Nghiên ứu xây dựng hệ thống haccp áp dụng cho quá trình sản xuất của công ty cổ phần suất ăn hàng không nội bài

60 Trang 6 Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt.CMC : Cacboxyl methyl cenllulose Da : Dalton GlcN : N-glucosamine GlcAc : N-acetyl glucosamine TLC : Sắc ký bản mỏng Thin layer chromatogr

luËn v¨n th¹c sÜ khoa häc

ngµnh : c«ng nghÖ sinh häc

nghiªn cøU x©y dùng hÖ thèng haccp

¸p dông cho qu¸ tr×nh s¶n xuÊt cña c«ng ty

cæ phÇn suÊt ¨n hµng kh«ng néi bµi

-LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM CHITOSANAZA TỪ CHỦNG

PENICILLIUM OXALICUM CURRIE AND THOM VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ THU NHẬN CHITOSA N OLIGOSACCHARIT

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VŨ THỊ ÁNH TUYẾT

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ THANH HÀ

HÀ NỘI 2008

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả luận văn xin cam kết những nội dung trong luận văn này là kết quả của quá trình nghiên cứu, học hỏi trong quá trình học tập, tiếp thu các kiến thức từ Cô giáo hướng dẫn TS Lê Thanh Hà và các Thầy, Cô trong Viện

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Báck Khoa -

Hà Nội

Tất cả số liệu phân tích thực nghiệm, bảng biểu trong đề tài này là kết quả của quá trình nghiên cứu, phân tích và đánh giá của bản thân tác giả đã tiếp thu được trong quá trình học tập, không phải là sản phẩm sao chép Mọi nguồn tài liệu khác đều được trích dẫn nguồn đầy đủ và được liệt kê trong phần Tài liệu tham khảo

Trên đây là cam kết ràng buộc trách nhiệm của tác giả đối với các nội dung, ý tưởng và đề xuất của luận văn này này

MỤC LỤC

Trang 1 1

LỜI CAM ĐOAN 2

MỤC LỤC 3

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt 5

MỞ ĐẦU 6

PHẦN 1 TỔNG QUAN 8

1.1 Chitin 8

1.2 Chitosan 9

1.2.1 Cấu tạo 9

1.2.2 Tính chất 10

1.2.3 Ứng dụng 11

1.3 Chitosanaza 12

1.3.1 Nguồn thu 13

1.3.2 Đặc tính 14

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza 15

1.3.3.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza 15

1.3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza 16

1.3.3.3 Ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng 16

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất enzym chitosanaza 17

1.4 Chitosan oligosaccharit 21

1.4.1 Đặc tính 21

1.4.2 Phương pháp thu nhận COS 21

1.4.3 Ứng dụng 24

1.4.3.1 Trong y học 24

1.4.3.2 Trong ngành thực phẩm 25

1.4.3.3 Trong nông nghiệp 25

1.4.3.4 Trong xử lý nước thải 26

1.4.3.5 Trong sản xuất mỹ phẩm 26

1.4.3.6 Chitosan oligosaccharit là chất dinh dưỡng 26

1.4.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitosan oligosaccharit 27

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ………. 30

2.1 Vật liệu và thiết bị ……… 30

2.1.1 Vật liệu ……… 30

2.1.2 Thiết bị ……… 31

2.1.3 Môi trường ……… 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu ……… 33

2.2.1 Phương pháp vi sinh ……… 33

2.2.2 Phương pháp hoá sinh ……… 34

2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym chitosanaza 34

2.2.2.2 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradfort 36

2.2.2.3 Tách enzym bằng phương pháp kết tủa muối (NH4)2SO4 37

2.2.2.4 Phân đoạn enzym bằng phương pháp lọc cut-off 38

2.2.2.5 Kiểm tra độ tinh sạch của enzym bằng phương pháp điện di 38

2.2.2.6 Phương pháp thu nhận chitosan oligosaccharit 42

2.2.2.7 Phương pháp sắc ký bản mỏng 43

2.2.2.8 Phương pháp xác định độ nhớt, khối lượng phân tử trung bình 44

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… 46

3.1 Xác định đặc tính của chủng 46

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza ……… 47

3.2.1 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ, thời gian nuôi cấy……….… 47

3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường……….… 48

3.2.3 Ảnh hưởng bởi nguồn cacbon……… …… 49

3.2.4 Ảnh hưởng bởi nguồn nitơ……… 50

3.3 Khảo sát thu nhận chitosanaza bằng kết tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4 51

3.4 Kết tủa phân đoạn enzym chitosanaza bằng muối amoni sulphat bão hoà 53

3.5 Phân đoạn dịch enzym chitosanaza bằng phương pháp màng lọc cut-off 55

3.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân thu nhận chitosan oligosaccharit 57

3.6.1 Ảnh hưởng của pH 57

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 59

3.6.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 60

3.6.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/ cơ chất 63

3.7 Thu nhận COS ……… 64

3.7.1 Thực ện ản hi ph ứng thuỷ ph n â ……… 64

3.7.2 Lọc qua màng lọc 10kDa ……… 64

3.7.3 Kết tủa dịch sản phẩm bằng cồn nguyên chất ……… 64

3.7.4 Thu nhận sản phẩm bằng sấy chân không……… 65

3.7.5 Sản phẩm……… 65

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 68

PHỤ LỤC ……… 75

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt.

SDS PAGE- : Sodium dodecyl sulfate- poly-acrylamide gel electrophoresis

MỞ ĐẦU

Ngày nay, công nghệ enzym đã và đang từng bước làm thay đổi và nâng cao chất lượng của một số quá trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế … Hàng năm, lượng enzym được sản xuất trên thế giới đạt khoảng 300 nghìn tấn với trị giá trên 500 triệu USD

Enzym chitosanaza (EC 3.2.1.132) là enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết trong nội phân tử chitosan và được ứng dụng chủ yếu để tạo ra các loại phân tử chitosan phân tử lượng thấp khác như glucosamine, chitosan oligosaccharit… với các đặc tính ưu việt hơn chitosan

Chitosan oligosaccharit có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, dược phẩm, thực phẩm… Chitosan oligosaccharit giúp kích thích tiêu hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, giảm cholesterol huyết tương, giúp giảm cân và ngăn chặn các căn bệnh ở người trưởng thành, ngăn ngừa các bệnh về gan nhờ sự tạo thành kháng thể nhanh trong gan và lá lách, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, làm giảm chất béo trong máu, ức chế sự phát triển của E.coli, phòng chống hữu hiệu các bệnh về đường tiêu hoá…

Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng to lớn của chitosan oligosaccharit đặc biệt trong y học và trong dược phẩm, em đã thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính enzym

chitosanaza từ Penicillium oxalicum Currie and Thom và ứng dụng để thu

nhận chitosan oligosaccharit”

Mục tiêu của đề tài là:

• Khảo sát ảnh hưởng của môi tr ờng nuôi cấy ến khả n ng sinh tổng ư đ ă

hợp enzym

• Qui trình tinh sạch enzym chitosanaza

• Xác địnhđặc tính của enzym chitosan za (nhiệt độ, pH,…) a

• Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện thuỷ phân (nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng…) đến khả năng thủy phân chitosan để thu nhận chitosan oligoscacharides

PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 Chitin

Chitin là polyme tự nhiên phổ biến thứ hai sau xenluloza Chitin là polysaccarit được tìm thấy ở động vật trong đó côn trùng và các loài giáp xác được biết là có chứa một lượng lớn chitin ở lớp vỏ cứng Thông thường vỏ tôm cua thu được có chứa 30-40% protein, 30 50% canxi cacbonat và canxi -photphat và 20-30% chitin Ngoài ra, chitin còn có thể thu được từ tảo biển, động vật, thực vật bậc thấp dưới biển và thực vật bậc thấp trên cạn với lượng nhỏ [44, 49]

Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo thành tế bào nấm, nó đóng vai trò cấu thành nên hình dạng và tạo độ cứng cho tế bào nấm

Chitin được cấu tạo bởi các đơn vị N-axetyl- -D-β glucosamine nối với nhau bởi các cầu nối β-1,4 glucozit [C8H13O5]n, Mchitin = (203.09)n

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Chitin

Khối lượng phân tử chitin trong tự nhiên lớn hơn 1 triệu Dalton Trong

tự nhiên, chúng không tồn tại ở dạng tinh khiết mà thường kết hợp với các polysacarit khác, với protein và với cả muối khoáng

Chitin không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các chất dung môi hữu cơ như ether, rượu… nhưng nó lại hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat Liti (LiSCN) và thioxianat canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo Chitin tương đối ổn định với các chất oxy hóa khử, như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Ca(ClO)2 …

lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin [8]

1.2 Chitosan

1.2.1 Cấu tạo

Chitosan là dẫn xuất đề axetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm ( COCH3) ở vị trí C(2) Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích -D-glucozamine liên kết với nhau bởi các liên kết β- - -(1 4) glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly β- -(1 4)-2-amino deoxi-2- -D-glucozơ hoặc là poly

β- - -D- (1 4) glucozamine (cấu trúc III) Công thức phân tử: [C6H11O4N]n,

MChitosan = (161.07)n

Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau ứng với các nguồn chitin khác nhau Khối lượng phân tử chitin trong tự nhiên lớn hơn 1 triệu Dalton trong khi sản phẩm chitosan thương mại có khối lượng phân tử từ 100.000 - 1.200.000 Dalton, phụ thuộc vào quá trình xử lý của nhà sản xuất

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử chitosan

Chitosan cũng được tìm thấy trong tự nhiên, nó được tìm thấy ở thành

tế bào của nấm thuộc họ Zygomycetes, trong các loài tảo biển có diệp lục Chlorella sp và trong lớp vỏ của các loài côn trùng Các chitosan tự nhiên

được tổng hợp bởi sự hoạt động của các enzym chitin syntheta và chitin zadeacetylaza [47].

Chitosan còn được tạo ra bởi sự phân cắt các phân tử chitin bằng các phương pháp hoá học hay sử dụng enzym

1.2.2 Tính chất

Chitosan không hoà tan trong các dung môi hữu cơ, trong các axit ở các nồng độ cao và trong kiềm, không tan trong nước, trừ các mẫu có phân tử lượng thấp Chitosan tan trong môi trường axit Sự hòa tan phụ thuộc vào mức độ deaxetyl hoá của nhóm amino, khi mức độ deaxetyl hoá tăng, mức độ hoà tan tăng và khi chitosan có mức độ deaxetyl hoá 70-100%, các polyme của chitin sẽ hoà tan hoàn toàn dưới dạng các muối axit

Mức độ hòa tan của các chitosan cũng bị ảnh hưởng bởi pH của dung dịch, tuy nhiên trong môi trường đệm axetat pH 3,18 5,4 ảnh hưởng này hầu -như không đáng kể Chitosan hoà tan tốt trong các dung dịch axit loãng có pH dưới 6, axit axetic, formic, lactic , HCl 1%, không hòa tan trong H2S, H3PO4

pH trên 7 làm cho sự hoà tan chitosan khó khăn hơn, tại pH cao, sự kết lắng hoặc sự tạo gel có khuynh hướng xảy ra và dung dịch chitosan ở dạng poly-ion sẽ tạo phức hợp với các ion Cl- tạo thành gel Chitosan là polycation mạch thẳng nên có khả năng bám dính tốt vào các bề mặt tích điện âm và có khả năng hấp phụ nhiều ion kim loại

Chitosan không độc với người và động vật, không có tính kháng nguyên Chitosan có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào, hoà hợp với mô sống, có khả năng phân huỷ sinh học, kháng nấm, kháng khuẩn, tăng khả năng tái tạo da, nhanh lành vết thương

Chitosan tự nhiên không bao giờ tồn tại ở dạng tinh khiết cao Để thu nhận chúng ở dạng tinh sạch có rất nhiều phương pháp hoá học hay sinh học

Hiện nay, chitosan được thu chủ yếu từ việc tách chiết từ nguồn nguyên liệu dồi dào là vỏ tôm, cua phế thải của ngành công nghiệp chế biến thuỷ sản Hiệu quả của quá trình phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn nguyên liệu ban đầu, mức độ deacetyl hoá Thực chất quá trình này là quá trình loại bỏ các thành phần tạp chất như khoáng, protein

Vỏ tôm, cua

Xay, nghiền

Khử màu(chiết tách bằng dung môi)Ngâm với HCl 3N lạnh Loại khoáng Xử lý với EDTA

Rửa

Ngâm với NaOH 20% lạnh loại protein

Rửa, sấy khô

Chitin tinh sạch

NaOH 50% 120°C Chitin deaxetylaza

2 giờ dưới nitơ (lặp lại nhiều lần) Khử axetyl

Rửa/sấy khô Chitosan tinh sạch Hình 1.3 Sơ đồ tách chiết chitosan từ vỏ tôm, cua [8]

