Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus và gây độc tế bào.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ …… ….***………… TRẦN THỊ HỒI VÂN NGHIÊN CỨU HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VIỆT NAM THEO ĐỊNH HƯỚNG KHÁNG CHỦNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS VÀ GÂY ĐỘC TẾ BÀO Chuyên ngành: Hoá học Hợp chất thiên nhiên Mã số: 9.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2023 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS PHẠM THỊ HỒNG MINH Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TS PHẠM QUỐC LONG Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … , ngày … tháng … năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Từ cuối năm 2010 đến nay, bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis disease - AHPND) với tác nhân gây bệnh cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang plasmid có chứa gen độc lực gây hoại tử gan tụy cấp gây thiệt hại lớn kinh tế cho ngành nuôi tôm công nghiệp nước ta Việc nghiên cứu tìm kiếm lồi thực vật có tác dụng tốt phịng trị bệnh ni trồng thủy sản nói chung tơm ni nói riêng xu hướng phát triển giới Trên sở sàng lọc hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus kết hợp với kinh nghiệm sử dụng dân gian, xác định nhiều loài thảo dược thể hoạt tính tốt có nhiều ưu điểm tiềm cho phát triển thành thuốc Mơ hình nghiên cứu thuốc sử dụng cơng cụ hỗ trợ máy tính ngày phổ biển có nhiều đóng góp quan trọng nghiên cứu phát triển thuốc Đây kỹ thuật đáng tin cậy hiệu phát triển thuốc tương lai Từ lí trên, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học số loài thực vật Việt Nam theo định hướng kháng chủng Vibrio parahaemolyticus gây độc tế bào” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học định hướng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tôm nuôi hoạt tính kháng u số lồi thực vật Việt Nam bao gồm: Đơn châu chấu (Aralia armata), Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica), Khổ sâm (Croton tonkinensis), Ké hoa đào (Urena lobata), Thồm lồm (Polygonum chinense), Thầu dầu (Ricinus communis) Cà trái vàng (Solanum xanthocarpum) Nghiên cứu hoạt tính sinh học theo định hướng tạo chế phẩm chống bệnh AHPND vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây cho tơm nghiên cứu hoạt tính sinh học theo định hướng gây độc tế bào ung thư phổi A549 ent-kaurane diterpenoid phân lập Sàng lọc in silico sở liệu hợp chất từ loài thực vật nghiên cứu dự đoán nhanh hoạt chất tiềm tác dụng số đích sinh học cụ thể sử dụng điều trị kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus kháng u Nghiên cứu chế hoạt động xác định mối tương quan hoạt tính – cấu trúc hoạt chất tiềm Các nội dung nghiên cứu luận án - Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ 07 loài thực vật nghiên cứu - Đánh giá hoạt tính kháng V parahaemolyticus in vitro cao chiết thô số hợp chất phân lập - Mơ tìm hiểu chế ảnh hưởng số hoạt chất đến chuyển hóa proline vi khuẩn V parahaemolyticus - Đánh giá hoạt tính kháng V parahaemolyticus in vivo cao chiết thô thực vật nghiên cứu - Nghiên cứu docking phân tử hợp chất ent-kaurane diterpenoid định hướng ức chế đường tín hiệu PI3K Cấu trúc luận án Luận án gồm 126 trang đánh máy với 17 bảng, 50 hình Phân bố cụ thể sau: Mở đầu 02 trang, tổng quan 26 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 09 trang, thực nghiệm 18 trang, kết