60 Trang 6 Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt.CMC : Cacboxyl methyl cenllulose Da : Dalton GlcN : N-glucosamine GlcAc : N-acetyl glucosamine TLC : Sắc ký bản mỏng Thin layer chromatogr
bộ giáo dục đào tạo trờng đại học bách khoa hµ néi - luận văn thạc sĩ khoa học ngành : công nghệ sinh học nghiên cứU xây dựng hệ thống haccp áp dụng cho trình sản xuất công ty cổ phần suất ăn hàng không nội 3898 lª anh minh Ngêi híng dÉn khoa häc: PGS - Ts Hà duyên t Hà Nội - 2008 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! 17057205018581000000 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** - LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYM CHITOSANAZA TỪ CHỦNG PENICILLIUM OXALICUM CURRIE AND THOM VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ THU NHẬN CHITOSAN OLIGOSACCHARIT NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC VŨ THỊ ÁNH TUYẾT Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ THANH HÀ HÀ NỘI 2008 LỜI CAM ĐOAN Tác giả luận văn xin cam kết nội dung luận văn kết trình nghiên cứu, học hỏi trình học tập, tiếp thu kiến thức từ Cô giáo hướng dẫn TS Lê Thanh Hà Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Báck Khoa Hà Nội Tất số liệu phân tích thực nghiệm, bảng biểu đề tài kết q trình nghiên cứu, phân tích đánh giá thân tác giả tiếp thu q trình học tập, khơng phải sản phẩm chép Mọi nguồn tài liệu khác trích dẫn nguồn đầy đủ liệt kê phần Tài liệu tham khảo Trên cam kết ràng buộc trách nhiệm tác giả nội dung, ý tưởng đề xuất luận văn này MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Chitin 1.2 Chitosan 1.2.1 Cấu tạo 1.2.2 Tính chất 10 1.2.3 Ứng dụng 11 1.3 Chitosanaza 12 1.3.1 Nguồn thu 13 1.3.2 Đặc tính 14 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitosanaza 15 1.3.3.1 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chitosanaza 15 1.3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chitosanaza 16 1.3.3.3 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng 16 1.3.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất enzym chitosanaza 17 1.4 Chitosan oligosaccharit 21 1.4.1 Đặc tính 21 1.4.2 Phương pháp thu nhận COS 21 1.4.3 Ứng dụng 24 1.4.3.1 Trong y học 24 1.4.3.2 Trong ngành thực phẩm 25 1.4.3.3 Trong nông nghiệp 25 1.4.3.4 Trong xử lý nước thải 26 1.4.3.5 Trong sản xuất mỹ phẩm 26 1.4.3.6 Chitosan oligosaccharit chất dinh dưỡng 26 1.4.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitosan oligosaccharit 27 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP …………………………… 30 2.1 Vật liệu thiết bị ………………………………………………… 30 2.1.1 Vật liệu ……………………………………………………… 30 2.1.2 Thiết bị ……………………………………………………… 31 2.1.3 Môi trường ………………………………………………… 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu …………………………………………… 33 2.2.1 Phương pháp vi sinh ………………………………………… 33 2.2.2 Phương pháp hoá sinh ……………………………………… 34 2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzym chitosanaza 34 2.2.2.2 Xác định protein tổng số theo phương pháp Bradfort 36 2.2.2.3 Tách enzym phương pháp kết tủa muối (NH 4)2SO4 37 2.2.2.4 Phân đoạn enzym phương pháp lọc cut-off 38 2.2.2.5 Kiểm tra độ tinh enzym phương pháp điện di 38 2.2.2.6 Phương pháp thu nhận chitosan oligosaccharit 42 2.2.2.7 Phương pháp sắc ký mỏng 43 2.2.2.8 Phương pháp xác định độ nhớt, khối lượng phân tử trung bình 44 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………………… 46 3.1 Xác định đặc tính chủng 46 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitosanaza ………………………………………………………… 47 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nuôi cấy…………….… 47 3.2.2 Ảnh hưởng pH môi trường………………………….… 48 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon………………………… …… 49 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ………………………………… 50 3.3 Khảo sát thu nhận chitosanaza kết tủa muối (NH4)2SO 51 3.4 Kết tủa phân đoạn enzym chitosanaza muối amoni sulphat bão hoà 53 3.5 Phân đoạn dịch enzym chitosanaza phương pháp màng lọc cut-off 55 3.6 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân thu nhận chitosan oligosaccharit 57 3.6.1 Ảnh hưởng pH 57 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 59 3.6.3 Ảnh hưởng thời gian phản ứng 60 3.6.4 Ảnh hưởng tỷ lệ E/ chất 63 3.7 Thu nhận COS …………………………………………………… 64 3.7.1 Thực phản ứng thuỷ phân …………………………… 64 3.7.2 Lọc qua màng lọc 