nghiên cứu phương pháp phân tích các chất kích thích tăng trưởng họ betaagonist(clenbuterol, salbutamol) trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH VÀ THÍ NGHIỆM BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG HỌ BETA-AGONIST C

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

THÁNG 2/ 2009

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH VÀ THÍ NGHIỆM

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG

TRƯỞNG HỌ BETA-AGONIST

(CLENBUTEROL, SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO, GAN HEO, THỨC

ĂN NUÔI HEO BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: THS CHU VÂN HẢI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/2009

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM DỊCH VỤ PHÂN TÍCH VÀ THÍ NGHIỆM

BÁO CÁO NGHIỆM THU

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG

TRƯỞNG HỌ BETA-AGONIST

(CLENBUTEROL, SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO, GAN HEO, THỨC

ĂN NUÔI HEO BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: THS CHU VÂN HẢI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/2009

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Clenbuterol (CLEN), Salbutamol (SAL) là các hợp chất thuộc nhóm beta-agonist được sử dụng bất hợp pháp trong thức ăn gia súc để kích thích tăng trưởng, giảm hàm lượng béo và tăng hàm lượng thịt Tại Việt Nam, CLEN và SAL được phân tích chủ yếu bởi phương pháp sàng lọc Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp GC/MS hay LC/MS chưa có phương pháp chuẩn nhất là khâu chuẩn bị mẫu Tại Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh (TTDVPTTN) đã nghiên cứu phương pháp phân tích CLEN, SAL bằng GC/MS và được sử dụng để phân tích CLEN, SAL trong thức ăn gia súc, thịt heo và gan heo, thực phẩm chế biến sẵn tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lận cận

sau đó được làm sạch bởi cột SCX (Alltech SPE 500mg/6ml), rửa giải bằng 6ml

m/z 227, 300, 335, 336 và 337 cho CLEN, và 207, 294, 350, 369 và 370 cho SAL Hiệu suất thu hồi của phương pháp hơn 65%-88% Giới hạn phát hiện của phương pháp cho CLEN là 0,16 ppb cho thức ăn gia súc, 0,05ppb cho thịt heo, 0,05ppb cho gan heo; cho SAL là 0,11ppb cho thức ăn gia súc, 0,07ppb cho thịt heo, 0,07ppb cho gan heo Phương pháp Elisa đã được sử dụng để phân tích các mẫu thức ăn cho heo, thịt heo, gan heo và được xác nhận lại bằng GC/MS cho các kết quả âm tính và dương tính,

có so sánh kết quả với LC/MS đối với các mẫu dương tính

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Clenbuterol (CLEN), Salbutamol (SAL) may be illegally used as feed additive for growth promotion with concomitant reduction of fat tissues in meat-producing livestock In Viet Nam, CLEN, SAL are being mainly detected by the screening ELISA method Use of GC/MS (Gas chromatographic-mass spectrometric method) or LC/MS (Liquid chromatographic-mass spectrometric method) is somewhat limited due to lack

of appropriate sample preparation Center of analytical services and experimentation (CASE) has devised a quite efficient GC/MS method for CLEN, SAL analysis which are being used to control feedstuff, pork meat, liver, processed food in Ho Chi Minh City and other provinces

enzyme β_Glucuronidase followed by a clean up step with SCX (Alltech SPE

selected ions monitoring mode is performed at m/z 227, 300, 335, 336 and 337 for

-88% The limits of detection were about 0.16ppb_feedstuff, 0.05ppb_pork meat, 0.05ppb_ liver for CLEN; 0.11ppb_feedstuff, 0.07 ppb_ pork meat, 0.07ppb_ liver for SAL The technique include Elisa that is used as screening methods and GC/MS

as confirmatory methods and is compared with LC/MS for positive samples

MỤC LỤC

Trang

Tóm tắt đề tài tiếng Việt

Tóm tắt đề tài tiếng Anh

Thời gian thực hiện

Kinh phí được duyệt

Kinh phí đã cấp

thế giới và ở Việt Nam

nước

1.8 Thời gian thu thập mẫu 10

nuôi heo, thịt heo, gan heo bằng GC/MS đã đăng báo

chuẩn 17- Methyltestosteron trên chuẩn bằng GC/MS

4.5 Xác định MLOD, MLOQ, hiệu suất thu hồi, độ chụm trên nền mẫu 71 thịt heo

gan heo

5.2 Thu thập mẫu thức ăn, mẫu thịt heo, gan heo, thực phẩm chế biến sẵn 79

SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI: Qui trình phân tích Clenbuterol, Salbutamol trong thịt heo, gan heo, thức ăn cho heo