thảo luận 58 trang, kết luận kiến nghị 02 trang, danh mục cơng trình cơng bố 01 trang, tài liệu tham khảo 10 trang NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: Giới thiệu loài thực vật nghiên cứu; Tình hình nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật gây độc tế bào ung thư; Các nghiên cứu thuốc thực vật chống chủng Vibrio gây bệnh nuôi trồng thủy sản; Sàng lọc ảo dự đoán hoạt chất định hướng hoạt tính kháng khuẩn gây độc tế bào Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu phương pháp phân lập xác định cấu trúc hóa học 2.1.1 Mẫu thực vật Đối tượng nghiên cứu luận án 07 mẫu thực vật: thân Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica), Thầu dầu (Ricinus communis), thân Ké hoa đào (Urena lobata), cành Khổ sâm (Croton tonkinensis), cành Thồm lồm (Polygonum chinense), thân Đơn châu chấu (Aralia armata) Cà trái vàng (Solanum xanthocarpum) Việt Nam 2.1.2 Phương pháp xử lý chiết mẫu Xử lý mẫu thực vật theo phương pháp thơng thường hóa học, tạo cao methanol tổng, sau bổ sung thêm nước chiết phân bố lại với dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate nước 2.1.3 Phương pháp phân tích, phân lập hợp chất từ mẫu Phối hợp phương pháp sắc ký khác như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh YMC RP 18 (Merck), sắc ký cột diaion sắc ký rây phân tử với pha tĩnh sephadex LH-20 (Merck) sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) điều chế 2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Sử dụng phương pháp phổ đại đồng thời kết hợp phân tích, tra cứu tài liệu tham khảo: Đo độ quay cực [α]; phổ khối lượng (MS); phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR, 13C-NMR DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY; phổ lưỡng sắc trịn (CD) 2.2 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn V parahaemolyticus in vitro phương pháp lập kháng sinh đồ đĩa thạch Kirby-Bauer khuyếch tán đĩa thạch Chaweepack (2015) thử nghiệm in vivo đươc thực Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I II Hoạt tính gây độc tế bào thử nghiệm phương pháp MTT [3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), phổi (A549) Phịng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, VAST 2.3 Phương pháp mô lắp ghép phân tử Mô docking phân tử sử dụng phần mềm AutoDock 4.2.6 Molegro Virtual Docker để tìm hiểu chế tác động lên trình chuyển hóa proline V.parahaemolyticus dự đốn hợp chất tiềm ức chế đường tín hiệu PI3K điều trị ung thư phổi Trung tâm Hóa thực vật Cơng nghệ Nano Y Sinh, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, VAST Chương THỰC NGHIỆM 3.1 Thân Đơn châu chấu (Aralia armata) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn chiết n-hexane (AAH) ethyl acetate (AAE) Thân Đơn châu chấu Sơ đồ 3.1 Sơ đồ 3.1 Phân lập cặn n-hexane ethyl acetate thân Đơn châu chấu 3.2 Cành Khổ sâm (Croton tonkinensis) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn dichloromethane (CTD) cành Khổ sâm sơ đồ 3.2 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập từ cặn dichloromethane cành Khổ sâm 3.3 Cành Thồm lồm (Polygonum chinense) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate (PCE) cành Thồm lồm Sơ đồ 3.3 Sơ đồ 3.3 Phân lập cặn n-hexane ethyl acetate cành Thồm lồm 3.4 Thân Bọ mắm (Pouzolzia zeylanica) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn chiết n-hexane (BMH) ethyl acetate (BME) cành Bọ mắm Sơ đồ 