Cơ sở di truyền học tế bào và phân tử

Liên kết hóa học của các đại phân tử sinh học

Đặc điểm liên kết hóa học của các đại phân tử sinh học

Liên kết hóa học là lực hấp dẫn giữ các nguyên tử với nhau, tạo thành phân tử Trước đây, chỉ có liên kết cộng hóa trị được coi là quan trọng, nhưng hiện nay, các liên kết yếu cũng đóng vai trò thiết yếu trong cấu trúc phân tử sinh học, như trong hemoglobin Các liên kết hóa học được phân loại dựa trên lực liên kết; liên kết mạnh không dễ đứt gãy, trong khi liên kết yếu dễ bị phá vỡ nhưng có thể tồn tại lâu dài khi kết hợp theo trật tự nhất định Lực của liên kết hóa học tương quan với chiều dài của chúng, với liên kết mạnh giữ nguyên tử gần nhau hơn Hóa trị của nguyên tử xác định số liên kết cộng hóa trị tối đa mà nó có thể tạo ra, như oxy có hóa trị 2 Số liên kết Van der Waals linh hoạt hơn, phụ thuộc vào vị trí không gian của nguyên tử Liên kết hydro thường hạn chế hơn, với nguyên tử hydro tham gia vào một liên kết hydro duy nhất, trong khi oxy có thể tham gia vào nhiều liên kết hydro khác nhau Cuối cùng, góc liên kết giữa các liên kết cộng hóa trị thường ổn định hơn so với các liên kết yếu.

Khi nguyên tử cacbon tạo bốn liên kết cộng hóa trị đơn (CH4), mỗi liên kết hình thành một góc của khối tứ diện đều với góc liên kết khoảng 109 độ Ngược lại, góc giữa các liên kết yếu thường không ổn định Các liên kết cộng hóa trị đơn cho phép nguyên tử quay tự do, trong khi các liên kết cộng hóa trị kép (liên kết đôi hoặc ba) thì cứng nhắc Điều này khiến các nhóm cacbonyl (C=O) và imino (N=C) trong liên kết peptide phải nằm trên cùng một mặt phẳng tương đối Các liên kết yếu hơn, như liên kết ion, không bị hạn chế về định hướng tương đối giữa các nguyên tử.

1.1.1 Sự hình thành liên kết hóa học gắn liền với sự thay đổi về năng l−ợng

Sự hình thành liên kết hóa học tự phát giữa hai nguyên tử liên quan đến việc giải phóng năng lượng bên trong các nguyên tử ở dạng không liên kết, chuyển đổi chúng thành dạng năng lượng mới Độ mạnh của liên kết càng cao thì năng lượng giải phóng càng lớn.

“thoát” ra càng lớn Phản ứng hình thành liên kết giữa hai nguyên tử A và B có thể mô tả nh− sau:

Phản ứng hóa học được mô tả bởi phương trình A + B → AB + năng lượng, trong đó AB là phân tử liên kết Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với tần số va chạm giữa các nguyên tử Năng lượng thường được đo bằng calo, tương ứng với lượng năng lượng cần thiết để tăng nhiệt độ 1 gam nước lên 1 độ C Tuy nhiên, để phá vỡ các liên kết hóa học trong một mole phân tử, thường cần hàng nghìn calo, do đó, mức thay đổi năng lượng trong phản ứng hóa học thường được biểu diễn bằng kcal/mol Các nguyên tử không luôn duy trì trạng thái liên kết do sự tác động của nhiều lực, trong đó có nhiệt năng Va chạm giữa các nguyên tử hoặc phân tử chuyển động nhanh có thể làm đứt gãy các liên kết hóa học Khi nhiệt độ tăng, tốc độ chuyển động của phân tử cũng tăng, dẫn đến khả năng phá vỡ các liên kết cao hơn Do đó, khi nhiệt độ của hỗn hợp tăng, sự bền vững của các liên kết hóa học sẽ giảm.

AB + năng l−ợng → A + B (ph−ơng trình 1.2)

Năng lượng cần thiết để phá vỡ một liên kết hóa học bằng đúng lượng năng lượng được giải phóng khi liên kết đó hình thành Sự cân bằng này phản ánh định luật nhiệt động học thứ nhất, theo đó năng lượng không thể tự sinh ra hoặc mất đi.