Ngoài ra, cũng có một số nghiên cứu việc tách chiết chitosan từ các nguồn khác như từ sinh khối vi sinh vật mà điển hình là sinh khối nấm sợi

1.2.3 Ứng dụng

Chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, do có t ính kháng nấm, kháng khuẩn, chitosan dùng để bọc nang các hạt giống ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, làm màng mỏng để bao gói thực phẩm, trái cây, làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả, làm băng gạc da nhân tạo trong điều trị bỏng

ức chế sự phát triển tế bào ung thư, khối u Do c ính chất hấp ó t thụ màu, chitosan còn được ứng dụng khử màu uđồ ống thực phẩm, tẩy lọc nguồn thải

do có l thể àm đông tụ c ác th rắn l lửng, giàu ể ơ protein, tạo phức với một s ốkim loại nh Pb, ư Hg…

Ngoài ra, chitosan còn có rất nhiều ứng dụng ở nhiều lĩnh vực khác như: làm chất mang cố định enzym, tế bào vi sinh vật trong sinh học, làm chất bảo vệ da khỏi tia cực tím, tạo các bột bền màu với ánh sáng, chất giữ ẩm trong mỹ phẩm, làm tăng độ bền dai trong sản xuất giấy và sản xuất vải

Với nhiều đặc tính trên, chitosan là thành phần không thể thiếu trong một số sản phẩm của nhiều ngành ứng dụng Tuy nhiên, chitosan cũng

có một số điểm cần kh c phục là độ hoà tan yếu, khả năng hấp thụ còn kém ắ

Do vậy, việc phân cắt phân tử chitosan thành mạch ngắn hơn tạo ra các đơn vị chitosan phân tử lượng thấp dễ hoà tan, hấp thụ tốt và có nhiều tính năng hơn đang là vấn đề được các nhà nghiên cứu quan tâm

1.3 Chitosanaza

Chitosanaza EC ( 3.2.1.132) còn được gọi là chitosan N-acetyl glucosamino hydrolaza, là enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết 1,4 giữa β-các D-glucosamine trong phân tử acetylated chitosan [11, 12, 14, 20]

Enzym chitosanaza có thể thuỷ phân các liên kết khác nhau trong phân

tử chitosan nh : liên kếư t GlcN-GlcN, GlcN-GlcNAc hoặc GlcN-GlcNAcGlcNAc nhưng không thuỷ phân liên kết GlcNAc GlcNAc trong phân tử -

-chitosan khi deacetyl hoá một phần [30] Nguyên tắc của quá trình thuỷ phân chitosan nhờ enzym chitosanazađược thể hiện ở hình 1.4:

Hình 1.4 Enzym chitosanaza thuỷ phân phân tử chitosan

Nhìn trên hình vẽ ta thấy gốc Glu22 đóng vai trò như là chất cho proton trong khi đó gốc Asp40 hoạt hóa một phân tử nước, sau đó tấn công vào cacbon C-1 của gốc đường tại vị trí xúc tác Kết quả là phân tử chitosan sẽ bị phân cắt thành các phân tử có kích thước nhỏ hơn đó là các chitosanoligosaccharit

1.3.1 Nguồn thu

Enzym Chitosanaza được tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật khác nhau như từ vi khuẩn Bacillus sp., Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, cổ khuẩn Acinetobacter sp., nấm mốc Aspergillus oryzae đến xạ khuẩn Streptomyces [11, 12, 15, 20, 31, 42]

Ngoài ra, chitosanaza cũng thấy xuất hiện ở thực vật như cam ngọt, dưa chuột tuy nhiên với hàm lượng nhỏ [48] Vì vậy, việc thu nhận enzym chitosanaza chủ yếu vẫn từ vi sinh vật

Tuỳ thuộc vào loài vi sinh vật và chủng vi sinh vật cũng như đ iều kiện môi trường nuôi cấy, thành phần môi tr ờng mà hoạt lực ư enzym thu được khác nhau Nhìn chung, vận tốc sinh tổng hợp chitosanaza từ vi khuẩn cao

hơn của nấm mốc nh ng hoạt tính lại thấp hơư n [12, 17, 19, 44, 45]

Enzym chitosanaza có nguồn thu từ nấm thuỷ phân ơc chất chitosan kém hơn 40% so với chitosanaza có nguồn thu từ vi khuẩn, nhưng lại có độdeaxetyl hoá lớn hơn 70% so với chitosanaza có u ng ồn thu từ vi khuẩn [23]

1.3.2 Đặc tính

Đặc tính của chitosanaza phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc vi sinh vật sinh tổng hợp ra nó Chitosanaza thu được từ vi khuẩn Bacillus sp KCTC 0377BP

có khối lượng phân tử khoảng 45kDa và pH hoạt ộng từ 4 8, pH tối đ - ưu 4-6

và nhiệt độ tối ưu 60°C [51]; từ vi khuẩn Bacillus subtilisIMR NK1 có khối lượng phân tử khoảng 36kDa và nhiệt ộ, pH tối u tương ứng là 45đ ư °C và 4 [13]; từ Bacillus sp là enzym chịu nhiệt có khối lượng phân tử là 29,5kDa [19]

-Hình 1.5.Cấu trúc 3D của enzym chitosanaza được phân lập từ vi khuẩn Bacillus circulansMH K1 và chitosanaza của - Streptomyces spN174

Trên đây là cấu trúc protein 3D của enzym chitosanaza thu được từ Bacillus circulans MH-K1 và Streptomyces sp N174 được nghiên cứu bởi nhóm Dr.Jon D.Robertus ( trường ại học Texas tại Austin) Hai gốc amino đaxit được thể hiện màu đỏ trên hình là GLU22 và ASP40 đóng vai trò xúc tác cho phản ứng

Nói chung enzym chitosanaza thường h ạt động trong vùng axit yếu oKhoảng pH thích hợp th ờng 4 6,5 tuỳ vào nguồn gốc mà nhiệt ộ và pH tối ư - đ

ưu của enzym chit anazaos thu được cũng khác nhau [10, 12, 14, 20, 42, , 45

50 ]