3.4 Sơ đồ 3.4 Phân lập cặn n-hexane ethyl acetate thân Bọ mắm 3.5 Lá Thầu dầu (Ricinus communis) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn chiết n-hexane (RCH) ethyl acetate (RCE) Thầu dầu Sơ đồ 3.5 Sơ đồ 3.5 Phân lập cặn n-hexane ethyl acetate Thầu dầu 3.6 Quả Cà trái vàng (Solanum xanthocarpum) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn methanol (SXM) Cà trái vàng Sơ đồ 3.6 Sơ đồ 3.6 Phân lập cặn n-hexane ethyl acetate Cà trái vàng 3.7 Thân Ké hoa đào (Urena lobata) Quá trình phân lập hợp chất từ cặn chiết n-hexane (ULH) ethyl acetate (ULE) thân Ké hoa đào Sơ đồ 3.7 Sơ đồ 3.7 Phân lập cặn n-hexane ethyl acetate thân Ké hoa đào 3.8 Mô docking phân tử Mô docking phân tử tìm hiểu chế hoạt động đích tác dụng PDH: Cấu trúc tinh thể proline dehydrogenase lấy từ sở liệu Protein Data Bank Các hợp chất flavonoid diterpenoid dùng nghiên cứu xây dựng cấu trúc ba chiều Chất ức chế PDH biết naucleidinal sử dụng làm chất chuẩn Các mô thực phần mềm AutoDock 4.2.6 Mô docking phân tử đích tác dụng đường tín hiệu PI3K: Cấu trúc tinh thể protein đường tín hiệu PI3K gồm AKT, mToR, COX-2, MDM2 PDK1 lấy từ sở liệu Protein Data Bank Để tính điểm cho hợp chất, hệ thống tính điểm MolDock Score [GRID] phần mềm MVD sử dụng Oxaliplatin dùng làm chất chuẩn so sánh 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn gây độc tế bào Cao chiết hợp chất phân lập Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn in vitro: theo phương pháp lập kháng sinh đồ đĩa thạch Kirby-Bauer phương pháp khuyếch tán đĩa thạch Chaweepack (2015) Hiệu đánh giá dựa vào vòng vơ khuẩn Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn in vivo: theo phương pháp thí nghiệm sử dụng chiết phẩm thô trộn vào thức ăn cho tôm ăn cho môi trường nước Xác định giá trị LC50 cao chiết Khổ sâm: thực dựa theo phương pháp APHA (2005) Ghi nhận số tôm chết hàng ngày theo dõi suốt 96 để xác định giá trị LC50 (nồng độ gây chết 50%) chương trình máy tính (Stephan & Rodgers, 1985) Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp MTT: dòng tế bào ung thư phổi người A549 lấy từ Trung tâm Dinh dưỡng nguyên liệu Dược phẩm, Đại học Myongji, Hàn Quốc Hoạt tính gây độc tế bào thực theo phương pháp MTT Nồng độ ức chế IC50 tính sử dụng phần mềm Graphpad Prism (USA) Hoạt tính kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus in vitro in vivo Cao chiết hợp chất thử nghiệm Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II 11 mẫu thử nghiệm có hiệu diệt khuẩn khơng có khác biệt với thuốc Doxycycline (30µg) Trong số mẫu thử nghiệm theo phương pháp kháng khuẩn đĩa thạch theo Chaweepack (2015) Cao chiết Đơn châu chấu (Aralia armata) có độ nhạy nhất, tiếp đến cao chiết Khổ sâm (Croton tonkinensis), khả ức chế phát triển vi khuẩn V parahaemolyticus với đường kính trung bình vịng ức chế 25 18 mm Dựa vào kết trên: Cao chiết tổng 07 mẫu nói tiếp tục nghiên cứu sâu (thử nghiệm tơm, nghiên cứu hóa học để xác định thành phần hóa học có mặt lớp chất mẫu thử nghiệm có tác dụng ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus) Kết lập kháng sinh đồ (Bảng 4.1) cho thấy nồng độ cao tách chiết sử dụng tăng lên gấp lần từ 66,7µg lên 200µg hiệu diệt khuẩn khơng có khác biệt ý nghĩa Vì áp dụng thử nghiệm tơm, nồng độ mức thấp tương ứng 66,7µg lựa chọn để áp dụng nhằm tăng hiệu kinh tế (giảm chi phí tách chiết thảo dược hiệu diệt khuẩn đáp ứng tốt, tương ứng