 10 àl β-mercaptoethanol Tiến hành ủ ở nhiệt độ 65 0 C trong 60 phút (cứ 10 phút lắc trộn đều mẫu 1 lần) Tiếp theo cho thờm vào mỗi tuýp 500 àl chloroform, trộn đều và đem ly tõm 13000 vũng trong 10 phỳt Rỳt 750 àl phần dung dịch bờn trờn cho vào tuýp mới, sau đú tiếp tục thờm vào 500 àl chloroform, trộn đều và ly tõm 13000 vũng trong 10 phỳt Rỳt tiếp 650 àl lớp dịch bờn trờn và cho vào tuýp mới, sau đú thờm 500 àl chloroform vào mỗi tuýp và ly tõm 13000 vũng trong 10 phỳt Tiếp theo rỳt mỗi tuýp 400 àl lớp dịch bờn trờn và cho vào tuýp mới, đồng thời thờm
400 àl isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở nhiệt độ –20 0 C trong 30 phỳt Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong phút, tiến hành đổ bỏ cẩn thận phần dung dịch bờn trờn, giữ lại phần kết tủa lắng tụ bờn dưới Thờm 500 àl ethanol 70% vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để rửa sạch mẫu, sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa Thờm tiếp tục 500 àl ethanol 70% vào mỗi tuýp để rửa sạch mẫu lần hai và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút Sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa Dùng micropipet hút sạch phần cồn còn sót lại trong mỗi tuýp và đem mẫu đi phơi khô (phơi dưới quạt trần) trong 1 giờ Cuối cùng thêm vào mỗi tuýp 30 àl TE (pH = 8,0) để hũa tan DNA và trữ lạnh ở nhiệt độ – 20 0 C
Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di trên gel Agarose
DNA sau khi được ly trích và tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% Quy trình thực hiện gồm các bước sau: Đầu tiên cân 0,25 g agarose cho vào bình tam giác, thêm vào 25 ml dung dịch TAE 1X, đậy kín bằng màng bao thực phẩm, lắc đều và cho vào máy microwave đun sôi trong 1 phút Lấy ra để nguội khoảng 5 phút Sau đó đổ vào khuôn điện di và đợi gel đặc lại khoảng 30 phút Tiếp theo, nhẹ nhàng tháo lược ra và cho gel vào dung dịch TAE 1X trong bộ điện di sao cho gel ngập trong phần dung dịch Trộn đều mỗi mẫu với 1 àl loading dye 6X, 1 àl DNA và 4 àl nước PCR trờn giấy parafilm rồi cẩn thận bơm từng mẫu vào giếng trên gel Sau khi bơm xong, đậy nắp bộ điện di lại và bắt đầu chạy điện di mẫu ở 85 V trong 30 phút Sau đó đem nhuộm trong ethidium bromide (10 mg/lít) khoảng 10 phút Kế tiếp đem rửa trong nước cất trong 5 phút và đem chụp ảnh gel với máy đọc gel bằng tia UV
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) hay còn gọi là phản ứng khuếch đại DNA, mỗi phản ứng bao gồm 50 àl, sử dụng bộ PCR KIT (NEXpro TM Diagnostics) gồm các thành phần 10X e-Taq Buffer, 10 mM dNTP, e-Taq DNA Polymerase, thêm vào nước tinh sạch, cặp mồi RbcL và DNA Tất cả được trộn đều trước khi cho vào máy PCR GeneAmp PCR System 2700 Phản ứng này được thực hiện trong 35 chu kỳ gia nhiệt, bao gồm: 5 phút ở 95 0 C, 30 giây ở 95 0 C, 30 giây ở 60
0C, 30 giây ở 72 0 C Kéo dài chuỗi trong 5 phút ở 72 0 C và sản phẩm được trữ ở
10 0 C trong 20 phút Điện di sản phẩm PCR và giải trình tự Điện di sản phẩm PCR rồi tinh chế bằng bộ kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up System (Promega), sau đó được gửi đi giải trình tự bằng phương pháp Sanger [84] tại công ty Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh
Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm GelAnalyzer Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản cập nhật mới nhất 7.0.5 (Thomas A Hall, 1999) Sau đó bằng phương pháp BLAST trên hệ thống ngân hàng gene NCBI (National Center for Biotechnology Information) dùng cho việc nhận diện loài
3.2.1.5 Khảo sát thành phần hoá thực vật trong thân rễ HL
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chuẩn bị dịch chiết để thử sơ bộ hóa thực vật
Phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật trong cây HL được tham khảo trong tài liệu [8], [12], [3]
Chiết 10 g bột dược liệu HL bằng diethyl ether trong bình nón (lắc, siêu âm 2, 3 lần) thu được dịch chiết lọc và cô còn khoảng 50 ml Bã dược liệu tiếp tục chiết tương tự với cồn cao độ thu được dịch chiết cồn, một phần dịch chiết cồn được thủy phân bằng cách lấy 15 ml dịch chiết cho vào bình nón 100 ml, thêm 10 ml acid hydrochloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, cô còn 50%, thêm 20 ml nước, để nguội, cho vào bình lắng gạn và chiết bằng ether ethylic (15 ml x 3 lần) thu được dịch chiết cồn thủy phân
Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn mang đi chiết nóng với nước trong bình nón trên bếp cách thủy sôi, gộp dịch, để nguội, lọc, cô còn khoảng 50 ml Thủy phân dịch chiết nước tương tự như với dịch chiết cồn và thu được khoảng 15 ml dịch chiết nước thủy phân Dịch chiết đã được thủy phân dùng để định tính các aglycon Xác định các nhóm hợp chất:
Dịch chiết ether dùng để xác định các nhóm hợp chất: chất béo, tinh dầu, carotenid, triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, anthraquinon, flavonoid
Dịch chiết cồn dùng để xác định các nhóm hợp chất: alkaloid, coumarin, glycosid tim, flavonoid, tannin, saponin, các chất khử, acid hữu cơ
Dịch chiết cồn thủy phân dùng để xác định các nhóm chất: triterpenoid thủy phân, coumarin, anthraquinon, glycosid tim, flavonoid
Dịch chiết nước dùng để xác định các nhóm chất: alkaloid, flavonoid, glycosid tim, tannin, saponin, các chất khử, acid hữu cơ, polyuronid
Dịch chiết nước thủy phân được dùng để xác định các nhóm chất: triterpenoid thủy phân, glycosid tim, anthraquinon, flavonoid
Tinh dầu: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ rồi lại bốc hơi cho đến cắn Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng kết luận có tinh dầu
Chất béo: Lấy vài giọt dịch chiết nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung môi Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết mờ kết luận có chất béo
Carotenoid: Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn (và hầu như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào cắn vài giọt dung dịch SbCl3 (khan) bão hòa trong chloroform Dung dịch có màu xanh sau đó chuyển thành màu đỏ kết luận có carotenoid
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát thực vật học
Hình 4.1 Hình ảnh toàn cây, hoa và quả cây Hàm liên Cây thân thảo, dây leo to, mọc thành bụi, toàn cây chứa nhiều nhựa mủ trắng, lông phủ dày đặc, thô ráp Thân non có màu xanh, phủ nhiều lông màu trắng, tiết diện hình trụ dẹt, đường kính 1,0 – 3,0 mm, thân nhẵn dần khi già Thân già có màu nâu xám, gỗ màu trắng vàng, có nhiều lỗ chân lông hình lỗ kim bao phủ dày đặc, ít lông hơn thân non, bên ngoài sần sùi có vết nứt, bần ở 2 bên thân hơi già, rỗng ở giữa, tiết diện hình trụ dẹt, đường kính 2,0 – 5,0 mm Các lóng có rãnh dọc rõ rệt ở hai bên, các rãnh xen kẽ đối xứng nhau ở các đốt
Lá đơn, mọc đối, phiến lá hình trứng, rộng 6 – 10 cm, dài 5 – 13 cm, mặt trên màu xanh đậm, phủ lông mịn thưa thớt, mặt dưới màu xanh nhạt, phủ lông màu trắng dày đặc nhưng mật độ lông không dày bằng gân lá Gốc lá hình tim, xẻ sâu, ngọn lá nhọn Cuống lá dài 6 - 10 cm, màu xanh nhạt, tiết diện tròn, đường kính khoảng 1mm, phủ lông thô ráp, lông hơi cong Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, thường có 1 gân chính, 3 - 5 đôi gân phụ , phủ nhiều lông màu trắng ở cả mặt trên và mặt dưới của gân lá Mép lá nguyên, mang nhiều lông màu trắng Có mùi thơm nhẹ, vị đắng và hậu có vị ngọt