1.1.2 Sự cân bằng giữa quá trình hình thành và phá vỡ liên kết hóa học

Sự hình thành và phá vỡ liên kết hóa học là kết quả của sự tương tác giữa các lực này Khi hệ thống kín đạt trạng thái cân bằng, số liên kết hình thành trong một đơn vị thời gian sẽ bằng số liên kết bị phá vỡ Tỉ lệ các nguyên tử ở trạng thái liên kết có thể được diễn đạt qua một công thức cụ thể.

Hằng số cân bằng Kcb được xác định theo công thức Kcb = [AB]/([A]x[B]), trong đó [AB], [A] và [B] là nồng độ của các chất tương ứng tính bằng mole/L Dù bắt đầu với A và B riêng biệt, phức hợp AB, hoặc cả ba chất trong hệ thống kín, cuối cùng nồng độ sẽ đạt được các giá trị tương quan theo Kcb.

1.1.3 Khái niệm về năng l−ợng tự do

Sự thay đổi năng lượng xảy ra khi một tỷ lệ nhất định các nguyên tử chuyển từ trạng thái liên kết sang trạng thái cân bằng, và trong sinh học, năng lượng tự do (G) là cách hiệu quả nhất để biểu diễn sự thay đổi này Mặc dù bài viết không đi sâu vào khái niệm năng lượng tự do, chúng ta hiểu rằng nó là dạng năng lượng có thể hoạt động Theo định luật thứ hai của nhiệt động học, năng lượng tự do sẽ giảm (∆G < 0) khi phản ứng hóa học diễn ra tự phát, và khi đạt đến trạng thái cân bằng, năng lượng tự do không thay đổi (∆G = 0) Do đó, trạng thái cân bằng của một hệ thống kín là trạng thái có mức thay đổi năng lượng tự do thấp nhất.

Năng lượng tự do mất đi khi đạt trạng thái cân bằng sẽ được chuyển hóa thành nhiệt năng hoặc làm tăng mức độ entropi, đại lượng đo mức độ hỗn loạn Mức độ hỗn loạn càng cao thì entropi càng lớn, dẫn đến xu hướng gia tăng các phản ứng tự phát, tức là năng lượng tự do giảm mà không nhất thiết làm tăng nhiệt độ Ví dụ, khi NaCl hòa tan trong nước, nhiệt lượng được hấp thụ, không được giải phóng ra ngoài Trong trường hợp này, năng lượng tự do giảm do sự gia tăng trạng thái hỗn loạn của các ion Na+ và Cl- khi chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hòa tan.

1.1.3.1 Hằng số Kcb có t−ơng quan theo hàm số mũ với chỉ số ∆G

Dựa vào lập luận nêu trên, có thể thấy rằng phản ứng sẽ có xu hướng xảy ra mạnh mẽ hơn khi các liên kết càng vững chắc và sự thay đổi mức năng lượng tự do càng lớn Điều này cho thấy số lượng nguyên tử tồn tại ở dạng liên kết cũng tăng lên Công thức dưới đây sẽ thể hiện mối quan hệ này một cách định lượng.

∆G = -RT ln Kcb hay Kcb = e - ∆ G/RT (ph−ơng trình 1.4) trong đó, R là hằng số khí phổ thông, T là nhiệt độ tuyệt đối, ln là hàm logarit cơ số e (của

Kcb), còn Kcb là hằng số cân bằng, e = 2,718

Khi sử dụng các giá trị thích hợp cho R (1,987 cal/deg.mol) và T (298 ở 25 o C), một mức chênh năng lượng tự do (∆G) khoảng 2 kcal/mol có thể đủ để thúc đẩy phản ứng hình thành liên kết, miễn là các thành phần phản ứng có mặt với số lượng mole phù hợp.

1.1.3.2 Các liên kết cộng hóa trị là các liên kết rất mạnh

Các giá trị ∆G của phản ứng hình thành liên kết cộng hóa trị từ các nguyên tử tự do thường lớn và âm, cho thấy quá trình này giải phóng năng lượng tự do.

