Định tính v cholerae và v parahaemolyticus

Thành phần môi trường APWThành phầnVai trò Trang 15 amino acid chuỗi dài, vitamin và các chấtdinh dưỡng cần thiết khác.Muối Sodium chlorie Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu.Bước 2: Tăn

PAGE \*

MERGEFORMAT iv

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-

TIỂU LUẬN MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

-TIỂU LUẬN MÔN: VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT

QUA MÀNG TẾ BÀO VI SINH VẬT

Nhóm: 13

1.2 Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

3.1 Môi trường APW

3.2 Môi trường TCBS agar

3.3 Khuẩn lạc V.Cholerae trên môi trường TCBS

3.9 V.Parahaemolyticus trên môi trường TCBS

3.10 V.Parahaemolyticus trên môi trường TSTA

3.1 Thiết bị và dụng cụ

3.2 Môi trường và hóa chất

3.3 Thành phần môi trường APW

3.4 Thành phần môi trường thạch TCBS

3.5 Các phép thử nhận dạng giả định

3.6 Thử nghiệm khẳng định

3.7 Thiết bị và dụng cụ

3.8 Môi trường và hóa chất

3.9 Thành phần môi trường TSTA

3.10 Thử nghiệm khẳng định

PAGE \*

MERGEFORMAT 8

MỞ ĐẦU

Giống Vibrio thuộc vào họ Vibrionaceae Chúng là những vi khuẩn hình que hơi cong

như dấu phẩy, Gram âm, không sinh nha bào, di động nhờ một lông ở một đầu,oxydase dương tính

Kể từ năm 1817 cho đến nay trên thế giới đã xảy ra 7 đại dịch tả Sáu đại dịch tả đều

do V.cholerae sinh type cổ điển gây nên Đại dịch tả lần thứ 7 do V.cholerae sinh type

El Tor gây nên, bắt đầu từ năm 1961 kéo dài cho đến ngày nay V.cholerae El Tor đề

kháng với tác nhân hóa học, tồn tại lâu hơn ở người và sống trong thiên nhiên lâu

hơn V.cholerae sinh type cổ điển Ngoài ra đối với vùng bệnh tả El Tor lưu hành thì

những trường hợp nặng thường ít hơn và những trường hợp nhẹ không triệu chứng lạinhiều hơn Bắt đầu từ năm 1992 dịch tả xảy ra ở Madras và nhiều nơi khác thuộc Ấn

Độ và Bangladesh do Vibrio cholerae O139 gây nên với cơ chế bệnh sinh hoàn toàn giống như Vibrio cholerae O1 Sau đó dịch tả do chủng O139 đã lây lan ra các nước

khác V.cholerae là nguyên nhân gây bệnh tả ngay cả khi ở điều kiện bình thường, là

một bệnh rất nguy hiểm lây lan rất nhanh trong cộng đồng từ người sang người qua

đường thực phẩm cả nước uống Nguồn nhiễm V.cholerae chủ yếu từ nước, động vật

có vỏ, hoặc các thực phẩm khác bị ô nhiễm bởi phân của những người có triệu chứnghoặc không có triệu chứng

V.parahaemolyticus được phân lập lần đầu ở Nhật Bản năm 1950 từ phân bệnh nhân tiêu chảy do ăn cá biển V.parahaemolyticus là một trong những nguyên nhân gây

nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn Người mắc bệnh chủ yếu là do ăn phải thức ăn hải sảnchưa được nấu chín hoặc bị nhiễm khuẩn trong quá trình chế biến và bảo quản Thờigian ủ bệnh ngắn từ 2 – 6 giờ

Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do nhóm vi khuẩn Vibrio rất thấp, có thể ở mức 10

tế bào/g sản phẩm Do vậy cần được kiểm soát rất nghiêm ngặt trong thực phẩm, đòihỏi các phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các quy trình kiểm soát phải chặt

chẽ V.Cholerae và V.Parahaemolyticus có thể được phát hiện bằng cách nuôi cấy một

lượng mẫu xác định vào mỗi trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môitrường tăng sinh chọn lọc Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn được cấy phân lập trên ítnhất 2 loại môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau Khuẩn lạc nghi ngờđược kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh

PAGE \*

MERGEFORMAT 8

Để làm rõ quy trình định tính và phân lập V.Cholerae và V.Parahaemolyticus, nhóm

13 chúng em xin trình bày đề tài“Định tính V.Cholerae và V.Parahaemolyticus” bằng

những hiểu biết cũng như một số tài liệu nghiên cứu và sưu tầm được để giải đáp thắcmắc và những vấn đề cấp thiết được đặt ra

Nội dung nghiên cứu:

Nghiên cứu tổng quan về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus.

