Phân tích vi sinh vật PHÁT HIỆN và ĐỊNH TÍNH v CHOLERAE và v PARAHAEMOLYTICUS

MỤC LỤC 4MỞ ĐẦU 51 GIỚI THIỆU VỀ VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS 51 1 Tình hình ô nhiễm Vibrio Cholera và Vibrio Parahaemolyticus 71 2 Đặc điểm sinh học 8Hình 1 1 Hình minh hoạ Vibrio Choler.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM -o0o PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH TÍNH V.CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS GVHD: Hồng Xn Thế Nhóm: 10 Phan Phước Tiến 2025190050 Nguyễn Thị Thu Trúc 2005170198 Nguyễn Thị Tường Vân 2005190797 Trương Nguyễn Bảo Trân 2005190706 Hà Thị Mỹ Trân 2005191299 Tp Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU GIỚI THIỆU VỀ VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS 1.1 Tình hình nhiễm Vibrio Cholera Vibrio Parahaemolyticus 1.2 Đặc điểm sinh học Hình 1.1: Hình minh hoạ Vibrio Cholerae 1.3 Khả gây bệnh 1.4 Nguồn gốc .9 Quy trình phân tích .9 Hình 2.1: Quy trình phân tích V Cholerae V Parahaemolyticus 11 Hình 2.2: Hình ảnh minh họa cho công đoạn chuẩn bị tăng sinh chọn lọc .11 Hình 2.3: Khuẩn lạc V choleroe V parahaemolyticus môi trường TBCS 12 Hình 2.4: Ảnh minh họa cho tính di động 13 Hình 2.5: Minh họa cho tính oxidase .13 Hình 2.6: Phát L-lyzin tách nhóm cacboxyl .15 Hình 2.7: Thử nghiệm sinh hóa ONPG 15 Hình 2.8: Phát Indol 17 Dụng cụ, môi trường, thiết bị .19 3.1 Tăng sinh chọn lọc: Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW) 20_Toc84795868 3.2 Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacaroza (TCBS thạch) 20 3.3 Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar –TSI (Khẳng định sơ bộ) 21 3.4 Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA (Khẳng định sơ bộ) 21 3.5 Hugh – Leifson Glucoza .22 3.6 Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường bản) (Thử nghiệm sinh học để khẳng định) 22 3.7 Canh thang urê 22 3.8 Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl (Phục hồi) .23 3.9 Thuốc thử Oxidaza (Khẳng định sơ bộ) 23 3.10 Thuốc thử ONPG (Thử nghiệm sinh học để khẳng định) 23 Ví dụ giải thích quy trình 24 Hình 2.9: Màu sắc khuẩn lạc mơi trường TCBS 26 An toàn phân tích 30 Hình 2.10: Minh họa yêu cầu cần tuân thủ chung .30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 MỞ ĐẦU Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus loài vi khuẩn gây bệnh tả người V parahaemolyticus thường lây truyền qua nước bị ô nhiễm.Vibrio cholera nhà giai phẫu học người Ý Filippo Pacini xác định gây bệnh tả vào năm 1854, khám phá ông không công nhận rộng rãi đến Robert Koch nghiên cứu độc lập sau ba mươi năm cơng bố thơng tin bệnh phương pháp phịng chống Bệnh tả hầu hết có liên quan đến thưc phẩm Một nghiên cứu bệnh chứng Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cho thấy yếu tố nguy cao mức tả ăn thức ăn không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Bệnh lây theo đường tiêu hóa thơng qua nguồn nước, thực phẩm rau quả,… thủy hải sản ( sị , ốc, hến,…) khơng rõ nguồn gốc, bị ô nhiễm làm lây lan mầm bệnh Hàng năm giới có vơ số ca mắc bệnh dịch tả, có trường hợp nặng phải tử vong Vì , việc tìm hiểu quy tỉnh định tính, phương pháp phân tích Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus cần thiết dể bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng cộng đồng Từ phần hạn chế trình trạng nhiễm Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus từ thực phẩm Do trình độ kiến thức, hiểu biết chưa sâu nên có nhiều thiếu sót, chúng em mong nhận bảo giúp đỡ lời nhận xét thầy cô môn để sửa chửa, khắc phục kiến thức thiếu giúp trở nên hồn thiện Chúng em xin chân thành cảm ơn! GIỚI THIỆU VỀ VIBRIO CHOLERA VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS 1.1 Tình hình nhiễm Vibrio Cholera Vibrio Parahaemolyticus Vibrio cholerae gồm týp sinh học (biotype) vi khuẩn tả cổ điển tả El Tor Mỗi týp sinh học lại chia thành týp huyết Ogawa, Inaba Hikojima Tả cổ điển Robert Koch phát năm 1883 nguyên nhân gây vụ đại dịch tả giới từ 1816-1926 Tả El Tor Gotschlich tìm năm 1905 khu vực Eltor – Ai Cập, nguyên nhân gây đại dịch tả lần thứ 1961 đến Từ cuối năm 1992, chủng tả O 139 lần phát vụ dịch tả lớn miền nam Ấn Độ Bangladesh (trong tháng có 100.000 người mắc) Đến cuối năm 1994, người ta phát V cholerae O139 vài vụ dịch tả số nơi khác (Pakistan, Nepal, Malaysia, Thái Lan, miền tây Trung Quốc) Tình hình dịch tả giới: Bệnh tả nói đến từ thời Hippocrates Sanskrit, mô tả lần Garcia del Huerto năm 1563 John Snow chứng minh vai trò lây truyền nước năm 1849 Trong vịng gần 200 năm qua lồi người trải qua qua vụ đại dịch tả: - Đại dịch tả lần thứ (1816-1826): Bắt đầu từ Bengal sau lan sang Ấn Độ, Trung Quốc biển Caspian - Đại dịch tả lần thứ hai (1829-1851): Năm 1831 dịch lan sang London (6.536 người chết), Paris (20.000 người chết tổng số 650.000 dân), tổng số chết toàn nước Pháp 100.000 Sau dịch lan sang Liên Xô, Quebec, Ontario New York - Đại dịch tả lần thứ ba (1852-1860): Xảy nhiều vùng Liên Xô, làm hàng triệu người chết Ở London, dịch làm 10.738 người chết Dịch xảy Chicago làm chết 5,5% dân số - Đại dịch tả lần thứ bốn (1863-1875): Dịch xảy chủ yếu Châu Âu Châu Phi Dịch xảy London làm chết 5.596 người - Đại dịch tả lần thứ năm (1881-1896): Năm 1892 dịch xảy Hamburg làm 8.600 người chết Đây vụ dịch nặng cuối Châu Âu - Đại dịch tả lần thứ sáu (1899-1923): Dịch Châu Âu giảm điều kiện vệ sinh tốt dịch xảy nặng nề thành phố Liên Xô - Đại dịch tả lần thứ bảy (1961 - năm 70): Dịch bắt đầu Indonesia năm 1963, với chủng vikhuẩn El Tor, sau lan sang Bangladesh (1963), Ấn Độ (1964), Liên Xô (1966) Từ Bắc Phi dịch lan sang Italy năm 1973, Nhật Bản Nam Thái Bình Dương Từ 1/1991 - 9/1994, dịch xảy Nam Mỹ, bắt đầu Peru với triệu người mắc 10.000 người chết, chủng tả O1 - El Tor gây nên, có khác chút với chủng tả đại dịch lần thứ bảy tái tổ hợp chủng tả cổ điển tả El Tor Từ đến nay, dịch thường xuyên xảy nước Châu Phi, Châu Á Mỹ la tinh Dịch tả đe doạ toàn cầu y tế công cộng số phát triển xã hội Năm 2006, số ca tả báo cáo giới tăng lên đáng kể, tăng 79% so với năm 2005 với tổng số 236.896 báo cáo từ 52 nước, 6.311 trường hợp tử vong Theo Tổ chức Y tế Thế giới số chiếm 10% tổng số ca bệnh xảy thực tế Tình hình tả Việt Nam: Bệnh tả lần xuất Việt Nam năm 1850 với triệu trường hợp bệnh thông báo Từ năm 1910-1938, hàng năm số bệnh nhân mắc tả thông báo dao động từ 5.000 - 30.000 người Bệnh tả El Tor lần xuất miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc bệnh 821 người tử vong Từ đến năm 1975, miền Trung miền Nam, bệnh tả xảy dạng dịch lưu hành Hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh tả thông báo Năm 1994, bệnh tả xuất khu vực Tây Nguyên với 1.459 bệnh nhân Từ năm 1993 -2004, dịch xảy ba miền Bắc, Trung, Nam với khoảng vài nghìn