Thông thường ∆G của các phản ứng này dao động trong khoảng từ -50 đến -110 kcal/mol

Hằng số K cb của một phản ứng có giá trị lớn tương quan với số liên kết được hình thành Chẳng hạn, với giá trị ∆G = -100 kcal/mol, nếu bắt đầu với 1 mol/L các nguyên tử phản ứng, chỉ có 1 trong 10^40 nguyên tử tồn tại ở trạng thái không liên kết khi hệ thống đạt đến trạng thái cân bằng.

Tầm quan trọng và đặc điểm của các liên kết yếu trong các hệ thống sinh học 3 1 Các liên kết yếu có năng l−ợng trong khoảng 1 – 7 kcal/mol

Các đại phân tử sinh học quan trọng nhất trong di truyền học và sinh học phân tử hiện nay là axit nucleic và protein, được tạo thành từ các liên kết cộng hóa trị giữa nucleotide và axit amin Những liên kết này mạnh mẽ và bền vững, không tự đứt gãy trong điều kiện nhiệt độ sinh lý tế bào Tuy nhiên, trong hệ thống sinh học còn tồn tại các liên kết yếu, có vai trò quan trọng trong sự sống, vì chúng có thể hình thành và đứt gãy trong điều kiện sinh lý bình thường Các liên kết yếu chủ yếu điều hòa tương tác giữa enzym và cơ chất, cũng như giữa các đại phân tử sinh học, đặc biệt là giữa protein và ADN Những liên kết yếu này ảnh hưởng đến cấu hình không gian và chức năng của các đại phân tử, do đó, mặc dù protein là các chuỗi polypeptide liên kết cộng hóa trị, chức năng của chúng lại phụ thuộc vào các liên kết yếu.

Bảng 1.1 Sự t−ơng quan giữa hằng số cân bằng K cb và ∆ ∆ ∆ ∆G ở 25 o C

Các liên kết yếu đóng vai trò quyết định trong việc xác định cấu hình không gian thực tế của protein khi thực hiện chức năng Tương tự, hai mạch của chuỗi xoắn kép ADN được giữ chặt với nhau nhờ các liên kết hydro, một loại liên kết yếu có vai trò đặc biệt trong cấu trúc ADN.

Các loại liên kết yếu, bao gồm liên kết Van der Waals, liên kết kị nước, liên kết hydro và liên kết ion, đóng vai trò quan trọng trong các hệ thống sinh học Đặc biệt, sự phân biệt giữa liên kết hydro và liên kết ion đôi khi có thể gặp khó khăn.

1.2.1 Các liên kết yếu có năng l−ợng trong khoảng 1 – 7 kcal/mol

Liên kết Van der Waals là loại liên kết yếu nhất, với năng lượng chỉ khoảng 1 - 2 kcal/mol, nhỉnh hơn một chút so với động năng của chuyển động nhiệt Trong khi đó, năng lượng của các liên kết hydro và ion dao động từ 3 - 7 kcal/mol.

Trong dung dịch, các phân tử thường tạo ra các liên kết yếu với các nguyên tử xung quanh Tất cả các phân tử đều có khả năng hình thành liên kết Van der Waals, trong khi các liên kết hydro và ion chỉ hình thành giữa các phân tử có điện tích hoặc khi điện tích phân bố không đều Do đó, nhiều phân tử trong dung dịch có thể đồng thời tạo ra nhiều loại liên kết yếu khác nhau Tuy nhiên, về mặt năng lượng, các phân tử có xu hướng ưu tiên hình thành các liên kết có năng lượng mạnh hơn.

1.2.2 Trong điều kiện sinh lý số liên kết yếu đ−ợc hình thành và phá vỡổn định

Năng lượng của các liên kết yếu chỉ lớn hơn khoảng 10 lần so với động năng chuyển động nhiệt ở 25 oC (~0,6 kcal/mol) Do động năng của nhiều phân tử đủ lớn để phá vỡ các liên kết yếu ngay khi chúng hình thành trong điều kiện nhiệt độ sinh lý của cơ thể, nên ở trạng thái cân bằng, số lượng liên kết yếu được hình thành và phá vỡ đạt sự ổn định.