Nghiên cứu phương pháp,quy trình định tính V.Cholerae và V.Parahaemolyticus.

Ngoài phần mở đầu, kết luận đề tài gồm 3 chương:

- Chương 1: Tổng quan về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus

- Chương 2: Phương pháp định tính

- Chương 3: Quy trình định tính

Để phân tích, nghiên cứu về vần đề “Định tính V.Cholerae và V.Parahaemolyticus”,

nhóm đã sử dụng một số phương pháp như phân tích và nghiên cứu tài liệu

Nguồn dữ liệu thứ cấp:

- Các số liệu, tài liệu đã có sẵn về V.Cholerae và V.Parahaemolyticus trong

nước và ngoài nước

- Một số bài báo khoa học, tiêu chuẩn sẵn có

Nguồn dữ liệu sơ cấp:

Đề tài được thực hiện bằng phương pháp nghiên cứu định tính: Sử dụng các số liệu, tàiliệu thống kê thông qua thu thập dữ liệu có sẵn từ sách vở, báo đài, các phương tiệntruyền thông, tiến hành phân tích, so sánh và đánh giá nội dung cần tập trung nghiêncứu

V.cholerae là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo hình hình dấu

phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi,không sinh H2S

V.Cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(-), LDC(+), lên men được sucrose, có thể

tăng trưởng trong môi trường có chứa 0 – 3% NaCl, không phát triển được trong cácmôi trường có chứa 6,8,10% muối

Cấu trúc kháng nguyên:

- Kháng nguyên thân O: bản chất là lipopolysaccharide Nó quyết định tính sinhmiển dịch của vaccine tả cổ điển (vaccine tả chết) Người ta phân biệt thành nhiều

nhóm huyết thanh “O” V.cholerae sinh type cổ điển và sinh type El Tor thuộc nhóm

huyết thanh O1 Trong nhóm O1 có 3 type huyết thanh : Ogawa, Inaba và Hikojima

- Kháng nguyên lông H: Không có giá trị trong thực tiễn

- Kháng nguyên độc tố ruột bản chất là protein, độc tố ruột của V.cholerae 01

kích thích cơ thể sinh kháng độc tố

Hình 1.1 Vi khuẩn V.cholerae 1.1.2 Nguồn nhiễm

Nước, động vật có vỏ, hoặc các thực phẩm khác bị ô nhiễm bởi phân của những người

có triệu chứng hoặc không có triệu chứng

1.1.3 Tác hại

Gây bệnh tả cho người Bệnh tả là một bệnh nhiễm trùng nhiễm độc cấp tính, lây rấtmạnh gây thành dịch lớn

PAGE \*

MERGEFORMAT 8

Thời gian ủ bệnh từ 2 đến 5 ngày Dấu hiệu đặc trưng của thời kỳ toàn phát của bệnh

là tiêu chảy và nôn, phân lỏng và trắng như nước vo gạo Bệnh nhân mất nước, mấtmuối rất nhanh, có thể mất 1 lít nước trong 1 giờ do đó chỉ vài giờ là xuất hiện hộichứng mất nước cấp tính làm cho toàn thân sút đi rất nhanh và rất nặng Nếu khôngđược điều trị, tỷ lệ chết rất cao (50 đến 60%)

Lâm sàng bệnh tả có nhiều biểu hiện rất khác nhau từ thể nhẹ dễ bỏ qua cho đến thểnặng với hội chứng tả điển hình

1.2. V.Parahaemolyticus

1.2.1 Đặc điểm sinh học

Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là một loại vi khuẩn trong cùng một nhóm với

những vi khuẩn gây ra bệnh tả, vi khuẩn có hình que hơi cong như dấu phẩy và ngắn,

là vi khuẩn gram âm, không sinh nha bào, di động nhờ một lông ở một đầu

V.parahaemolyticus bị chết ở 65oC sau 10 phút, chúng không phát triển được ở nhiệt

độ dưới 15oC Phát triển mạnh ở 37oC

Có oxidase (+), lên men D-mannitol, maltose, L.arabinose, không lên men saccharose

Vi khuẩn có 3 loại kháng nguyên :

