Bài tiểu luận các phương pháp cải tiến giống vi sinh vật trong công nghiệp

Ngày nay người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa nhanh vừa có hiệuquả.Nguyên lý của phương pháp “sàng lọc” là:Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ hỗn hợp các giống VSV từ mẫu tự nhiên như

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP

Phương pháp đột biến nhân tạo

2.1.1 Đặc điểm của phương pháp chọn lọc đột biến

Các thành tựu của Công nghiệp vi sinh vật không thể tách rời với những tiến bộ nhảy vọt của khoa học kỉ thuật trong chọn lọc các chủng có năng suất cao

Phương pháp này có các đặc điểm:

 Thu nhận kết quả rất nhanh

 Chỉ đánh giá sản phẩm thu được, không quan tâm các biến đổi sinh lí, sinh hoá.

 Tạo ra các chủng có năng suất cao.

 Khắc phục một số nhược điểm của chủng ban đầu.

 Làm biến đổi bản chất hoá học các chất trong chủng ban đầu.

Quá trình chọn giống các chủng Penicillium chrysogenum ở Mỹ có thể lấy làm ví dụ điển hình cho phương pháp này Từ dòng ban đầu có sản lượng 60mg/l, chọn các đột biến ngẫu nhiên được dòng 150mg/l và sau đó sử dụng các đột biến nhận được do tác động tia

X và UV Việc chọn lọc theo nguyên tắc: lấy dòng có sản lượng cao nhất đem gây đột

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4 biến rồi chọn chủng Vi nấm Penoicillium chrysogenum suất cao nhất Qua nhiều bước trung gian cuối cùng tạo được dòng E.15.1 có sản lượng 7000mg/l

Phương pháp chọn giống đột biến được sử dụng để tạo các chủng sản sinh ra nhiều axit amin (như glutamic axit) hay các nucleotit Ngoài ra còn có thể nhận các đột biến liên quan đến cơ chế điều hoà trao đổi chất:

 Các đột biến cơ cấu (constitutive mutants): tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng (inducer).

 Các đột biến kháng ức chế ngược là các đột biến tạo sản phẩm nhiều mà không bị ức chế bởi sản phẩm cuối (end product repression)

Hình 2.1 : Gen bị đột biến

2.1.2 Phân loại các tác nhân gây đột biến

2.1.2.1 Những tác nhân vật lý:

 Bắn phá bằng hạt nơtron hay electron.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.2: Các tác nhân vat lí gây độ biến

Trong các tác nhân vật lý dùng vào mục đích này là tia cực tím hay là tia tử ngoại. Người ta dùng đèn thạch anh phát ra tia cực tím chiếu lên dịch huyền phù, giống vi sinh vật được chuẩn bị trong môi trường đẳng trương, đựng trong hộp petri mở nắp và có khuấy hoặc lắc Khoảng cách từ đèn UV đến dịch huyền phù vi sinh vật, thời gian chiếu và cường độ bức xạ được điều chỉnh sao cho số tế bào bị tiêu diệt và số sống sót tối đa vào khoảng 0,2-0,5%.

2.1.2.2 Những tác nhân hoá học:

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Sử dụng các hợp chất hóa học:

Hình 2.3: Các tác nhân hóa học gây đột biến

Dùng các tác nhân hoá học có thể tới mức các thể đột biến cần tìm xuất hiện trong khoảng 105-108 tế bào Nồng độ hoá chất và thời gian chiếu xạ là do thực nghiệm xác định, làm sao cho chỉ còn một số rất nhỏ tế bào vi sinh vat sống sót Những chủng sau khi chịu tác dụng của các tác nhân đột biến được rửa bằng nước đẳng trương vô khuẩn và sau nhiều lần pha loãng liên tiếp được cấy chuyền nhiều lần trên hộp petri để khảo sát đặc tính mới của chúng Việc cấy chuyền được thực hiện bằng kỹ thuật đóng dấu:dùng con dấu nhung chuyển khuẩn lạc từ hộp petri này sang hộp petri khác.