Hoạt tính của enzym chitosanaza phụ thuộc vào nguồn thu, khối lượng phân tử Enzym βGlcNase dạng exo có khối lượng 97 135 kDa thuỷ p- hân chitosan cho sản phẩm chủ yếu là GlcN, các mạch dài hơn cũng bị phân cắt

thành đơn vị nhỏ Enzym dạng endo khối lượng phân tử 20 50 kDa cho hiệu suất thu COS cao hơn, thuỷ phân chitosan thành các đơn vị (GlcN)3-6[50]

-1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza

1.3.3.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza

pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH- trong môi trường tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay đổi sự vận chuyển của

cơ chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi trường

Mặt khác ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng đến hệ enzym của vi sinh vật, tham gia vào hoạt động sống, sinh tổng hợp của vi sinh vật

Enzym chitosanaza thường hoạt động trong vùng axit yếu Khoảng

pH thích hợp là từ 4.0 6.5 Tuỳ vào nguồn gốc mà pH tối thích của nó khác – nhau

1.3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp chitosanaza

Đa số vi sinh vật sinh tổng hợp enzym chitosanase là vi sinh vật ưa ẩm Nhiệt độ tối thích cho vi sinh vật phát triển và sinh tổng hợp enzym chitosanase nằm trong khoảng từ 30 – 45oC [11, 16 , 39, 45]

Thông thường các loài vi sinh vật có nhiệt độ tối thích cho phát triển và sinh tổng hợp enzym cao thì tính bền nhiệt của enzym tạo thành cũng cao Điều này rất có lợi cho quá trình ứng dụng vì hầu hết các quá trình thuỷ phân đều toả nhiệt Nếu enzym bền nhiệt thì hiệu quả sử dụng enzym cao hơn và không phải dự kiến các phương án làm giảm nhiệt độ môi trường

1.3.3.3 Ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong suốt quá trình sống để xây dựng tế bào và tạo ra các sản phẩm sinh tổng hợp, bởi các thành phần quan trọng của tế bào và sản phẩm sinh tổng hợp đều có chứa nitơ (protein, axit nucleic, enzym …) Chính do vậy, trong môi trường nuôi cấy cần thiết có nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hoá được Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để đảm bảo được hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Sự sinh tổng hợp enzym chitosanaza được tổng hợp trong tế bào vi sinh vật chịu ảnh hưởng khá lớn vào nguồn cacbon có mặt trong môi trường nuôi cấy Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ như glucose, tinh bột tan … thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng enzym chitosanaza mà vi sinh vật tiết ra môi trường là rất ít Muốn thu được enzym thì cần phải có chất cảm ứng để vi

sinh vật có thể tiết ra enzym để thuỷ phân nguồn cơ chất đó Nguồn cacbon đóng vai trò là chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitosanaza là chitosan, chitin

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất enzym chitosanaza

Các enzym chitosanaza thu được từ các nguồn gốc các chủng khác nhau có khối lượng phân tử, pH hoạt động, nhiệt độ tối ưu khác nhau được ứng dụng chủ yếu trong quá trình sản xuất thu nhận các mạch chitosan phân

tử lượng thấp, glucosamin, chitosan oligosaccharit

Tiềm năng ứng dụng rộng lớn của chitosanaza ang được các nhà khoa đhọc quan tâm và nghiên cứu rất nhiều trên thế giới Rất nhiều nước tiến hành nghiên cứu quá trình ản xuất enzym chitosanas za như: Nhật, Canada, Mỹ, Hàn Quốc… Nhưng quy trình sản xuất chitosanaza hiện nay chưa có trên quy

mô công nghiệp chỉ tiến hành nghiên cứu trong viện và ở các trường đại học Trong quá trình tìm hiểu và tham khảo tài liệu trên các trang web và các tạp trí tôi đưa ra sơ ư l ợc tình hình nghiên cứu sản xuất enzym chitosanaza trên thế giới qua bảng 1.1 sau:

Bảng 1.1 Các nghiên cứu sinh tổng hợp chitosanaza từ vi sinh vật

hành Nghiên cứu sinh

chủng Bacillus

megaterium P1

450C, hai enzym còn lại có khối lượng 43 kDa và 22 kDaLàm sạch và xác

Chủng nuôi cấy được phân lập

từ đất Khối lượng 45kDa, hoạt

độ enzym bền ở 40-450C khi giữ

ở nhiệt độ này 24 giờ hoạt độ enzym hầu như không thay đổi

Nhưng qua 500C trong 5 giờ và

Chui-Liang Chiang,

Hsien- Yi Sung Đại học Quốc Gia Đài Loan [12]

thuỷ phân chitin Trong chuỗi sắp xếp gen của chitosanaza có

391 amino axit Enzym chịu nhiệt

700C trong 60 phút cũng như dưới các nhân làm biến tính

protein

Ho-Geun Yoon, HeeYum Kim, Hye- Kyung Kim, Hong-Yon Choie Đại học Hanseo, Chungnam, Hàn Quốc 9] [1

tử là 108 kDa và nội bào (ChiB)

có khối lượng 29kDa

là 42, 40, 26 và 20 kDA và enzym chitosanaza Hỗn hợp enzym này hoạt động ở nhiệt độ

Tatarinova, Valery P Varlamov- Trung tâm

kỹ thuật sinh học, Viện hàn lâm Khoa

Streptomyces

kurssanovii

45-500C và pH 5.0 đã thuỷ phân chitosan có khối lượng phân tử

Woo- jin Jung, Alfred

Dong Park, Donal L Smith trường Đại học McGill, Anne- de-

Canada Truờng Đại

Chonnam, Hàn Quốc [ ] 48

Sau 1h thuỷ phân thu được các chitosan có khối lượng phân tử

Ấn Độ [ ] 15

Theo các nghiê ứu ên c tr n bảng 1.1 ta thấy, chitosanaza được sinh tổng

h ợpchủ ếu ởi vi khuẩ hoặc ấm ốc, người ta c thể ử ụng các ph ng y b n n m ó s d ươ

pháp tinh sạch để thu enzym chit anaza tinh sạch ặc thu chế ẩm os ho ph enzym

thô chủ ếu ứng ụng thu nhận chitosan ph n tử ượng y d â l thấp, chitosan oligosaccharit hay glucosamine…