1.2.3 Sự khác biệt giữa các phân tử phân cực và không phân cực

Sự phân cực của các điện tử trong các nguyên tử phụ thuộc vào bản chất của chúng, có thể là thường xuyên hoặc tạm thời Ví dụ, trong phân tử oxy (O:O), điện tích được phân bố đối xứng, khiến mỗi nguyên tử không mang điện tích Ngược lại, trong phân tử nước (H:O:H), điện tích không được phân bố đều do nguyên tử oxy hút các điện tử mạnh hơn, dẫn đến việc nguyên tử oxy mang điện âm, trong khi hai nguyên tử hydro chia sẻ điện tích dương Sự phân cực này tạo ra một momen lưỡng cực, phản ánh sự khác biệt trong ái lực của các nguyên tử đối với điện tử Các nguyên tử có khả năng hút điện tử mạnh được gọi là nguyên tử âm điện, trong khi các nguyên tử dễ dàng cho điện tử được gọi là nguyên tử dương điện.

Các phân tử có momen l−ỡng cực, như H2O, được gọi là phân tử phân cực, trong khi các phân tử không có momen l−ỡng cực rõ rệt, như methane (CH4), được xem là phân tử không phân cực Trong phân tử CH4, ái lực của các nguyên tử carbon và hydro với cặp điện tử là đồng đều, dẫn đến việc phân tử này không có tính phân cực.

1.2.4 Liên kết Van der Waals

Liên kết Van der Waals hình thành khi hai nguyên tử tiếp xúc gần nhau, tạo ra lực hấp dẫn không đặc hiệu Sự hấp dẫn này xuất phát từ dao động của các điện tử khi các phân tử di chuyển gần nhau.

Lực Van der Waals có thể xuất hiện giữa tất cả các loại phân tử, bao gồm cả phân cực và không phân cực Sự xuất hiện của chúng chủ yếu phụ thuộc vào khoảng cách giữa các nhóm tương tác, với năng lượng liên kết tỉ lệ nghịch theo lũy thừa 6 của khoảng cách.

Tuy vậy, khi các nguyên tử tiến gần đến nhau một mức nhất định thì lại xuất hiện lực đẩy Van der Waals

Lực đẩy giữa các nguyên tử xuất phát từ sự tương tác của lớp áo điện tử bao quanh chúng Lực đẩy và lực hấp dẫn Van der Waals giúp duy trì khoảng cách ổn định giữa hai nguyên tử, được gọi là bán kính Van der Waals Năng lượng liên kết Van der Waals giữa hai nguyên tử tương ứng với tổng bán kính Van der Waals của chúng và tăng lên khi kích thước của mỗi nguyên tử lớn hơn Đối với hai nguyên tử có kích thước trung bình, năng lượng liên kết này vào khoảng

1 kcal/mol chỉ lớn hơn một chút so với động năng nhiệt trung bình của các phân tử ở nhiệt độ phòng (0,6 kcal/mol), cho thấy rằng lực Van der Waals có ảnh hưởng đáng kể trong các tương tác phân tử.

Lực liên kết Van der Waals trở nên quan trọng ở nhiệt độ phòng khi các nguyên tử của một phân tử tương tác với nguyên tử của một phân tử khác Năng lượng liên kết này lớn hơn động năng nhiệt, giúp ngăn chặn sự phân tách Để tương tác mạnh qua liên kết Van der Waals, cấu hình không gian của các phân tử phải "ăn khớp" chặt chẽ, đảm bảo khoảng cách giữa các nguyên tử không vượt quá tổng bán kính Van der Waals Nếu khoảng cách này lớn hơn, lực liên kết sẽ nhanh chóng giảm Liên kết Van der Waals mạnh nhất khi một phần cấu trúc của một phân tử phù hợp với một nhóm hoặc vùng cấu trúc của phân tử khác, như trong tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể, nơi năng lượng liên kết có thể đạt từ 20 đến 30 kcal/mol, dẫn đến việc phức hợp kháng nguyên - kháng thể hiếm khi tách rời.