2.1.3 Phát hiện các thể đột biến có hiệu quả

Muốn phát hiện các đột biến có hiệu quả cần có hệ thống chọn lọc để tìm thấy các đột biến hiếm hoi trong khối rất lớn các dạng không đột biến Các hệ thống chọn lọc đột biến có nhiều phụ thuộc vào các đột biến khác nhau Liên quan đến chọn lọc đột biến ở vi sinh vat, người ta đưa ra khái niệm lực phân giải (resolving power) Khái niệm này dùng để chỉ khả năng phát hiện các đột biến rất hiếm so với không đột biến.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

2.1.3.1 Phương pháp đề kháng: Ở vi khuẩn các tác nhân chọn lọc thường là thuốc và phage Các đột biến được dễ dàng phát hiện trên môi trường agar có thuốc hay phage ở dạng các khuẩn lạc được mọc lên.

2.1.3.2 Phương pháp làm giàu chậm:

Việc phát hiện đột biến khuyết dưỡng khó khăn hơn Dung dịch vi khuẩn pha loãng được cấy lên bề mặt môi trường agar tối thiểu để mọc rời thành khuẩn lạc Một lớp môi trường tương tự được đổ lên trên, phủ lớp mỏng Hộp petri được ủ để các khuẩn lạc bình thường mọc lên Sau đó, đổ phủ thêm một lớp môi trường dinh dưỡng có chất bổ sung và ủ tiếp cho chất bổ sung khuếch tán Các đột biến khuyết dưỡng sẽ mọc sau khi có chất bổ sung, nên khuẩn lạc nhỏ hơn do mọc chậm.

2.1.3.3 Phương pháp làm giàu hạn chế:

Là dạng đơn giản của phương pháplàm giàu chậm Các vi khuẩn được cấy trên môi trường tối thiểu có một ít bổ sung Trong điều kiện đó các đột biến khuyết dưỡng mọc đến khi hết chất dinh dưỡng bổ sung thì dừng, nên tạo khuẩn lạc nhỏ Các vi khuẩn bình thường tiếp tục mọc tạo khuẩn lạc to.

2.1.3.4 Phương pháp làm giàu nhờ penicillin: Được áp dụng cho các vi khuẩn.Penicillin có tác dụng diệt các vi khuẩn bình thường khi phân chia Các vi khuẩn được cho vào môi trường tối thiểu có penicillin Các vi khuẩn đang tăng trưởng bị diệt chỉ có các tế bào đột biến không tăng trưởng còn sống sót Sau đó hỗn hợp được cấy lên môi trường không có penicillin thì các đột biến khuyết dưỡng mọc lên với tỷ lệ tương đối cao hơn.

2.1.3.5 Phương pháp chọn lọc: Được sử dụng để chọn lọc các đột biến khuyết dưỡng ở nấm sợi Dung dịch các bào tử được nuôi trong môi trường dinh dưỡng thiếu chất bổ sung Các đột biến thiếu chất bổ sung không mọc được, các dạng bình thường mọc ra nhiều sợi Khi lọc qua màng lọc sợi thủy tinh, các dạng bình thường nhiều sợi bị giữ lại, các dạng đột biến đi qua màng lọc Dung dịch có nhiều dạng đột biến được cấy trên môi trường có chất bổ sung và kiểm tra tìm các dạng đột biến.

Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu Các khuẩn lạc đột biến không mọc lên được Căn cứ vào đột biến không mọc ở bản sao tách các đột biến khuyết dưỡng.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Phương pháp này đã đem lại những thành tích ngoạn mục, góp phần tích cực cho sự phát triển của công nghiệp lên men vi sinh như:

 Chủng Penicillium chrysogenum ban đầu có năng suất 60 mg/l và nay đạt 60000 mg/l, hơn chủng ban đầu đến 1.000 lần.

 Chủng Corynebacterium glutamicum tạo glutamic axit đạt hơn 200g/l so với ban đầu chỉ có 20g/l.

 Chủng Serratia marcescens sinh ra biotin đạt 600mg/l.

 Riboflavin(vitamin B2) là sản phẩm thương mại được tổng hợp bằng phương pháp lên men và phương pháp hoá học Sản xuất riboflavin do 2 chủng vi nấm

Eremothecium ashbyii và Ashbya gossypii với sản lượng hơn 20 g/l, gấp 40000 lần nhu cầu của nó.

 Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp do các chủng vi khuẩn Propionibacterium shermanii hoặc Pseudomonas denitrificans Các chủng đột biến này sản sinh một lượng sản phẩm lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn nhiều lần khối lượng khô của nó Pseudomonas denitrificans sinh ra vitamin B12 gấp 100000 lần nhu cầu của nó.