- Kháng nguyên thân O : chịu nhiệt, được chia thành 12 type

- Kháng nguyên lông H

- Kháng nguyên vỏ K : không chịu nhiệt, được chia thành 59 type

Hình 1.2.Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

PAGE \*

MERGEFORMAT 8

1.2.2 Nguồn nhiễm

V.parahaemolyticus tồn tại trong nước biển và các động vật biển như cá, tôm, sò, ốc ;

hải sản chưa được nấu chín hoặc bị nhiễm khuẩn trong quá trình chế biến, bảo quản

Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 8988:2012; TCVN 7905 – 1:2008

, ISO/TS 21872-1:2007 được áp dụng phát hiện V.Cholerae và V.Parahaemolyticus

trong các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường trong khu vực chế biến và vận chuyển thực phẩm

2.1.2 Nguyên tắc

Cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng chọn lọc Từ môi trường nuôi cấynày phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, những khuẩn lạc nghỉngơi và được kiểm tra khẳng định thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh

- Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt

- Kháng thể biết trước được “rữa” qua bề mặt đó Kháng thể này được gắnenzyme

- Thêm vào cơ chất (substance): Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu

có thể xác định được Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từmẫu chứa kháng nguyên – kháng thể Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên –kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra Với nguyên lý trên, ELISA giúp xácđịnh sự có mặt hay không cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymer Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phátminh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinhhọc trên toàn thế giới Đây là phương pháp intro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp sốlượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa vào hoạt động của các dNTP

PAGE \*

MERGEFORMAT 8

tự do là enzyme polymerase, sau 20 – 35 chu kì có thể nhân được khi biết rõ các trìnhđặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khuôn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặchiệu

Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh doVibrio spp trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian đê phân lập vi khuẩn

Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một DNA đặc hiệu cho Vibrio spp

CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH 3.1 Truyền thống

3.1.1 V.Cholerae

3.1.1.1 Nguyên tắc

Phát hiện V Cholerae trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu

xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc Từ đây dịch khuẩn được cấy

chuyển sang môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử

nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa

3.1.1.3 Môi trường và hóa chất

Bảng 3.2 Môi trường và hóa chất

APW (Alkaline Phosphate Water) Tăng sinh chọn lọc

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Phân lập

Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định

Ornithine decarboxylase

Lysine decarboxylase

TW (Tryptone Water)

ONPG

HCL và NaOH (KOH) 10% Điều chỉnh pH

3.1.1.4 Quy trình định tính

Phân lập trênTCBSTăng sinh lần 1

Đồng nhất 25g mẫu với 225ml

APW

6 – 8 giờ

3.1.1.5 Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Cân vô trùng 25 g mẫu vào một túi PE đã vô trùng Cắt các mẫu lớn thành các mảnhnhỏ rồi thêm 225 ml nước peptone kiềm APW vào túi, dập mẫu 60 giây, ủ ở 370Ctrong 16 – 24 giờ

Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình tăng sinh chọn lọc

Hình 3.1 Môi trường APW Bảng 3.3 Thành phần môi trường APW

Peptone Nguồn cung cấp nitrogen và carbon, các

Ủ ở 37,0 0,50C trong khoảng 24 giờ

amino acid chuỗi dài, vitamin và các chất

dinh dưỡng cần thiết khác

Muối Sodium chlorie Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Tăng sinh chọn lọc lần thứ nhất:

- Ủ huyền phù ban đầu ở 37 0C trong 6 h ± 1 h đối với các sản phẩm đông lạnhsâu hoặc ở 41,5 0C trong 6 h ± 1 h đối với sản phẩm tươi, khô hoặc sản phẩm đã ướpmuối

- Cần chú ý khi áp dụng toàn bộ phương pháp cho các sản phẩm có hàm lượngmuối cao, vì nồng độ muối cuối cùng trong môi trường có thể làm thay đổi các đặctính

Tăng sinh chọn lọc lần thứ hai:

- Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong bước tăng sinh chọn lọc lần thứ nhấtđược lấy từ bề mặt cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường APW

- Ủ trong môi trường APW trong 18 h ± 1 h ở nhiệt độ 41,5 oC

Bước 3: Phân lập

Sau 24 giờ, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối trên môi trường ASPW và cấy lên

bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 370C trong 24 giờ

Mục đích: Nhận dạng và phát hiện V.cholerae.

