Định Tính V.cholerae Và V.parahaemolyticus.pptx

Thạch máu Wagatsuma Trang 11 THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG THẠCH TCBSThành phầnVai tròSucroseLên men làm môi trường có tính acidDipeptoneCung cấp nitrogen, vitamins, và các amino acid trong TCB

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN : PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI : ĐỊNH TÍNH V.CHOLERAE VÀ

V.PARAHAEMOLYTICUS

GVHD : Cô ĐINH THỊ HẢI THUẬN NHÓM THỰC HIỆN : NHÓM 13

Nhan Nguyễn Phương Duy 2005208355Nguyễn Thị Mộng Thi 2005202143

THÀNH VIÊN

TRƯỜNG

& HÓA CHẤT

Môi trường, thuốc thử

1 Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW)

2 Môi trường phân lập:

3 Môi trường, thuốc thử sinh hoá

4 Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường cơ bản)

5 Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản)

V.CHOLERAE

V PARAHAEMOLYTICUS

Môi trường, thuốc thử

1 Môi trường Glucose Salt Teepol Broth (GSTB)

* Đối với canh thang đậm đặc thì trọng lượng mỗi thành phần tăng gấp 2 lần (trừ nước): San ra các ống nghiệm loại 20x150mm, mỗi ống 10ml

* Đối với canh thang loãng: San ra các ống nghiệm loại 18x150mm, mỗi ống 10ml

V PARAHAEMOLYTICUS

2 Môi trường thạch đĩa Thiosulfate Citrate Bile

3 Thạch máu Wagatsuma

4 Môi trường HLGB ( Hugh Leifson Glucose Broth)

5 Môi trường canh thang muối trypticase (STB)

6 Môi trường Trypticase (Tryptic) Soy Agar (TSA)

7 Canh thang Trypticase Soy Broth (TSB)

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG

THẠCH TCBS

Thành phần Vai trò

Sucrose Lên men làm môi trường có tính acid

Dipeptone Cung cấp nitrogen, vitamins, và các amino acid trong TCBS agar Sodium Citrate Ức chế sự phát triển của Enterobacteria

Sodium Thiosulfate

Sodium Chloride Cung cấp sự phát triển tối ưu và hoạt động trao đổi chất của các

loài vibrio sống trong môi trường mặn Yeast Extract Cung cấp nitrogen, vitamins, và các amino acid trong TCBS agar Oxbile (Oxgall) Làm chậm sự sinh trưởng của enterococcic

Ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương Sodium Cholate

Ferric Citrate Sản xuất hydrogen sulfide

Bromothymol Blue Chất chỉ thị pH

Thymol Blue

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG TSA

carbohydrate và vitamin cần thiết

trao đổi chất của các loài vibrio sống trong

môi trường mặn

Bile salts

Làm chậm sự sinh trưởng của enterococcic

Ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram

dương

QUY TRÌNH

PHÂN TÍCH

DỤNG CỤ

Nồi

hấp

Tủ cấy Tủ ấm

Kính hiển vi Máy lắc ổn nhiệt Tủ sấy

Đĩa petri Que cấy vòng

Que cấy ria Que trải

Lam kính Ống nghiệm

thạch nghiêng

Bình tam giác

NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH

Phát hiện V Cholerae và V.parahaemolyticus trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc Từ đây dịch khuẩn được cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa

QUY TRÌNH PHÂN

TÍCH

Đồng nhất 25g mẫu với 225ml APW

Tăng sinh lần 1 Phân lập lên TCBS

Tăng sinh lần 2

Ủ 37 độ c trong khoảng 24h

V.cholerae: KL vàng, đường kinh 2-3mm V.paraheamolyticus: KL xanh, đường kinh 3-4mm

Cấy chuyên sang BHI hay TSA có 1%NaCl

Sinh hóa sơ bộ, khẳng định, kháng huyết thanh Kết luận

Bước 1: Chuẩn Bị Mẫu

THÀNH

Peptone Nguồn cung cấp nitrogen và carbon, các amino acid

chuỗi dài, vitamin và các chất dinh dưỡng cần thiết khác

Muối Sodim chlorie

Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

MÔI TRƯỜNG ASPW

 Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Cấy phần mẫu thử vào môi trường

tăng sinh ở nhiệt độ môi trường.