Waals th−ờng không chiếm −u thế trong sự liên kết giữa các phân tử phân cực Bởi vì các

Lùc hÊp dÉn Van der Waals mạnh

Lùc hÊp dÉn Van der Waals yÕu

Lùc hÊp dÉn Van der Waals trở nên cân bằng với lực đẩy do sự đè lên nhau của lớp áo điện tử

Hình 1.1 Lực Van der Waals thay đổi theo khoảng cách nguyên tử Các nguyên tử ở đây là khí trơ Argon (theo Pauling I., 1953, General Chemistry, p.322)

Bảng 1.2 Bán kính Van der Waals của một số nguyên tử phổ biến trong các phân tử sinh học

Nguyên tử Bán kính Van der Waals (Å)

Một nửa chiều dày phân tử chất thơm 1,7 Đinh Đoàn Long

6 phân tử này có xu hướng đạt được trạng thái năng lượng thấp nhất (mất ít năng lượng tự do nhất) khi hình thành các dạng liên kết khác

Liên kết hydro là liên kết đ−ợc hình thành giữa một nguyên tử hydro liên kết cộng hóa trị

Liên kết hydro xảy ra giữa một nguyên tử hydro và một nguyên tử khác mang điện tích âm hoặc dương, được gọi là nguyên tử nhận liên kết hydro Một ví dụ điển hình là sự hấp dẫn giữa nguyên tử hydro trong nhóm amino (-H2) và các nguyên tử oxy tích điện âm trong nhóm keto (-C=O) Trong sinh học, liên kết hydro giữa nguyên tử hydro và nguyên tử oxy (O-) đóng vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của các phân tử sinh học.

Tầm quan trọng và đặc điểm của các liên kết cao năng

Trong bài viết trước, chúng ta đã thảo luận về sự hình thành các liên kết yếu từ góc độ nhiệt động học Theo đó, các liên kết yếu thường xuất hiện khi ∆G < 0, cho thấy sự ổn định và khả năng hình thành của chúng trong các quá trình hóa học.

Xu hướng liên kết cộng hóa trị trong tế bào không hoàn toàn tuân theo nguyên lý nhiệt động học, đặc biệt trong các phản ứng kết nối phân tử nhỏ thành đại phân tử lớn Sự hình thành các liên kết này thường làm tăng mức năng lượng tự do, dẫn đến quan niệm rằng tế bào có khả năng đi ngược lại các nguyên lý nhiệt động học, từng được coi là "bí ẩn của sự sống".

Các quá trình sinh tổng hợp không vi phạm các nguyên lý nhiệt động học mà diễn ra dựa trên những phản ứng khác biệt.

Các axit nucleic, glycogen và protein không được hình thành từ sự kết tụ đơn giản của các thành phần cơ bản như nucleoside monophosphate, glucose hay axit amin Thay vào đó, chúng cần năng lượng từ ATP hoặc các hợp chất tương đương để chuyển hóa thành các tiền chất năng lượng cao Những tiền chất này, với sự hỗ trợ của enzym đặc hiệu, mới có thể tự phát kết hợp để tạo thành các đại phân tử Bài viết này sẽ xem xét sự hình thành các liên kết peptide trong protein và liên kết phosphodieste trong axit nucleic dựa trên nguyên lý nhiệt động học, đồng thời đề cập đến các đặc điểm cơ bản của liên kết cộng hóa trị.

1.3.1 Các phân tử cao năng th−ờng kém bền

Sự khác biệt về mức năng lượng tự do trong các phân tử là do các liên kết cộng hóa trị khác nhau Ví dụ, liên kết O-H mạnh hơn liên kết H-H và O-O, dẫn đến việc hình thành nước từ oxy và hydro trong hỗn hợp có nồng độ cao Một phân tử có năng lượng tự do lớn hơn khi các nguyên tử khác loại liên kết bằng các liên kết yếu Mặc dù điều này có vẻ nghịch lý, thực tế cho thấy các phân tử với liên kết mạnh giải phóng ít năng lượng tự do hơn Ngược lại, các phân tử dinh dưỡng như glucose có liên kết yếu, dễ bị oxy hóa thành nước và CO2, giải phóng năng lượng Trong khi đó, CO2 không thể làm nguồn dinh dưỡng cho động vật do liên kết mạnh giữa C và O Tuy nhiên, ở thực vật, CO2 có thể sử dụng làm nguồn cacbon nhờ năng lượng từ ánh sáng qua quá trình quang hợp, chuyển hóa thành ATP.

