Các phương pháp phân tích sắc kí

Các phương pháp phân tích sắc kí

trong ống mao quản (đường kính trong 25 - 100 μm) trên nền củam) trên nền của

dung dịch chất điện giải và chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một điện trường E nhất định được cung cấp bởi nguồn thế cao một

chiều (10 - 40 kV) đặt vào hai đầu ống mao quản

Với lượng mẫu nạp vào cột tách rất nhỏ (khoảng 5 - 20nL), vàthời gian phân tích ngắn (khoảng 5 – 20 phút) nên kĩ thuật HPCEC cóbước phát triển nhảy vọt Nó đã và đang phát triển ở mức độ cao vàđược ứng dụng rất hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoahọc công nghệ, nhất là y dược và sinh học

PHẦN I: NỘI DUNG

I.1 Lớp điện kép trên thành mao quản

Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế Zêta sát thành mao quản luôn xuất hiện, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện

di Yếu tố bề mặt mao quản, thành phần và pH của pha động có liên quan đến sự hình thành, độ lớn và sự tồn tại của lớp điện kép trên bề mặt mao quản và thế Zêta Khi lực ion của dung dịch điện di tăng thì lớp điện kép sẽ bị nén lại làm thế Zêta giảm và ảnh hưởng đến dòng điện di thẩm thấu

Độ lớn của thế Zêta (Vzet) được tính gần đúng theo công thức:

 là hằng số điện môi của dung dịch pha động;

q là tổng điện tích dung dịch theo một đơn vị thể tích;

RD là bán kính hydrat của ion (bán kính Debye) được xác địnhtheo biểu thức:

2

8

D

kT R

I.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

I 2.1 Khái niệm dòng điện di thẩm thấu

Bản chất chính của sự hoạt động trong ống mao quản của HPCEC

là dòng chảy điện di thẩm thấu EOF, gọi tắt là dòng điện di thẩm thấu

Dòng EOF là dòng chảy khối của chất lỏng trong ống mao quản,

nó quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành mao quản

Dòng EOF sẽ xác định thời gian tồn tại của chất tan trong mao quản Nó bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là chất tan di

chuyển trong dòng EOF này

I.2.2 Nguồn gốc dòng điện di thẩm thấu

Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (Si-OH) trênthành mao quản sẽ giải phóng ra ion H+ và bề mặt mao quản mang điện tích âm Do bề mặt mang điện tích âm nên các cation do lực hút

tĩnh điện sẽ tạo thành lớp điện kép để cân bằng điện tích và tạo nênhiệu thế sát thành mao quản (thế Zeta)

Hình 2 Dòng điện di thẩm thấu EOF

Khi áp thế V vào 2 đầu mao quản, các cation trong lớp điện kép

sẽ đi về catot Nhưng vì các cation này bị sonvat hóa nên kéo cả khốidung dịch trong mao quản đi về catot Sự di chuyển của khối dungdịch trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường tạo nêndòng điện thẩm thấu EOF

Tốc độ v của dòng EOF tỉ lệ thuận điện trường E, với thế zeta VZet

và tỉ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch đệm điện li theo côngthức:

EOF

4

Zet EV

Dòng EOF được quyết định bởi thế V đặt vào 2 đầu mao quản,

pH dung dịch đệm điện li, chất điện giải, lớp điện kép, độ nhớt củadung dịch pha động, hằng số điện môi, độ xốp, cỡ hạt Nhờ đặc tínhnày người ta chọn được các điều kiện tối ưu để có tốc độ dòng EOFphù hợp cho quá trình tách sắc kí

Hình 3 Ảnh hưởng của pH lên dòng EOF

I.2.3 Đặc điểm của dòng điện di thẩm thấu

Dòng EOF có 2 đặc điểm chính:

Thứ nhất, dòng EOF là dòng chuyển khối phẳng trong mao quản.

Có đặc điểm này vì lực tạo ra sự di chuyển của dòng EOF phân bốđồng nhất dọc theo mao quản nên không có sụt áp trong mao quản Trong HPLC thì dòng chảy có dạng parabol do hiệu ứng thành:các phần tử giữa dòng di chuyển nhanh, các phần tử gần thành di

chuyển chậm) Vì vậy pic sắc kí trong HPCEC gọn và sắc nét hơn HPLC.