PHỤ LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CÁC HÌNH

MS

50

Tên đ ề tài: Nghiên cứu phương pháp phân tích các chất kích thích tăng trưởng họ

beta-agonist (Clenbuterol, Salbutamol) trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng

phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS

Chủ nhiệm đề tài: Ths.Chu Vân Hải

Cơ quan chủ trì: Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm TPHCM

Thời gian thực hiện : 12/2005-12/2008

Kinh phí được duyệt : 210.000.000 VNĐ

1 Mở đầu :

Clenbuterol (CLEN) và Salbutamol (SAL) là các chất đã bị Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (PTNT) cấm sử dụng từ năm 2002 Mặc dù bị cấm nhưng các chất này vẫn được lén lút sử dụng trong thức ăn chăn nuôi Sự tồn dư của các chất này gây những rối lọan chức năng tim và phổi như tim đập nhanh, run cơ, đau đầu, buồn

nôn…mà các chất này lại chỉ bị phân giải ở nhiệt độ cao Hiện nay chưa có tài liệu khoa học nào nói các chất Clenbuterol và Salbutamol cũng như dư lượng của chúng trong sản phẩm chăn nuôi gây ung thư cho người Tuy ảnh hưởng của dư lượng các chất này được coi là độc trung bình nhưng các nhà khoa học khẳng định rằng tất cả các ảnh hưởng xấu của chất này trên người là không thể chấp nhận được

Thời gian qua, một số cơ quan báo chí và Đài truyền hình Việt Nam đăng tải về việc sử dụng hócmôn kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi và việc quản lý nhà nước về lĩnh vực này Bộ Nông nghiệp và PTNT đã có thông báo ý kiến chỉ đạo ngày 09/06/2006 số 2646/TB-BNN-VP về việc kiểm tra chất lượng Clenbuterol ở thức

ăn chăn nuôi trong phạm vi tòan quốc Đồng thời, ngày 25/08/2006 Bộ trưởng bộ Nông nghiệp và PTNT đã ban hành chỉ thị về việc tăng cường công tác quản lý, nâng cao chất lượng nông lâm sản, vật tư nông nghiệp và đảm bảo vệ sinh, an tòan nông sản, thực phẩm Theo đó, Bộ trưởng đã chỉ đạo các đơn vị trực thuộc thường xuyên kiểm tra

về chất lượng sản phẩn chăn nuôi, con giống và thức ăn chăn nuôi Bộ trưởng bộ Nông nghiệp và PTNT đã ra quyết định ngày 09 tháng 01 năm 2007 số 65/QĐ-BNN-CN về

việc qui định các bước xác định hàm lượng chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức

ăn chăn nuơi Quyết định đã đề rõ: trước hết định lượng Clenbuterol, Salbutamol theo phương pháp sử dụng KIT ELISA Nếu mẫu thức ăn cho kết quả âm tính thì khẳng định là mẫu thức ăn đĩ khơng chứa các họat chất trên Trong trường hợp mẫu thức ăn cho kết quả dương tính với Clenbuterol, Salbutamol thì tiếp tục phân tích các chất này theo một trong các phương pháp: Sắc ký khí khối phổ GC/MS, Sắc ký khí khối phổ/ khối phổ GC/MS/MS, Sắc ký lỏng khối phổ LC/MS, Sắc ký lỏng khối phổ/ khối phổ LC/MS/MS Kết quả phân tích bằng một trong các phương pháp trên sẽ khẳng định hàm lượng Clenbuterol, Salbutamol cĩ trong mẫu thức ăn chăn nuơi

Trong khi đó các doanh nghiệp xuất khẩu, các cơ quan chức năng quản lý ngành nông nghiệp rất cần sự giúp đỡ từ phía các phòng thí nghiệm trong nước để xác định các độc chất này nhằm bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng trước mắt cũng như lâu dài Hiện tại một số nơi ở Viêt Nam cũng đã triển khai các đề tài nghiên cứu phân tích Clenbuterol, Salbutamol trong thức ăn gia súc và thịt heo bằng phương pháp Elisa Tại trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm cũng đã triển khai đề tài: Nghiên cứu phương pháp phân tích các chất kích thích tăng trưởng họ beta-agonist (Clenbuterol, Salbutamol) trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuơi

hiện của phương pháp cho CLEN là 0,16 ppb cho thức ăn gia súc, 0,05ppb cho thịt heo, 0,05ppb cho gan heo; cho SAL là 0,11ppb cho thức ăn gia súc, 0,07ppb cho thịt heo, 0,07ppb cho gan heo Hiệu suất thu hồi của phương pháp hơn 65%-88%, gĩp phần

Việt Nam

Tại Nhật bản: Cấm sử dụng các chất sau trong chăn nuôi, trong sản phẩm động

vật, sản phẩm nhập khẩu

Tại Malaysia: yêu cầu tất cả các sản phẩm thịt, thuỷ sản nhập khẩu phải có giấy

chứng nhận không có Nitrofuran, Chloramphenicol, ß-agonist, nếu không sẽ không

được nhập khẩu

Tại Hương Cảng: Cấm các chất sau:

Tại Việt Nam: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra quyết định

29/2002-QĐ-BNN, quyết định 54/2002/QĐ-BNN và quyết định 40/2002/QĐ-BNN cấm sử dụng các chất sau :

Stt

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Từ năm 1996 các nước châu Âu đã cấm đưa Clenbuterol và Salbutamol vào thức ăn chăn nuơi Sau đây là một số các phương pháp phân tích đã được áp dụng ở nước ngịai:

-Phương pháp xác định hàm lượng CLEN và SAL trong gan heo, nước tiểu heo bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ: [32]

Xử lý mẫu: Mẫu được trích bởi Acetonitril sau đó được clean up bởi SPE C18 Dẫn suất: BSTFA + 1% TMCS

LOD: 0,5 ng/ml ( nước tiểu); 0,5 ng/g (gan)

% Recovery: >80%

-Phương pháp xác định hàm lượng CLEN và SAL trong thịt heo, gan heo, thức ăn gia súc,tôm bằng phương pháp ELISA [33]

Xử lý mẫu: Mẫu được clean up bằng SPE C18

CLEN: LOQ: 5 ng/g (thức ăn), LOQ: 40 ppt (tôm, thịt,gan), SAL:LOQ: 0,05 ppb

% Recovery: >80%

-Phương pháp phân tích SAL và CLEN bằng Sắc ký lỏng hiệu năng cao [34]

Xử lý mẫu: Mẫu được Clean up và làm giàu mẫu bằng cột Oasis HLB 1cc/30mg Extraction Cartridge

Đầu dò: Fluorescence

- Phương pháp phân tích SAL và CLEN bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ[34]

Xử lý mẫu: Mẫu được clean up bằng cột MCX extraction plate, 10mg/96-well Ion source: Electrospray positive

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

- Hiện nay Viện Nông nghiệp Miền Nam đang có dự án điều tra về CLEN trong thực phẩm và thức ăn gia súc bằng Elisa

- Tại Chi Cục Thú Y TP.Hồ Chí Minh cũng đang có dự án điều tra về CLEN trong thực phẩm và thức ăn gia súc bằng Elisa

- Ở Hà Nội, Bộ Thực phẩm cũng đang có dự án về điều tra tình hình nhiễm CLEN và kháng sinh trong thực phẩm bằng Elisa

- Tại Trung tâm đào tạo và phát triển Sắc ký đang triển khai phân tích Clenbuterol và Salbutamol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

- Tại trung tâm nhiệt đới Việt Nga, triển khai phân tích Clenbuterol trong thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sĩng vuơng quét nhanh trên cực giọt chậm

Hiện nay phân tích hàm lượng các chất siêu vết ở dạng ppb, ppt chỉ có thể áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) và sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Chính vì vậy chúng tôi đã chọn kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) vì đây là thiết bị phân tích sẵn có tại Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm

1.2.3 Giới hạn dư lượng tối đa cho phép:

Ngày 24/2/2005, Bộ trưởng Bộ thủy sản đã ban hành quyết định số 07/2005/QĐ-BTS về việc ban hành Danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thuỷ sản Để triển khai quyết định này, các sản phẩm thức ăn cho nuôi trồng thuỷ sản, thuốc thú y thuỷ sản trước khi đăng ký cấp phép lưu hành, nguyên liệu thuỷ sản nuôi trước khi đưa vào chế biến phải được kiểm nghiệm dư lượng các chất Clenbuterol, Salbutamol và trong danh mục này cĩ

18 chất trong đó CLEN đứng ở hàng thứ 3, SAL đứng ở hàng thứ 14 bị cấm sử dụng Theo Codex thì MRL (Maximum residue limit) trong thịt là 0,2ppb, MRL trong gan

là 0,6ppb

1.3 Mục tiêu của đề tài :

Cho đến nay thì chưa có một phòng thí nghiệm nào ở Việt Nam có phương pháp để xác định được hàm lượng CLEN và SAL trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo, trong khi đó các doanh nghiệp xuất khẩu, các cơ quan chức năng quản lý ngành nông nghiệp rất cần sự giúp đỡ từ phía các phòng thí nghiệm trong nước để xác định các độc chất này nhằm bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và bảo vệ sức khoẻ cộâng đồng trước mắt cũng như lâu dài Chính vì vậy mục tiêu của đề tài là cần tìm ra các phương pháp phân tích khá nhạy để phát hiện và định lượng chính xác độc chất CLEN và SAL trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo trên cơ sở nghiên cứu xây dựng phương pháp dựa trên các bài báo đã công bố đồng thời đánh giá tình hình nhiễm CLEN và SAL trong thịt heo, thức ăn nuôi heo, gan heo và thực phẩm chế biến sẵn trên địa bàn TP.Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận

Do Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm (TTPTDVTN) đang có máy sắc ký ghép khối phổ sử dụng bẫy ion có thể cho phép thực hiện kỹ thuật ion hóa dương PICI (Positive Ion Chemical Ionization), kỹ thuật ion hoá bằng va chạm điện tử ( Electron impact- EI), cũng như kỹ thuật MS/MS, chúng tôi sẽ tận dụng ưu điểm này

của thiết bị để nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích CLEN, SAL với độ nhạy lớn thích hợp với điều kiện Việt Nam và đủ sức đáp ứng yêu cầu về chất lượng phân tích của nhiều nước tiên tiến trên thế giới, đồng thời qua đó góp phần đảm bảo an tịan thực phẩm trong nước, cũng như xuất khẩu

Đề tài này được thực hiện nhằm vào 2 mục tiêu chính:

1 Xây dựng phương pháp phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)

ăn nuôi heo Đặc biệt trong các sản phẩm chế biến sẵn từ thịt heo, gan heo

1.4 Đối tượng nghiên cứu:

- Thức ăn nuơi heo

- Thịt heo

- Gan heo

- Sản phẩm chế biến từ thịt heo, gan heo

1.5 Nội dung thực hiện đề tài:

Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài cần thực hiện nội dung nghiên cứu sau:

1/ Để xây dựng phương pháp phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) cần:

- Nghiên cứu chạy chuẩn CLEN và SAL trên máy ở 03 nồng độ từ thấp , trung bình đến cao (hàm lượng các chất chuẩn này ở µg/kg – ppb) và tìm LOD của thiết

bị

- Nghiên cứu phương pháp tách chiết để loại mỡ, loại tạp trên các nền mẫu thịt , gan, thức ăn gia súc

- Chạy mẫu và tìm LOQ của mẫu

- Phân tích mẫu thêm chuẩn và tính hiệu suất thu hồi của phương pháp ở 03 nồng độ khác nhau

- Phân tích các dư lượng Clebuterol và Sabutamol trong thịt, gan heo và thức ăn nuơi heo bằng phương pháp Elisa

- Các kết quả có được từ phương pháp Elisa sẽ bắt đầu triển khai phân tích định lượng trên thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ ( GC/MS)

2/ Để báo cáo hiện trạng tồn dư Clenbuterol, Salbutamol trong thức ăn nuơi heo, thịt heo, gan heo, thực phẩm chế biến sẵn từ thịt heo và gan heo trên địa bàn thành phố và các tỉnh lân cận cần:

- Xác định hàm lượng Clenbuterol, Salbutamol trong thức ăn nuơi heo, thịt heo, gan heo, thực phẩm chế biến sẵn từ thịt heo, gan heo trên địa bàn thành phố và các tỉnh lân cận

- So sánh kết quả giữa phương pháp Elisa và GC/MS

- So sánh kết quả với 1 phịng thí nghiệm khác để kiểm chứng về phương pháp phân tích

1.6 Phương pháp nghiên cứu:

- Phương pháp thu thập tài liệu: Tìm hiểu các công trình nghiên cứu của một số tác giả trên thế giới về CLEN và SAL

- Phương pháp thực nghiệm: Lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp với điều kiện hiện có và phân tích thử nghiệm

- Phương pháp phân tích số liệu: sử dụng các phương pháp thống kê để xử lý cũng như đánh giá số liệu phân tích

- Phương pháp so sánh và đánh giá

1.7 Nơi thu thập mẫu: Thu thập 22 mẫu thức ăn hỗn hợp cho heo thịt, 20 mẫu thịt

biến sẵn trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh

1.8 Thời gian thu thập mẫu: tháng 10/2007 – 11/2008

1.9 Nơi phân tích:

- Nơi lấy mẫu và phân tích bằng phương pháp Elisa: Viện Khoa học Kỹ thuật nơng nghiệp Miền nam theo hợp đồng số 113/2007/HĐK-TTPT giữa Viện Khoa học Kỹ thuật nơng nghiệp Miền nam và Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm ngày 12 tháng 9 năm 2007

- Nơi thực hiện xây dựng phương pháp phân tích và phân tích mẫu theo kỹ thuật GC/MS: Trung tâm dịch vụ phân tích và thí nghiệm

1.11 Ý NGHĨA THỰC TIỄN

- Góp phần đánh giá hiện trạng tồn dư CLEN, SAL trong thịt heo, thức ăn nuôi heo, gan heo, thực phẩm chế biến sẵn từ thịt và gan heo trên địa bàn TP.Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận

- Từ các kết quả nghiên cứu xây dựng được phương pháp ly trích mẫu, phân tích CLEN, SAL trong thịt heo, thức ăn nuôi heo, gan heo với kết quả tin cậy được trên

trang thiết bị hiện có của Trung tâm Dịch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm, phục vụ phân tích cho an toàn thực phẩm trong nước và phục vụ cho xuất khẩu

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN

2 1 TỔNG QUAN VỀ CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL

2.1.1 Một số tính chất cơ bản của Clenbuterol và Salbutamol:

- Clenbuterol:

-Tên hĩa học:

4-amino-3,-dichloro-α-(((1,1-imethylethyl)amino)methyl)benzenemethanol;

4-amino- α ((tert-butylamino)methyl)-3,5-dichlorobenzyl alcohol;

- Tên thương mại: Monores ( Valeas)

- Trọng lượng phân tử: 277,19

* Dẫn xuất: Hydrochloride

- Tên thương mại: Spiropent, Ventipulmin

tốt trong nước , methanol, ethanol, tan nhẹ trong Chloroform Khơng tan trong

- Salbutamol:

- Công thức hoá học của Salbutamol

- Tên hĩa học: α-(((1, 1-Dimethylethyl)