Cụm hoa xim phân nhánh nhiều, mọc ở nách lá, nhiều hoa; trục cụm hoa dài tới 2 cm Cụm hoa có chiều dài khoảng 12 cm và chiều rộng khoảng 8 cm
Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, màu xanh, lúc già chuyển sang ngả vàng Cuống hoa
6 – 8 mm, hình trụ, có lông xung quanh, màu xanh Lá bắc hình tam giác dài, màu xanh, có lông bao phủ Bao hoa gồm lá đài và cánh hoa Thuỳ đài nhỏ, đầu hơi tù kích thước 3 x1-1,5 mm Gốc đài có các tuyến mọc xen với lá đài, ít khi không có tuyến đài Đài hoa gồm 5 lá đài, màu xanh nhạt, dính với nhau bên dưới thành ống hình chuông, khoảng 3 x 1 – 1,3 mm, tiền khai ngũ điểm, các phiến rời phía trên hình mũi mác, mặt ngoài có lông mịn Tràng hoa mẫu 5, phần trên rời hình trứng, đầu tròn, cánh dạng đài xanh tươi, thuôn dài 8 – 10 mm, tiền khai vặn, lớp trên của tràng hoa có một lớp phấn trắng mỏng, lớp dưới tràng hoa và ngoài ống tràng có lông mịn mượt như nhung, thùy tràng không gập vào trong nụ, xoắn sang phải, họng tràng thường có lông, mặt trong thùy tràng không dày lên (không có gờ) Vảy tràng phụ thường ngắn, hình tam giác, nhô lên khỏi ống tràng, đỉnh có 2 – 4 răng Tràng phụ đơn, dính với cột nhị nhụy Các thùy hoa nhô ra từ ống hoa, hình thuôn, đầu nhọn hình cụt với các góc tạo thành sừng ngắn, đôi khi có răng giữa chúng Bộ nhị số lượng 5, đều, đính trên đế hoa.Chỉ nhị dính nhau, bao phấn
2 ô, có phần phụ ở đỉnh thuôn Hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên, chỉ có 1 khối phấn trong mỗi ô phấn Các phần phụ của bao phấn hình thuôn dài, dài hơn một chút so với thùy hào quang, bao phấn hình trụ cong Bộ nhuỵ 2 lá noãn, Đầu nhụy hình trụ rộng, được che bởi các phụ bao phấn
Quả mọc thành chùm, quả gồm 2 đại, dài 9 - 13cm, hình thuôn nhọn, tiết diện tròn, có rãnh sâu dọc theo chiều dài quả, đường kính khoảng 0.7 – 1 cm, vỏ dày màu xanh, bên ngoài nhiều lông màu trắng Quả già có màu nâu đến đen, khô tự nứt dọc Bên trong chứa khoảng 10 – 12 hạt có mào lông ở 1 đầu, hạt hình trứng dài khoảng 1cm, mào lông màu trắng, dài khoảng 3 cm
Hình 4.2 Đặc điểm hình thái cây Hàm liên
1 Đoạn thân trường thành; 2 Cách mọc lá; 2’ Cụm hoa ; 3 Cụm hoa non;
4 Cách mọc cụm hoa; 5 Nhựa; 6 Tiết diện thân non; 7 Tiết diện thân già;
8 Thân non; 9 Thân già; 10 Mặt trên lá; 11 Mặt dưới lá; 12 Gốc lá;
13 Mép lá mặt trên; 14 Mép lá mặt dưới; 15 Gân lá mặt trên;
16 Gân lá mặt dưới; 17 Vỏ quả; 18 Hạt
Hình 4.3 Các bộ phận hoa cây Hàm liên
1 Nụ hoa; 2 Nụ hoa cắt dọc; 3, 4 Hoa; 5, 6 Đài hoa; 7, 8 Tràng hoa;
9, 10, 11, 12, 13 Tràng phụ; 14 Bầu nhụy; 15, 16 Nhị và khối phấn;
Hình 4.4 Hình ảnh hoa đồ của cây HL Ảnh tiêu bản M tenacissima lưu trữ tại Royal Botanic Garden Edinburgh
4.1.2 Đặc điểm vi phẫu của cây Hàm liên
Vi phẫu rễ gần tròn, vùng vỏ chiếm 3/4 bán kính Từ ngoài vào trong có bần gồm các lớp tế bào hình chữ nhật, vách tẩm bần uốn lượn và xếp dãy xuyên tâm Mô mềm tế bào hình đa giác, vách cellulose, kích thước không đều nội bì caspary không rõ, kích thước không đều Libe 2 tạo thành vòng quanh gỗ chiếm tâm, mạch gỗ 2 hình đa giác, vách tẩm chất gỗ, xếp xuyên tâm Các tinh thể calci oxalat cầu gai khác nhiều nằm rải rác khắp vi phẫu
Hình 4.4 Hình ảnh vi phẫu cây Hàm liên
Vi phẫu gần hình tròn, vùng vỏ chiếm 1/3 bán kính, từ ngoài vào trong bao gồm: Vùng vỏ: Lớp biểu bì gồm 1 lớp tế bào xếp khít nhau có hình dạng và kích thước tương đối đồng đều, mang nhiều lông che chở, lớp cutin dày, bắt màu xanh Lông che chở đa bào nằm trên biểu bì, gồm 2 – 12 tế bào, thon nhọn dần về phía ngọn đầu