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum Vi khuẩn Serratia marcescens

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Eremothecium ashbyii sinh vitamin B2 ngay trên môi trường

Hình 2.4: Các loại vi sinh vật được cải tiến cho năng suất cao

Thường các chủng hoang dại trong tự nhiên không có sự tổng hợp thừa Các chủng nguyên thủy thuần khiết sau khi phân lập cũng không bền vững Từ nhu cầu của thực tế sản xuất công nghiệp dẫn đến việc lựa chọn giống có khả năng “siêu tổng hợp” so với chủng nguyên thủy nên phương pháp đột biến đã đáp ứng được yêu cầu.

Phương pháp tái tổ hợp gen: Biến nạp, tiếp hợp, tải nạp

Các tế bào vi sinh vật đã giúp cho việc tạo giống vi sinh vật công nghiệp Nhiều chủng mới có hoạt tính cao, có khả năng sinh tổng hợp các chất liệu quí mà trước đây chỉ có thể sinh ra ở cơ thể động vật hoặc thực vật thì nay các gen điều khiển tổng hợp chất đó đã được ghép vào tế bào vi khuẩn Công việc sau đó là tổ chức một quá trình lên men và đưa vào sản xuất công nghiệp như các sản phẩm truyền thống khác.

Các sản phẩm như interferon, insulin, các kháng thể đơn dòng…đã được sản xuất theo công nghệ lên men Cũng cần lưu ý rằng việc dùng các chủng vi sinh vật đã được thay đổi bộ gen di truyền là một việc làm hết sức quan trọng, vì ra tự nhiên khó kiểm soát được các chủng này và hậu quả thì khó lường được Vì vậy, ở các nước phát triển có qui định ngặt nghèo với việc cho phép sử dụng các chủng tái tổng hợp dùng cho công nghiệp

2.2.1 Phương pháp biến nạp (transformation)

Hiện tượng biến nạp được Griffith phát hiện ở vi khuẩn Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae - phế cầu khuẩn gây sưng phổi ở động vật có vú) vào năm 1928.Đó là quá trình chuyển DNA trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận nhằm truyền thông tin di truyền qua DNA Trong biến nạp, ADN trần từ một tế bào vi khuẩn (thể cho) này được truyền sang tế bào vi khuẩn khác (thể nhận) Biến nạp xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tế bào Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do bị tan (lysis), ADN vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các tế bào nhận khác.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Thí nghiệm được Griffith tiến hành:

Hình 2.5 : Hiện tượng biến nạp Dạng S III , gây bệnh có vỏ bao tế bào (capsule) bằng polysaccharid cản trở bạch cầu phá vỡ tế bào Dạng R II , không gây bệnh, không có vỏ bao

Hiện tượng trên cho thấy vi khuẩn S không thể tự sống lại được sau khi bị đun chết, nhưng các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào R Nó được gọi là biến nạp (transformation)

Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một số nhóm vi khuẩn khác.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.6: Kỉ thuật biến nạp được sử dụng ở vi khuẩn E Coli

Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố:

Tính dung nạp của tế bào nhận.

Kích thước của đoạn ADN ngoại lai.

Sử dụng phương pháp biến nạp có thể sử dụng được các ADN có lợi trong công nghiệp sản xuất.

Chuyển gen gián tiếp hay phương pháp chuyển gen tải nạp nhờ các nhân tố trung gian như vi khuẩn Agrobacterium hoặc virút và phage

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium: Là phương pháp sử dụng vi khuẩn gây các khối u ở thực vật Vi khuẩn Agrobacterium chứa một plasmit lớn tạo nên khối u ở thực vật gọi là Ti-plasmit Cây bị nhiễm Agrobacterium qua vết xước thì vi khuẩn truyền một đoạn ADN của Ti-plasmit có mang các gen sản sinh auxin, opin cho cây, làm cây hình thành khối u Ti-plasmit được biến đổi bằng cách loại bỏ gen gây khối u mà lại được gắn gen mới để chuyển gen vào cây trồng.

 Chuyển gen nhờ virút và phage: là phương pháp sử dụng các virut (SV 40, BPV ) hoặc các phage (phage , phage M 13 ) để chuyển gen vào vi khuẩn hoặc tế bào thực vật.

Gồm hai kiểu tải nạp: tải nạp chung và tải nạp chuyên biệt( đặc hiệu)

 Tải nạp chung là trường hợp bất kì gene nào của thể cho cũng có thể được chuyển sang thể nhận bằng phage.