ca bệnh báo cáo hàng năm Tuy nhiên, bệnh khơng bùng phát thành dịch lớn, có trường hợp tử vong Các năm 2005-2006, nước không ghi nhận trường hợp Từ cuối năm 2007, dịch lại bùng phát 19 tỉnh/thành phố phía Bắc, hàng ngàn trường hợp mắc khơng có trường hợp tử vong 1.2 Đặc điểm sinh học - Vibrio parahaemolyticus loại vi khuẩn họ chi với vi khuẩn Vibrio cholerae Có hình dấu phẩy cong ngắn Không bắt màu Gram (Gram -) có lơng nên di động Là vi khuẩn ưa mặn (halophile) nên phát triển tốt môi trường kiềm mặn, tồn nước biển động vật biển cá, tơm, sị, ốc , thường sống cửa sông ven biển hầu hết vùng giới V.parahaemolyticus bị chết 65 0C sau 10 phút, chúng không phát triển nhiệt độ 15 0C Nhiệt độ thích hợp cho nhân lên 370C - Vibrio Cholerae có hình dạng dài que, đầu cong trơng giống dấu phẩy nên cịn gọi phẩy khuẩn tả Phẩy khuẩn tả dễ nuôi cấy môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (pH từ 8,5-9,0) mặn Thuộc nhóm Gram âm, hiếu khí khơng sinh nha bào Chúng có vỏ bao bọc với lơng đầu để di chuyển, chúng có khả di động mạnh Sinh độc tố ruột nội độc tố đường tiêu hóa  Vibrio cholerae O1: nhóm vi khuẩn tả có khả sản xuất độc tố đường ruột gây nên bệnh dịch tả  Vibrio cholerae O139: chúng gây bệnh tả nhờ vào độc tố ruột kháng nguyên điều hịa độc tố TCP  Vibrio cholerae khơng phải O1 khơng phải O139: vi khuẩn thuộc nhóm huyết từ O2 đến O138 Những vi khuẩn thuộc nhóm khơng có khả gây bệnh dịch tả chúng có khả gây viêm đường ruột cấp tính Hình 1: Hình minh hoạ Vibrio Cholerae Khả tồn mơi trường bên ngồi: Phẩy khuẩn tả dễ bị tiêu diệt nhiệt độ (800C/5 phút), hố chất (Clo mg/lít) mơi trường axit Khô hanh, ánh nắng mặt trời làm chết phẩy khuẩn tả Nó tồn lâu phân, đất ẩm, nước, thực phẩm Trong đất, phẩy khuẩn sống 60 ngày, phân 150 ngày, bề mặt thân thể 30 ngày, sữa 6-10 ngày, rau 7-8 ngày, nước 20 ngày Nhiệt độ 250C- 370C, nồng độ muối 0,5 đến 3%, độ pH kiềm (7 - 8,5) giàu chất dinh dưỡng hữu nước điều kiện tối ưu cho phẩy khuẩn tả tồn 1.3 Khả gây bệnh * Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus Gây bệnh dịch tả người nhiễm trùng đường ruột Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus tiết độc tố gây tiêu chảy dội, dẫn đến nước nặng nề, suy kiệt Các vi khuẩn tả xâm nhập thể đường tiêu hóa chúng phải vượt qua hàng rào dịch vị dày có pH axit để xuống ruột non nơi có pH thích hợp cho phát triển vi khuẩn Độ axít bình thường dịch vị cản trở lớn trình sinh bệnh vi khuẩn tả Vào đến ruột non, V.cholerae bám dính vào tế bào niêm mạc ruột nhờ có yếu tố bám dính kháng nguyên TCP Nhờ vào kháng nguyên bám dính, vi khuẩn tả sống lâu ruột non sản xuất nhiều độc tố để gây bệnh Khi gắn kết vào tế bào biểu mơ đường ruột, vi khuẩn tả làm thay đổi tính chất màng tế bào, đưa đến rối loạn cân nước điện giải lòng ruột, hậu tình trạng tiêu chảy cấp tính Đây chế gây nên chết người mắc bệnh tả khơng điều trị, tình trạng nước rối loạn điện giải vắt kiệt sức người bệnh gây nên nhiều biến chứng lên quan khác thể tim mạch thần kinh Một điều đáng lưu ý là, vi khuẩn tả độc tố khơng gây tổn thương lên bề mặt lớp tế bào biểu mô gây biểu đau bụng tiêu chảy người bệnh - Thời kỳ ủ bệnh từ đến ngày Triệu chứng ban đầu thường bao gồm đau bụng, tiêu chảy cấp nơn mửa Mất nước qua phân L/h thường nhiều Thường phân chứa chất lỏng trắng (phân nước vo gạo) Mất nước điện giải trầm trọng dẫn đến, thiểu niệu, chuột rút cơ, suy