Bài giảng Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu

Trang 1 Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu Trần Thị Tơn Hồi, PhD.. Trang 5 ELISA cạnh tranh  Yếu tố cần được phát hiện sẽ cạnh tranh với yếu tố đã biết được đánh dấu  Enzym xúc tác phản ứng t

Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu

Trần Thị Tôn Hoài, PhD

Bộ môn YDHCS – Khoa Y Dược

ĐHQGHN

Miễn dịch đánh dấu

 Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được phát hiện nhờ một chất đánh dấu

 Chất đánh dấu thường dùng:

 Chất phóng xạ: 125 I, 32 P, 35 S

 Huỳnh quang

 Enzym: peroxidase

ELISA - Enzyme-linked

immunosorbent assay

 Chất đánh dấu: enzym

 Phản ứng enzym – cơ chất đặc hiệu, thường tạo màu

Phản ứng peroxidase

ELISA cạnh tranh

 Yếu tố cần được phát hiện sẽ cạnh tranh với yếu tố đã biết được đánh dấu

 Enzym xúc tác phản ứng tạo màu

 Có thể cạnh tranh giữa các kháng nguyên, hoặc cạnh tranh giữa các kháng thể

ELISA không cạnh tranh

 Phát hiện tương tác kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu nhờ phản ứng tạo màu xúc tác bởi enzym đánh dấu

 Không có sự cạnh tranh giữa yếu tố miễn

dịch cần được phát hiện (kháng nguyên hoặc kháng thể) với yếu tố miễn dịch đã biết được đánh dấu

Một số kỹ thuật ELISA

Chất chuẩn

 Theo định nghĩa của Cơ quan đo lường hợp pháp

quốc tế (OIML ): Mẫu chuẩn là một vật liệu hay một

chất mà một hay nhiều tính chất của chúng đủ đồng nhất và được tạo nên để chuẩn hoá một dụng cụ,

đánh giá một phương pháp đo hoặc để xác định giá trị đối với các vật liệu

 Dải chất chuẩn đã biết chính xác nồng độ

 Tạo đường cong chuẩn -> phân tích kết quả với mẫu chưa biết

 Giúp loại trừ sai số hệ thống

Tiến hành thí nghiệm

 Dụng cụ:

 Đĩa 96 giếng có tế bào đã cố định

 Pipet

 Hóa chất

 Thuốc nhuộm

 Dung dịch rửa

 Dung dịch thôi màu

 Bổ sung 100 ul thuốc nhuộm vào mỗi giếng

 Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng

 Đổ bỏ thuốc nhuộm thừa

 Rửa 5 lần bằng dung dịch rửa

 Để khô ở nhiệt độ phòng

 Bổ sung 100 ul dung dịch thôi màu vào mỗi giếng, lắc nhẹ

 Quan sát kết quả và nhận xét

Tiến hành thí nghiệm

Miễn dịch huỳnh quang

 Chất đánh dấu: thuốc nhuộm huỳnh quang

 Thường gắn với kháng thể

 Cũng có thuốc nhuộm có thể nhận biết và

bám trực tiếp vào phân tử sinh học cần quan sát

Miễn dịch huỳnh quang

Molecular Probes –The Handbook

Huỳnh quang

 Các phân tử huỳnh quang hấp thụ ánh sáng

có bước sóng nhất định rồi tái phát xạ ra ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn

Tức là:

 Nếu ta chiếu một ánh sáng màu nhất định lên một mẫu vật, ta có thể thu được ánh sáng với màu khác phát ra từ mẫu vật đó

Mức năng lượng thông thường

Phân tử kích hoạt

Khi hẩp thụ năng

lượng từ photon,

phân tử được kích

hoạt lên mức năng

lượng cao hơn

Electrons ở mức năng lượng nảy không ổn định và sẽ trở lại mức năng lượng thông thường  giải phóng năng lượng thừa dưới dạng nhiệt hay quang năng

Do một phần năng lượng đã

bị mất đi dưới dạng nhiệt, photon được giải phóng có mức năng lượng thấp hơn photon kích hoạt phân tử

 có bước sóng dài hơn và

có thay đổi về màu

Huỳnh quang

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang – Ví dụ

 Cố định mẫu sinh phẩm (vi khuẩn) trên lam kính/lá kính

 Ủ với kháng thể đặc hiệu (kháng thể sơ cấp)

 Rửa bỏ kháng thể thừa, còn lại phức kháng thể - vi khuẩn

 Phát hiện vi khuẩn bằng cách ủ với kháng thể thứ cấp gắn huỳnh quang kháng kháng thể sơ cấp -> phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang

 Nhuộm trực tiếp

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Lắng đọng IgM ở các thể cytoid trong mẫu sinh thiết da của bệnh nhân viêm da bệnh lichen phẳng

 Nhuộm gián tiếp

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Phát hiện ANA