Khi không có chất xúc tác, các phản ứng hóa học chuyển đổi phân tử thành phân tử mới với năng lượng liên kết thấp hơn rất khó xảy ra ở nhiệt độ sinh lý bình thường Liên kết cộng hóa trị, dù yếu nhất, cũng đủ mạnh để không dễ bị phá vỡ bởi chuyển động nhiệt trong tế bào Nếu không có chất xúc tác, liên kết chỉ bị phá vỡ khi có đủ năng lượng cung cấp để đẩy các nguyên tử ra xa nhau Khi các nguyên tử được đẩy ra, chúng có khả năng liên kết với nguyên tử mới, tạo ra các liên kết mạnh hơn Năng lượng giải phóng trong quá trình tái kết hợp này tương đương với tổng năng lượng cần thiết để phá vỡ liên kết cũ và năng lượng chênh lệch giữa liên kết cũ và liên kết mới.

Năng lượng cần thiết để phá vỡ một liên kết cộng hóa trị được gọi là năng lượng hoạt hóa Năng lượng hoạt hóa thường thấp hơn năng lượng của liên kết gốc, do sự sắp xếp lại các phân tử không tạo ra các nguyên tử tự do hoàn toàn Khi hai phân tử tham gia phản ứng va chạm, chúng thường hình thành một phức hệ tạm thời ở trạng thái hoạt hóa Trong trạng thái này, sự tiếp xúc gần gũi giữa hai phân tử làm cho các liên kết khác trở nên kém ổn định, do đó năng lượng cần để phá vỡ liên kết thấp hơn so với khi liên kết tồn tại trong một phân tử ở trạng thái tự do.

Vì vậy, hầu hết các phản ứng cộng hóa trị trong tế bào đ−ợc mô tả bởi ph−ơng trình sau:

Sự biểu diễn tác dụng khối l−ợng của phản ứng nh− sau:

K cb = ([A – D] x [B – C]) / ([A – D] x [B – C]) (ph−ơng trình 1.6) trong đó [A – D], [B – C] là nồng độ các chất tham gia phản ứng tính theo mol/L, và giá trị K cb quan hệ với ∆G qua ph−ơng trình 1.4

Năng lượng hoạt hóa cần thiết để các liên kết cộng hóa trị thay đổi là rất cao, khoảng 20 - 30 kcal/mol, do đó trạng thái hoạt hóa không thể tự xuất hiện trong điều kiện nhiệt độ sinh lý Điều này tạo ra một "rào cản" ngăn cản sự thay đổi tự phát của các liên kết này trong tế bào.

Những rào cản này đóng vai trò thiết yếu trong sự tồn tại của sự sống, vì nếu không có chúng, các nguyên tử chỉ có thể tồn tại ở mức năng lượng thấp nhất, dẫn đến việc không có năng lượng dự trữ cho các hoạt động tiếp theo Hơn nữa, sự sống cũng không thể hình thành nếu thiếu cơ chế giảm năng lượng kích hoạt của các phản ứng một cách đặc hiệu Điều này là cần thiết để quá trình phát triển của tế bào diễn ra với tốc độ đủ nhanh và tránh được sự ảnh hưởng của các lực ngẫu nhiên như bức xạ.

UV hay ion hóa) có thể làm phá vỡ các liên kết hóa học

1.3.2 Enzym có vai trò làm giảm năng l−ợng hoạt hóa của các phản ứng

Các enzym là những yếu tố thiết yếu cho sự sống, đóng vai trò quan trọng trong việc tăng tốc độ các phản ứng hóa học cần thiết cho sự tồn tại của tế bào Chúng hoạt động bằng cách giảm năng lượng hoạt hóa, giúp các chuyển động nhiệt đủ để sắp xếp lại các phân tử.

