Trang 1 Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu Trần Thị Tơn Hồi, PhD.. Trang 5 ELISA cạnh tranh Yếu tố cần được phát hiện sẽ cạnh tranh với yếu tố đã biết được đánh dấu Enzym xúc tác phản ứng t
Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu Trần Thị Tơn Hồi, PhD Bộ môn YDHCS – Khoa Y Dược ĐHQGHN Miễn dịch đánh dấu Phản ứng kháng nguyên – kháng thể phát nhờ chất đánh dấu Chất đánh dấu thường dùng: Chất phóng xạ: 125I, 32P, Huỳnh quang Enzym: peroxidase 35S ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay Chất đánh dấu: enzym Phản ứng enzym – chất đặc hiệu, thường tạo màu Phản ứng peroxidase ELISA cạnh tranh Yếu tố cần phát cạnh tranh với yếu tố biết đánh dấu Enzym xúc tác phản ứng tạo màu Có thể cạnh tranh kháng nguyên, cạnh tranh kháng thể ELISA không cạnh tranh Phát tương tác kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu nhờ phản ứng tạo màu xúc tác enzym đánh dấu Khơng có cạnh tranh yếu tố miễn dịch cần phát (kháng nguyên kháng thể) với yếu tố miễn dịch biết đánh dấu Một số kỹ thuật ELISA Chất chuẩn Theo định nghĩa Cơ quan đo lường hợp pháp quốc tế (OIML ): Mẫu chuẩn vật liệu hay chất mà hay nhiều tính chất chúng đủ đồng tạo nên để chuẩn hoá dụng cụ, đánh giá phương pháp đo để xác định giá trị vật liệu Dải chất chuẩn biết xác nồng độ Tạo đường cong chuẩn -> phân tích kết với mẫu chưa biết Giúp loại trừ sai số hệ thống Tiến hành thí nghiệm Dụng cụ: Đĩa 96 giếng có tế bào cố định Pipet Hóa chất Thuốc nhuộm Dung dịch rửa Dung dịch màu Tiến hành thí nghiệm Bổ sung 100 ul thuốc nhuộm vào giếng Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Đổ bỏ thuốc nhuộm thừa Rửa lần dung dịch rửa Để khô nhiệt độ phòng Bổ sung 100 ul dung dịch màu vào giếng, lắc nhẹ Quan sát kết nhận xét Miễn dịch huỳnh quang Miễn dịch huỳnh quang Chất đánh dấu: thuốc nhuộm huỳnh quang Thường gắn với kháng thể Cũng có thuốc nhuộm nhận biết bám trực tiếp vào phân tử sinh học cần quan sát Nhuộm DAPI Molecular Probes –The Handbook BODIPY FL C5-ceramide Huỳnh quang Các phân tử huỳnh quang hấp thụ ánh sáng có bước sóng định tái phát xạ ánh sáng mức lượng thấp Tức là: Nếu ta chiếu ánh sáng màu định lên mẫu vật, ta thu ánh sáng với màu khác phát từ mẫu vật Huỳnh quang Phân tử kích hoạt Khi hẩp thụ lượng từ photon, phân tử kích hoạt lên mức lượng cao Electrons mức lượng nảy không ổn định trở lại mức lượng thông thường giải phóng lượng thừa dạng nhiệt hay quang Do phần lượng bị dạng nhiệt, photon giải phóng có mức lượng thấp photon kích hoạt phân tử có bước sóng dài có thay đổi màu Mức lượng thông thường Nhuộm miễn dịch huỳnh quang – Ví dụ Cố định mẫu sinh phẩm (vi khuẩn) lam kính/lá kính Ủ với kháng thể đặc hiệu (kháng thể sơ cấp) Rửa bỏ kháng thể thừa, lại phức kháng thể - vi khuẩn Phát vi khuẩn cách ủ với kháng thể thứ cấp gắn huỳnh quang kháng kháng thể sơ cấp -> phát sáng kính hiển vi huỳnh quang Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Nhuộm trực tiếp Lắng đọng IgM thể cytoid mẫu sinh thiết da bệnh nhân viêm da bệnh lichen phẳng Nhuộm miễn dịch huỳnh quang Nhuộm gián tiếp Phát ANA