Dưới biểu bì là lớp mô dày góc gồm các tế bào hình bầu dục có kích thước gần đều nhau xếp khít nhau liên tục, thành tế bào dày gồm 6 – 8 lớp Tiếp đến là lớp mô mềm vỏ dạng mô mềm khuyết gồm 8 – 12 lớp tế bào, các tế bào có hình đa giác vách cellulose, kích thước không đều, xếp sát nhau, thành tế bào mỏng, bắt màu hồng Tinh thể calci oxalate hình cầu gai, nằm rải rác trong các mô tế bào mô mềm Ống nhựa mủ nằm rải rác trong toàn thân cây
Vùng trung trụ - trụ bì hoá sợi mô cứng thành đám, các bó sợi có vách bằng cellulose xếp thành một vòng không liên tục nằm rải rác trong mô mềm Libe 1 xếp thành từng cụm nằm dưới lớp trụ bì Libe 2 kết tầng, gồm 3 – 5 lớp tế bào hình đa giác hay hình chữ nhật, kích thước gần đều, vách cellulose xếp thành dãy xuyên tâm, rải rác trong vùng libe có ống nhựa mủ thật, vách tế bào uốn lượn rất nhiều Vùng gỗ: Gỗ 2 dày gấp 2 - 3 lần libe 2; mạch gỗ 2 liên tục, tế bào hình đa giác, xếp lộn xộn hoặc thành dãy; mô mềm gỗ 2 hình đa giác, vách tẩm gỗ, xếp thành dãy xuyên tâm Tia tủy gồm 2-5 dãy tế bào Bó gỗ 1 phân bố không đều, mỗi bó gồm 1-3 mạch gỗ hình đa giác; mô mềm gỗ 1 hình đa giác, vách cellulose, xếp lộn xộn Libe quanh tủy xếp thành cụm to hay nhỏ, có cấu tạo giống libe 1 Mô mềm tủy khuyết, tế bào hình gần tròn, vách cellulose, xếp lộn xộn
Hình 4.5 Cấu tạo vi phẫu thân cây Hàm liên
Cuống lá: vi phẫu tiết diện hình trứng Biểu bì tế bào hình chữa nhật, lớp cutin mỏng, lông che chở đa bào Mô dày tròn nhiều lớp tế bào hình đa giác gần tròn, kích thước không đều Mô mềm gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác gần tròn hoặc tròn, kích thước tương đương với mô dày Bó dẫn hình cung gỗ ở trên, libe ở dưới Libe gồm nhiều lớp tế bào đa giác nhỏ, vách uốn lượn xếp lộn xộn thành cụm Mạch gỗ hình đa giác tròn, kích thước không đều, xếp thành dãy hướng tâm Mô mềm gỗ hình đa giác vách cellulose xếp 1 – 2 dãy xen kẽ với các mạch gỗ Libe trong tế bào đa giác vách uốn lượn xếp thành cụm Ống nhựa mủ có chứa khối nhựa màu nâu hoặc màu vàng nằm rải rác trong mô mềm Tinh thể calci oxalat hình khối trong vùng mô mềm và mô dày nhưng tập trung rất nhiều ở mô mềm gần bó dẫn
Hình 4.6 Cấu tạo vi phẫu cuống lá cây Hàm Liên
Gân lá: Vi phẫu lồi nhiều ở mặt dưới, mặt trên lồi ít gần như phẳng Biểu bì tế bào hình chữ nhật có núm, biểu bì trê lớp hơn gấp 2 lần tế bào biểu bì dưới, lớp cutin mỏng, lông che chở đa bào ở biểu bì dưới nhiều hơn ở biểu bì trên Mô dày tròn nhiều lớp ở dưới biểu bì trên và 5-6 lớp ở dưới biểu bì dưới, tế bào đa giác gần tròn hoặc tròn, kích thước không đều Mô mềm đạo gồm nhiều lớp tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn hoặc tròn, kích thước lớn hơn mô mềm chứa lục lạp Bó dẫn xếp hình cung gỗ ở trên, libe ở dưới, cấu trúc tương tự bó dẫn của cuống lá Libe trong xếp thành cụm Tinh thể calci oxalate (5) hình cầu gai, mật độ lớn, nằm rải rác trong các tế bào mô mềm Ống nhựa mủ có chứa nhựa màu nâu hoặc vàng rải rác trong mô mềm gần libe
Hình 4.7 Hình ảnh vi phẫu gân và phiến lá hàm liên
Phiến lá: biểu bì hình chữ nhật, biểu bì trên và dưới dưới gồm 1 lớp tế bào tương đối đồng đều về hình dạng và kích thước, cutin mỏng, nhiều lông che chở đa bào có cả 2 biểu bì; lỗ khí có ở mặt dưới của lá Có rất nhiều ống nhựa nằm rải rác trên phiến lá Mô giậu gồm 2 lớp tế bào hình que xếp xít nhau
4.1.3 Đặc điểm bột dược liệu Hàm liên
Bột Hàm liên có màu vàng nhạt, có mùi thơm nhẹ, có vị đắng, hậu ngọt Quan sát dưới kinh hiển vi cho thấy có các thành phần như lông che chở đa bào, mảnh mạch điểm, mảnh mạch xoắn, tinh thể calci oxalat hình cầu gai, hạt tinh bột
Hình 4.8 Hình ảnh soi bột thân rễ dược liệu Hàm liên
Bột thân có màu nâu, vị đắng, không mùi Quan sát trên kính hiển vi thấy có nhiều lông che chở đa bào, kích thước khác nhau Tinh thể calci oxalat nằm rải rác, nhiều, hình cầu gai Mảnh mạch xoắn,mảnh mạch điểm, mảnh bần, biểu bì, bó sợi nằm rải rác trên vi trường
