Phan tich sac ki khi th vung

1 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Chương 1: CƠ SỞ LÍ THUYẾT CHUNG VỀ TÁCH SẮC KÝ 1.1. Giới thiệu phương pháp 1.1.1 Định nghĩa sắc kí (Chromatography) Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906):  Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy. Định nghĩa của IUPAC (1993):  Sắc kí là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định. 1.1.2. Phân loại  Người ta phân loại các phương pháp sắc kí dựa vào cơ chế hoạt động sắc kí: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion… và vào tính chất của pha tĩnh cũng như phương pháp thể hiện sắc kí. Ví dụ: - Phương pháp sắc kí lỏng rắn trên cột, phương pháp sắc kí phân bố khí lỏng trên cột. - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng trên bản phẳng hai chiều. - Phương pháp sắc kí phân bố lỏng lỏng pha ngược áp suất cao trên cột…  Cơ chế sắc kí có nhiều nhưng để thực hiện quá trình sắc kí thì chỉ có hai dạng: dạng cột và dạng bản phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy).  Trong sắc kí cột, pha tĩnh được giữ trong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc do trọng lực. Trong sắc kí bản mỏng, pha tĩnh được phủ trên một mặt phẳng thủy tinh hoặc kim loại.  Thường để đơn giản hóa, tuy không chính xác người ta gọi tắt các phương pháp sắc kí: sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc kí lỏng cao áp, sắc kí lớp mỏng, sắc kí gel…  Trong số các phương pháp sắc kí được biết, quan trọng nhất là sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố và sắc kí trao đổi ion. Dưới đây sẽ giới thiệu ba phương pháp sắc kí này nhằm vào hai mục đích: chuẩn bị mẫu cho chất phân tích và phân tích một hỗn hợp chất. Bảng 1: Phân loại các phương pháp sắc kí cột Phân loại chung Phương pháp cụ thể Pha tĩnh Kiểu cân bằng Sắc kí lỏng (LC) (Pha động : lỏng) - Lỏng- lỏng hoặc phân bố - Pha lỏng liên kết - Lỏng-rắn hoặc hấp phụ trao đổi ion - Lỏng được phủ trên một chất rắn - Chất hữu cơ được gắn trên một bề mặt rắn - Rắn Nhựa trao đổi ion - Phân bố - Phân bố giữa chất lỏng và bề mặt liên kết - Hấp phụ Trao đổi ion 2 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Sắc kí khí (GC) (pha động: Khí) - Khí-lỏng - Khí - pha liên kết - Khí - rắn - Lỏng được phủ trên một chất rắn - Chất hữu cơ được liên kết trên một bề mặt rắn - Rắn - Phân bố giữa khí và lỏng - Phân bố giữa lỏng và bề mặt liên kết - Hấp phụ Sắc kí lỏng siêu tới hạn Pha lỏng: chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid) Chất hữu cơ được liên kết trên một bề mặt rắn Phân bố giữa chất lỏng siêu tới hạn và bề mặt liên kết Hình 1.1: Sơ đồ nguyên tắc a) sắc kí cột b) sắc kí bản mỏng 1.2. Cơ sở lí thuyết chung của phương pháp sắc kí 1.2.1 Quá trình sắc kí  Sắc kí là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.  Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim được phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn. Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Pha đ ộ ng M ẫ u Pha t ĩnh H ư ớ ng ch ả y pha động S ắ c kí đ ồ Detector Các c ấ u t ử giải tách ra Pha đ ộ ng L ớ p m ỏ ng pha t ĩnh B ả n m ỏ ng trơ Các c ấ u tử tách ra H ư ớ ng ch ả y pha động M ẫ u (A+B+C) Xuất phát Đi ể m đ ế n dung môi N ồ ng đ ộ của B 3 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký  Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc kí. Kết quả là chúng được tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh.  Cấu tử di chuyển chậm (tương tác yếu) ra trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn ra sau dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc kí và được hiển thị dưới dạng sắc kí đồ. Hình 1.1 minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm hai chất A và B (lực tương tác với pha tĩnh của A < B) theo thời gian.  Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của mẫu được hòa tan trong pha động được di chuyển tại phần đầu của cột (tại thời điểm t o ). Ở đây các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha.  Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra (thời điểm t 1 ). Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu.  Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai pha. Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong pha đó. Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha động mạnh hơn. Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi nhau.  Nếu đặt một detectơ có khả năng phát hiện được các chất tan (cấu tử A và B) tại cuối cột tách và tín hiệu của nó được vẽ lại như một hàm của thời gian (hoặc thể tích được thêm vào) thì một loạt pic đối xứng sẽ được ghi lại và được gọi là sắc kí đồ.  Vị trí của các pic theo thời gian được dùng để nhận diện định tính và diện tích của píc được dùng cho phép phân tích định lượng của cấu tử đang xét. 4 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.2: Quá trình tách sắc kí trên cột của hai chất A và B 1.2.2. Các phương pháp tiến hành tách sắc kí Để thực hiện tách sắc kí người ta có thể sử dụng một trong ba phương pháp sau: 1.2.2.1. Phương pháp rửa giải  Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi nhất trong các phương pháp sắc kí hiện nay.  Một lượng nhỏ hỗn hợp mẫu được giới thiệu vào cột với pha động có ái lực với pha tĩnh bé hơn so với bất kì cấu tử cần tách có trong mẫu. Vì thế các cấu tử cần tách di chuyển M ẫ u C ộ t nhồi Pha đ ộ ng Detector S ắ c kí đồ Th ờ i gian 5 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải. Tốc độ này được xác định bởi ái lực tương đối của mỗi cấu tử lên pha tĩnh so với pha động, đó chính là hệ số phân bố K = C sp /C mp . Ở đây C sp , C mp là nồng độ của cấu tử đang xét trên pha tĩnh và trong pha động.  Các cấu tử được rửa giải theo trật tự ái lực của chúng nhưng tốc độ di chuyển tương đối của chúng phụ thuộc vào tương tác 3 thành phần giữa chúng với pha động, với pha tĩnh và giữa pha động với pha tĩnh. Bởi vì các cấu tử được tách khỏi nhau với một vùng pha động ở giữa chúng nên phương pháp này được sử dụng trong các phép tách với mục đích phân tích.  Pha động có thể không thay đổi thành phần dung môi trong suốt quá trình rửa giải; có thể thay đổi dung môi rửa giải sau một thời gian định trước (rửa giải theo từng giai đoạn); cũng có thể không thay đổi các dung môi tạo nên pha động nhưng thay đổi nồng độ của các thành phần có trong pha động sau một thời gian định trước (rửa giải gradient). 1.2.2.2. Phương pháp tiền lưu  Hỗn hợp cần tách gồm các chất A, B và C được cho chảy liên tục vào phần trên của cột, trong đó A là cấu tử có ái lực yếu nhất với pha tĩnh.  Do các cấu tử A, B và C bị lưu giữ trên cột, nên trước hết từ cột chảy ra chỉ có dung môi. A do có lực tương tác trên cột yếu nhất sẽ di chuyển xuống dưới còn các cấu tử có ái lực mạnh hơn A bị pha tĩnh giữ ở phần trên của cột.  Do dung dượng có hạn của pha tĩnh nên khi vượt dung lượng này thì cấu tử A sẽ di chuyển dọc theo cột và ra khỏi cột ở dạng nguyên chất sau đó là hỗn hợp của các thành phần tiếp theo A+B rồi A+B+C.  Phương pháp tiền lưu ít được dùng do không thực hiện được việc tách hoàn toàn các cấu tử, đặc biệt khi sử dụng sự tách sắc kí vào mục đích phân tích. 1.2.2.3. Phương pháp thế đẩy:  Mẫu được cho vào cột, dùng dung môi rửa giải có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào của hỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột.  Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử khác có ái lực với pha tĩnh tăng dần.  