Dương Thúc Huy SVTH: Nguyễn Khánh Toàn MSSV: K38.106.133 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 Tr
TỔNG QUAN
GI ỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS
1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps
Các loài nấm thuộc chi Cordyceps, bao gồm C sinensis, C militaris, C pruinosa và C ophioglossoides, là nguồn nguyên liệu quý giá trong dược học Những loài nấm này, đặc biệt là Cordyceps sinensis, thường phát triển trên ấu trùng và được biết đến với tên gọi Đông Trùng Hạ Thảo.
Thảo, hay còn gọi là Đông-Trùng-Hạ-Thảo trong tiếng Trung Quốc và Tochukaso trong tiếng Nhật, là một loại thảo dược nổi bật với sự chuyển đổi theo mùa Vào mùa đông, ấu trùng nhiễm nấm biến thành sâu sống trong đất, được gọi là Đông Trùng Khi hè đến, stroma phát triển trên đầu ấu trùng, tạo hình dáng giống cỏ, nên được gọi là Hạ Thảo Tại Trung Quốc, thảo dược này đã được sử dụng như một vị thuốc quý trong hàng ngàn năm.
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps
Chi Cordyceps chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như cordycepin, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptide với aminoisobutyric acid Những hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như kháng ung thư, ức chế miễn dịch, kháng oxy hóa và kháng viêm Nghiên cứu gần đây cho thấy polysaccharide trong C sinensis có khả năng chống oxy hóa, ức chế miễn dịch và điều hòa miễn dịch, trong khi cordycepin có tác dụng ức chế sự phát triển khối u Sự quan tâm của các nhà nghiên cứu đối với loài nấm này đang gia tăng nhờ vào giá trị dinh dưỡng và dược học của nó Tuy nhiên, nguồn cung tự nhiên của Cordyceps đang giảm do môi trường sống khắc nghiệt và khai thác quá mức, dẫn đến việc một số loài đã được chiết tách và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.
Khóa luận quản trị nhân lực
NH ỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI
Các hợp chất như Cordycepin (3’-deoxyadenosine), 3’-amino-3’- deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và D- mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950
(Cunningham và cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3]; Kredich và Guarino, 1961 [18]; Kaczka và cộng sự 1964 [10], Liu và cộng sự 1989 [22])
Một nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác biệt về thành phần và hàm lượng hóa chất giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy Cụ thể, nấm nuôi cấy có hàm lượng polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với nấm tự nhiên Ngoài ra, Li và cộng sự cũng phát hiện nấm C sinensis nuôi cấy có hàm lượng nucleoside cao hơn so với loài tự nhiên.
Ergosterol có mặt trong C sinensis đã được xác định qua phương pháp sắc kí lớp mỏng (Li và Li, 1991; Li và cộng sự, 2004) Boros và cộng sự (1994) đã công bố ophiocordin, một hợp chất có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, được chiết xuất từ C sinensis.
C ophioglossoides (Kneifel và cộng sự 1977 [2]) có cấu trúc của balanol từ
Bioxanthracenes (55-67) được cô lập từ C pseudomilitaris (Isaka và cộng sự
2001 [8]) Ngoài ra các hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cũng được cô lập từ loài nấm trên bởi cùng nhóm tác giả (Isaka và cộng sự 2001 [9])
Compounds containing 10-carbon rings, such as cepharosporolides C, E, and F, along with cordycepin, pyridine-2,6-dicarboxylic acid, and 2-carboxymethyl-4-(30-hydroxybutyl)furan, were isolated from C militaris by Rukachaisirikul et al in 2004 Additionally, Krasnoff et al reported the discovery of cicadapeptins I and II, which are peptides containing aminoisobutyric acid, and the antifungal agent myriocin in 2005.
Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-Gal-
N-Acol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] được cô lập từ C ophioglossoides (Kawaguchi và cộng sự 1986) [10] Các polysaccharide cũng được cô lập bởi nhiều nhóm tác giả Bốn exopolysaccharides có khối lượng phân tử từ 50 kDa đến 2260 kDa được cô lập từ C militaris bởi Kim và cộng sự (2003b, c) [13-
Khóa luận quản trị nhân lực
15] Yu và cộng sự (2004a, b) cũng công bố bốn polysaccharides từ C militaris
[31-32] Ngoài ra còn nhiều công bố khác nghiên cứu về polysaccharide từ nấm
Cordyceps nhưChun và cộng sự, 2003 [5]; Methacanon và cộng sự, 2005 [23]; Wu,
Các nghiên cứu trước đây, bao gồm các tác giả như Sun và Pan (2006), Xiao và cộng sự (2006), Yu và cộng sự (2007), và Cheung cùng cộng sự (2009), chủ yếu tập trung vào việc xác định thành phần monosaccharide, khối lượng phân tử và hoạt tính sinh học của polysaccharide Tuy nhiên, một nghiên cứu gần đây của Yu và cộng sự (2009) đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris.
Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009
Recently, Yang and colleagues isolated cordysinins A-E (1-5) along with 46 other known compounds from cultured Cordyceps sinensis, including ergosterol (6), (17R)-17-methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9), fungisterol (10), a mixture of β-sitosterol (11) and stigmasterol (12), a blend of β-sitosterol 3-O-acetate (13) and stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), p-hydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), and genistein (22).
D-mannitol (23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25), acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28), syringic acid (29), cyclo(L-Phe-L-Pro) (30), cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31), 2- furancarboxylic acid (32), p-methoxyphenol (33), glycitein (34), salicylic acid (35), methyl p-hydroxyphenylacetate (36), thymine (37), nicotinic acid (38), ergosteryl-3-
O-β- D -glucopyranoside (39), flazin (40), 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone (41), succinic acid (42), perlolyrine (43), 1-methylpyrimidine-2,4-dione (44), protocatechuic acid
(45), 3,4-dihydroxyacetophenone (46), 4-hydroxyacetophenone (47), 2-deoxy-D- ribono-1,4-lactone (48), 1-acetyl-β-carboline (49), và adenosine (50)
Khóa luận quản trị nhân lực
Hình 2.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
Khóa luận quản trị nhân lực
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
Khóa luận quản trị nhân lực
Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
Khóa luận quản trị nhân lực
NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
HOÁ CH ẤT, THIẾT BỊ
Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí
Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F
Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất
Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng vanillin/H2SO4
Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu
Máy cô quay chân không
Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm
Các thiết bị ghi phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và 2D-NMR được trang bị tại phòng Phân tích Trung tâm của trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tọa lạc tại số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
NGUYÊN LI ỆU
Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS Đinh Minh Hiệp (Ban quản lý khu nông nghiệp công nghệ cao) vào tháng 7 năm 2015 với khối lượng 3.5 kg.
Khóa luận quản trị nhân lực
QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Sinh khối nấm tươi 3.5 kg được làm sạch, sau đó để khô và nghiền nhỏ thành 700 g bột khô Bột khô này được ngâm trong ethanol ở nhiệt độ phòng, và sau đó, dịch cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp, thu được 200 g cao ethanol thô.
Cao ethanol thô được hòa tan nhiều lần trong methanol và sau đó cô quay để thu hồi dung môi Quá trình này dẫn đến sự hình thành kết tủa, với 70.0 g kết tủa được lọc riêng Phần methanol thô còn lại là 130.0 g Tiếp theo, thực hiện sắc ký cột cao methanol thô với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được các phân đoạn như trong Bảng 2.1 Cuối cùng, tiến hành sắc ký cột trên hai phân đoạn A1 và A3, cho ra hai chất là T2 và TT4.
Bảng 2.1 Phân đoạn trên cao methanol thô
2.3.1 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A1
Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g), phần dầu DA1 (660.0 mg) và tủa TA1 (0.9 g) được tách riêng Tủa TA1 sau đó được rửa bằng acetone, và dịch rửa thu được (200.0 mg) được sử dụng để thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.2) Qua quá trình này, hợp chất T2 có khối lượng 6.0 mg và dạng bột màu trắng được thu nhận.
Khóa luận quản trị nhân lực
2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4
Cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:AcOH
(4:1.0:0.2) thu được 6 phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến A3.6
Phân đoạn A3.4 (360.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi C:Me (5:0.1) thu được hợp chất TT4 có khối lượng 15.0 mg có dạng bột màu trắng.
Khóa luận quản trị nhân lực
- Cô quay thu h ồi dung môi
Rửa bằng Ac nhiều lần
Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2
Hòa tan trong Methanol nóng
Khóa luận quản trị nhân lực