10kDa …………………………………… 64 3.7.3 Kết tủa dịch sản phẩm cồn nguyên chất ……………… 64 3.7.4 Thu nhận sản phẩm sấy chân không………………… 65 3.7.5 Sản phẩm…………………………………………………… 65 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………… 68 PHỤ LỤC ……………………………………………………………… 75 Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt CMC : Cacboxyl methyl cenllulose Da : Dalton GlcN : N-glucosamine GlcAc : N-acetyl glucosamine TLC : Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography) COS : Chitosan oligosaccharit SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate- poly-acrylamide gel electrophoresis MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ enzym bước làm thay đổi nâng cao chất lượng số q trình cơng nghệ chế biến thực phẩm, nông nghiệp, dược phẩm, y tế … Hàng năm, lượng enzym sản xuất giới đạt khoảng 300 nghìn với trị giá 500 triệu USD Enzym chitosanaza (EC 3.2.1.132) enzym ngoại bào thuỷ phân liên kết nội phân tử chitosan ứng dụng chủ yếu để tạo loại phân tử chitosan phân tử lượng thấp khác glucosamine, chitosan oligosaccharit… với đặc tính ưu việt chitosan Chitosan oligosaccharit có ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, dược phẩm, thực phẩm… Chitosan oligosaccharit giúp kích thích tiêu hố thức ăn, tăng tính thèm ăn vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả miễn dịch, ngăn cản phát triển tế bào ung thư, giảm cholesterol huyết tương, giúp giảm cân ngăn chặn bệnh người trưởng thành, ngăn ngừa bệnh gan nhờ tạo thành kháng thể nhanh gan lách, giảm huyết áp lượng đường máu, làm giảm chất béo máu, ức chế phát triển E.coli, phòng chống hữu hiệu bệnh đường tiêu hoá… Xuất phát từ tiềm ứng dụng to lớn chitosan oligosaccharit đặc biệt y học dược phẩm, em thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận, tinh xác định đặc tính enzym chitosanaza từ Penicillium oxalicum Currie and Thom ứng dụng để thu nhận chitosan oligosaccharit” Mục tiêu đề tài là: • Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzym • Qui trình tinh enzym chitosanaza • Xác định đặc tính enzym chitosanaza (nhiệt độ, pH,…) • Khảo sát ảnh hưởng điều kiện thuỷ phân (nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng…) đến khả thủy phân chitosan để thu nhận chitosan oligoscacharides PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Chitin Chitin polyme tự nhiên phổ biến thứ hai sau xenluloza Chitin polysaccarit tìm thấy động vật trùng lồi giáp xác biết có chứa lượng lớn chitin lớp vỏ cứng Thông thường vỏ tôm cua thu có chứa 30-40% protein, 30-50% canxi cacbonat canxi photphat 20-30% chitin Ngồi ra, chitin cịn thu từ tảo biển, động vật, thực vật bậc thấp biển thực vật bậc thấp cạn với lượng nhỏ [44, 49] Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo thành tế bào nấm, đóng vai trị cấu thành nên hình dạng tạo độ cứng cho tế bào nấm Chitin cấu tạo đơn vị N-axetyl-β-D-glucosamine nối với cầu nối β-1,4 glucozit [C 8H13O5]n, Mchitin = (203.09)n Hình 1.1 Cấu tạo phân tử Chitin Khối lượng phân tử chitin tự nhiên lớn triệu Dalton Trong tự nhiên, chúng không tồn dạng tinh khiết mà thường kết hợp với polysacarit khác, với protein với muối khống Chitin khơng tan nước, mơi trường kiềm, acid lỗng chất dung mơi hữu ether, rượu… lại hịa tan dung dịch đặc nóng muối thioxianat Liti (LiSCN) thioxianat canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo Chitin tương đối ổn định với chất oxy hóa khử, thuốc tím (KMnO4 ), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Ca(ClO)2 … lợi dụng tính chất người ta sử dụng chất oxy hóa để khử màu cho chitin [8] 1.2 Chitosan 1.2.1 Cấu tạo Chitosan dẫn xuất đề axetyl hố chitin, nhóm (–NH2) thay nhóm (-COCH3) vị trí C(2) Chitosan cấu tạo từ mắt xích D-glucozamine liên kết với liên kết β-(1-4)-glicozit, chitosan gọi poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ poly β-(1-4)-D- glucozamine (cấu trúc III) Công thức phân tử: [C 6H11O4N]n, M Chitosan = (161.07)n Chitosan có khối lượng phân tử khác ứng với nguồn chitin khác Khối lượng phân tử chitin tự nhiên lớn triệu Dalton sản phẩm chitosan thương mại có khối lượng phân tử từ 100.000 1.200.000 Dalton, phụ thuộc vào trình xử lý nhà sản xuất Hình 1.2 Cấu tạo phân tử chitosan Chitosan tìm thấy tự nhiên, tìm thấy thành tế bào nấm thuộc họ Zygomycetes, loài tảo biển có diệp lục Chlorella sp lớp vỏ lồi trùng Các chitosan tự nhiên