- Trọng lượng phân tử: 239,31

cơ

2.1.2 Tác hại của Clenbuterol và Salbutamol đối với động vật và người [4]

- Clenbuterol, Salbutamol là chất kích thích tăng trưởng, biểu hiện trên lâm sàng,

thống thần kinh bị hưng phấn

- Clenbuterol là chất dùng để điều trị bệnh đường hơ hấp cho trâu, bị, ngựa và dùng cho trâu bị khi sinh đẻ…Thuốc cĩ thể thải dần theo đường tiểu và một ít qua phân của gia súc Thử nghiệm với liều cao trên chuột, thỏ, chĩ cho thấy độc tính chủ yếu làm tăng nhịp tim và gây co giật; ở trâu bị nếu tiêm tĩnh mạch liều cao cũng làm tăng nhịp tim, nhịp hơ hấp Nếu sử dụng ở liều cao kéo dài cĩ thể gây họai tử cơ tim Sử dụng clenbuterol với liều uống 100mg/kg/ngày trên chuột cống cĩ thể gây dị tật bào thai Cũng theo nghiên cứu này trên một số gia súc cho biết 100% dư lượng của thuốc này tồn dư ở trong cơ khơng biến đổi, mất đi qua quá trình nấu nướng ở nhiệt độ đun sơi

khỏang năm phút thì cĩ thể mất đi

- Ngoài ra CLEN, SAL còn điều tiết sinh trưởng động vật Động vật vỗ béo thịt sử dụng 5-10 lần liều trị bệnh Nó thúc đẩy phát triển cơ bắp và tác dụng phân giải

lipit, tăng cao tỷ lệ thịt nạc so với thịt mỡ Có tác dụng phân phối lượng năng lượng

nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn

Vì vậy, CLEN, SAL thường bị lợi dụng làm chất bổ sung tăng tỷ lệ thịt nạc, tăng khả năng tiêu hóa và chúng là những chất rất dễ tồn dư trong thịt, thường tạo thành hiện tượng trúng độc cấp tính và trúng độc mãn tính khi sử dụng thực phẩm còn tồn dư CLEN, SAL

Ở nước ngoài [7]:

Tại Tây Ban Nha: 22/3-4/4 và 22/5-17/6/1991: 43 gia đình đã bị nhiễm CLEN, SAL sau khi ăn gan heo Các triệu chứng như chân tay run, nhịp tim đập nhanh, bồn chồn, đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, sốt, lạnh Triệu chứng xảy ra trong vòng 30-

360 phút Kết quả kiểm tra nước tiểu của các bệnh nhân cho thấy rằng hàm lượng CLEN là 160-291 ppb

Tại Pháp: 24/9/1990, 22 bệnh nhân từ 8 gia đình tại các khu vực khác nhau cũng bị nhiễm CLEN sau khi ăn thịt heo với các triệu chứng như cơ bắp run, đau đầu, tim đập nhanh

Tại Trung Quốc: 5/1998: Tại Hương Cảng 17 người dân đã bị trúng độc CLEN, SAL khi ăn thịt heo làm chân tay run rẩy, đau đầu, tim đập nhanh, miệng khô, mắt bị trợn…

2001: toàn Trung Quốc có 1600 người bị trúng độc với trịêu chứng như trên

Phân tích mẫu thịt phát hiện CLEN 1020µg/kg, 310µg/kg, 80µg/kg (Trung tâm khống chế và dự phòng bệnh Triết Giang)

Tại Việt Nam [4]:

Những năm gần đây đôi lúc cũng xảy ra trường hợp ngộ độc thức ăn tương tự, không loại trừ khả năng trong thực phẩm còn tồn dư những chất cấm mà chưa

được kiểm soát Một số người buôn lậu thức ăn gia súc và các chế phẩm sinh học qua biên giới, không được giám sát kỹ thuật, chất lượng, đưa lậu vào thị trường Việt Nam, ngoài ra một số thức ăn bổ sung của nước ngoài đưa vào thị trường Việt Nam chỉ mới kiểm soát qua giấy tờ mà chưa phân tích kiểm nghiệm chất lượng, vì vậy ta chưa kiểm soát và phát hiện được những chất cấm sử dụng trong thức ăn chăn nuôi Tồn dư các chất này trong thịt gia súc, gia cầm cĩ thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng như gây biến chứng ung thư, run cơ, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, chĩang váng

Ở quận Cái Răng (Cần thơ), tại trại gà sau khi cho đàn gà 17 tháng tuổi ăn (100 con) Sau đó bốn ngày một hiện tượng lạ xảy ra; lượng trứng gà tăng lên đột ngột đạt 98% trước đó tỉ lệ trứng đạt 65-70% Chưa hết, ngay chiều hôm đó có một con gà chết, hôm sau gà lại tiếp tục chết Không chỉ thế đàn gà tơ khi cho ăn lô thức ăn này cũng gặp những trường hợp tương tự Sáu ngày sau khi cho ăn thì lượng trứng tăng lên rất nhiều, có con đẻ mỗi ngày hai trứng Khoảng 20 ngày sau thì đàn gà chết hết Khi cho đàn vịt xiêm khoảng 10 con và ba con vịt siêu thịt ăn Chuyện lạ tiếp tục đến: vịt đẻ trứng to dị thường, có hai lòng đỏ, thậm chí có những con mới vừa ấp lại bỏ ổ và… tiếp tục đẻ

