Bài báo cáo lý thuyết pcr

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN BỘ MÔN: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN

BỘ MÔN: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT POLYMARESE CHAIN REACTION TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH KHẢM LÁ TRÊN CÂY SẮN DO

Sri Lankan Cassava Mosaic Virus GÂY RA

Giảng viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết

: Ks Trương Quang Toản Nhóm sinh viên thực hiện:

Niên khóa : 2023 – 2024

Mục Lục

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 2

1.1 Đặt vấn đề: 2

1.2 Mục tiêu đề tài: 2

1.3 Nội dung thực hiện: 3

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

2.1 Tách chiết DNA: 4

2.2 Phương pháp PCR: 4

2.2.1 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị 4

2.2.2 Thực hiện: 4

2.3 Phương pháp điện di: 4

2.3.1 Vật liệu: 4

2.3.2 Các bước thực hiện: 5

CHƯƠNG 3: BIỆN LUẬN KẾT QUẢ 7

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 8

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề:

Sắn (Manihot esculenta Crantz) theo truyền thống được trồng làm cây trồng tự cung tự

cấp ở Lào, nhưng trong những năm gần đây, việc trồng sắn ở nước này đã mở rộng và đang trở thành “cây trồng thu lợi nhuận” cho nông dân Tại Việt Nam, cây sắn là một trong 13 cây chủ lực của quốc gia, có kim ngạch xuất khẩu đạt 1,3 - 1,5 tỷ USD, đứng thứ ba trong sản lượng nông nghiệp xuất khẩu của Việt Nam, sau gạo và cà phê Năm

2022, xuất khẩu sắn và các sản phẩm từ sắn của Việt Nam đạt 3,25 triệu tấn, trị giá 1,4

tỷ USD

Tuy nhiên, một mối lo vẫn kéo dài dai dẳng từ các vùng trồng sắn là bệnh khảm lá virus

Bệnh khảm sắn (CMD), do một số loài Begomovirus gây ra và lây lan qua các cành bị nhiễm bệnh hoặc do ruồi trắng Bemisia tabaci truyền bệnh Virus khảm sắn Sri Lanka

(SLCMV), một loại begomovirus lưỡng cực, là loài virus gây CMD ở Đông Nam Á (SEA) và phổ biến ở Campuchia, Việt Nam, Thái Lan và miền nam Trung Quốc

CMD gây hại và ảnh hưởng nghiêm trọng đến cây trồng Bệnh này chủ yếu ảnh hưởng đến các lá non của cây Khi cây bị bệnh khảm lá sắn sẽ xoắn lại và gần như không thể phát triển được Đồng thời, thân cây sẽ trở nên giòn, rỗng hơn dẫn đến dễ gãy hơn Những năm gần đây, loại bệnh này gây hại tại nhiều địa phương khiến lợi nhuận từ cây trồng này của bà con nông dân không còn cao và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng các vùng nguyên liệu Đây cũng là thực trạng đáng lo ngại đối với ngành sắn Việt Nam

1.2 Mục tiêu đề tài:

Để phòng ngừa và kiểm soát tốt CMD, ngoài việc tích cực thực hiện các biện pháp phòng ngừa ngăn chặn ruồi trắng Bemisia tabaci thì việc kiểm tra và đảm bảo các cây sắn sạch bệnh (không có sự tồn tại của virus) là một yếu tố rất quan trọng

Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) cho phép khuếch đại một đoạn DNA được xác định bằng phương pháp gia, giảm nhiệt có chu kỳ bao gồm ba bước:

1) Biến tính (denaturation): hỗn hợp được đặt ở nhiệt độ cao nhằm tách các sợi DNA mạch đôi thành DNA mạch đơn

2) Bắt cặp (annealing): nhiệt độ được hạ xuống sao cho phù hợp để đoạn mồi gắn bổ sung vào khuôn DNA

3) Kéo dài (elongation): dưới tác động của enzyme DNA polymerase, các nucleotide được lần lượt gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn,

từ đó tổng hợp nên sợi mới theo chiều 5’ – 3’

Điện di là kỹ thuật giúp nhận biết kích thước và mật độ DNA bằng chiều dòng điện trên gel agarose cùng với chất phát huỳnh quang dùng để xem kết quả Mục tiêu của đề tài

sẽ là sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại một đoạn gene của virus trong mẫu thực vật thu được và dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra kết quả PCR

1.3 Nội dung thực hiện:

Các mẫu lá được thu, tách chiết DNA và thực hiện PCR bằng cách sử dụng các đoạn mồi SLCMV-F ATGTCGAAGCGACCAGCAGATATAAT-3′) và SLCMV-R (5′-TTAATTGCTGACCGAATCGTAGAAG-3′) nhắm vào gen AV1 (), theo sau giao thức được mô tả trong Siriwan et al (2020) và các đoạn mồi SLCMV-B-F1

CACCTACCCTGTTATCGCTAAG-3′) hướng tới một phần của gen BV1 Mẫu sau khi thực hiện phản ứng PCR sẽ được đem đi điện di trên gel argarose để xem kết quả Mẫu DNA được xác định dương tính khi xuất hiện băng DNA ở thang đo 800bp

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Tách chiết DNA:

Thực hiện phương pháp tách chiết bằng cách sử dụng bộ kit tách chiết mẫu mô thực vật bằng cột silica theo hướng dẫn của nhà sản xuất (ABT, Việt Nam) DNA tổng số sau khi tách chiết và kiểm tra bằng điện di được cất trữ ở -20 ºC để tiếp tục thực hiện hai phương pháp là PCR và điện di