Hình 2.7: Tải nạp chung (generalized transduction)

 Tải nạp chuyên biệt( đặc hiệu, hạn chế) là trường hợp phage chỉ truyền đi những gene nhất định từ thể cho sang thể nhận.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.8: Tải nạp chuyên biệt hay tải nạp hạn chế (restricted transduction)

Ngoài ra có thể sử dụng các kĩ thuật như kĩ thuật siêu âm, kĩ thuật xung điện, vi tiêm,bắn gen để nạp gen là vào tế bào chủ.

 Kĩ thuật siêu âm: là kĩ thuật dùng máy siêu âm để đưa ADN ngoại lai xâm nhập vào bộ gen tế bào trần của vật chủ.

 Kĩ thuật xung điện: là kĩ thuật sử dụng dòng điện cao áp khoảng 500V/cm với thời gian 4-5%o giây tạo các lỗ thủng trên tế bào trần làm cho gen lạ bên ngoài dễ xâm nhập vào bộ gen của tế bào chủ.

 Kĩ thuật vi tiêm: là kĩ thuật sử dụng một lượng nhỏ ADN (các gen) tiêm vào tế bào chủ hoặc tiêm vào tế bào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi có 4-8 tế bào.

 Kĩ thuật bắn gen: là kĩ thuật sử dụng sử dụng thiết bị bắn vi đạn mang gen cần chuyển (súng bắn gen) vào bộ gen của tế bào chủ Vi đạn là các hạt vonfram hoặc vàng trộn với gen cần chuyển và phụ gia làm gen chuyển bao quanh vi đạn Vi đạn được gắn vào đầu viên đạn lớn hơn, sau đó được nạp vào súng bắn gen Súng bắn gen có lưới thép mịn ở đầu nòng cho phép khi bắn thì viên đạn lớn được giữ lại, còn vi đạn được bắn vào tế bào với gia tốc lớn Gen cần chuyển được bắn vào có thể tái tổ hợp với bộ gen của tế bào chủ, tạo nên tế bào mang gen được chuyển, từ đó tạo ra cơ thể chuyển gen.

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Các thành tựu tiêu biều:

 Tạo chủng vi khuẩn E.Coli sản suất hoócmôn insulin để chữa tiểu đường ở người.

 Tạo chủng vi khuẩn E.Coli sản suất hoocmôn somatostatin.

 Chuyển gen tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn (sinh sản chậm) vào các chủng vi khuẩn (sinh sản nhanh) nhằm mục đích hạ giá thành thuốc kháng sinh.

 Tạo chủng vi khuẩn chuyển gen có khả năng phân hủy nhanh rác thải

Hình 2.9: Sơ đồ thí nghiệm tạo dòng vi khuẩn mang ADN tái tổ hợp có chứa gen Insulin ở người

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

2.2.3 Giao nạp hay tiếp hợp (Conjugation)

Vào năm 1946, J Lederberg và E Tatum chứng minh có trao đổi vật chất di truyền giữa các vi khuẩn sống Sự trao đổi này gọi là giao nạp hay tiếp hợp.

Hình 2.10: (a) Joshua Lederberg (trái) và E.L Tatum; (b) E coli tiếp hợp Hai tế bào kết hợp nhau bằng một cầu nối, thể cho bên trái và thể nhận bên phải

Giao nạp ở vi khuẩn là sự kết hợp nhất thời của hai tế bào có kiểu bắt cặp đối nhau, được tiếp nối bằng sự chuyển một phần vật chất di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận qua cầu tế bào chất, và sau đó các tế bào tách nhau ra (exconjugants) Giao nạp đòi hỏi sự tiếp xúc trực tiếp giữa 2 loại tế bào được khởi sự bằng ống giao nạp hay tính mao (pilus), một sợi ống nhỏ rất dài do tế bào cho (donor cell) tạo ADN được truyền qua một cầu tế bào chất mỏng (a thin cytoplasmic bridge) gọi là ống giao nạp (conjugation tube) Kiểu sao chép sigma (σ) được tế bào vi khuẩn sử dụng trong giao nạp để truyền phân tử ADN dạng thẳng sang tế bào khác Khi đọan ADN vào bên trong tế bào nhận (recipient cell), nó thực hiện tái tổ hợp với các gen tương đồng (homologous gens).