Chuyển 1 ml dịch cấy thu được lấytừ bề mặt cho vào

ống nghiệm chứa 10 ml môi trường ASPW.

Ủ huyền phù ở 37 0 C trong 6h

1h đối với sản phẩm đông lạnh sâu

hoặc ở 41,5 0 C trong 6h 1h đối

với sản phẩm tươi, khô hoặc sản

Bước 3: Phân Lập

Sau 24h, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối trên môi trường ASPW và cấy lên bề

mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập

khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 24 giờ

=> Mục đích: để nhận dạng và phát hiện được V.Cholerae &

V.Parahaemolyticus

Khuẩn lạc V.Cholerae trên

Khuẩn lạc V.Parahaemolyticus

trên môi trường TCBS

Trên môi trường thạch TCBS

khuẩn lạc V Parahaemolyticus

trơn nhẵn,có màu xanh, đường kính 3 – 4mm

Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/

TSA

Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ

đĩa trên môi trường phân lập TCBS

=> Lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi

ngờ cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1,5% NaCl Ủ ở

37±10C trong 24 giờ

=> Mục đích: chuẩn bị những khuẩn lạc giống V.Cholerae và

V.Parahaemolyticus để thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa

Bước 5: Khẳng định sinh hóa V.Cholerae và

V.Parahaemolyticus

Mục đích từng bước của quy

trình

• Bước 1: Tăng sinh:

Phục hồi sức sống của các vi sinh vật bị tổn thương, nhằm tăng mật độ tương đối của một số vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy trước khi cấy trên môi trường rắn chọn lọc

• Bước 2: Phân lập:

Mục đích tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng vi khuẩn thuần khiết (clon) được gọi

là khuẩn lạc

Bước 3: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA:

Trường hợp 1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện

Trường hợp 2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu

Bước 4: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh: Dùng để xác định các dòng Vibrio có các kiểu

kháng nguyên chuyên biệt

MÀU KHUẨN LẠC

Khuẩn lạc V cholerae tròn, lớn, đường kính khoảng 3mm, láng, có màu vàng, hơi phẳng, tâm đục và chung quanh khuẩn lạc có quầng trắng đục

2-Khuẩn lạc V parahaemolyticus tròn, lớn, đường kính khoảng 3-4mm, có màu từ xanh đến xanh dương

Màu của phản ứng trên môi trường khẳng

Thử nghiệm tính di

động

Dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng, đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường, ủ 37℃ trong 24h trong 24h

Thử nghiệm oxidase- Lấy giấy lọc đã ngâm với chất

phenylenediamine

tetramethyl-p Làm ẩm giấy bằng nước cất

vô trùng

- Chọn khuẩn lạc để được thử nghiệm bằng que cấy gỗ hoặc bạch kim và bôi trong giấy lọc

- Quan sát vùng giấy được cấy xem sự thay đổi màu thành xanh đậm hoặc tím trong vòng 10-30 giây

Thử nghiệm decarboxylase

Thử nghiệm ONPG

• Xác định sự hiện diện của enzym β-galactoside

• Môi trường ONPG

• Dùng que cấy vòng cấy sinh khối

từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống môi trường, ủ 37 trong 24 ℃ trong 24 giờ

Thử nghiệm TSI

V parahaemolyticus

V cholera

• Xác định khả năng sử dụng nguồn Carbon và sinh h2s

• Môi trường TSI

• Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn vào phần nghiêng của ống thạch nghiêng và cấy đâm sâu vào phần đứng của ống thạch nghiêng, ủ 37℃ trong 24h trong 24 giờ

Thử nghiệm khẳng định sinh hóa

-+ + - - -

VÍ DỤ GIẢ ĐỊNH

Chuẩn bị mẫu : (Mẫu tôm )

Cân vô trùng 25g mẫu tôm vào một túi PE đã vô

trùng=>Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm

225ml nước peptone kiềm APW vào túi => nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2 phút