nồng độ cao (200µg) Cao chiết tổng Đơn châu chấu (A armata) có khả ức chế phát triển vi khuẩn V parahaemolyticus cao cao chiết Khổ sâm (C tonkinensis) Đơn châu chấu phổ biến, phụ thuộc vào mùa vụ nên việc thu thập mẫu khó khăn, ảnh hưởng đến thử nghiệm thực nghiệm quy mô lớn Ngược lại, Khổ sâm sử dụng rộng rãi dân gian, mọc hoang trồng nhiều làm thuốc Ba Vì, Ninh Bình, Hịa Bình, … Đây nguồn nguyên liệu dễ kiếm Mặt khác, kết thử hoạt tính kháng vi khuẩn V parahaemolyticus hợp chất tinh (ent-kauran) phân lập từ Khổ sâm thể hoạt tính tốt nhiều so với hợp chất tinh 12 (triterpenoid) phân lập từ thân Đơn châu chấu Vì vậy, lựa chọn cao chiết Khổ sâm (C tonkinensis) đưa vào thử nghiệm tơm hồn tồn hợp lý Cao chiết tổng Thồm lồm (P chinense) Thầu dầu (R communis) đưa vào thử nghiệm tôm Thầu dầu ưu tiên lựa chọn để thử nghiệm số lý sau: Cà trái vàng (S xanthocarpum) Thầu dầu (R communis) có hiệu tương tự kết lập kháng sinh đồ Tuy nhiên, bảng 4.1 cho thấy đường kính vơ khuẩn Thầu dầu lớn 0,9; 0,1 0,6mm so với Cà trái vàng nồng độ tương ứng 200, 66,7 40µg Ngồi ra, Việt Nam nuôi trồng thủy sản Thầu dầu loại thảo dược khuyến cáo sử dụng trị bệnh cho cá nuôi chữa bệnh lở loét, đốm đỏ có kết cao (ngâm 15-20kg /8-10m3 lồng nuôi cá) Trong nuôi trồng thủy sản, Thồm lồm xác định có hiệu kháng khuẩn nấm, phổ diệt khuẩn rộng với vi khuẩn Gr (+) Gr (-) (V parahaemolyticus) đường kính vịng vô khuẩn đạt 18,0 mm (Staphylococcus aureus) 22,3 mm (Bacillus subtilis) tương ứng với hàm lượng 100 µg/khoanh giấy 4.2 Thành phần hóa học thực vật có hoạt tính Kết phân lập xác định cấu trúc hợp chất loài nghiên cứu tóm tắt bảng 4.9 Bảng 4.9 Tổng hợp hợp chất phân lập từ loài nghiên cứu TT Tên hợp chất Lớp chất Loài phân lập KL (mg) Triterpenoit A armata 18,0 Lignan A armata Tính oleanolic acid (A3) liriodendrin (A4) 12,5 L 13 Diterpenoid C tonkinensis 20,5 Diterpenoid C tonkinensis 50,5 Diterpenoid C tonkinensis 20,3 Flavonoid P chinense U lobata 9,8 7,3 Flavonoid P chinense 6,9 L Flavonoid P chinense 9,5 L ent-18-axetoxy-7-hydroxy-kauran-15on (C1) ent-1α-axetoxy-7,14α-dihydroxykaur16-en-15-on (C2) ent-18-axetoxy-7-hydroxykaur-16-en15-on (C3) quercetin (P1) (-)-epicatechine (P2) quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (P3) 14 Triterpenoid P zeylanica 110,5 L Triterpenoid P zeylanica 36,0 L Lignan P zeylanica 6,6 H Triterpenoid R communis 13,0 Triterpenoid R communis 20,5 L Steroid R communis 19,2 L Alkaloid R communis 16,2 friedelan-3-one (Z1) 10 3β-friedelanol (Z2) 11 pouzolignan F (Z3) 12 lupeol (R1) 13 epialeuritolic acid (R2) 14 ergosterol peroxide (R3) 15 ricinine (R4) 15 16 Alkaloid R communis 10,1 H Alkaloid S xanthocarpum 50,0 Alkaloid S xanthocarpum 9,0 Alkaloid U lobata 53,1 H Flavonoid U lobata 8,6 H Flavonoid U lobata 5,3 H 3-carboxy-4-methoxy-N-methyl-2pyridone (R5) 17 solasonine (S1) 18 solamargine (S2) 19 -acetylamino-phenylpropyl benzoylamino-phenylpropanoate (U1) 20 trans-tiliroside (U2) 21 cis-tiliroside (U3) 16 Steroid (Phytosterol) β-sitosterol (A1) A armata C tonkinensis P chinense P zeylanica R communis U lobata 30,0 1800 1100 35,3 28,1 1200 Steroid (Phytosterol) Daucosterol (A2) A armata C tonkinensis P chinense P zeylanica R communis U lobata 44,0 15,5 9,5 50,2 13,4 15,1 22 23 L: Lần phân lập từ loài H: Lần phân lập từ họ 4.3 Kết tác dụng kháng V parahaemolyticus chất Các hợp chất thu từ loài nghiên cứu