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.11: Sự tiếp hợp giữa các tế bào E coli F+(đực) với F- (cái),với sự truyền nhân tố F- (ở dạng DNA sợi đơn đang tái bản kiểu vòng lăn) từ tế bào F+bào F- qua cầu tiếp hợp Trong điều kiện lý tưởng, tế bào F- bản sao của nhân tố F và sau đó tổng hợp sợi DNA bổ sung và trỏ thành tế bào F+

Thí nghiệm: Vào năm 1946, Joshua Lederberg và E.L.Tatum đã sử dụng các nòi đột biến khuyết dưỡng khác nhau ở E, coli để chứng minh có tái tổ hợp giữa chúng Cụ thể, nòi A có kiểu gene met- bio- thr+ leu+ và nòi B có kiểu gene ngược lại, met+ bio+ thr- leu Nếu đem nuôi cấy riêng rẽ trên các môi trường tối thiểu, các nòi này không sinh trưởng được Tuy nhiên sau khi trộn lẫn hai nòi A và B trong ống nghiệm và đem cấy lên môi trường tối thiểu, thấy có xuất hiện các khuẩn lạc Điều đó chứng tỏ có sự tái tổ hợp giữa hai nòi và làm xuất hiện dạng lai hay các thể tái tổ hợp, với kiểu gene met+ bio+ thr+ leu+ bù đắp sự khiếm khuyết cho nhau trong nhu cầu dinh dưỡng (Hình 2.12)

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Hình 2.12 : Thí nghiệm kinh điển của J Lederberg và E Tatum

Hình 2.13 cho thấy cơ chế tiếp hợp ở E coli

Hình 2.13: Cơ chế tiếp hợp và tái tổ hợp gene ở các tế bào E coli

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

Lựa chọn giống thường xuyên

Thu thập các số liệu năng suất của các chủng vi sinh vật trong từng thời kì Sao đó đánh giá dựa trên các tiêu chuẩn đề ra nếu không phù hợp cần thay thế giống khác để đạt được chất lượng cao hơn Giúp năng suất sản phẩm luôn đạt được kết quả cao nhất.

CÁC YÊU CẦU VỀ CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT

Một giống sau khi được cải tạo phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

 Cho năng suất cao, chất lượng tốt.

 Sử dụng nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền.

 Thời gian sản xuất ngắn hơn chủng ban đầu.

 Sinh khối hay sản phẩm sinh ra dễ sử dụng.

 Không cho các sản phảm phụ không mong muốn.

 Vi sinh vật phải được thuần chủng, không chứa vi sinh vật lạ, đặc biệt là vi sinh vật không có lợi hay gây hại.

 Chủng sinh vật phải khỏe mạnh, phát triển nhanh.

 Có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường.

 Dễ bảo quản và sử dụng các đặc tính sinh lí, sinh hóa luôn ổn định trong thời gian sử dụng.

 Có khả năng thay đổi các đặc tính bằng các kĩ thuật đột biến, kỹ thuật gen để không ngừng nâng cao chất lượng sản phẩm.

ỨNG DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP

Sản xuất etanol nhiên liệu

Nấm men S cerevisiae và vi khuẩn Zymomonas mobilis là 2 VSV chủ yếu có khả năng sử dụng trong lên men etanol nhiên liệu Nấm men vẫn giữ vai trò chủ yếu, nhưng nó không lên men xyloz, pentoz và một số lọai đường khác Do tầm quan trọng chiến lược cấp thiết, hiện tại và trong tương lai có rất nhiều nổ lực được tập trung cho cải thiện chủng giống nhằm sử dụng tốt hơn nguồn nguyên liệu đa dạng và thuận tiện cho quy trình công nghiệp

Các nghiên cứu chủ yếu nhằm thiết kế:

 Các chủng sử dụng lactoz để tận dụng phụ phẩm công nghiệp sữa

 Các chủng vi sinh có khả năng chuyển hoá xyloz mà nấm men không đồng hoá.

 Các chủng nấm men phân giải tinh bột để lên men bột khỏi phải qua đường hoá

 Các chủng vi sinh vật để sản xuất etanol từ pentoz.

 Ngoài ra, vấn đề quan trọng khác là sản xuất enzym cellulaz giá rẻ để giá thành etanol nhiên liệu đủ sức cạnh tranh với xăng dầu

Chuyển hoá sinh khối thực vật thành etanol nhiên liệu là một điểm nóng của CNSH hiện đại.