Thứ hai, dòng EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung

dịch điện di, bất kể có mang điện hay không di chuyển theo cùng một hướng nhất định từ anot (cực +) về catot (cực -) (nếu pH ≥ 4):

Các cation di chuyển nhanh về catot với tốc độ khác nhau

tùy điện tích và kích thước của nó;

Các phân tử trung hòa được dòng EOF mang theo cùng với

tốc độ của dòng EOF (nhưng chúng không tách ra đượctrong CEC);

Các anion di chuyển về anot nếu tốc độ của nó lớn hơn tốc

độ dòng EOF Ngược lại chúng bị dòng EOF mang theo vềcatot

Hình 4 So sánh dòng chảy trong HPLC và trong CEC

Hình 5 Sự chuyển của các phần tử trong CEC

Theo đó thứ tự rửa giải theo thời gian sẽ là: cation điện tích lớn,kích thước nhỏ ra đầu tiên → các phân tử trung hòa → anion cóđiện tích lớn và kích thước nhỏ ra sau cùng (Hình 6)

I.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến dòng điện di thẩm thấu

nhiều nên trị số dòng EOF càng lớn Phụ thuộc vào điều kiện điện di cụ thể, trong khoảng pH 2 - 12 dòng EOF có thể thay đổi

10 lần

giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm

Trong một số trường hợp dung dịch đệm nước có thêm một số dung môi hữu cơ như methanol, acetonitril (để dễ hũa tan chất phân tích), hằng số điện môi của dung dịch diện di giảm xuống kéo theo sự giảm dòng EOF

I.2.5 Kiểm tra và khống chế dòng điện di thẩm thấu

Theo trên ta thấy dòng EOF là một yếu tố thuận lợi và có vai trò

quan trọng trong kĩ thuật CEC nên cần kiểm tra và khống chế nó ởmức độ phù hợp cho mục đích phân tích Các cách kiểm tra, khốngchế dòng EOF được tổng kết ở bảng 4

Bảng 1 Các cách kiểm tra, khống chế EOF Cách thức thay đổi Kết quả Nhận xét chung

Điện trường E (tức

điện thế V)

Sự thay đổi tỉ lệ vớiEOF

+ Độ phân giải và số đĩa

lý thuyết hiệu lực giảm.+ Làm nóng mao quản.Giá trị pH của

dung dịch đệm

Làm giảm thế zeta vàEOF khi tăng lực ion,

+ Lực ion lớn, tạo dòngđiện lớn và hiệu ứng Jun

đệm + Độ nét pic sắc kí bị

ảnh hưởng nếu độ dẫnkhác độ dẫn của mẫu+ Hạn chế sự nạp mẫuNhiệt độ Thay đổi độ nhớt 2 –

3%/0C

Dùng khi kiểm tra vàkhống chế nhiệt độ tựđộng

+ Có thể thay đổi độchọn lọc của hệ pha

Các chất hoạt động

bề mặt

Hấp phụ lên thànhmao quản qua tươngtác ionic hayhydrophopic

+ Chất hoạt động bề mặt

là ation làm tăng EOF,cation làm giảm EOF, cóthể đổi chiều EOF

+ Thay đổi độ chọn lọcDùng polymer

hydrophilic trung

tính

Hấp phụ lên thànhmao quản qua tươngtác hydrophopic

+ Làm giảm EOF quathay đổi điện tích bề mặt+ Làm tăng độ nhớt Hoạt hóa bề mặt

bằng cách cộng

hợp

Tạo liên kết hóa họcmới lên thành maoquản

+ Có nhiều cách thayđổi: hydrophylicity, thayđổi điện tích

+ Làm bền bề mặt maoquản

Bài 1: Trong ống mao quản có chiều dài hiệu lực 50 cm, độ dài tổng

cộng 58,5 cm đặt một hiệu thế 25000 V Sau quá trình chạy sắc kí, trên sắc đồ người ta thu được 3 pic với thời gian lưu lần lượt là 38,4s, 50,7s, 93,1s ứng với 3 chất X, Y, Z Tính độ điện di toàn phần, độ điện di hiệu lực của X, Y, Z Biết Y là chất trung tính, từ đó có nhận xét gì về giá trị độ điện di hiệu lực μm) trên nền củaef ?