TTDVPTTN phân tích lô mẫu thức ăn gia cầm này bằng phương pháp Elisa, phân tích 3 mẫu và cả 3 đều phát hiện thấy Clenbuterol với hàm lượng 137,03 ng/g,149,46ng/g, 142,97 ng/g

Chất Clenbuterol được người chăn nuơi sử dụng cách khoảng 21 ngày trước khi xuất chuồng bán Đây là chất cực mạnh, cĩ tác dụng nhanh, với 1 kg Clenbuterol cĩ thể trộn với 1 tấn thức ăn gia súc Nếu như trước đây nuơi một con heo 5 tháng mới được 1

tạ, nay với Clenbuterol chỉ cần chưa đầy 3 tháng là heo đã đủ tạ Một trang trại nuơi vài trăm con heo, cĩ sử dụng Clenbuterol trong thức ăn, thì lợi nhuận tăng rất nhanh Nhưng hậu quả ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng là rất nghiêm trọng

2.2 Tổng quan các phương pháp phân tích Clenbuterol, Salbutamol trong thức

ăn nuơi heo, thịt heo, gan heo bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ đã đăng báo:

* Phương pháp phân tích hàm lượng vết Clenbuterol trong các mẫu nước tiểu và mẫu gan: [13]

- Xử lý mẫu gan: mẫu + acetonitril, ly tâm, đuổi khơ dung mơi, hịa tan cặn với đệm

- Dẫn xuất: BSTFA + 1% hay 10% TMCS hoặc MSTFA + 1% hay 10% TMCS

- Sử dụng máy: Trace GC 2000 series ghép với đầu dị MS (EI) Finnigan Polaris

(Thermo Quest)

- Các ion xác nhận m/z: 243, 262, 264, 333

- Hiệu suất thu hồi: 83-94%

- Giới hạn phát hiện: 0,5 ng/g

* Phương pháp phân tích hàm lượng Clenbuterol trong thịt, gan, thận, phổi heo sử dụng

kỹ thuật thủy phân acid và clean up mẫu bằng cột SCX [12]

- Xử lý mẫu: mẫu + acid perchloric, đánh siêu âm Lọc Chỉnh pH với sodium

hydroxide Thêm vào mẫu sodium chloride, isopropanol, ethyl acetate Đuổi khơ dung mơi Hịa tan cặn với đệm phosphate Clean up mẫu bằng cột SCX

- Dẫn xuất: 1% TMCS + BSTFA hoặc HFBA hoặc BBA

- Hiệu suất thu hồi: > 73,4%

* Phương pháp phân tích ractopamin và clenbuterol trong thức ăn gia súc bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ [30]

- Xử lý mẫu: mẫu + perchloric acid, lắc, ly tâm Chỉnh pH mẫu với ammonium

hydroxide Thêm vào ethyl acetate, isopropyl alcohol Đuổi khô dung môi Hòa tan cặn bằng đệm ammonium acetate, clean up mẫu bằng cột SCX

- Hiệu suất thu hồi: 70%

- Giới hạn phát hiện: 0,022 ppb (Clenbuterol), 0,024 ppb (salbutamol)

* Phương pháp phân tích Clenbuterol trong nước tiểu người bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ: [37]

dung dịch rửa giải methanol Thủy phân bằng enzyme bằng cách thêm vào mẫu đệm

phosphate và ß-glucoronidase từ E.Coli, ủ mẫu ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ Chỉnh pH mẫu về 9,2 với đệm carbonate, đem tạo dẫn xuất

- Sử dụng máy: GC/MS/MS/MS

- Các ion xác nhận m/z: 335- 337 —300

- Giới hạn phát hiện: 0,2 ppb

2.3 Sơ lược về kỹ thuật sắc ký khí:

Sắc ký khí là phương pháp phân tích phổ biến hiện nay Nguyên tắc hoạt động của nó có thể được thể hiện qua sơ đồ sau:

Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống sắc ký khí

cột sắc ký mao quản Cột sắc ký mao quản là một cuộn ống nhỏ, đường kính khoảng 0.25- 0.53 mm, phía trong được áo lên một lớp mỏng pha tĩnh Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài và được ghi nhận bởi đầu dò Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ Với cột ít phân cực, đa số các chất tách ra khỏi cột theo độ bay hơi của từng chất Và các chất được xác định bởi

giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ Nhưng điểm hạn chế của sắc ký khí này là đôi khi ta không thể phát hiện nếu các chất chập trong một mũi

Trong sắc ký khí cĩ nhiều lọai đầu dị FID, ECD (electron capture detector), NPD, PDFP, sắc ký khí ghép với khối phổ GC/MS

2.3.1 Cột sắc ký khí:

Trong sắc ký khí cột gồm ba lớp: ngoài là ống tròn nhỏ rỗng dạng cột mao quản là dạng cột thông dụng nhất, phía trong cột, lớp chất mang silica kế tiếp là những hợp chất hữu cơ (pha tĩnh)