nhược thể độ đàn hồi da Nếu bệnh tả không điều trị, dẫn tới truỵ mạch mê Tình trạng giảm lưu lượng máu kéo dài gây hoại tử ống thận 1.4 Nguồn gốc Có thể tìm thấy nước, thực phẩm sữa, thủy sản , côn trùng, phân người, phân động vật môi trường xung quanh Quy trình phân tích QUY TRÌNH PHÂN TÍCH V CHOLERAE VÀ V PARAHAEMOLYTICUS Cân 25g mẫu + 225ml APW Dập mẫu 60 giây Ủ canh khuẩn 37oC Phân lập lên TCBS Phân lập lên TCBS Ủ 37oC 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng: - V cholera tròn: khuẩn lạc vàng, đường kinh 2-3mm - V parahaemolyticus tròn: khuẩn lạc xanh, đường kinh 3-4mm Ria lên TSA chứa 1% NaCl hay BHI, ủ qua đêm 37oC Thử nghiệm sơ bộ: + KIA: đỏ/vàng, H2S (-), gas (+) + Di dộng thạch mềm (+) + Oxidase: (+) + KOH thử Gram: (-) Thử nghiệm khẳng định Kết luận Hình 2.1: Quy trình phân tích V Cholerae V Parahaemolyticus Các bước tiến hành: 10 Natri clorua (NaCl) : 30,00 g Dextroza : 10,00 g Tím bromcresol : 0,015 g Thạch : 3,00 g Nước cất : ,00 lít pH = 7,4 ± 0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun nóng để hồ tan hồn tồn thành phần chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút 3.6 Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường bản) (Thử nghiệm sinh học để khẳng định) Pepton : 5,00 g Cao nấm men : 3,00 g Glucoza : 1,00 g Tím bromcresol : 0,02 g Nước cất : 1,00 lít pH = 6,5 ± 0,2 (ở nhiệt độ 250C) Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm g loại axitamin: L-lysin L-arginin L-ornithin vào môi trường Sau đó, rót ml mơi trường vào ống nghiệm, nới lỏng nắp Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Các ống phải nút chặt bảo quản sau cấy 3.7 Canh thang urê Urê : 20,00 g Dinatri hydro phosphat (na2hpo4) : 9,50 g Dikali hydro phosphat (k2hpo4) : 9,10 g Cao nấm men : 0,10 g Ðỏ phenol : 0,01 g Nước cất : 1,00 lít ph = 6,8 ± 0,1 (ở nhiệt độ 250c) Hoà tan thành phần Không hấp khử trùng, lọc vô trùng màng lọc có đường kính lỗ 0,45 ml Sau đó, rót khoảng 1,5 – 3,0 ml vào ống nghiệm đĩa petri sấy vô trùng 21 3.8 Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl (Phục hồi) Trypton : 10,00 g Natri clorua (NaCl) : 20,00 g Thạch : 20,00 g Nước cất : 1,00 lít pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun sôi để hoà tan thành phần Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 – 500C rót đĩa ống nghiệm 3.9 Thuốc thử Oxidaza (Khẳng định sơ bộ) Hoà tan 1,0 g N,N, N‘, N‘-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng Ðựng dung dịch lọ sẫm màu bọc lọ giấy bạc Bảo quản dung dịch nhiệt độ – 80C, sử dụng vòng ngày 3.10 Thuốc thử ONPG (Thử nghiệm sinh học để khẳng định) Dung dịch đệm: Natri dihydro phosphat ngậm phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90 g Nước cất : 45,00 ml Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml Hoà tan NaH2PO4.H2O nước cất Thêm dung dịch NaOH 30% chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml Bảo quản dung dịch nhiệt độ – 80C Dung dịch ONPG: ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg Nước cất 370C : 15,00 ml Dung dịch đệm : 5,00 ml Hoà tan ONPG nước cất nhiệt độ 370C Thêm dung dịch đệm vào lắc Bảo quản nhiệt độ – 80C Trước sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 370C Chú thích: sử dụng đĩa ONPG sản xuất sẵn thay cho dung dịch ONPG 22 Ví dụ giải thích quy trình Phát định danh V cholerae V Parahaemolyticus Phát định danh V cholerae hải sản ( hàu ) Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp định tính vi khuẩn Vibrio cholerae sản phẩm thuỷ sản Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo chương 9, Sổ tay phân tích vi sinh, tái lần năm 1998 Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ Nguyên tắc Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả di động, phản ứng oxidaza dương tính, phát triển nhiệt độ 420C, lên men đường sacaroza, khử lysin; phát triển môi trường khơng có muối khơng phát triển mơi trường có nồng độ muối lớn %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat Phát Vibrio cholerae cách tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc cấy chuyển phân lập môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc nghi ngờ khẳng định thử nghiệm sinh hoá kháng huyết Phương pháp tiến hành 4.1 Chuẩn bị mẫu 4.1.1 Chuẩn bị mẫu thuỷ sản Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào túi PE vô trùng Cắt mẫu lớn thành mảnh nhỏ thêm 225 ml nước pepton kiềm APW vào túi, nghiền máy nghiền đồng thể phút 4.1.2 Chuẩn bị mẫu hàu Lấy phần thịt 10 – 12 hàu (kể nước) cắt nhỏ, trộn Sau đó, nghiền máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu 450 ml nước pepton kiềm APW 23 THÀNH PHẦN Peptone Muối chloride VAI TRÒ Nguồn cung cấp nitrogen carbon, amino acid chuỗi dài, vitamin chất dinh dưỡng cần thiết khác Sodium Duy trì cân áp suất thẩm thấu phút Chia dung dịch mẫu vào bình vơ trùng, bình chứa 250 ml pha lỗng thành hai dãy cách trộn 10 ml dung dịch mẫu 90 ml nước pepton kiềm APW ủ mẫu hai chế độ nhiệt 37,00C ± 1,00C 42,00C ± 0,20C theo qui định 4.2 Tăng sinh 4.2.1 Ðối với mẫu thơng thường Ủ bình chứa mẫu chuẩn bị (kể mẫu chứng dương mẫu chứng âm) nhiệt độ 37,00C 1trong – Sau phân lập, phần cịn lại ủ tiếp 16 – 24 phân lập lại 4.2.2 Ðối với mẫu hàu Ủ dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 nhiệt độ 37,00C ± 1,00C – 16 – 24 Ủ dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 nhiệt độ 42,00C ± 0,20C – 4.3 Phân lập đọc kết đĩa Sau nuôi ủ chế độ nhiệt khoảng thời gian trên, không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch Ủ đĩa TCBS thạch nhiệt độ 37,00C ±1,00C 18 – 24 Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V cholerae trịn, dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacaroza), đậm có viền mờ xung quanh 24 Hình 2.9: Màu sắc khuẩn lạc môi trường TCBS 4.4 Thử nghiệm sinh hoá kháng huyết 4.4.1 Thử nghiệm sinh hoá sơ Chọn khuẩn lạc nghi ngờ TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl ủ nhiệt độ 37,00C ±1,0oC 18 – 24 Khuẩn lạc mọc môi trường sử dụng để thực thử nghiệm sinh hố 4.4.1.1 Thử nghiệm mơi trường TSI, KIA Cấy chuyển khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống thạch nghiêng TSI KIA Nới lỏng nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí Ni ủ nhiệt độ 37,00C± 1,00C 18 – 24 Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng thạch đứng môi trường chuyển màu vàng, không sinh không sinh H2S Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ thạch đứng màu vàng, không sinh không sinh H2S 4.4.1.2 Thử nghiệm với canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 10 % Nuôi ủ nhiệt độ 37,00C 18 – 24 giờ, ủ lại ống âm tính sau 18 – 24 V cholerae phát triển ống canh thang có nồng độ NaCl 0%, 3% làm đục mơi trường 4.4.1.3 Thử nghiệm lên men – oxy hố Cấy khuẩn lạc từ môi trường vào ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson) O/F glucoza Phủ khoảng – ml dầu khống vơ trùng vào ống 25 ủ ống nghiệm nhiệt độ 37,00C ±1,00C – ngày V cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh – Leifson từ màu tím chuyển thành vàng mơi trường O/F từ màu xanh thành vàng 4.4.1.4 Thử nghiệm oxidaza Ðặt giấy lọc lên nắp đĩa petri, nhỏ khoảng – giọt thuốc thử oxidaza Dùng que cấy bạch kim (platin) que cấy nhựa dùng lần; que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí nhỏ thuốc thử oxidaza V cholerae làm vết ria có màu tím thẫm xanh thẫm sau 10 giây Chú thích: khơng dùng que cấy crôm sắt thử nghiệm 4.4.1.5 Nhuộm gram V cholerae vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy 5.4.2 Thử nghiệm sinh hố khẳng định 4.4.2.1 Thử nghiệm phát triển nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào ống canh thang trypton 1% NaCl ,ủ nhiệt độ 42,00C ±0,20C 18 – 24 V cholerae phát triển nhiệt độ 420C làm môi trường bị đục 4.4.2.2 Thử nghiệm cacbonhydrat Cấy vi khuẩn từ TSA vào ống canh thang bromcresol có chứa lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, Dmannoza ủ ống canh thang nhiệt độ 37,00C ± 1,00C Phản ứng dương tính mơi trường có màu vàng, âm tính mơi trường giữ ngun màu đỏ V cholerae phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính 4.4.2.3 Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào ống canh thang ornithin, lysin, arginin ống đối chứng khơng có axit amin Mỗi ống phủ – ml dầu khoáng vô ủ ống nhiệt độ 37,00C ±1,0 0C 18 – 24 Phản ứng dương tính mơi trường giữ ngun màu tím đậm Phản ứng âm tính tồn ống canh thang có màu vàng ổn định ngày (tương tự màu ống đối chứng) V cholerae cho phản ứng lysin ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính 4.4.2.4 Thử nghiệm urê 26 Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê , ủ nhiệt độ 37,00C ±1,00C 18 – 24 V cholerae cho phản ứng âm tính mơi trường giữ ngun màu tím hồng 4.4.2.5 Thử nghiệm ONPG Lấy vi khuẩn phát triển môi trường TSI từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hồ tan Thêm giọt toluen vào ống lắc đều, để yên phút Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG ủ ống nghiệm nhiệt độ 37,00C ± 1,00C Kiểm tra ống định kỳ 24 V cholerae cho phản ứng ONPG dương tính dung dịch có màu vàng Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống ủ ấm đọc kết 4.4.2.6 Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl Ðặt đĩa O/129 có chứa 10 mg 150 mg Vibriostat vào vị trí khác Sau đó, lật ngược đĩa ủ nhiệt độ 37,00C ±1,00C 18 – 24 V cholerae không phát triển bị ức chế Vibriostat tạo vịng vơ khuẩn xung quanh đĩa O/129 4.4.3 Thử nghiệm kháng huyết Nhỏ giọt kháng huyết lên lam kính giọt nước muối sinh lý lên vị trí khác lam Dùng que cấy vơ trùng khác chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch phân tán vi khuẩn Kết luận dương tính có tượng ngưng kết giọt có kháng huyết khơng có tượng ngưng kết giọt nước muối Sử dụng chủng chứng dương chủng chứng âm q trình thực Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết V cholerae theo Bảng Bảng Kháng nguyên Chủng có kết sinh hoá tương tự V cholerae Kháng huyết đa giá O1 Dung dịch muối sinh lý + - 27 Kết luận V.cholerae O1 Chủng có kết sinh hố tương tự V cholerae - - V.cholerae nonO1 Chủng có kết sinh hoá tương tự V cholerae + + Chủng khơng đặc hiệu với kháng ngun O nhóm Bảng – Phân biệt V cholerae O1 V cholerae