Cải biến các chủng vi sinh vật sản xuất vitamin

Riboflavin (Vitamin B2): Phương pháp mới sử dụng các loài Candida hoặc chủng Bacillus subtilus tái tổ hợp cho sản lượng 20 – 30g/l.

Tổng hợp các tiền chất của vitamin: Gần đây (1990) đã thành công trong tạo dòng các gen cho sự sinh tổng hợp carotenoit vòng, chứa β-caroten từ Erwinia uredovora Sau khi 4 gen sinh tổng hợp β-caroten được chuyển vào Z mobilis và Agrobacterium tumefaciens,

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4 các khuẩn lạc màu vàng thu được trên các đĩa thạch Các thể tiếp hợp sản xuất 220 − 350γg β-caroten trên gram khối lượng khô ở phaz ổn định trong môi trường nuôi.

L-ascorbic axit (Vitamin C) được hiện tổng hợp thương mại theo một quy trình đắt tiền, bao gồm 1 giai đoạn lên men Vi sinh vật và một số giai đoạn hóa học bắt đầu với D- glucoz Giai đoạn cuối cùng trong quá trình là sự chuyển hoá 2-KLG thành L-ascorbic axit dưới xúc tác là axit.

Do đó, cách tốt nhất để chuyển hoá glucoz thành 2-KLG là chế tạo một Vi sinh vật có mang tất cả các enzym cần thiết Việc chuyển hóa D-glucoz thành 2,5- DKG bằng

Erwinia herbicola bao gồm nhiều bước xúc tác bởi enzym, trong khi đó sự chuyển đổi

2,5-DKG thành 2-KLG do Corynebacterium sp Cách đơn giản nhất để thiết kế một sinh vật có khả năng chuyển D-glucoz thành 2-KLG là tách gen 2,5-DKG reductaz từ

Các tế bào Erwinia được biến nạp gen 2,5-DKG reductaz có khả năng chuyển hoá trực tiếp D-glucoz thành 2-KLG, vì các enzym nội bào của Erwini nằm ở màng trong của vi khuẩn chuyển glucoz thành 2,5-DKG và 2,5- DKG reductaz xúc tác chuyển 2,5-DKG thành 2-KLG Do đó, bằng thao tác gen, khả năng chuyển hoá của 2 Vi sinh vật rất khác nhau lại được kết hợp thành một và do đó có khả năng tạo sản phẩm cuối của quá trình chuyển hoá được thiết kế Sinh vật loại này rất hữu ích như là một nguồn 2-KLG cho sản xuất L-ascorbic axit, bằng cách đó thay thế 3 công đoạn đầu của quy trình hiện đang được sử dụng.

Thông qua đột biến điểm định hướng bằng oligonucleotit đã thu được đột biến2,5-DKG reductaz có hoạt tính cao hơn khoảng 2 lần và bền với nhiệt hơn dạng enzym tự nhiên.

Tạo ra các protein tái tổ hợp

Các r-protein đầu tiên được sản xuất nhờ các vi sinh vật chủ như E coli hay nấm men S cerevisiae đã được nêu trên bảng dưới đây.

Bảng 3.1 : Các loại protein trị liệu tạo ra do E coli hay nấm men S cerevisiae

STT Tên sản phẩm Các bệnh được điều trị

2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi C, mụn cóc qua đường tình dục, ung thư

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4

3 Interferon beta Xơ cứng (Multiple sclerosis)

4 Hormone tăng trưởng người Thiểu năng tăng trưởng (Growth defiency)

Hóa trị liệu giảm bạch cầu trung tính (Chemotherapy-induced neutropenia)

Ngoài ra còn có các phân tử sinh học khác như:

 Các enzym: ADNz I, alginat lyaz, phenylalanin amonilyaz, alpha-1-antitrypsin.

 Các kháng thể dùng trong chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh.