Hình 4.9 Hình ảnh soi bột thân dược liệu Hàm liên
Bột lá có màu xanh đậm, vị hơi đắng, thơm nhẹ Quan sát thấy rất nhiều lông che chở đa bào, hình thuôn nhọn, gồm nhiều tế bào xếp sát nhau, thành tế bào dày Tinh thể calci oxalat nhiều, hình cầu gai, mảnh mô mềm mang diệp lục màu xanh gồm các tế bào thành mỏng, hình tròn, xếp sát nhau Mảnh biểu bì mang lỗ khí, lỗ khí Mạch xoắn nằm rải rác khắp vi trường
Hình 4.9 Hình ảnh soi bột lá dược liệu Hàm liên
chiết xuất, phân lập một số thành phần hóa thực vật từ thân rễ cây hàm liên
4.2.1 Khảo sát quy trình chiết cao toàn phần
Sơ bộ khảo sát điều kiện chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với các nồng độ cồn khác nhau
Bảng 4.3 Hiệu suất chiết cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt
Hình 4.12 Kết quả SKLM cao toàn phần dược liệu Hàm liên
Lấy một lượng cao cồn ở 3 nồng độ tương đương nhau chấm lên bảng, triển khai trên hệ dung môi EtOAc-Cf: MeOH: HCOOH(10:1:0,5) kiểm tra bằng UV 254 nm cho thấy cao cồn 70% cho nhiều vết tắt quang hơn, UV 365nm cho thấy các vết phát quang trên cao cồn 30% ít hơn so với các cao còn lại; nhúng thuốc thử Dragendoff và VS cho kết quả với cao cồn 70% và 90% cho nhiều tương đương nhau, cồn 30% cho vết nhạt và ít nhất
Do dược liệu chiết với ethanol 70% và 90% cho ra nhiều vết sắc kí trên bản mỏng tương tự nhau, tuy nhiên hiệu suất chiết ở ethanol 90% thấp hơn và nguy cơ cháy nổ cao hơn Do vậy, cồn 70% được chọn làm dung môi chiết ngấm kiệt cho quy mô lớn
4.2.2 Tiến hành chiết cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt
Chiết ngấm kiệt 6394 g bột dược liệu Hàm liên bằng cồn 70% trong bình ngấm kiệt kích thước 20 x 40 x 80 cm Làm ẩm bột dược liệu bằng cồn 70% khoảng 12 giờ, cho toàn bộ dược liệu vào bình ngấm kiệt, cho dung môi ngập mặt dược liệu
1 - 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ, mở van thu dịch chiết với tốc độ 2 - 3 ml/phút, chiết cho tới khi dịch chiết hầu như không còn phản ứng với thuốc thử Dragendoff Thu toàn bộ dịch chiết, cô trên bếp cách thủy ở 60 o C
Hiệu suất chiết cao bằng phương pháp ngấm kiệt trình bày trong bảng sau
Bảng 4.4 Hiệu suất chiết cao bằng phương pháp ngấm kiệt
Khối lượng dược liệu (g) 6394 Độ ẩm dược liệu (%) 7,68
Khối lượng cao toàn phần (g) 1361 Độ ẩm cao toàn phần (%) 13.22
Hiệu suất chiết cao toàn phần (%) 20,01
4.2.3 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần
Phân tán 1061 g cao cồn vào một lượng nước cất vừa đủ, sau đó tiến hành lắc phân bố với lần lượt các dung môi n-hexan, cloroform, etyl acetat, mỗi dung môi sử dụng với 2,5 lít/lần x 8 lần Sau mỗi lần lắc phân bố, rút dịch chiết và cô quay chân không thu hồi dung môi, sử dụng dung môi thu hồi cho lần lắc tiếp theo Kết quả thu được 27,5 g cao n-hexan (ký hiệu Hx), 189,82 g cao cloroform (ký hiệu Cf), 4,85 g cao EtOAc (ký hiệu EA) và 96,50 g cao nước (kí hiệu là HO)
Bảng 4.5 Hiệu suất chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần
Cao EtOAc Khối lượng (g) 6394 1061 27,5 189,82 4,85 Độ ẩm (%) 13,22 2,8 4,38 3,74
Nhận xét: Sau khi lắc phân bố lỏng-lỏng thu được 4 cao phân đoạn có thành phần đơn giản hơn, kiểm tra bằng SKLM cho thấy cao Cf có cho nhiều vết và vết đậm hơn khi nhúng thuốc thử Dragendoff và VS so với các cao phân đoạn còn lại và hiệu suất chiết của cao Cf cao nhất so với các cao phần đoạn còn lại Do đó quyết định chọn cao Cf được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu các thành phần
Kiểm tra bằng SKLM vớ hệ dung môi EA:Cf:MeOH: a.formic (10:1:1:0,5) cho kết quả như hình