Hình 3.2 Môi trường TCBS agar

Bảng 3.4 Thành phần môi trường thạch TCBS

Sucrose Lên men làm môi trường có tính acid

amino acid trong TCBS agarSodium Citrate

Ức chế sự phát triển của EnterobacteriaSodium Thiosulfate

động trao đổi chất của các loài vibriosống trong môi trường mặn

amino acid trong TCBS agar

Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS.Nếu trên một đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ thì lấy tất cảcác khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1,5% NaCl

Ủ ở 37± 1oC trong 24 giờ

Trường hợp 1: Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử

nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện

Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù

hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạcnày cho kết qua thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện và ngược lại thìkết luận không phát hiện

Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh

Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy vào các môi trường thửnghiệm sau:

Phép thử nhận dạng giả định

Bảng 3.5 Các phép thử nhận dạng giả định Phép thử Phản ứng tiêu biểu của V.Cholerae

- Oxidase: Lấy giấy lọc đã ngâm với chất nền dihydrochloride tetramethyl – phenylenediamine Làm ẩm giấy bằng nước cất vô trùng Chọn khuẩn lạc đểđược thử nghiệm bằng que cấy gỗ hoặc bạch kim và bôi trong giấy lọc Quan sátvùng giấy được cấy xem sự thay đổi màu thành xanh đậm hoặc tím trong vòng 10 – 30giây.

p-Hình 3.5 Thử nghiệm oxidase

Thử nghiệm khẳng định

Bảng 3.6 Thử nghiệm khẳng định Phép thử Phản ứng tiêu biểu của V.cholerae

6%

8%

10%

++ -

- Phép thử ADH: Cấy môi trường dung dịch muối ADH ngay dưới bề mặt Thêmkhoảng 1 ml dầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h Sau

khi ủ thấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính (có vi khuẩn mọc và có

sự dihydro hóa của arginin) Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính

- Phép thử ODC: Cấy dung dịch muối lỏng ODC ngay dưới bề mặt Thêm khoảng 1 mldầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h Sau khi ủ thấyđục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính (có vi khuẩn mọc và có sự táchnhóm cacboxyl (decarboxylation) của ornithin) Màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính

- Phép thử LDC: Cấy dung dịch muối lỏng LDC ngay dưới bề mặt Thêm khoảng 1 mldầu khoáng vô trùng lên mặt môi trường Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h Sau khi ủ màthấy đục hoặc có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính (có vi khuẩn mọc và có sựtách nhóm cacboxyl (decarboxylation) của lyzin) Màu vàng chứng tỏ phản ứng âmtính

- Phép thử TSI: Cấy đâm sâu xuống đáy ống thạch và cấy ria theo mặt nghiêng củathạch Ủ ở 37 0C trong 24 ± 3 giờ

+ Quan sát ở đáy cột thạch:

Màu vàng Dương tính glucoza (lên men glucoza)

Màu đỏ hoặc không đổi màu Âm tính glucoza (không lên men glucoza)

Có bọt hoặc rạn nứt Sinh khí từ glucoza

+ Quan sát trên bề mặt thạch nghiêng:

Màu vàng Dương tính lactoza và/hoặc sacaroza (sử dụng lactoza

và/hoặc sacaroza)Màu đỏ hoặc không đổi màu Âm tính lactoza và sacaroza (không sử dụng lactoza

hoặc sacaroza)

Các phản ứng điển hình của V cholerae ứng với cấy bề mặt nghiêng axit (màu vàng)

và cấy đâm sâu axit (màu vàng) mà không sinh hydro sulfua hoặc khí Thời gian ủ

không quá 24 h, vì cấy bề mặt nghiêng thì màu vàng V cholerae có thể chuyển sang

màu đỏ sau 24 h

Hình 3.6 Thử nghiệm TSI

- Phép thử ONPG: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 0,25 ml dung dịchONPG Thêm 1 giọt toluen và lắc ống Đặt ống vào nồi cách thủy để ở 37 0C và để yênkhoảng 5 phút Thêm 0,25 ml thuốc thử để phát hiện – galactoxidase và trộn Đặtống vào nồi cách thủy để ở 37 0C, để yên trong 24 h ± 3 h, kiểm tra liên tục Màu vàngchứng tỏ phản ứng dương tính (có mặt – galactoxidase) Phản ứng thường xảy rasau 20 phút Sau 24 giờ không có màu chứng tỏ phản ứng âm tính

Hình 3.7 Thử nghiệm ONPG

- Phép thử Indol: Cấy khuẩn nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường muối tryton –tryptophan Ủ ở 37 0C trong 24 h ± 3 h Sau khi ủ, thêm 1 ml thuốc thử Kovac’s Việchình thành vòng màu đỏ phản ứng dương tính (hình thành indol) Vòng màu nâu –vàng chứng tỏ phản ứng âm tính