tiếp tục thử nghiệm in vitro tác dụng kháng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND Chuẩn bị chủng khuẩn V parahaemolyticus phương pháp thử nghiệm thực mục 3.9 Kết thử nghiệm chất sạch: oleanolic acid, liriodendrin (cây Đơn châu chấu), 3-friedelanone, 3β-friedelanol, pouzolignan F (cây Bọ mắm), lupeol, epialeuritolic acid, ergosterol peroxide, ricinine (cây Thầu dầu) solasonine solamagine (Cà trái vàng) vi khuẩn V parahaemolyticus nồng độ 50, 100, 200 300µg/khoanh tẩm phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán đĩa thạch theo W Kirby A Bauer (1961) phịng thí nghiệm, khơng có hiệu kháng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPND Kết thử nghiệm tác dụng kháng V parahaemolyticus chất sạch: ent-18-axetoxy-7-hydroxykauran-15-on (C1, hàm lượng 0,012%), ent-1α-axetoxy-7,14α-dihydroxykaur-16-en-15-on (C2, hàm lượng 0,80%) ent-18-axetoxy-7-hydroxykaur-16-en-15-on (C3, hàm lượng 0,52%) (cây Khổ sâm) quercetin-3-O-β-D- 17 glucopyranoside (P3, hàm lượng 1,11%) phương pháp khuyêch tán đĩa thạch thể bảng 4.10 Bảng 4.10 Hiệu ức chế chất đến phát triển Vibrio parahaemolyticus (VP) nuôi cấy môi trường ISB sau 24 Nồng Mật độ Tỷ lệ ức chế vi độ chất (CFU/ml) khuẩn sau 24h Cồn tuyệt đối + VP + ISB 1,37 x 108 P3 2,4 x 107 82,5% C1 4,0 x 107 70,8% 0,1% C2 7,6 x 10 44,5% C3 6,8 x 107 50,4% Kết bảng 4.10 cho thấy tỷ lệ ức chế V parahaemolyticus nghiệm thức chứa chất tinh P3 82,5% nghiệm thức chứa chất tinh C1 chiếm 70,8% nồng độ 0,1% Ở nghiệm thức chứa chất tinh C3 C2 có tỷ lệ ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus 50,4% 44,5% Điều cho thấy P3 C1 nồng độ 0,1% có khả ức chế phát triển V parahaemolyticus Vì vậy, chúng dùng cho thí nghiệm phịng bệnh AHPND phịng thí nghiệm với liều 0,1% (1g/kg thức ăn) 4.4 Mô docking phân tử tìm hiểu chế tác động số hoạt chất đến chuyển hóa proline vi khuẩn V parahaemolyticus Proline dehydrogenase (PDH) enzyme điều hịa đóng vai trò quan trọng việc tự tổ chức protein vi khuẩn Cơ chế hoạt động hợp chất ent-1α-axetoxy-7,14α-dihydroxykaur-16-en15-on (C2), ent-18-axetoxy-7-hydroxy-kauran-15-on (C1), ent-18axetoxy-7-hydroxykaur-16-en-15-on (C3) quercetin-3-O-β-Dglucopyranoside (P3) phân tích sử dụng phương pháp mơ lắp ghép phân tử hợp chất với đích enzyme PDH Bảng 4.11 Điểm lượng liên kết tương tác tạo thành chất với PDH Hợp chất G (kcal/mol) Số liên kết Amino axit tham gia tạo Tên chất 18 liên kết Hydrogen Gly64; Asp281 Gly64; Gln102 Gly64; Asp281; Arg289 Asp61; Leu62; Gly64; P3 -11.59 Leu98; Leu100; Gln102 ; Arg288 ; Arg289 Naucleidinal -7.82 Gly64; Arg289 Kết mô tương tác hợp chất tiềm với vùng hoạt động enzyme proline dehydrogenase trình bày bảng 4.11 Theo thuật tốn phần mềm Autodock 4.2.6, hợp chất có điểm lượng liên kết tự âm nhiều có nghĩa lực liên kết hợp chất với đích tác dụng lớn Xét theo tiêu chí trên, bốn hợp chất sau mô cho kết lực liên kết vùng hoạt động PDH tốt so với chất chuẩn naucleidinal, hợp chất P3 cho thấy lực liên kết cao (-11.59 kcal/mol), hợp chất C2 có lực liên kết thấp bốn chất nghiên cứu (-9.91 kcal/mol) Những số liệu ban đầu cho thấy độ tương quan cao tính tốn với thực nghiệm thể qua hệ số tương quan R2 = 0.8014 Điều gợi ý mơ hình tính tốn sử dụng nghiên cứu có tiềm ứng dụng dự đốn hợp chất có khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus Nhìn chung, hợp chất hình thành liên kết với amino axit quan trọng nằm vùng