Giải

 Ta có công thức tính độ điện di toàn phần:

EOF

58, 5.50 93,1.25000

tot Z

  = 1,26.10-3 (cm2.V-1.s-1) Chất Y trung tính nên μm) trên nền củai = 0, do đó:

μm) trên nền củaef (Y) = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1)

Nhận xét: μm) trên nền củaef (Z) < 0 → Z là một anion; μm) trên nền củaef (X) > 0 → X là một

cation

Bài 2: Tách các protein bằng HPCEC Mao quản dài 84 cm, thế

phải mất hết 308s để di chuyển đoạn 64 cm từ chỗ nạp mẫu đếndetector Chất A có thời gian lưu là 343s Tính độ điện di tổng cộng

và độ điện di hiệu lực của chất A

uEOF = 30864 = 0,208 ( cm/s)

 Độ điện di của dòng EOF:

Từ uEOF = μm) trên nền củaEOF.E → μm) trên nền củaEOF = uEOF /E = 0,208 /298 = 6,98.10

-4 (cm2.V-1.s-1)

 Độ điện di hiệu lực:

ef  tot  EOF = 6,26.10-4 - 6,98.10-4

= -0,72.10-4 (cm2.V-1.s-1)

Vì μm) trên nền củaef < 0 nên có thể suy ra A là một anion

Bài 3 Trong một phép tách HPCEC, mao quản có chiều dài tổng

bằng 1m, chiều dài hiệu lực bằng 90cm Thế áp đặt vào hai đầu ốngmao quản là 20 kV Detector được đặt phía trước catot với chất đệm

b) Nếu một phân tử nhỏ không mang điện có thời gian lưu bằng 5phút, hãy xác định độ điện di của dòng EOF.

c) Tính độ điện di hiệu lực của chất đó

d) Tính số đĩa lý thuyết N nếu chất có hệ số khuếch tan D = 2.10-5

a Độ điện di tổng cộng μm) trên nền củatot :

μm) trên nền củatot = .. 20000.10.60100.90 7,5.10 (4 2. 1. 1)

Vì μm) trên nền củaef < 0 nên có thể suy ra chất đó là một anion

d Số đĩa lý thuyết N nếu chất có hệ số khuếch tan D = 2.10-5

cm2/s

4 5

5.10 20000.90

337500

2 2.2.10 100

tot V l N

D L



Bài 4 Phân tích sắc kí điện di mao quản với kỹ thuật CZE Mao

quản có chiều dài tổng là 32cm, chiều dài hiệu lực là 24,5cm ở thếđiện di 30 kV Dưới những điều kiện của thí nghiệm ghi được trongmôi trường trung tính đã xuất hiện chất có thời gian lưu là 3 phút.a) Tính độ điện di hiệu lực của một chất có thời gian lưu 2,5 phút.b) Tính hệ số khuyếch tán dưới những điều kiện đã cho của chất

đó, biết số đĩa lý thuyết N = 80 000

GIẢI:

a.Độ điện di hiệu lưc:

μm) trên nền củatot = .. 30000.2,5.6032.24,5 1,742.10 (4 2. 1 )1

Bài 5 Cho một cột mao quản dài 50cm được áp đặt thế 30 000V,

độ điện di tính được với thời gian 10 phút là 2.10-8 m2s-1V-1 Tính sốđĩa lý thuyết cho ion Li+ (D = 1,0.10-9 m2s-1) và cho một protein cóphân tử khối 105 (D = 3.10-11m2s-1)

2.10 30000

3.10

2 2.10

i Li

V N

2.10 30000

10 2.3.10

dụng chất nội chuẩn là o-ethoxybenzamide Khi phân tích dung dịchchứa 100,0 ppm B1 và 100,0 ppm o- ethoxybenzamide thì diện tíchpic của B1 bằng 71% diện tích pic chất nội chuẩn Phân tích 0,125gthuốc viên vitamin B cho diện tích pic của B1 bằng 1,82 lần so vớichất nội chuẩn Tính số mg vitamin B1 có trong thuốc này, biết thểtích dung dịch ban đầu là 20 mL

Bài 7 Một cation vô cơ có độ điện di 4,31.10-4 cm2.V-1.s-1 và hệ

số khuếch tán 9,8.10-6 cm2.s-1 được phân tích bằng kĩ thuật CZE vớimao quản dài 50 cm và thế điện di 10 kV Trong điều kiện này, dòngđiện di thẩm thấu có tốc đô 0,85 mm/s đi về phía catot Nếu detectorđược đặt cách điểm nạp mẫu 40 cm thì cation mất bao lâu để đếnđược detector ?

L L

0,862 0,85 1, 712( / )400

233, 64( ) 3,9 út0,712

i

i i

i

mm V s V

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Ngô Văn Tứ, Bài giảng sắc ký.

2 Phạm Luận (2002), Cơ sở lý thuyết của Sắc kí điện di mao

quản hiệu năng cao (HPCEC), ĐH KHTN – ĐHQG Hà

Nội

Electrophoresis, AP.

4 Ruth Freitag (2002), Modern Advances in Chromatography,

University of California, USA