non – O1 Kháng nguyên Kháng huyết Inaba Kháng huyết Ogawa Dung dịch muối sinh lý Kết luận V cholerae O1 + - - Chủng Inaba V cholerae O1 - + - Chủng Ogawa V cholerae O1 + + - Chủng Hikojima V cholerae O1 - - - Chủng không đặc hiệu Bảng – Phân biệt kiểu huyết chủng V.cholerae O1 Ðọc kết Kết luận : Phát không phát V cholerae 25 g mẫu 28 An tồn phân tích Hình 2.10: Minh họa u cầu cần tuân thủ chung Các yêu cầu cần tuân thủ chung Nhằm đảm bảo an tồn phịng thí nghiệm, yêu cầu sau phải tuân thủ : - Trang bị đầy đủ bảo hộ lao động (áo phòng thí nghiệm, trang, găng tay kính bảo hộ cần), cột gọn tóc (nữ), rửa tay thay dép theo quy định trước vào khu vực phịng thí nghiệm Vi sinh - Khơng mặc bảo hộ bên ngồi khu vực phịng thí nghiệm - Bảo hộ phải ln tình trạng - Rửa tay kỹ trường hợp sau: - Trước sau làm việc; - Trước sau ăn; - Trước sau vệ sinh; - Bất nghi ngờ tiếp xúc với mẫu vật liệu nhiễm vi sinh - Các vết thương da phải bảo vệ kỹ, tránh tiếp xúc với dụng cụ làm việc - Không ăn uống, hút thuốc khu vực phịng thí nghiệm khơng trữ thức ăn khu vực phịng thí nghiệm, tủ mát, tủ lạnh lị vi sóng - Hóa chất, dung mơi thải dễ bay gom vào bình chứa có nắp vặn kín bỏ theo hướng dẫn dịch vụ thu gom  Các yêu cầu phòng vi sinh 29 Hạn chế tiếp cận khu vực phòng thí nghiệm Vi sinh: - - Có biển cảnh báo hạn chế tiếp cận “Không phận sự, không phép vào khu vực này” người không phận sự, trước vào khu vực phịng thí nghiệm Vi sinh Những nhân viên khơng có phận sự, khơng phép tiếp cận khu vực phịng thí nghiệm vi sinh Khách tham quan, người liên hệ công tác, nhân viên cần tiếp cận, phải đồng ý Phụ trách phịng có nhân viên phận hướng dẫn lại khu vực phịng thí nghiệm - Các bề mặt bàn làm việc phịng thí nghiệm phải vệ sinh kỹ cồn 70 % trước sau làm việc - Các thao tác với chủng vi sinh vật chuẩn phải thực tủ an toàn sinh học cấp - Khi chuẩn bị hóa chất mơi trường có cảnh báo nguy hiểm, cần đọc kỹ tuân theo hướng dẫn pha chế MSDS hóa chất mơi trường - Khi vận hành thiết bị có liên quan đến tính an tồn (nồi hấp, đèn Bunsen), cần đọc kỹ tuân thủ hướng dẫn sử dụng thiết bị Yêu cầu rác thải mẫu kiểm nghiệm xong phòng vi sinh - - Rác thải vi sinh phải phân loại xử lý Rác thủy tinh vỡ vật dụng sắc nhọn (kim tiêm): gom vào thùng dày, có nắp đậy kín Rác thải nhiễm mẫu thực phẩm nhiễm vi sinh phải hấp tiệt trùng 121OC, 30 phút trước cho vào thùng có nắp kín, chuyển cho dịch vụ thu gom rác cuối ngày làm việc Rác thải nhiễm vi sinh bao gồm loại sau: + Mẫu thực phẩm, môi trường nuôi cấy vật dụng chứa (túi mẫu, đĩa petri, ống nghiệm) sau cấy nuôi ủ; + Đầu tip, khay đựng mẫu, cốc đựng típ, que cấy, que trang, giá ống nghiệm vật dụng tiếp xúc trực tiếp với mẫu nhiễm có nguy bị mẫu nhiễm rơi đổ; + Găng tay, trang, bơng gịn vệ sinh mặt bàn thao tác với mẫu nhiễm;  Cách xử lý trường hợp khẩn cấp 30 Báo cho phụ trách phịng thí nghiệm có trường hợp khẩn cấp xảy để có phương án xử lý thích hợp  Rơi đổ hóa chất - Xử lý hóa chất rơi đổ theo hướng dẫn MSDS hướng dẫn ban an tồn - Kịp thời thơng báo cho người để có biện pháp xử lý - Hóa chất bị đổ có khả gây cháy phải tắt nguồn điện thiết bị cung cấp nguồn - Sử dụng vật liệu cần thiết chất hấp thụ để làm hóa chất rơi đổ theo MSDS - Mang đầy đủ dụng cụ bảo hộ cá nhân xử lý chất rơi đổ - Thu hồi xử lý vật liệu hấp thụ - Vệ sinh lại tồn khu vực bị rơi hóa chất  Văng bắn hóa chất vào người - Khi bị văng bắn hóa