UV 256 nm UV 345 nm TT Dragendoff TT VS
Hình 4.13 Kết quả SKLM cao phân đoạn từ cao toàn phần dược liệu Hàm liên 4.2.4 Phân lập các hợp chất bằng kĩ thuật sắc ký cột
Cột thủy tinh kích thước 40 x 6 cm
Pha tĩnh: 212, 45 g silica gel kớch thước hạt 40 – 63 àm
Mẫu phân tích: 40 g cao Cf
Pha động: n-hexan, cloroform với tỉ lệ dung môi thay đổi
Kết quả: Từ 40 g cao CF sau khi tiến hành sắc kí cột cổ điển và kiểm tra bằng
SKLM thu được 9 phân đoạn được ký hiệu CF1→ CF9
Bảng 4.6 Các phân đoạn chloroform thu được
Nhận xét: Các PĐ CF2, CF3, CF4 và CF8 và CF9 có dịch màu vàng, để bay hơi tự nhiên đến bão hòa có tủa trắng ngà dưới đáy lọ, kiểm tra bằng SKLM cho thấy CF9 cho vết đơn giản hơn so với các phân đoạn còn lại và dương tính với TT VS
Do vậy, phân đoạn này được sử dụng để tiếp tục tách các chất đơn giản hơn
Hình 4.14 SKLM phân đoạn dược liệu Hàm liên
Phân đoạn Dung môi khai triển Cảm quan
CF1 n-hexan-CHCl3 (95:5-100:0) Không màu
CF2 n-hexan-CHCl3 (90:10-95:5) Vàng nhạt
CF3 n-hexan-CHCl3 (85:15-80:20) Vàng nhạt
CF4 n-hexan-CHCl3 (75:25-65:35) Vàng nhạt
CF5 n-hexan-CHCl3 (60:40-45:55) Xanh lá nhạt
CF6 n-hexan-CHCl3 (50:50-45:55) Xanh đậm
CF7 n-hexan-CHCl3 (40:60-:35:65) Vàng đậm
CF8 n-hexan-CHCl3 (30:70-25:75) Vàng nhạt
CF9 n-hexan-CHCl3 (25:75-20:80) Vàng nhạt
Hình 4.15 SKLM phân đoạn dược liệu Hàm liên 4.2.5 Tinh khiết hóa
Phân đoạn CF9 được chọn sau khi cho bay hơi tự nhiên khoảng 80% dung môi thì có các hạt tủa màu trắng ngà lắng đọng dưới đáy lọ, lượng dung môi còn lại màu vàng nhạt được hút để riêng
Rửa tủa với n-hexan lạnh, hòa tan tủa với cloroform, kết tinh lại bằng phương pháp giảm độ phân cực của dung môi-nhỏ từ tư hexan vào cho đến khi có tủa xuất hiện, lọc lấy tủa Kiểm tra độ tinh khiết của tủa thu được bằng SKLM với 3 hệ dung môi, thuốc thử VS và HPLC
Phân đoạn CF9 cô thu hồi dung môi thu được 2,36 g có màu trắng ngà
Hình 4.16 Hình ảnh tủa phân đoạn CF9
Kết tinh lại như trên 3 đến 4 lần từ 400 mg tủa CF9 thu được 104,23 mg tủa có màu trắng gọi là MT1
Hình 4.17 SKLM giữa CF9 và MT1
Kiểm tra MT1 phân lập từ phân đoạn CF9
Kiểm tra MT1 trên sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khai triển EA:CF:a.formic (10:5:0,5) Kết quả cho thấy tủa sạch không lẫn tạp, nhúng VS cho thấy màu vàng đậm, nhúng Dragendoff cho màu hồng đỏ
4.2.6 Kiểm tra độ tinh khiết
4.2.6.1 Kiểm tra MT1 tinh khiết trên SKLM
Kiểm tra độ tinh khiết của MT1 bằng SKLM với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, phát hiện ở UV 254, UV 365, TT VS, TT Dragendorff
MT1 được kiểm tra ở 3 dung môi lần lượt là: EA bão hòa (100%), EA:CF:a.formic (3:1:0,5); EA:CF:Me:a.formic (10:1:1:0,5)
Hình 4.19 SKLM kiểm tra tinh khiết MT1
Hình 4.20 Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết MT1
4.2.6.2 Kiểm tra độ tinh khiết MT1 trên HPLC
Dựa vào kết quả kiểm tra trê phổ HPLC cho thấy MT phổ UV của 1 chất, có đỉnh hấp thụ tối đa tại 240 nm, độ tinh khiết đạt 96% tính theo diện tích pic
4.2.7 Xác định cấu trúc MT bằng phổ NMR
Mẫu MT1 được gửi đo các phổ NMR, tuy nhiên trên phổ H cho thấy có nhiều tín hiệu tạp, nên chất cần được tinh khiết thêm để tiếp tục đo các phổ NMR giúp xác định cấu trúc MT1
Tuy nhiên trên phổ H cũng thể hiện một số tín hiệu đặc trưng của 1 terpenoid dạng glycosid
Hình 4.21 Phổ H NMR của MT1
Hình 4.22 Phổ H NMR của MT1 phóng to cho thấy các tín hiệu có thể là tín hiệu đặc trưng của H trong khung terpenoid
Hình 4.23 Phổ H NMR của MT phóng to cho thấy có nhiều tín hiệu nghi ngờ của H trong khung đường
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ dạ dày của cao chiết từ thân rễ cây Hàm liên trên mô hình Loét dạ dày bằng indomethacin ở chuột nhắt trắng