2.2 Phương pháp PCR:

2.2.1 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị

- DNA mẫu (DNA genomic) - Mồi xuôi và mồi ngược

- Máy luân nhiệt - Dung dịch đệm 10X PCR buffer

- dNTP 10mM - Eppendorf 0,5 ml; 0,2 ml vô trùng

- Enzyme Taq DNA polymerase - Nước cất hai lần vô trùng

- Pipetteman các loại

2.2.2 Thực hiện:

- Dùng pipetman hút và cho lần lượt vào eppendorf 0,2 ml theo thứ tự

- Đặt eppendorf chứa dung dịch phản ứng vào máy luân nhiệt theo chương trình nhiệt

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,0 % trong 20 phút

2.3 Phương pháp điện di:

2.3.1 Vật liệu:

Thiết bi điên di agarose:

• Bộ cung cấp nguồn điện (power source)

• Bồn điện di (gel box)

Hóa chất:

• Dung dịch đệm điện di (TAE)

• Agarose

• GelRed (Loading dye + sample dye)

2.3.2 Các bước thực hiện:

Chuẩn bị gel:

- Chuẩn bị khay đổ gel, gài 13 giếng vào sao cho cách đáy khay khoảng 1mm tránh làm thủng gel

- Pha dung dịch gel: 2% agarose (1g), 50 ml dung dịch đệm TAE

- Đun trong lò vi sóng khoảng 1 phút cho agarose tan ra

- Để nguội tầm 5-10 phút sau đó đổ gel vào khuôn chờ gel đông lại

Chuẩn bị bồn điện di:

- Khi gel nguội và đặc lại, khay gel được đặt vào bồn điện di, ngập trong dung dịch đệm điện di Lược gel được tháo ra tạo nên các “giếng” rỗng dành để cho mẫu điện

di vào

Chuẩn bị mẫu:

- Sử dụng dung dịch loading dye trộn với GelRed Hút 10 µl dung dịch loading dye lên miếng nylon sau đó hút 5 µl dung dịch DNA mẫu (DNA tổng số hoặc DNA plasmid) vào miếng nylon, trộn đều 2 giếng cho 2 mẫu DNA đã ly trích

- Pipeting và hút hết dịch vừa trộn cho vào giếng

- Giếng cuối cùng là chứa thang chuẩn DNA (Là một hỗn hợp

các đoạn DNA chứa các kích thước khác nhau và đã biết trước kích

thước đó→ Mua) Cách làm: Hút 10 µl GelRed + 5 µl Ladder →Trộn đều

Điện di:

- Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường các nắp bồn điện di chỉ

có thể lắp vào bồn theo 1 hướng dựa vào vị trí đánh dấu các điện cực

- Lắp nguồn điện vào cài đặt cho dòng điện 100V chạy qua trong 30 phút, cho dòng điện chạy qua miếng gel, sau đó đưa vào máy đọc

CHƯƠNG 3: BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

3.1 Kết quả dương tính với SLCMV:

Kết luận cây sắn dương tính với SLCMV khi kết quả điện di hiển thị có DNA ở kích thước 800bp Đối với các cây dương tính chúng tôi kiến nghị tiêu hủy để tránh lây lan bệnh vì hiện tại ở Việt Nam vẫn chưa phát triển một phương pháp cụ thể nào để điều trị bệnh

3.2 Kết quả âm tính với SLCMV:

Kết luận cây sắn âm tính với SLCMV khi kết quả điện di không hiển thị DNA hoặc có hiển thị mờ nhạt ở mức thang nhỏ nhất Đối với các cây âm tính chúng tôi kiến nghị các biện pháp bảo vệ vật lý, hóa học hoặc sinh học để phòng ngừa ruồi trắng

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

Chittarath, K., Jimenez, J., Vongphachanh, P., Leiva, A M., Sengsay, S., Lopez-Alvarez, D., & Cuellar, W J (2021) First report of cassava mosaic disease and Sri Lankan cassava mosaic virus in Laos Plant Disease, 105(6), 1861

Malik, A I., Sophearith, S., Delaquis, E., Cuellar, W J., Jimenez, J., & Newby, J C (2022) Susceptibility of cassava varieties to disease caused by Sri Lankan cassava mosaic virus and impacts on yield by use of asymptomatic and virus-free planting material Agronomy, 12(7), 1658

Legg, J P., Kumar, P L., Makeshkumar, T., Tripathi, L., Ferguson, M., Kanju, E., & Cuellar, W (2015) Cassava virus diseases: biology, epidemiology, and management

In Advances in virus research (Vol 91, pp 85-142) Academic Press

Siriwan, W., Jimenez, J., Hemniam, N., Saokham, K., Lopez-Alvarez, D., Leiva, A M., & Cuellar, W J (2020) Surveillance and diagnostics of the emergent Sri Lankan cassava mosaic virus (Fam Geminiviridae) in Southeast Asia Virus research,

285, 197959

Dutt, N., Briddon, R W., & Dasgupta, I (2005) Identification of a second

begomovirus, Sri Lankan cassava mosaic virus, causing cassava mosaic disease in India Archives of Virology, 150, 2101-2108

Trần, K C (2019) Chẩn đoán và xác định đặc điểm di truyền học của Sri Lanka Mosaic virus gây bệnh khảm lá Cây Sắn: Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học (Doctoral dissertation, Đại học Nguyễn Tất Thành (Khoa Công nghệ Sinh học))