Hình 2.2: Mặt cắt của cột sắc ký mao quản phóng to

Những hợp chất hữu cơ đó được gắn lên chất mang rắn silica hoặc các cấu tử từ silica theo hai kiểu:

• Hấp thụ vật lý

• Liên kết hóa học

Trong quá trình sử dụng, do kiểu “hấp thụ vật lý” có những nhược điểm (dễ bị tách

ra khỏi chất mang, nhiều hợp chất ra khỏi cột…) nêu sau này hầu như các cột đều sử dụng liên kết hóa học để gắn các hợp chất hữu cơ lên chất mang

Trong sắc ký khí cột sắc ký mao quản sẽ có thành phần và tỉ lệ các hợp chất hữu cơ được nhà sản xuất nghiên cứu thay đổi tạo ra nhiều loại cột khác nhau đáp ứng đầy đủ yêu cầu phân tích.Ví dụ như nhà sản xuất Alltech có thể cung cấp các loại cột từ không phân cực, phân cực ít, đến rất phân cực

Hình 2.3: Mức độ phân cực của các loại cột sắc ký khí của Alltech

Trong đđề tài này, loại cột được dùng là 5MS So với loại cột DB-5 thì cột

Hình 2.4: Cấu trúc cột sắc ký 2.3.2 Hệ số phân bố:

Cân bằng của cấu tử X trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình đơn giản sau:

Hằng số cân bằng k cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hệ số phân bố

(partition coefficient) và được tính như sau:

Hệ số k này tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

2.3.3 Thời gian lưu:

tO thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết

S

V

V C

C

k’ là đại luợng quan trọng nhất trong sắc ký và được đo bằng thực nghiệm k’ có thể tính theo công thức:

C

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại

lâu, mũi có khả năng bị tù

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phúc tạp, k’ có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20

* 54 5

2

* 16

2.3.6 Độ chọn lọc:

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

' 1

' 2

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:

1 2

* 2

W W

t t

k

' 1

'

* 4

1

α

α − +

=

Với N được xác định từ phương trình 5 hoặc 6

2.3.8 Các loại chất phù hợp phân tích bằng sắc ký khí

phải bền ở nhiệt độ cao và nhanh chóng chuyển vào pha hơi mà không bị phân huỷ hoặc phản ứng với các chất khác

Vậy phần lớn các hợp chất vô cơ không phù hợp cho phân tích GC Một số hợp chất cơ kim có thể phân tích bằng GC bởi nó chứa hàm lượng hữu cơ cao Đa số các hợp chất hữu cơ phù hợp để phân tích bằng GC ngoại trừ những hợp chất sinh học, dược liệu và môi trường Cụ thể, các hợp chất có trọng lượng phân tử cao và chứa các nhóm chức phân cực, dễå bị phân huỷ ở nhiệt độ tách sắc ký và những hợp chất phản ứng với vật liệu dùng trong GC và cột

Vì vậy, để mở rộng khả năng phân tích áp dụng GC người ta khắc phục bằng cách tạo dẫn xuất để giảm độ phân cực, hạ thấp nhiệt độ bốc hơi Ngoài ra tạo dẫn xuất còn được ứng dụng rộng rãi trong phép phân tích sắc ký khí nhằm nâng cao độ

nhạy và độ chọn lọc khi dùng các loại cột và đầu dò khác nhau Hiện nay, người ta thường dùng một số kỹ thuật tạo dẫn xuất trong phân tích sắc ký khí như: alkyl hoá, acyl hoá, silyl hoá

2.3.9 Một số kỹ thuật tạo dẫn xuất

Alkyl hoá

Alkyl hoá là một trong những kỹ thuật dẫn xuất, ở đây xảy ra sự thay thế một nguyên tử hydrogen hoạt tính bằng một nhóm alkyl hoặc một nhóm aryl qua một phản ứng hoá học Các nhóm chức thông dụng bị alkyl hoá bao gồm: R-

Một số thuốc thử thường dùng cho phản ứng alcyl hoá: trifluoroacetyl, pentafluoropropionyl, heptafluorobutyryl

Silyl hoá

Silyl hoá là một trong những kỹ thuật vạn năng nhất để nâng cao độ hoàn hảo của GC bằng cách khoá vị trí proton hoạt tính, làm giảm tương tác lưỡng cực lưỡng cực và làm tăng độ bay hơi Ngoài ra, tạo dẫn xuất silyl hoá còn dùng để nâng cao tính chất phổ khối lượng bằng cách tạo ra các ion phân mảnh nhận danh ưu đãi hơn để nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hoặc ion nhận danh trong phân tích vết Các nhóm chức có khả năng silyl hoá theo thứ tự: alcohol > phenol > acid carboxylic > amine > amide

Phản ứng tổng quát biểu diễn sự tạo thành dẫn xuất trialkyl silyl bởi sự thay thế proton hoạt tính như sau:

Thường R là gốc methyl và tạo thành dẫn xuất trimethyl silyl (TMS) Cơ chế phản ứng silyl hoá còn được giải thích qua sự tác kích ái nhân bởi dị nguyên tố âm điện hơn trên nguyên tử silic của chất cho silyl tạo thành trạng thái chuyển tiếp lưỡng phân Nhóm rời chuyển phải có tính bazơ thấp, khả năng an định điện tích âm trong trạng thái chuyển tiếp và ít hoặc không có khuynh hướng tạo liên kết π (p_d) giữa nó và nguyên tử silic

Các phản ứng thường gặp:

Một số thuốc thử thường dùng làm tác nhân tạo dẫn xuất silyl hoá và sắp xếp theo thứ tự khả năng cho nhóm silyl như sau:

Trimethylsilylimidazole (TMSIM) > N,O-bis-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) > N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamide (BSA) > N-methyl-N-

N-methyl-N(trimethylsilyl)acetamide (MSTA) > Trimethylchlorosilane (TMCS) > Hexamethyldisilazane (HMDS)

2.4 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ:

2.4.1 Đại cương:

Đây là sự kết hợp giữa hai dụng cụ sắc ký khí và đầu dò khối phổ

Hình 2.6: Sơ đồ loại sắc ký khí ghép khối phổ

Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ qua vùng nối (interface)

đi vào trong đầu dò khối phổ Có rất nhiều đầu dò khối phổ nhưng tất cả đều dựa theo nguyên tắc sau: các cấu tử lần lượt được ion hóa, các ion được phân tách tùy thuộc vào khối lượng của chúng và các ion phân tách đó được đưa đến đầu dò để

ghi nhận Sau đó, hệ thống dữ liệu các mảnh ion sinh ra từ mẫu được máy tính thể hiện ra bằng khối phổ biểu diễn cường độ mỗi ion theo m/z

Ban đầu, sự ion hóa tạo ra ion phân tử, nhưng sau đó quá trình phức tạp có thể làm ion phân tử phân mảnh Cùng với ion phân tử các mảnh ion đó tạo nên khối phổ Do vậy, đối với từng hợp chất thì khối phổ sẽ có những đặc tính riêng biệt

Theo qui ước thì ion có cường độ mạnh nhất là ion gốc (base peak) và xem cường

độ là 100%, và các mảnh ion khác sẽ biểu diễn theo % của nó

khối phổ aceton, ion mạnh nhất ở đây giá trị được ghi là tỉ lệ khối lượng trên điện tích và lưu ý rằng ion phân tử ở đây không phải là ion mạnh nhất Ion gốc (base

cấu trúc phân tử Ví dụ sự mất mảnh 15 từ ion phân tử của acetone chứng tỏ sự có mặt của gốc metyl ở phân tử ban đầu Hay sự mất mảnh 28 kế tiếp tương đương với nhóm CO Do đó, chúng ta có thể xác định được cấu trúc của một hợp chất chưa biết dựa trên các chi tiết trên khối phổ Trong một số trường hợp, sự phân mảnh quá lớn làm cho trên khối phổ mảnh ion phân tử không còn, do vậy việc xác định cấu trúc hợp chất gặp khó khăn

Các mảnh trung tính thông thường

2.4.2 Kỹ thuật ion hóa trong GC/MS:

Trong máy GC/MS có hai kỹ thuật:

• Ion hóa điện tử (EI- Electron impact)

• Ion hóa hóa học (CI- Chemical ionization)

2.4.2.1 Kỹ thuật EI:

Được sử dụng phổ biến Các chất sau khi ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào buồng ion hóa (ion source), tại đây chúng sẽ được ion hóa bằng một điện tử có năng lượng khoảng vài chục eV (thông thường dùng là 70 eV) dưới áp suất thường Sự phân mảnh của chúng sẽ khác nhau khi sử dụng cường độ năng lượng ion hóa khác nhau

Hình 2.7: Sự phân mảnh với sự thay đổi của năng lượng bắn phá

(tùy thuộc vào các hợp chất)

Từ buồng ion, các ion đi vào trong bộ phận tách ion (mass analyzer) bẫåy ion; tứ cực tùy theo chế độ gài đặt mà có sự khống chế loại ion đến đầu dò Đầu dò ghi nhận tín hiệu và diễn giải thành khối phổ

Hình 2.8: Sơ đồ quá trình hoạt động trong máy sắc ký khí ghép khối phổ

e

e

e

Các phản ứng trong trường hợp EI:

2.4.2.2 Kỹ thuật CI:

Ion hóa hóa học hay còn gọi là phương pháp ion hóa mềm Khác với phương pháp

EI ion trực tiếp lên hợp chất, phương pháp CI ion hóa lên chất khí (khí reagent) tạo ion, sau đó ion khí này mới thực hiện phản ứng ion-phân tử với hợp chất cần phân tích Trong CI, khí reagent được sử dụng thường là ammonia, metan hay isobutan

Người ta gọi CI là kỹ thuật ion hóa mềm vì sự tạo ra ít mảnh hơn EI Trong CI có hai kiểu là ion hóa ion hóa học dương (Positive Ion Chemical Ionization-PICI) và ion hóa ion hóa học âm (Negative Ion Chemical Ionization- NICI)