MỘT SỐ THÀNH TỰU CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT

Năm 1949, BS Nguyễn Văn Hưởng đã sản xuất hàn loạt các vắcxin chống đậu mùa, tả, thương hàn,…

Năm 1950, GS.BS Đặng Văn Ngữ và GS BS Phạm Ngọc Thạch đã thử nghiệm thành công nuôi cấy nấm Pennicilin để chế kháng sinh cho các chiến sĩ bị thương ngoài chiến trường GS,BS Đặng Văn Ngữ đã trực tiếp sản xuất dịch thô Penicilin ở chiến khu Việt Bắc.Và ông cũng là người xây dựng nên bộ môn vi sinh học và kí sinh trùng của Trường ĐH Y Hà Nội và xây dựng nên viện sốt rét kí sinh trùng và côn trùng.

Trong lĩnh vực công nghiệp vacxin đã đạt được những hiệu quả to lớn.Các công ty vaccin trong nước đã có thể sản xuất được nhiều loại vaccin đáp ứng nhu cầu trong nước và cả xuất khẩu ra nước ngoài như viêm não Nhật Bản, tả, dại, ho gà, uốn ván,…

Từ năm 1995, đã tiến hành nghiên cứu vi sinh vật tái tổ hợp, vaccin tái tổ hợp,

Xử lí bào tử của nấm Penicillium bằng tia phóng xạ rồi chọn lọc, người ta đã tạo được chủng Penicillium có hoạt tính pênixilin tăng gấp 200 lần dạng ban đầu Trên nấm men, vi khuẩn, người ta đã chọn tạo được các thể đột biến sinh trưởng mạnh để sản xuất sinh khối chọn được những chủng vi sinh vật không gây bệnh, đóng vai trò một kháng nguyên, gây miễn dịch ổn định cho kí chủ chống loài vi sinh vật đó, trên nguyên tắc này đã tạo được những vacxin phòng bệnh cho người và gia súc.

Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh dại và viêm gan B Sản xuất vaccine kỹ thuật gen là một lĩnh

Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường

CÁC PHƯƠNG PHÁP CẢI TIẾN GIỐNG VI SINH VẬT TRONG CÔNG NGHIỆP NHÓM 4 vực phát triển mạnh hiện nay của công nghệ DNA tái tổ hợp Đây là loại vaccine được bào chế từ vi khuẩn đã được chuyển gen mã hóa tổng hợp một protein kháng nguyên của một loại virus hay một loại vi khuẩn gây bệnh nào đó Hiện nay, các loại DNA vaccine tái tổ hợp được sử dụng cho người bao gồm vaccine viêm gan B, vaccine dại kiểu mới, vaccine tả kiểu mới, vaccine sốt rét và vaccine bệnh phong Virus viêm gan B có vỏ ngoài lypoprotein Kháng nguyên bề mặt là protein chính của vỏ ngoài, được phát hiện trong máu người bị nhiễm Người ta biến nạp gen tổng hợp kháng nguyên của virus viêm gan B vào vi khuẩn E coli sau đó sản xuất sinh khối ở quy mô lớn các vi khuẩn E coli mang gen tái tổ hợp này, biến E coli thành “nhà máy” sản xuất kháng nguyên để làm vaccine. Bên cạnh đó, mô hình sản xuất vaccine dựa trên cơ sở thực vật (vaccine thực phẩm) cũng có tiềm năng ứng dụng rất lớn Bằng cách chuyển một loại gen kháng nguyên của virus hoặc vi khuẩn vào tế bào thực vật, gen này sẽ hoạt động trong cơ thể và biến thực vật thành nơi sinh ra kháng nguyên Khi những kháng nguyên này đi vào cơ thể người thì hệ thống miễn dịch của người sẽ tự động sinh ra kháng thể đặc hiệu tương ứng Như vậy, thay vì tiêm chủng theo phương thức thông thường người ta có thể ăn những hoa quả có kháng nguyên được sử dụng làm vaccine.

Cải thiện việc sản xuất công nghiệp các chất quan trọng Như Vitamin C là một ví dụ Phương pháp sản xuất vit C dựa vào thứ tự của các phản ứng sau:

Glucozo E A KGLC( dikettogluconat) E.B KGUC(ketogluconat) xử lí axit vit C

Có thề sử dụng vi sinh vật để thực hiện hai bước trên tuy nhiên trong tự nhiên chưa tim thấy VSV nào có cả hai E trên, một số chỉ tạo E A, một số chỉ tạo E.B Tuy nhiên khi gen đọc mã cho E B được đưa vào VSV tổng hợp được E.A thì vi sinh vật này có thể chuyển hóa glucozo hoàn toàn thành KGUL, từ đó rút ngắn thời gian sản xuất vit C