Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN BỘ MÔN: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN BỘ MÔN: THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG KỸ THUẬT POLYMARESE CHAIN REACTION TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH KHẢM LÁ TRÊN CÂY SẮN DO Sri Lankan Cassava Mosaic Virus GÂY RA Giảng viên hướng dẫn : TS Huỳnh Văn Biết : Ks Trương Quang Toản Nhóm sinh viên thực hiện: Phan Minh Ngọc 21126426 DH21SHB Hen Rích 21126488 DH21SHB Nguyễn Thị Mỹ Ngọc 21126425 DH21SHB Niên khóa : 2023 – 2024 TP Thủ Đức, ngày 22 tháng 10 năm 2023 Mục Lục CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục tiêu đề tài: 1.3 Nội dung thực hiện: CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Tách chiết DNA: 2.2 Phương pháp PCR: 2.2.1 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị 2.2.2 Thực hiện: 2.3 Phương pháp điện di: 2.3.1 Vật liệu: 2.3.2 Các bước thực hiện: CHƯƠNG 3: BIỆN LUẬN KẾT QUẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO: CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Sắn (Manihot esculenta Crantz) theo truyền thống trồng làm trồng tự cung tự cấp Lào, năm gần đây, việc trồng sắn nước mở rộng trở thành “cây trồng thu lợi nhuận” cho nông dân Tại Việt Nam, sắn 13 chủ lực quốc gia, có kim ngạch xuất đạt 1,3 - 1,5 tỷ USD, đứng thứ ba sản lượng nông nghiệp xuất Việt Nam, sau gạo cà phê Năm 2022, xuất sắn sản phẩm từ sắn Việt Nam đạt 3,25 triệu tấn, trị giá 1,4 tỷ USD Tuy nhiên, mối lo kéo dài dai dẳng từ vùng trồng sắn bệnh khảm virus Bệnh khảm sắn (CMD), số loài Begomovirus gây lây lan qua cành bị nhiễm bệnh ruồi trắng Bemisia tabaci truyền bệnh Virus khảm sắn Sri Lanka (SLCMV), loại begomovirus lưỡng cực, loài virus gây CMD Đông Nam Á (SEA) phổ biến Campuchia, Việt Nam, Thái Lan miền nam Trung Quốc CMD gây hại ảnh hưởng nghiêm trọng đến trồng Bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến non Khi bị bệnh khảm sắn xoắn lại gần phát triển Đồng thời, thân trở nên giòn, rỗng dẫn đến dễ gãy Những năm gần đây, loại bệnh gây hại nhiều địa phương khiến lợi nhuận từ trồng bà nông dân không cao ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng vùng nguyên liệu Đây thực trạng đáng lo ngại ngành sắn Việt Nam 1.2 Mục tiêu đề tài: Để phịng ngừa kiểm sốt tốt CMD, ngồi việc tích cực thực biện pháp phịng ngừa ngăn chặn ruồi trắng Bemisia tabaci việc kiểm tra đảm bảo sắn bệnh (khơng có tồn virus) yếu tố quan trọng Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) cho phép khuếch đại đoạn DNA xác định phương pháp gia, giảm nhiệt có chu kỳ bao gồm ba bước: 1) Biến tính (denaturation): hỗn hợp đặt nhiệt độ cao nhằm tách sợi DNA mạch đôi thành DNA mạch đơn 2) Bắt cặp (annealing): nhiệt độ hạ xuống cho phù hợp để đoạn mồi gắn bổ sung vào khuôn DNA 3) Kéo dài (elongation): tác động enzyme DNA polymerase, nucleotide gắn vào đầu 3’ đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn, từ tổng hợp nên sợi theo chiều 5’ – 3’ Điện di kỹ thuật giúp nhận biết kích thước mật độ DNA chiều dịng điện gel agarose với chất phát huỳnh quang dùng để xem kết Mục tiêu đề tài sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gene virus mẫu thực vật thu dùng kỹ thuật điện di để kiểm tra kết PCR 1.3 Nội dung thực hiện: Các mẫu thu, tách chiết DNA thực PCR cách sử dụng đoạn mồi SLCMV-F (5′-ATGTCGAAGCGACCAGCAGATATAAT-3′) SLCMV-R (5′TTAATTGCTGACCGAATCGTAGAAG-3′) nhắm vào gen AV1 (), theo sau giao thức mô tả Siriwan et al (2020) đoạn mồi SLCMV-B-F1 (5′và ACCGGATGGCCGCGCCCCCCTCT-3′) SLCMV-B-606R (5′ - CACCTACCCTGTTATCGCTAAG-3′) hướng tới phần gen BV1 Mẫu sau thực phản ứng PCR đem điện di gel argarose để xem kết Mẫu DNA xác định dương tính xuất băng DNA thang đo 800bp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Tách chiết DNA: Thực phương pháp tách chiết cách sử dụng kit tách chiết mẫu mô thực vật cột silica theo hướng dẫn nhà sản xuất (ABT, Việt Nam) DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra điện di cất trữ -20 ºC để tiếp tục thực hai phương pháp PCR điện di 2.2 Phương pháp PCR: 2.2.1 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị - DNA mẫu (DNA genomic) - Mồi xuôi mồi ngược - Máy luân nhiệt - Dung dịch đệm 10X PCR buffer - dNTP 10mM - Eppendorf 0,5 ml; 0,2 ml vô trùng - Nước cất hai lần vô trùng - Enzyme Taq DNA polymerase - Pipetteman loại 2.2.2 Thực hiện: - Dùng pipetman hút cho vào eppendorf 0,2 ml theo thứ tự - Đặt eppendorf chứa dung dịch phản ứng vào máy luân nhiệt theo chương trình nhiệt - Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,0 % 20 phút 2.3 Phương pháp điện di: 2.3.1 Vật liệu: Thiết bi điên di agarose: • Bộ cung cấp nguồn điện (power source) • Bồn điện di (gel box) • Khay gel (casting tray), lược gel (combs) Hóa chất: • Dung dịch đệm điện di (TAE) • Agarose • GelRed (Loading dye + sample dye) 2.3.2 Các bước thực hiện: Chuẩn bị gel: - Chuẩn bị khay đổ gel, gài 13 giếng vào cho cách đáy khay khoảng 1mm tránh làm thủng gel - Pha dung dịch gel: 2% agarose (1g), 50 ml dung dịch đệm TAE - Đun lị vi sóng khoảng phút cho agarose tan - Để nguội tầm 5-10 phút sau đổ gel vào khn chờ gel đông lại Chuẩn bị bồn điện di: - Khi gel nguội đặc lại, khay gel đặt vào bồn điện di, ngập dung dịch đệm điện di Lược gel tháo tạo nên “giếng” rỗng dành mẫu điện di vào Chuẩn bị mẫu: - Sử dụng dung dịch loading dye trộn với GelRed Hút 10 µl dung dịch loading dye lên miếng nylon sau hút µl dung dịch DNA mẫu (DNA tổng số DNA plasmid) vào miếng nylon, trộn giếng cho mẫu DNA ly trích - Pipeting hút hết dịch vừa trộn cho vào giếng - Giếng cuối chứa thang chuẩn DNA (Là hỗn hợp đoạn DNA chứa kích thước khác biết trước kích thước đó→ Mua) Cách làm: Hút 10 µl GelRed + µl Ladder →Trộn Điện di: - Đậy nắp bồn điện di cẩn thận Không chạm vào mẫu Thường nắp bồn điện di lắp vào bồn theo hướng dựa vào vị trí đánh dấu điện cực - Lắp nguồn điện vào cài đặt cho dòng điện 100V chạy qua 30 phút, cho dòng điện chạy qua miếng gel, sau đưa vào máy đọc CHƯƠNG 3: BIỆN LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Kết dương tính với SLCMV: Kết luận sắn dương tính với SLCMV kết điện di hiển thị có DNA kích thước 800bp Đối với dương tính kiến nghị tiêu hủy để tránh lây lan bệnh Việt Nam chưa phát triển phương pháp cụ thể để điều trị bệnh 3.2 Kết âm tính với SLCMV: Kết luận sắn âm tính với SLCMV kết điện di khơng hiển thị DNA có hiển thị mờ nhạt mức thang nhỏ Đối với âm tính chúng tơi kiến nghị biện pháp bảo vệ vật lý, hóa học sinh học để phịng ngừa ruồi trắng TÀI LIỆU THAM KHẢO: Chittarath, K., Jimenez, J., Vongphachanh, P., Leiva, A M., Sengsay, S., LopezAlvarez, D., & Cuellar, W J (2021) First report of cassava mosaic disease and Sri Lankan cassava mosaic virus in Laos Plant Disease, 105(6), 1861 Malik, A I., Sophearith, S., Delaquis, E., Cuellar, W J., Jimenez, J., & Newby, J C (2022) Susceptibility of cassava varieties to disease caused by Sri Lankan cassava mosaic virus and impacts on yield by use of asymptomatic and virus-free planting material Agronomy, 12(7), 1658 Legg, J P., Kumar, P L., Makeshkumar, T., Tripathi, L., Ferguson, M., Kanju, E., & Cuellar, W (2015) Cassava virus diseases: biology, epidemiology, and management In Advances in virus research (Vol 91, pp 85-142) Academic Press Siriwan, W., Jimenez, J., Hemniam, N., Saokham, K., Lopez-Alvarez, D., Leiva, A M., & Cuellar, W J (2020) Surveillance and diagnostics of the emergent Sri Lankan cassava mosaic virus (Fam Geminiviridae) in Southeast Asia Virus research, 285, 197959 Dutt, N., Briddon, R W., & Dasgupta, I (2005) Identification of a second begomovirus, Sri Lankan cassava mosaic virus, causing cassava mosaic disease in India Archives of Virology, 150, 2101-2108 Trần, K C (2019) Chẩn đoán xác định đặc điểm di truyền học Sri Lanka Mosaic virus gây bệnh khảm Cây Sắn: Khóa luận tốt nghiệp Chun ngành Cơng nghệ Sinh học (Doctoral dissertation, Đại học Nguyễn Tất Thành (Khoa Công nghệ Sinh học))