TỪ THÂN RỄ CÂY HÀM LIÊN TRÊN MÔ HÌNH LOÉT DẠ DÀY BẰNG INDOMETHACIN Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG
4.3.1 Xác định liều tối đa và liều độc cấp tính của cao toàn phần chiết từ rễ cây Hàm liên trên chuột
Sau khi uống cao toàn phần từ thân rễ Hàm liên với liều cao nhất có thể qua được kim cho uống là 10.000 mg cao/kg trọng lượng chuột thì sau 12 giờ, 2/10 con chuột có tình trạng co giật vùng bụng phải, co rúm người và tử vong, số chuột còn lại trong lô không có hiện tượng gì bất thường Sau 24 giờ, không thấy xuất hiện chuột chết, theo dõi chuột còn sống trong 14 ngày cũng không xuất hiện triệu chứng bất thường
Vậy kết quả thuộc trường hợp thứ 3
Sau khi cho uống cao thử, phân suất tử vong thấp hơn 100% (2/10 chuột), không xác định được liều gây chết tuyệt đối Đối với trường hợp này, không thể suy ra liều LD50 Liều tương đối an toàn DS dùng cho thực nghiệm dược lý có giá trị bằng 1/5 hoặc 1/10 LD0 Từ đó xác định được liều Dmax = 10.000 mg/kg và xác định được liều cao thử trên thực nghiệm
Bảng 4.7 Mức độ tổn thương dạ dày theo thang điểm Shay và thang điểm Desai
Các liều cao thử trên thực nghiệm bao gồm: 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg,
400 mg/kg và 500 mg/kg
4.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ dạ dày của Esomeprazol trên chuột nhắt trắng gây loét bởi Indomethacin
Sau 6 giờ chuột uống indomethacin, chuột có hoạt động leo trèo, cào bới và cắn phá hơn nhiều Tỉ lệ gây tổn thương dạ dày của indomethacin là 100%
Mức độ tổn thương dạ dày Thang điểm theo Shay và cộng sự(1945)
Thang điểm theo Desai và cộng sự (1999)
Dạ dày không loét: 0 điểm
Xói mòn bề mặt niêm mạc: 1 điểm
Vết loét sâu hoặc hoại tử: 2 điểm
Vết loét xuất huyết, thâm : 2 điểm
Vết loét thâm hoặc đục: 3 điểm
Sau thực nghiệm, kết quả được thể hiện dưới bảng sau
Bảng 4.8 Mức độ tổn thương dạ dày theo thang điểm của Shay al
*p < 0,05; **p < 0,01 so với lô mô hình (Mann-Whitney test)
Nhận xét: Esomeprazol liều 20 mg/kg có tác dụng bảo vệ dạ dày rõ ràng trên chuột Tất cả các chỉ số đánh giá loét trong bảng đều giảm rõ rệt so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05
Các chỉ số đánh giá loét cụ thể như sau:
Số ổ loét trung bình và mức độ tổn thương dạ dày
Nhận xét: từ kết quả biểu đồ 4.24 và 2.4 ta thấy
- Biểu đồ 4.24: esomeprazol liều 20 mg/kg làm giảm rõ rệt (2,76 lần) số ổ loét trung bình so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,012
- Biểu đồ 4.25: Lô mô hình (indomethacin liều 20 mg/kg) có mức độ tổn thương cao từ trung bình đến nặng, chủ yếu là các vết loét sâu, hoặc xuất huyết và thủng esomeprazol liều 20mg/kg cho kết quả làm giảm mức độ tổn thương dạ dày xuống rõ rệt (1,54 lần) so với lô mô hình Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p = 0,009**)
Sự khác biệt này là do esomeprazol làm giảm tỉ lệ các vết thủng (12,5%), giảm vết loét sâu (từ 87,5% còn 37,5%) và thay vào đó làm tăng tỉ lệ loét bề mặt (0% lên 62,5%) so với mô hình Từ đó làm cải thiện mức độ tổn thương dạ dày từ trung bình – nặng đến trung bình – nhẹ so với mô hình
Mức độ tổn thương dạ dày
Hình 4.24 Biểu đồ số ổ loét trung bình
Hình 4.25 Biểu đồ % tổn thương dạ dày theo thang điểm Shay Al
Chỉ số loét và % ức chế loét
Hình 4.26 Biểu đồ chỉ số loét và % ức chế loét dạ dày bằng phương pháp Shay et.al Nhận xét
- Esomeprazol làm giảm chỉ số loét cao hơn 2,6 lần so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,01;
% M ức độ tổ n th ươn g
Loét bề mặt Loét sâu Thủng
Số ổ lo ét tr un g bìn h
SỐ Ổ LOÉT TRUNG BÌNH số ổ loét trung bình Linear (số ổ loét trung bình)
* p< 0,05 so với lô mô hình
Chỉ số loét % ức chế loét Linear (Chỉ số loét)