1.4 Chitosan oligosaccharit

1.4.1 Đặc tính

Chitosan oligosaccharit (COS) là chitosan phân tử lượng thấp, cấu tạo từ

3 đến 11 đơn vị glucosamine liên kết β-(1- -D- 4) glucozamine tạo thành So với chitosan thì chitosan oligosaccharit có nhiều tính chất đặc biệt hơn như là

nó có khả năng hoà tan trong nước rất tốt, có khả năng hút ẩm, và có nhiều đặc tính sinh học khác nhau như kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm, hoạt tính chống lại sự phát triển của các khối u, hoạt động như một tác nhân miễn dịch và liên kết với các protein kháng bệnh ở các loài thực vật bậc cao [51]

Hoạt tính của chitosan oligosaccharit phụ thuộc chủ yếu vào độ dài của chuỗi và độ deaxetyl hoá COS có mạch dài hơn 6 đơn vị glucosamine được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn, chống ung thư và có khả năng miễn dịch cao hơn các oligosaccharit mạch ngắn hơn Độ deaxetyl hoá của COS tăng sẽ làm tăng theo tính kháng khuẩn, và giảm cholesterol trong máu [51] Như vậy, độ dài của mạch và độ deaxetyl hoá là hai yếu tố cần chú ý khi tiến hành sản xuất thu COS

1.4.2 Phương pháp thu nhận COS

Chitosan oligosaccharit được thu nhận chủ yếu từ việc phân cắt phân tử chitosan thành các đơn vị nhỏ từ 3 đến 11 đơn vị D glucosamin Người ta có

thể phân cắt chitosan bằng nhiều phương pháp khác nhau như hoá học, vật lý hay sinh học

Chitosan có thể bị phân cắt bởi axit vô c ơ hay hữu cơ như axit clohidric, axit fomic và axit axetic cho hiệu suất thấp, do chi ph cao khi sí ử

dụngax ápit, dụngtrong sản xuất quy m ớn kh ng khả thi l u dài ơn nữa, ô l ô â H

do phương pháp này tạo ra một lượng lớn các mạch chitosan oligosaccharitmạch ngắn, thậm chí tạo ra cả đơn phân tử do đó dẫn đến tạo ra một lượng rất thấp oligosaccharit [2] Khi sử dụng phương pháp này cần xử lý thu hồi các sản phẩm sạch và rất hạn chế khi ứng dụng sản phẩm trong một số ngành như thực phẩm, mỹ phẩm hay dược học

Phân cắt chitosan bằng chiếu xạ (tia gamma hay tia X) với tần số chiếu

xạ thấp, tia chiếu x là ạ sóng có năng lượng cao làm biến đổi vật bị chiếu xạ tạo nhiều gốc ion tự do Phương pháp cho hiệu suất cao, thu hồi sản phẩm nhanh [6] Tuy nhiên, màu chitosan chuyển từ màu trắng sang màu vàng, mức

độ an toàn của các sản phẩm chiếu xạ cũng là vấn đề cần bàn cãi khi ứng dụng trong ngành thực phẩm, dược học

Phân cắt chitosan bằng phương pháp thuỷ phân bởi enzym là phương pháp an toàn nhất hiện nay, với hiệu suất thu hồi khá cao và đã có rất nhiều thử nghiệm, có t ính khả thi khi ứng dụng sản xuất quy mô rộng Hầu hết chitosanaza thuỷ chitosan cho sản phẩm COS từ 2 đến 11 đơn vị GlcN [17,

46, 47] Sản phẩm thu hồi đặc biệt an toàn trong các ứng dụng sản xuất các sản phẩm các ngành đòi hỏi sự an toàn cao như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm Để thu được lượng sản phẩm tối ưu người ta tiến hành khảo sát các , điều kiện phản ứng như: nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng, tỷ lệ enzym/cơ chất… sau đó, ti hành k tủa, s ô ến ết ấykh thu thành ph ẩm

Theo phương pháp enzym, hiện nay có rất nhiều nước đã công bố kết quả nghiên cứu quá trình sản xuất và tinh sạch enzym chitosanaza theo như

bảng 1.1, ứng dụng sản xuất chitosan oligosaccharit như Đức, Nhật Bản, Canada, Trung Quốc, Hàn Quốc…

COS được thu nhận từ enzym chitosanaza sinh tổng hợp bởi Bacillus sp Strain KCTC 0377BP có thành phần là (GlcN)2-6 với sản phảm chủ yếu là (GlcN)3, do các đơn vị (GlcN)5-6 đều bị phân cắt tiếp thành các đơn vị nhỏ hơn, ngoài COS sản phẩm thuỷ phân còn có chitosan phân tử lượng thấp, chitosan có độ deaxetyl hoá cao [51]

Hỗn hợp enzym có cùng chức năng với chitosanaza và cenlulaza thu từ cenlulasza thương mại sản xuất b ởi trichoderma1 viride thuỷ phân chitosan thu được COS có thành phần gồm (GlcN)2-6, thành phẩn ản phẩm COS thu s được ngoài hoạt tính ủa c enzym còn ph ụ thu vào độ deaxtelyl hoá của c ộc ơ

ch chit anất os [23]

Enzym chitosanaza thu từ chủng Aspergillus sp CJ22 326- có 2 loại có

khối lượng phân tử ác nhau 29kDa v 109kDa, lo enzym 109kDa thukh à ại ỷ

phân chit an cho sos ản ẩm cuối cph ùngchủ ếu GlcN, do các ạch ài ơ y là m d h n đều b ị thuỷ ph n ti t GlcN Lo 29kDa thuỷ phân cho sản phẩm COS từ â ếp ạo ại(GlcN)3-6, cho hiệu suất ạo OS t C cao hơn[50]

Nhìn chung, các nghiên cứu thu nhận enzym chitosanaza đều ứng dụng thu nhận chitosan phân tử lượng thấp, COS hay glucosamine…

Các enzym chitosanaza thu từ các chủng khác nhau có các đặc tính khác nhau, để thu nhận COS ngoài hoạt động của enzym còn phụ thuộc vào độ deaxetyl của cơ chất chitosan, độ nhớt, nồng độ c ơ ch chitosan sử dụng, loại ấtaxit sử dụng để hoà tan cơ chất, lượng enzym và các điều kiện phản ứng như

pH, nhiệt độ, độ khuấy…

Sản phẩm chitosan oligosaccharit hiện đã xuất hiện trên thị trường như Đức, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc…