chất vào người cần phải xủ lý theo MSDS - Dùng vòi sen hay vòi rửa mắt rửa nước 15 phút - Trong trường hợp có người bị thương cần phải giữ nạn nhân bình tĩnh, sơ cấp cứu báo cho ban an tồn khu thí nghiêm  Rơi đổ chủng vi sinh vật - Để tránh trường hợp đổ chủng vi sinh vật phạm vị lớn, thao tác tiến hành với chủng chuẩn phải thực khay vật liệu hấp tiệt trùng - Rác thải nhiễm vi sinh phải hấp tiệt trùng 121oC 20 phút trước đổ bỏ vào thùng thu gom  Phạm vi đổ mức độ nhỏ Dùng vật liệu thấm chất tiệt trùng thích hợp (cồn 70 %) phủ lên bề mặt phạm vi chủng vi sinh vật bị đổ Thu gom toàn vật liệu vào vật chứa đem hấp khử trùng Vệ sinh bề mặt chất khử trùng (cồn 70 %) 31  Phạm vi đổ mức độ lớn - Ở tủ cấy sinh học, tủ ấm Mang đầy đủ dụng cụ bảo hộ cá nhân làm vệ sinh vùng bị lây nhiễm đổ VSV Trong suốt trình làm vệ sinh tủ, tủ phải ln ln mở Nếu phạm vi đổ nhỏ dùng vật liệu thấm chất tẩy tiệt trùng, lau lọai bỏ rác thải nhiễm vi sinh vật Nếu chủng vi sinh vật đổ bề mặt làm việc, phủ toàn bề mặt làm việc vật liệu có chất tẩy tiệt trùng, để yên 20 phút Thu hồi loại bỏ rác thải nhiễm Vệ sinh toàn bề mặt tủ chỗ bị văng bắn chất tẩy tiệt trùng Thu hồi vật bị nhiễm cho vào vật chứa đem hấp khử trùng - Bên tủ cấy, tủ ấm bên phịng thí nghiệm Nếu chủng vi sinh vật bị đổ phạm vi lớn ý di tản toàn nhân viên khu vực đổ Dán giấy cảnh báo lên cửa phịng thí nghiệm đóng cửa khu vực lại Nếu có tai nạn xảy người báo cho phận an tồn quan để có phương án xử lý thích hợp Người phân cơng xử lý khu vực cần phải trang bị đầy đủ: chất tẩy, dụng cụ chứa, khăn thấm, túi đựng Mang đầy đủ dụng cụ bảo hộ cá nhân xử lý  Vệ sinh toàn khu vục bị đổ chất tẩy tiệt trùng theo bước sau: + Cơ lập tồn khu vực bị đổ vật liệu có thấm chất tẩy tiệt trùng để ngăn chặn chảy tràn Phủ lên toàn bề mặt đổ vật liệu có thấm chất tẩy + Để yên 20phút, sau thu hồi, loại bỏ rác thải nhiễm + Vệ sinh vật liệu không hấp khử trùng chất tẩy sát trùng Những vật sắc, nhọn mà có nhiễm vi sinh vật cần phải thu hồi để vào bình chứa thích hợp trước đem hấp khử trùng loại bỏ Những vật liệu khác bị nhiễm vi sinh vật thu hồi hấp khử trùng để tái sử dụng loại bỏ  Sự cố cháy nổ - Trong phạm vi nhỏ 32 Báo cho trưởng phòng ban an tồn Các đám cháy nhỏ phịng thí nghiệm chữa cháy bình chữa cháy hóa chất khơ hay bình CO2 theo hướng dẫn Ban an toàn - Trong phạm vi lớn Báo động cho cho trưởng phịng ban an tồn (bộ phận phịng cháy, chữa cháy quan) để có phương pháp xử lý thích hợp Khơng tự đưa vào tình nguy hiểm Sơ tán người khỏi khu vực cháy TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6404:1998 Trần Linh Thước “Phương pháp phân tích vi sinh vật nước , thực phẩm mĩ phẩm” tái lần thứ , Nhà xuất Giáo Dục Bộ Y Tế “Hướng Dẫn Thực Hành Kỹ Thuật Xét Nghiệm Vi Sinh Lâm Sàng” (Ban hành kèm theo Quyết định số 1539/QĐ-BYT ngày 20/4/2017 Bộ trưởng Bộ Y tế), Nhà xuất Y Học Hà Nội – 2017 https://www.dieutri.vn/bgvisinhyhoc/vi-khuan-ta-vibrio-cholerae http://www.pasteurhcm.gov.vn/news/benh-ta-52.html https://visitech.vn/thao-tac-thuc-hien-pp-kiem-vibrio-spp-theo-tcvn-khuanlac-vibrio-spp-phan-2/ 33 https://luattrongtay.vn/ViewFullText/Id/ca00f7f3-0b9b-4b4f-aa0b7d2cccf97003 https://vanbanphapluat.co/data/2017/08/297308_tcvn7905-1-2008.pdf Tham khảo : Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 200 : 2004 Vibrio Cholerae sản phẩm thủy sản - Phương pháp định tính Bộ Thuỷ sản ban hành 34