Phương pháp này tạo nên các dải rửa giải không hoàn toàn được tách khỏi nhau: có dải thu được chất nguyên chất nhưng có dải giữa các dải nguyên chất thì gồm hỗn hợp của chúng. Trong thực hành phòng thí nghiệm để tách các hỗn hợp phức tạp người ta thường hay dùng hơn cả là phương pháp rửa giải. 6 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.3: Các phương pháp rửa giải, tiền lưu, thế đẩy 1.2.3. Đặc tính sắc kí của chất tan 1.2.3.1. Tính chất lưu giữ Tính chất lưu giữ phản ánh sự phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động và được biểu thị bằng các đại lượng thể tích lưu hay thời gian lưu.  Thể tích lưu V R là thể tích pha động cần thiết để vận chuyển chất tan i từ thời điểm đưa mẫu vào, đi qua cột và đến detectơ (trên sắc kí đồ là điểm cực đại của pic).  Thời gian lưu t Ri là thời gian từ lúc chất tan i được nạp vào cột tách ở bộ phận tiêm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại. Dung môi r ử a gi ả i (E) Pha t ĩnh R ử a gi ả i Ti ề n lưu Th ế đ ẩ y Đ ế n Detector Tín hi ệ u Detector Th ể tích dung môi rửa giải 7 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký  Thể tích lưu có thể nhận được trực tiếp từ thời gian lưu t R trên sắc kí đồ bằng cách nhân với tốc độ thể tích dòng F c (thể tích của pha động trên một đơn vị thời gian): V R = t R . F c  Tốc độ dòng được tính theo các thông số của cột như sau: M t c c t Ld F    4 2 Ở đây:  d c là đường kính của cột,  L là chiều dài cột,  ε t là độ rỗng toàn phần của chất nhồi cột (độ rỗng của chất nhồi cột biểu thị tỉ số thể tích kẽ hở của chất nhồi và thể tích khối toàn phần của nó: đối với chất nhồi rắn = 0.35 - 0.45, chất nhồi xốp = 0.70 - 0.90, cột mao quản = 1.0),  V c là thể tích bên trong cột.  Tốc độ tuyến tính trung bình u của sự dịch chuyển chất tan là: R t L u   Tốc độ tuyến tính trung bình u của pha động là: M t L u  Ở đây t M hay t o là thời gian không bị lưu giữ của chất tan (thời gian chất tan lưu trong pha động). Trong sắc kí khí, t M được lấy bằng thời gian cần thiết cho CH 4 di chuyển đi qua cột. Tương ứng t M hay t o có thể tích V M (hoặc V o ) biểu thị thể tích trống của cột (bao gồm cả thể tích của bộ phận tiêm mẫu (injector), thể tích các đoạn ống nối, thể tích rỗng của chính cột và thể tích detectơ).  Thể tích lưu hiệu chỉnh V’ R hoặc thời gian lưu hiệu chỉnh t’ R được cho bởi: V’ R = V R –V M hoặc t’ R = t R – t M (thời gian không bị lưu giữ của chất tan gần đúng được xem như là thời gian lưu của pha động). 8 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký Hình 1.4: Sắc kí đồ minh họa các thời gian lưu t (hoặc thể tích lưu) và độ rộng của đáy pic W của chất tan không bị lưu giữ M và của 2 chất bị lưu giữ 1 và 2 1.2.3.2. Hệ số phân bố K (Partition coefficient)  Mỗi cấu tử hoặc chất tan được phân bố giữa 2 pha với một cân bằng được thiết lập và tất cả các quá trình tách sắc kí được dựa trên sự khác nhau về khả năng phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh.  Khi chất tan đi vào hệ thống sắc kí, nó ngay lập tức phân bố giữa các pha động và pha tĩnh. Giả thiết nếu pha động dừng lại vào bất kì một thời gian nào, chất tan có một sự phân bố cân bằng giữa hai pha, và nồng độ của chất tan ở trong mỗi pha được cho bởi hệ số phân bố nhiệt động: M s C C K  Ở đây C s và C M là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động tương ứng. Trường hợp khi K = 1 thì chất tan được phân bố bằng nhau giữa hai pha.  Hệ số phân bố xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan (chính xác là tâm vùng) do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột.  Đối với pic đối xứng, khi cực đại pic xuất hiện ở lối ra của cột, một nửa lượng chất tan đã được rửa khỏi cột trong thể tích lưu V R và một nửa còn lại được phân bố giữa thể tích pha động V M và thể tích pha tĩnh V s : V R C M = V M C M + V s C s hay V R = V M + KV s hay V R – V M = KV s Tiêm m ẫ u C ư ờ ng đ ộ tín hi ệ u Detector Th ờ i gian ( th ể tích ) 9 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký  Phương trình này đúng với cột phân bố lỏng, còn đối với cột hấp phụ, V s phải thay bằng S s là diện tích bề mặt của chất hấp thụ. 1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’ (The capacity factor)  Hệ số dung lượng k’ là thông số thực nghiệm quan trọng trong sắc kí cột được sử dụng rộng rải để mô tả các tốc độ dịch chuyển của các chất tan trên cột.  