Tăng sinh :

Ủ ở nhiệt độ 37°C sau đó đem đi phân lập, phần còn lại đem đi ủ tiếp

Phân lập và đọc kết quả trên đĩa :

 Sau khi ủ , dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS Sau đó đem đi ủ các đĩa

ở nhiệt độ 37°C trong 18-24 giờ

 Trên môi trường TCBS ở nồng độ 10-3 thì khuẩn lạc

V.Cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng ( do vi khuẩn

sacaroza ), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh

KẾT QUẢ

PHÂN TÍCH

Việc nhận dạng sinh hóa của Vibrio là rất khó, tốt nhất để khẳng định chính xác các chủng V choleae hoặc V parahaemolyticus bằng cách gửi đến phòng thử nghiệm chuẩn/chuyên dùng.

Để vận chuyển chúng, cấy vào bề mặt nghiêng của thạch dinh dưỡng muối

THANKS FOR WATCHING!

PHẦN TRẮC NGHIỆM

1.Vibrio có khả năng lên men những loại đường nào ?

A.Có khả năng lên men glucose, không lên men sucrose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S

B Lên men sucrose nhưng không sinh hơi

C Lên men D-mannitol ,maltose, không lên men saccharose

D Tất cả ý trên

3.Dấu hiệu nhận biết của khuẩn lạc V.Cholerae trên môi

4.Vibrio thuộc nhóm ngoại bào hay nội bào ? Sinh ra độc tố

gì cho thực phẩm ?

A Vibrio thuộc nhóm nội bào, không sinh dộc tố

B Vibrio thuộc nhóm nội bào Gây ra độc tố ruột, ức chế miễn

dịch tế bào bằng cách tác động trực tiếp lên macrophage và tế bào lympho T

C Vibrio thuộc nhóm huyết thanh Có khả năng sinh độc tố ruột

và bệnh dịch tả

D Vibrio thuộc nhóm nội bào, có thể gây ra ngộ độc thực phẩm.

5.Các phản ứng sinh hóa dùng trong phân tích Salmonella là ?

A Thử nghiệm LDC , thử nghiệm urea

B Thử nghiệm kháng huyết thanh , thử nghiệm LDC, thử nghiệm

H2S

C Thử nghiệm LDC, thử nghiệm H2S

D Thử nghiệm H2S, thử nghiệm LDC, thử nghiệm urea, lên men mannitol, sorbitol(+)

6.Mục đích của các bước phân lập ?

A.Pha loãng mẫu

B.Ủ mẫu

C.Chuẩn bị mẫu

D.Nhận dạng và phát hiện

V.cholerae,V.Paraharmolyticus

7.Môi trường APW có mục đích là gì?

8.Đâu là đặc điểm của Vibrio ?

A.Gram(+), hình que, dị động, không sinh H2S

B.Gram(-), hình que, dị động, có khả năng sinh H2S

C.Gram(-), hình dấu phẩy, dị động, lên men glucose nhưng không sinh H2S

D.Gram(+), hình dấu phẩy, dị động, lên men glucose nhưng không sinh H2S

9.Trên môi trường thạch TBCS, khuẩn lạc của V.Cholerae

10.Mục đích của thử nghiệm ONPG ?

A.Xác định sự hiện diện của enzym β-galactoside

B.Xác định khả năng sinh indol từ trytophan

C.Xác định khả năng sử dụng nguồn Carbon và sinh H2S

D.Xác định tính dị động

11.Vai trò của Saccharose trong môi trường TSA là gì?

A Kiểm tra độ vô trùng

B Tác nhân làm cứng

C Lên men làm môi trường có tính acid

D Cân bằng các lượng amino acid, carbohydrate và vitamin cần thiết

12 Nguyên tắc phân tích V Cholerae và V.parahaemolyticus

trong thực phẩm là:

A Cân một lượng mẫu và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc, các khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa

B Cân một lượng mẫu rồi cấy trực tiếp lên môi trường rắn chọn lọc, các khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa

C Cân một lượng mẫu và nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc, sau đó lấy dịch khuẩn cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc, các khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa

D Cả A & B đều đúng

13.Mục đích của việc phân lập VSV:

A Để nhận dạng và phát hiện được V.Cholerae &

V.Parahaemolyticus.