1.4.3 Ứng dụng

1.4.3.1 Trong y học [39, 45, 46]

Chitosan oligosaccharit là chất có khả năng ngăn chặn sự tích luỹ các chất béo bên trong các cơ quan bên trong thể sinh vật, đặc biệt là ở trong thận của những người sau khi uống rượu Quan trọng hơn chitosan oligosaccharit ngăn chặn những tác động xấu của rượu lên gan Chitosan oligosaccharit giữ vai trò quan trọng trong việc điều khiển chức năng gan ngăn chặn những ảnh , hưởng xấu đến các bệnh về gan những người nghiện rượu

Không giống với chitosan, chitosan oligosaccharit dễ đồng hóa bên trong

cơ thể và bên cạnh đó nó có thể làm tăng sự đồng hoá của một số nguyên tố vi lượng như canxi, sắt… Tương ứng, ứng dụng của oligosaccharit cho phép giải quyết một số vấn đề về dinh dưỡng liên quan đến sự thiếu hụt các chất vi lượng Nó loại bỏ một cách hoàn toàn cholesterol và mật độ thấp lipoprotein

từ mạch máu Bởi vậy việc bổ sung chitosan oligosaccharit vào cơ thể của các bệnh nhân bị béo phì thì có kết quả rất tốt Chitosan oligosaccharit là cation dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion clo có trong mạch máu rồi thải chúng ra ngoài có tác dụng làm giảm huyết áp

Chitosan oligosaccharit có nhiều đặc điểm nổi bật hơn chitin và chitosan

Tỉ lệ hấp thụ chitosan oligosaccharit trong cơ thể người là 100% và hoạt tính

và chức năng sinh học của nó cao hơn chitosan rất nhiều Do vậy nên đưa vào

cơ thể hàng ngày để duy trì sức khoẻ

Chitosan oligosaccharit còn có thể sử dụng để ức chế sự tiêu hoá như sự tiêu hoá các chất béo và nó đóng vai trò như là một tác nhân vận chuyển và nó được sử dụng như là tác nhân làm giảm cholesterol Chitosan oligosaccharit phá vỡ khối mỡ, cản trở sự hấp phụ chất béo bằng cách tạo keo với chất béo trong ruột non

Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh chitosan oligosaccharit có chức năng tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, tạo sự hình thành các kháng thể nhanh trong gan và lá lách, kích thích sự tiêu hoá canxi và các chất khoáng, sản sinh các tế bào vi khuẩn có thể chữa bệnh như: bifidobacterium và vi khuẩn laclic, làm giảm chất béo trong máu, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, điều chỉnh cholesterol, giảm cân và ngăn các bệnh ở người trưởng thành…

1.4.3.2 Trong ngành thực phẩm

Chitosan oligosaccharit được dùng trong các quá trình xử lý sản phẩm, tạo gel, tạo độ mịn, bề dày cho sản phẩm, đặc biệt hơn chitosan oligosaccharit

có thể hút nước trong các sản phẩm nhằm tránh một số quá trình lên men xảy

ra trong khi bảo quản [11, 26]

Ngoài ra, chitosan oligosaccharit còn được sử dụng như một phụ gia thực phẩm do có tính năng kháng nấm, kháng khuẩn, do đó kéo dài thời hạn bảo quản cho sản phẩm thực phẩm Ứng dụng trong sản xuất đồ uống do có đặc tính tẩy màu, không hấp thụ mùi

1.4.3.3 Trong nông nghiệp [25, 33, 5] 4

Chitosan oligosaccharit có thể sử dụng như một chất kích thích sinh trưởng được bón cho cây trồng để cải thiện sản lượng hoa quả và rau và nó có thể ngăn chặn sự nhiễm sâu bệnh, sinh sản ra chất kháng khuẩn trong đất và làm phân bón sinh học Sản xuất phân bón và chất trừ sâu sinh học từ chitosan oligosaccharit đang là lĩnh vực mới mẻ trong tương lai

1.4.3.4 Trong xử lý nước thải [11, 12, 33]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy chitosan oligosaccharit có thể sử dụng là tác nhân đông tụ hiệu quả cho các hợp chất hữu cơ, nó đóng vai trò như một chiếc kìm liên kết các chất độc kim loại nặng, nó có khả năng hấp thụ các chất nhuộm và nồng độ nhỏ của các phenol khác nhau trong công nghệ xử lý nước thải

Trong ứng dụng đặc biệt này, chitosan oligosaccharit tỏ ra có hiệu quả hơn các hợp chất cao phân tử khác được tổng hợp nhân tạo, than hoạt tính thậm chí cả chitin Hơn nữa nhóm amoni (-NH2) trong chitosan oligosaccharit

là nhóm hoạt động nhất và nó có thể đóng vai trò là tác nhân hấp phụ hiệu quả

1.4.3.5 Trong sản xuất mỹ phẩm[25, 31]

Chitosan oligosaccharit tạo màng tốt đối với các protein có khả năng giữ

ẩm tốt và đó là đặc tính chủ yếu của các sản phẩm chăm sóc tóc, chăm sóc da… Tính chất là chất mang có lợi cho phép chitosan oligosaccharit liên kết với các chất trên bề mặt tóc, da hợp thành thành phần có lợi đối với da và tóc

1.4.3.6 Chitosan oligosaccharit là chất dinh dưỡng

 Là chất có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu có tác dụng tốt đối với những người bị cao huyết áp, những người béo

 Làm giảm cân đối với những người có nhu cầu giảm cân

Giống chitosan, chitosan oligosaccharit là chất có lợi cho sức khoẻ Những nghiên cứu đã cho biết rằng chitosan oligosaccharit có khả năng liên kết với các chất béo và cholesterol Chitosan oligosaccharit có cấu trúc dạng sợi, và có các thuộc tính giống như các chất có cấu trúc dạng sợi như

xelluloza nên có thể dùng cho những người ăn kiêng, thay thế thức ăn chứa nhiếu calo

1.4.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitosan oligosaccharit

Trên thế giới, việc nghi n cứu và s ê ản xuất chitosan, chitosan oligosaccharit đã được thực hiện t rừ ất sớm Các phương ph sản xuất C áp OS

như thu ân bằng ỷ ph axit hay chiếu ạ kh x á ph biổ ến, sử dụng ương pháp phenzym đang là một hướng đi mới cho công nghệ sản xuất COS hiện nay, bởi