hoạt động enzyme PDH, điều gợi ý giải thích hợp lý cho chế tạo hoạt tính kháng khuẩn hợp chất nghiên cứu 4.5 Kết tác dụng kháng V parahaemolyticus cao chiết thô in vivo 4.5.1 Cao chiết Thồm lồm Thầu dầu bổ sung vào môi trường nước Kết thử nghiệm bổ sung cao chiết ethanol tổng Thồm lồm (PC.M) Thầu dầu (RC.M) vào môi trường nước: cao chiết PC.M nồng độ 30g/m3 sử dụng pha vào nước ni tơm có mầm bệnh AHPND thời điểm (bắt đầu xuất mầm bệnh lặp lại sau 24h) nâng C2 C1 C3 -9.91 -10.85 -10.34 Hydrogen 2 19 cao tỷ lệ sống tôm (60%) so với lô đối chứng dương Cao chiết PC.M (25g/m3) RC.M (35g/m3; 40g/m3) không diệt khuẩn nước hồn tồn, tỷ lệ chết 100% sau ngày thí nghiệm 4.5.2 Cao chiết Khổ sâm, Đơn châu chấu, Bọ mắm, Ké hoa đào bổ sung vào môi trường nước Kết thử nghiệm bổ sung cao chiết ethanol tổng Khổ sâm (CT.M), Đơn châu chấu (AA.M), Bọ mắm (PZ.M), Ké hoa đào (UL.M) vào môi trường nước trước gây nhiễm ngâm lần sau 24 gây nhiễm với liều 20 ppm: tỷ lệ sống trung bình tơm sau ngày gây nhiễm ghi nhận cao 71,7 ± 2,9% nghiệm thức ngâm CT.M, ngâm AA.M 61,7 ± 2,9%, ngâm PZ.M 35% ± 10,0% thấp ngâm UL.M 11,7 ± 7,6% Trong đó, tỷ lệ sống trung bình nghiệm thức đối chứng dương 10 ± 5,0% đối chứng âm tôm sống 100% sau kết thúc thí nghiệm Tỷ lệ gây chết tơm thu nhận, giá trị LC50 xác định thời điểm 48, 72 96 93,02ppm, 81,25ppm, 81,25ppm Trong khi, thời điểm 24 giờ, giá trị LC50 không xác định tỷ lệ chết thấp 4.5.3 Tác dụng kháng V parahaemolyticus trộn thức ăn nuôi tôm 4.5.3.1 Cao chiết Thồm lồm (PC.M) trộn thức ăn nuôi tôm Đối với công thức phối trộn cao chiết Thồm lồm PC.M vào thức ăn: tôm ăn với nồng độ 25 30g/100kg tôm liên tục ngày, sau cơng cường độc vi khuẩn bổ sung vi khuẩn vào nước nuôi với mật độ 105-106 cfu/mL Kết cho thấy biện pháp cho ăn nồng độ 25g/100kg tôm tỷ lệ chết 27%, lơ ăn 30g/100kg tơm có tỷ lệ chết 60% Tỷ lệ chết cao lô cho ăn 30g/100kg tôm ghi nhận ngày thứ sau công cường độc Như qua mơ hình thí nghiệm nhận thấy thảo dược PC.M có hiệu phịng bệnh AHPND với tỷ lệ sống đạt cao >60% so với lô đối chứng dương 20 4.5.3.2 Cao chiết Khổ sâm (CT.M) trộn thức ăn ni tơm Kết thí nghiệm phịng bệnh cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn cho tôm ăn suốt ngày 12 ngày: Tỷ lệ sống tôm nghiệm thức đối chứng dương (tôm ăn thức ăn không trộn cao chiết) 15%±5% tỷ lệ sống trung bình tơm nghiệm thức đối chứng âm 100% Trong đó, nghiệm thức phòng bệnh dịch chiết nồng độ 1%; 2% 4% có tỷ lệ tơm sống 43,3%±5,8%; 63,3%±7,6% 71,7%±2,9% Điều nói dịch chiết Khổ sâm có hiệu phịng bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tôm thẻ chân trắng với hai liều 2% 4% trộn vào thức ăn với tỷ lệ sống trung bình 60% Kết phân tích mơ bệnh học mẫu tơm thí nghiệm phịng bệnh AHPND cho thấy gan tuỵ tơm ăn thức ăn trộn 2% 4% cao Khổ sâm có cấu trúc bình thường Tỷ lệ chết trung bình tơm thí nghiệm thời điểm 24, 48, 72, 96 thử nghiệm Tôm cho ăn hàng ngày với nồng độ cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn bao gồm 0, 25, 30, 35, 40, 45% Kết thí nghiệm cho thấy khơng có tơm chết nghiệm thức đối chứng (0%) suốt 96 thí nghiệm Ở tất nghiệm thức ăn cao chiết, tôm chết sau 24 giờ, có tỷ lệ chết trung bình từ 1,67%2,89% đến 5%0% Tỷ lệ trung bình tơm bị chết sau 48 nồng độ cao chiết cao (45%) 15%5% Ở thời điểm 72 96 giờ, tỷ lệ trung bình tơm chết nồng độ cao thí nghiệm (45%) tương đương (21,67%2,89%) Do kết tỷ lệ tôm chết