B chuẩn bị những khuẩn lạc giống V.Cholerae và

V.Parahaemolyticus để thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.

C Chuẩn bị cho quá trình tăng sinh chọn lọc

D.Không có đáp án đúng

14.Trong quy trình phân tích, cần ủ vi khuẩn ở điều kiện nào?

A Ủ ở 37oC trong 48h

B Ủ ở 40oC trong 24h

C Ủ ở 40oC trong 48h

D Ủ ở 37oC trong 24h

15 Trong quá trình phân tích V Cholerae và V.parahaemolyticus,

cần tăng sinh bao nhiêu lần?

16.Loài vi khuẩn gây bệnh dịch tả ở người ?

A Vibrio cholerae

B Vibrio parahaemolyticus

C Vibrio vulnificus

D Vibrio adaptatus

17.Ở bước phân lập của quá trình định tính Vibrio cholerae và

Vibrio parahaemolyticus, thì ta thấy các khuẩn lạc xuất hiện Vibrio cholerae trên môi trường TCBS có màu gì?

E Màu xanh lá

F Màu vàng

G Màu tím

H Màu đen

18.Vibrio.Parahaemolyticus và Vibrio cholerae có thể có mặt

một lượng nhỏ và thường đi kèm với một lượng lớn đáng kể các loài vi sinh vật khác thuộc họ Vibrionaceae hoặc các họ khác, vì vậy trong quá trình định tính

Vibrio.Parahaemolyticus và Vibrio cholerae cần phải thực

hiện bước nào 2 lần liên tục để phát hiện chúng?

A Khẳng định sinh hóa

B Phân lặp

C Tăng sinh chọn lọc

D Kháng huyết thanh

19.Mục đích của môi trường APS dùng để làm gì?

A Phân lặp

B Tăng sinh chọn lọc

C Phục hồi

D Khẳng định sơ bộ

20.Mục đích của quá trình phân lặp

A Tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng

vi khuẩn thuần khiết (clon) được gọi là khuẩn lạc

B Dùng để xác định các dòng Vibrio có các kiểu kháng nguyên chuyên biệt

C Chuẩn bị những khuẩn lạc giống V.Cholerae và

V.Parahaemolyticus để thử nghiệm bằng các phản ứng sinh

hóa

D Chuẩn bị cho quá trình tăng sinh chọn lọc

21 Thử nghiệm oxidaza nên dùng que cấy gì để không gây hiện tượng dương tính giả

A Sắt

B Crom

C Gỗ hoặc Crom

D Gỗ hoặc bạch kim

22.Ở bước phân lập của quá trình định tính Vibrio cholerae

và Vibrio parahaemolyticus, thì ta thấy các khuẩn lạc xuất

hiện Vibrio parahaemolyticus trên môi trường TCBS có màu

23.Ở thử nghiệm oxidaza kết quả cuối cùng khuẩn lạc trên môi trường có màu gì?

25.Có bao nhiêu phản ứng kháng huyết thanh A.1

B.2

C.3

D.4

26.Tính chất nào sau đây của E.coli ?

A Trực khuẩn gram + hình que

B Hiếu khí

C Trực khuẩn nhỏ uống cong gram –

27.Mục đích của môi trường TBX

A Chuẩn bị mẫu

B.Pha loãng mẫu

C.Dùng để nuôi cấy E.coli

28.Nuôi cấy Salmonella ở nhiệt độ là bao nhiêu ?

A.Dưới 6 độ C

B 6 độ C

C Trên 6 độ C

29.Hai loại phản ứng kháng huyết thanh là

A.Loại trừ chủng tự ngưng kết, kiểm tra O,H

B.Loại trừ chủng tự ngưng kết, kiểm tra C,H

30.Các tiêu chuẩn vi sinh về ATTP không cho phép sự xuất

hiện của Salmonella trong

A.23g/23ml mẫu

B.24g/25ml mẫu

C.25g/25ml mẫu

D.29g/30ml mẫu