ư đu iểm an toàn áp, dụngquy m ản xuất lớn, hiệu suất ô s thu hồi kh cao á

Ở Việt Nam hiện nay, sản phẩm chitosan ngày càng được ứng dụng rộng rãi Nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin, chitosan khá dồi dào: vỏ, đầu tôm phế thải từ các nhà máy chế biến thủy sản trong nước Hàng năm, tôm đông lạnh xuất khẩu khoảng 50.000 tấn và lượng phế thải cũng khoảng 33.000 tấn (chiếm khoảng 40% nguyên liệu) Từ trước đến nay nguồn phế liệu này chủ yếu được làm từ thức ăn gia súc mà chưa tận dụng để sản xuất các sản phẩm

có giá trị cao Trước tình hình thực tế, các nhà khoa học trong nước đã và đang đầu tư và nghiên cứu công nghệ để tách chiết ra chitin, chitosan

Vào những năm 1978 đến 1980, trường Đại học Thủy sản đã công bố quy trình sản xuất chitin chitosan từ vỏ tôm, cua… nhưng chưa có ứng dụng -

cụ thể trong sản xuất

Hiện nay được biết có một số trường và Viện đang nghiên cứu sản xuất chitin-chitosan như Trung tâm Chế biến Trường Đại học Thủy sản, Đại học Y Dược, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Viện nghiên cứu thủy sản, Viện Khoa học Việt nam Gần đây có nghiên cứu của Trần Thái Hòa trường ĐH Khoa –học Huế năm 2005, tác giả đã dùng mô hình toán học quy hoạch thực nghiệm trong quá trình thủy phân cắt mạch chitin từ vỏ tôm với hiệu suất hơn 30%

Sản phẩm chitosan chế biến từ vỏ tôm, cua ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm, thuốc chữa bỏng hay làm giảm béo đã được sản xuất và lưu hành trên thị trường.

Ngoài ra, chitosan cũng đang được nghiên cứu tách chiết từ sinh khối vi sinh vật, một nguồn nguyên liệu dồi dào trong ngành công nghệ sinh học, thực phẩm để ứng dụng sản xuất các sản phẩm trong nhiều lĩnh vực của đời

làm gia tăng đáng kể hiệu suất cắt mạch bức xạ đối với chitosan Các tác giả này cũng đã nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan Kết quả cho thấy khối lượng phân tử của chitosan giảm dần khi tăng liều chiếu xạ Hàm lượng oligochitosan tan trong nước pH = 7 đạt khoảng 75% tại liều 48 KGy Độ deaxetyl của oligochitosan thay đổi hầu như không đáng kể so với chitosan ban đầu Phổ XRD cho thấy oligochitosan

có cấu trúc vô định hình [6] Nguyễn Thị Huệ, Bùi Thị Huyền nghiên cứu quá trình thuỷ phân chitosan bằng một số axit hữu cơ đặc biệt là axit fomic và axit

axetic Kết quả quá trình thuỷ phân được đánh giá qua các giá trị khối lượng phân tử trung bình (Mw) và độ deaxetyl hoá (DD) của các sản phẩm sau phản ứng [2]

Những nghiên cứu thu nhận chitosan oligosacharit ở trong nước chủ yếu dựa vào phương pháp hoá học, vật lý như thuỷ phân bằng axit hay giảm cấp chitosan bằng hoá chất kết hợp bằng phương pháp chiếu xạ Chưa có công bố nghiên cứu khoa học nào về phương pháp thuỷ phân chitosan bằng enzym để tạo chitosan oligosacharit

Với nguồn nguyên liệu sản xuất chitosan dồi dào, và một số hạn chế của chitosan trong quá trình sản xuất các sản phẩm ứng dụng trong đời sống và sản xuất, việc nghiên cứu thu nhận enzym chitosanaza là cần thiết để sản xuất chitosan oligosaccharit, ứng dụng trong các ngành thực phẩm, dược phẩm, y học… hiện nay

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và thiết bị

(NH4)2SO4, muối acetat natri : Trung Quốc

Chủng Penicillium oxalicum

Currie and Thom

: Phòng TN Vi sinh - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

2.1.2 Thiết bị.

Máy so màu quang phổ UV-VIS

Ultropee

: Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển

* Thành phần môi trường nước chiết khoai tây PDA:

2.1.3.2 Mô i trường hoạt ho á

* Thành phần môi trường Czapeck: (g/l)

môi trường Czapeck trong vòng 36 giờ, 300C Sau đó, chủng được chuyển vào môi trường MS-Chitosan trong điều kiện 300C, pH =7, lắc 170 vòng/phút trong 96 giờ để thu nhận enzym chitosanaza

2.2.2 Phương pháp hoá sinh

2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym chitosanaza

 Xác định hoạt độ enzym chitosanaza bằng định lượng theo phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS)

Phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitro salicylic Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử Biết được mật độ quang của dịch đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn của D glucosamine với thuốc thử này suy ra được hàm -lượng đường khử của dịch nghiên cứu

Cách tiến hành: Dựa vào hàm lượng đường khử ta suy ra hoạt độ enzym

chitosanaza với cơ chất phản ứng là chitosan 0,5% pha trong đệm

CH3COONa 0,2M, pH=5 Phản ứng được tiến hành ở 500C trong 30 phút Mấu đối chứng là enzym đã vô hoạt

Định nghĩa hoạt độ enzym chitosanaza:

tác thuỷ phân cơ chất giải phóng ra 1µmol D-glucosamine trong 1 phút ở

 Xây dựng đồ thị đường chuẩn của D -glucosamine và DNS để xác định hoạt độ chitosanaza

Pha các mẫu có nồng độ đường xác định rồi cho phản ứng với thuốc thử DNS theo tỉ lệ 1:1, sau đó đem đun sôi cách thuỷ trong 5 phút, làm nguội rồi

đo mật độ quang ở bước sóng λ = 540nm

Từ kết quả thu được lập đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ glucosamine và mật độ quang tại bước sóng 540nm

Từ số liệu trên ta xác đồ thị đường chuẩn có dạng đường thẳng,

y = ax + bTrong đó: x: hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml)

y: giá trị mật độ quang OD tại 540nm

Từ đồ thị có thể tính được hàm lượng đường glucosamine trong mẫu từ giá trị mật độ quang OD tại 540nm đo được

 Xác định hoạt độ enzym chitosanaza bằng phương pháp khuyếch tán trên bề mặt thạch.