- Esomeprazol có tỉ lệ ức chế loét, bảo vệ dạ dày khá cao > 50% (61,59%) so với lô mô hình
Theo đánh giá theo thang điểm Desai
Bảng 4.9 Kết quả chỉ số đánh giá loét trên dạ dày chuột theo thang điểm Desai
Mức độ tổn thương dạ dày
*p < 0,05; **p < 0,01 so với lô mô hình (Mann-Whitney test)
Nhận xét: Esomeprazol liều 20 mg/kg có tác dụng bảo vệ dạ dày rõ ràng trên chuột Tất cả các chỉ số đánh giá loét trong bảng 4.9 đều giảm rõ rệt so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05
Các chỉ số đánh giá loét cụ thể như sau:
Số ổ loét trung bình và mức độ tổn thương dạ dày
Lô mô hình: tỉ lệ tổn thương các vết loét thâm , đục chiếm 62,5%, các vết loét sâu chiếm tỉ lệ còn lại và không có loét bề mặt Thể hiện tình trạng tổn thương nặng ở dạ dày chuột
Lô esomeprazol liều 20mg/kg cho hiệu quả tác dụng, làm giảm tỉ lệ các vết loét thâm hoặc đục xuống khá cao so với lô mô hình (từ 62,6% => 12,5%), giảm gần 50% tình trạng nặng Tỉ lệ loét sâu hoặc hoại tử cũng được giảm (37% => 25%), giảm 12,5% Tỉ lệ loét nhẹ, xói mòn bề mặt tăng cao 62,5% so với lô mô hình
Hình 4.27 Biểu đồ số ổ loét trung bình (Desai et al)
Hình 4.28 Biểu đồ % mức độ tổn thương dạ dày (Desai et al)
% MỨC ĐỘ TỔN THƯƠNG DẠ
DÀY bề mặt xói mòn loét sâu, hoại tử vết thâm/ đục
Số ổ lo ét tr un g bìn h
SỐ Ổ LOÉT TRUNG BÌNH số ổ loét trung bìnhLinear (số ổ loét trung bình)
Chỉ số loét và % ức chế loét
Hình 4.29 Biểu đồ chỉ số loét và % ức chế loét dạ dày theo thang điểm Desai al
Esomeprazol làm giảm chỉ số loét (1,3 lần) so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
Esomeprazol có khả năng ức chế loét với tỉ lệ (24,32%), khác biệt có ý nghĩa thống kê
Lô 1 Sinh lí Lô 2 Mô hình Lô 3 ESO
Hình 4.30 Đại thể dạ dày chuột của 3 lô thực nghiệm
UI (chỉ số loét) % ức chế loét Linear (UI (chỉ số loét))
Mô hình gây loét bởi indomethacin trên chuột nhắt trắng phù hợp trong thực nghiệm với tỉ lệ 100% chuột bị loét khi uống 1 liều duy nhất IND ở liều 20 mg/kg sau 6h
Esomeprazol liều 20 mg/kg, uống 1 lần/ ngày vào 8h sáng, trước khi ăn 30 phút trong vòng 10 ngày có tác dụng ức chế loét với tỉ lệ 61,65%
Vì vậy, nghiên cứu tác dụng bảo vệ dạ dày của cao chiết từ thân rễ dược liệu Hàm liên được tiếp tục tiến hành trên mô hình gây loét bởi indomethacin liều 20 mg/kg
4.3.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống loét dạ dày của cao chiết từ thân rễ cây Hàm liên trên chuột
4.3.3.1 Đánh giá theo thang điểm của Shay
Kết quả thực nghiệm được thể hiện tại bảng sau:
Bảng 4.10 Ảnh hưởng của cao Hàm liên đến số ổ loét trung bình
Mức độ tổn thương dạ dày
*p < 0,05; **p < 0,01; ***p 0,05 Cao thử HL ở 4 mức liều còn lại có tác dụng bảo vệ dạ dày rõ ràng trên chuột chỉ số loét và % ức chế loét của tất cả các lô đều giảm rõ rệt so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05 Trong đó, cao HL liều 400 mg/kg và 500 mg/kg cho tác dụng cao nhất, liều 500 mg/kg có % ức chế loét cao hơn lô esomeprazol ( cao hơn 1,62%)
Xét cụ thể từng chỉ số đánh giá loét dạ dày như các biểu đồ dưới đây: a Số ổ loét trung bình
Hình 4.31 Biểu đồ ảnh hưởng của cao Hàm liên đến số ổ loét trung bình
Kết quả bảng 4.10 cho thấy:
Cao HL liều 500 mg/kg giảm số ổ loét trung bình có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình với p = 0,016 Làm giảm số ổ loét trung bình tương đương với esomeprazol liều 20 mg/kg, sự khác biệt không có ý nghĩa thông kê với p = 0,943
Cao HL liều 400 mg/kg làm giảm rõ rệt (2,14 lần) số ổ loét trung bình so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,027 Làm giảm số ổ loét trung
Mô hình Esomeprazol HL100 HL200 HL300 HL400 HL500 số ổ loé t tr un g bìn h
* p