Cho một chất tan, hệ số dung lượng k’ được định nghĩa như là tỉ số mol chất tan trong pha tĩnh và số mol chất tan trong pha động: k’ = M s MM ss V V K VC VC  Tỉ số V M /V s được gọi là tỉ số thể tích pha  Hệ số dung lượng còn được định nghĩa là tỉ số giữa thời gian của chất tan lưu lại trên pha tĩnh và thời gian cần để chất tan đó di chuyển trong pha động suốt chiều dài của cột nếu không bị lưu giữ t M . M MR M MR M R V VV t tt t t k     ' '  Khi k’ cho một chất tan nhỏ hơn 1 nhiều, sự rửa giải xảy ra rất nhanh nên việc xác định thời gian lưu là rất khó. Còn khi k’ khoảng 20 đến 30 thì thời gian rửa giải sẽ bị kéo dài. Vì vậy các phép tách nên được thực hiện ở những điều kiện mà các k’ của các chất tan nằm trong khoảng giá trị từ 1 đến 5.  Giá trị k’ trong sắc kí khí có thể được thay đổi bởi việc thay đổi nhiệt độ và cách nhồi cột. Còn trong sắc kí lỏng, k’ thường được điều khiển để cho phép tách tốt hơn bởi thay đổi thành phần pha động và pha tĩnh. 1.2.3.4. Hệ số chọn lọc (The selectivity factor)  Khả năng của một pha tĩnh tách 2 cấu tử A và B (B là cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn) được xác định bởi tỉ số phân bố tương đối của chúng và cũng là những hệ số lưu giữ của chúng đối với một pha tĩnh đã cho.  Hệ số chọn lọc α là một hàm của sự lưu giữ tương đối của mỗi cấu tử trên pha tĩnh: A B A B R R K K k k t t  ' ' ' 1 ' 2  10 Bùi Xuân Vững Cơ sở phân tích sắc ký  Hệ số chọn lọc của một cặp dải (pic) gần nhau là một hàm phụ thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng, pha động và nhiệt độ của cột. Để cho một sự tách được tốt thì α nên có gía trị lớn hơn 1. Hai chất cần tách càng tách ra xa khỏi nhau khi α càng lớn nhưng nếu quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài, α nên trong khoảng từ 1,05 đến 2,0. 1.2.3.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lưu giữ Tốc độ di chuyển của một dải chất tan qua một cột hay một đĩa sắc kí lớp mỏng phụ thuộc vào sự phân bố của các phân tử chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự phân bố hay sự lưu giữ là:  Thành phần và tính chất của pha động  Kiểu và tính chất của pha tĩnh  Các lực tương tác các phân tử giữa các cấu tử của pha động và pha tĩnh  Nhiệt độ Hai yếu tố góp phần để tách tốt các hợp chất bởi sắc kí là:  Sự khác nhau về thời gian phân bố của chúng trong 2 pha: nếu sự khác nhau càng lớn thì sự tách chúng càng tốt.  Độ doãng rộng của các pic nếu càng rộng thì sự tách chúng càng kém. 1. 3. Sự doãng rộng của pic và hiệu lực tách 1.3.1. Mở đầu  Hiệu lực của một cột tách chịu tác động bởi độ lớn của sự doãng rộng pic xảy ra khi một chất chuyển động dọc theo cột.  Chất tan khi chạy dọc theo cột có khuynh hướng phân bố như một hình phân bố chuẩn Gaussian với độ lệch chuẩn σ (hình 5).  Nếu chất tan tiêu tốn nhiều thời gian khi dịch chuyển dọc xuống cột thì pic càng bị doãng rộng. Độ doãng rộng của một pic thường được biểu diễn thông qua các giá trị:  W 1/2 là độ rộng của của pic được đo ở ½ chiều cao của pic,  W là độ rộng của đáy pic được xác định tại hai điểm cắt của hai đường tiếp tuyến của hai bên thân pic với đường nền. . có th không thay đổi th nh phần dung môi trong suốt quá trình rửa giải; có th thay đổi dung môi rửa giải sau một th i gian định trước (rửa giải theo từng giai đoạn); cũng có th không thay. động cũng có ích. Cải thiện Rs nhờ hệ số chọn lọc α  Khi tăng α hay khi tăng tỉ số phân bố th độ phân giải cũng tăng theo. Cách để thay đổi α là thay đổi pha tĩnh hoặc thay đổi cả pha tĩnh. N là số đĩa lý thuyết,  k’ 2 là hệ số dung lượng của cấu tử th hai, α = ' 1 ' 2 k k Nếu số đĩa lý thuyết của 2 pic không giống nhau th thay th N bằng 21 NN và thay k’ 2 bằng