Môi trường MS-Chitosan được thanh trùng ở 1210C trong 30 phút Rót vào các hộp peptri với chiều dày 0,5cm Để nguội môi trường, đục các lỗ thạch có đường kính 8 mm trên đĩa thạch Nhỏ vào mỗi lỗ thạch 20 µl dịch enzym thô Giữ hộp thạch trong tủ lạnh 40C trong 1h sau đó chuyển vào tủ ấm

300C trong 24h cho phản ứng xảy ra

Bán kính vòng thuỷ phân được xác định bằng công thức D = - r R

Trong đó R: Bán kính từ tâm lỗ thạch đến mép ngoài vòng thuỷ phân r: Bán kính lỗ đục trên hộp thạch

2.2.2.2 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradfort

Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein trong dung dịch axit Sự thay đổi màu được đo tại bước sóng 595nm Nồng độ protein trong mẫu được xác định dựa vào đường protein chuẩn được xác định đồng thời với mẫu sử dụng BSA

là protein chuẩn

Cách tiến hành: Hoà tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G-250 trong 50ml etanol 95%, thêm 100ml axit photphoric 85% (w/v) Pha loãng tới 1 lít khi thuốc nhuộm đã hoà tan hoàn toàn, sau đó lọc thu dịch Dùng NaOH 1M nếu mẫu không tan trong dung dịch thí nghiệm

 Xây dựng đường chuẩn:

- Chuẩn bị các mẫu chứa 5 100 µg protein chuẩn như BSA trong –

- Đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm

 Xác định protein tổng số trong các mẫu thí nghiệm:

− Lấy 100 l mẫu cho vào ống nghiệm.µ

− Thêm 5 ml dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue Để yên trong 5 phút

− Mẫu đối chứng thay dung dịch protein chuẩn bằng nước cất và được làm trong cùng điều kiện thí nghiệm

− Đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm

Từ số liệu trên ta xác đồ thị đường chuẩn có dạng đường thẳng,

y = a1 x + b1

Trong đó: x: hàm lượng protein có trong mẫu (mg/ml)

y: giá trị mật độ quang OD tại 595 nm

Từ đồ thị có thể tính được hàm lượng protein tổng số trong mẫu từ giá trị mật độ quang OD tại 595nm

Dựa vào nồng độ protein tổng và hoạt độ enzym U ta xác định được hoạt

độ riêng chế phẩm enzym:

“Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzym được biểu diễn bằng số đơn vị

2.2.2.3 Tách enzym bằng phương pháp kết tủa muối (NH4)2SO4

Sau khi nuôi cấy, canh trường vi sinh vật được đem lọc thu dịch trong

Bổ sung muối amoni sulphat ở các nồng độ bão hoà khác nhau Thời gian kết tủa 30 phút ở 00C, sau đó để lắng, ly tâm thu kết tủa ở 40C, vận tốc 9000vòng/phút trong 30 phút Kết tủa thu được hoà tan trong đệm natriaxetat 0,2M, pH = 5 Tiến hành thẩm tích muối trong đệm natriaxetat ở 40C Dịch sau thẩm tích đem xác định hoạt độ enzym bằng phương pháp DNS và nồng

độ protein theo phương pháp Bradford

2.2.2.4 Phân đoạn enzym bằng phương pháp lọc cut-off

Enzym sau khi kết tủa bằng muối natriaxetat, đem thẩm tích trong đệm, sau đó đem ly tâm trên màng lọc cut off 50 kDa và 10 kDa ở 4- 0C, trong 10 phút vận tốc 9000 vòng/phút Thu được 3 phân đoạn với phân tử lượng <10 kDa, 10-50 kDa, ≥ 50 kDa

Các phân đoạn được đem đi xác định hoạt độ enzym theo phương pháp DNS và nồng độ protein theo phương pháp Bradford

2.2.2.5 Kiểm tra độ tinh sạch của enzym bằng phương pháp điện di

Điện di là quá trình dịch chuyển của các phân tử tích điện dương trong điện trường Vận tốc dịch chuyển của các phân tử phụ thuộc vào điện tích, kích thước và khối lượng phân tử Điện di các chất cao phân tử như protein enzym thường được thực hiện bằng cách đưa một lượng nhỏ mẫu lên chất mang là khối gel xốp với vận tốc khác nhau và sẽ có vị trí dưới dạng các băng khác nhau khi nhuộm màu gel

Gel có tác dụng giữ ổn định môi trường điện di làm cho các băng không

bị khuyếch tán và trộn lẫn khi dòng điện đi qua làm dung dịch điện di nóng lên, đồng thời nó còn đóng vai trò như một lưới lọc phân tử Gel polyacrylamit thường được sử dụng trong điện di Gel polyacrylamit có cấu trúc dạng bọt biển, do đó có nhiều liên kết ngang Các phân tử protein có kích thước lớn hơn khi đi qua các lỗ của gel dưới tác dụng của điện trường sẽ chuyển dịch chậm hơn các phân tử có kích thước nhỏ

Khi có mặt β-mercaptoetanol (HS-CH2CH2OH), để khử các cầu disulfua (-S-S-) và natri dodecul sulfat (SDS) CH3(CH2)11 – SO3Na, các protein sẽ bị biến tính Chuỗi polypeptit đã bị giãn ra sẽ được phủ kín bằng phân tử SDS để tạo ra một polyanion có mật độ điện tích trên một phân tử chiều dài gần như

không đổi và không phụ thuộc vào trình tự của chuỗi peptit Dưới tác dụng của một điện trường các protein đã được SDS phủ kín sẽ di chuyển lên gel acryamit về phía cực dương (anot) Do các mắt lưới của gel, mạch polypeptit càng dài thì di chuyển càng chậm vì vậy các protein khác nhau của một hỗn hợp có thể được tách ra tuỳ theo kích cỡ và điện tích ban đầu, còn hình dạng của phân tử thì không bị ảnh hưởng Kết quả điện di sẽ cho biết protein enzym là sạch hay không đươc thể hiện qua các băng điện di đồ.

Cách tiến hành

Điện di đứng được xác định trên bản gen có kích thước 100mm x 100mm x 1mm Bản gel gồm hai lớp gel khác nhau, được đúc từ một buồng gel bằng khung bản kính có kích thước tương ứng

 Gel cô (stacking gel): 1ml

 Gel tách (running gel): 10ml

Dung dịch Tris HCl 1,5 M pH 8,8: 2500 µl