Sự có mặt của enzym đặc thù loại bỏ "rào cản" ngăn cản các phản ứng xảy ra, cho phép chúng diễn ra ngay cả khi các phân tử có năng lượng tự do thấp nhất Enzym không ảnh hưởng đến trạng thái cân bằng của phản ứng, mà chỉ đơn giản là tăng tốc độ của chúng.

Nếu điều kiện nhiệt động học không thuận lợi cho sự hình thành của một phân tử, thì ngay cả khi có sự hiện diện của enzym, phân tử đó cũng sẽ không bao giờ được tích lũy.

Trong tế bào, hầu hết các phản ứng đều được xúc tác bởi các enzym đặc thù, do đó việc hiểu mức năng lượng tự do của các phân tử không đủ để đánh giá khả năng phản ứng của chúng.

Hình 1.3 Năng l−ợng hoạt hóa của phản ứng hóa học:

(A - B) + (C – D) → (A – D) + (C – B) Phản ứng này đi kèm với sự giảm đi của năng l−ợng tự do (∆G < 0) Đinh Đoàn Long

Tốc độ của các phản ứng sinh hóa rất quan trọng, vì khi tế bào có enzym, phản ứng mà enzym đó xúc tác sẽ diễn ra nhanh chóng và trở nên thiết yếu cho quá trình sống.

1.3.3 Năng l−ợng tự do trong các đại phân tử sinh học

Nguyên lý nhiệt động học cho thấy rằng mọi phản ứng hóa sinh đều diễn ra với sự giảm năng lượng tự do, đặc biệt rõ rệt trong các phản ứng dị hóa Trong quá trình này, các phân tử dinh dưỡng không bền vững được chuyển hóa thành các hợp chất bền vững hơn như CO2 và H2O, đồng thời giải phóng nhiệt Các phản ứng phân giải sinh học có hai đặc điểm chính: (1) tạo ra các chất hữu cơ nhỏ hơn, và (2) giữ lại một phần năng lượng tự do của chất dinh dưỡng ban đầu để phục vụ cho hoạt động sống Điều này được thực hiện thông qua việc kết hợp một số bước trong quá trình phân giải với việc hình thành các phân tử cao năng như ATP, nhằm tích lũy năng lượng tự do.

Các liên kết mạnh và yếu quy định cấu hình của các đại phân tử

ADN, ARN và protein là các đại phân tử sinh học được hình thành từ các đơn phân, trong đó ADN và ARN được cấu thành từ nucleotide, còn protein từ 20 loại axit amin cơ bản Chức năng sinh hóa và di truyền của các đại phân tử này phụ thuộc vào thành phần và trật tự của các đơn phân Các liên kết yếu đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu hình không gian và chức năng của chúng Cấu trúc bậc I của ADN, ARN và protein là trật tự của các đơn phân liên kết bằng liên kết cộng hóa trị, nhưng cấu hình đặc thù của chúng chủ yếu được quy định bởi sự hiện diện của nhiều liên kết yếu như liên kết hydro, ion, kị nước và lực Van der Waals.

Các lực Van der Waals đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc của protein và ADN, với ADN có dạng chuỗi xoắn kép Khi các liên kết yếu bị phá vỡ do nhiệt hoặc chất tẩy, hoạt tính sinh học của phân tử ADN vẫn bị ảnh hưởng dù các liên kết cộng hóa trị vẫn còn Phần này sẽ khám phá các lực quy định cấu hình không gian của ADN, ARN và protein, là cơ chế chính trong nhiều quá trình sinh học, đặc biệt là di truyền học, bao gồm sao chép, phiên mã, dịch mã, và điều hòa biểu hiện gen, cũng như sự thay đổi chức năng protein thông qua cơ chế "dị hình".

1.4.1 Cấu hình phân tử đ−ợc quy định bởi các liên kết trong và ngoài phân tử

1.4.1.1 Sự hình thành chuỗi xoắn kép đều đặn của phân tử ADN

Cấu trúc xoắn kép của ADN được hình thành bởi hai mạch polynucleotide song song ngược chiều, liên kết qua các liên kết hydro bổ sung Hai mạch ADN được giữ chặt nhờ các liên kết hydro giữa các cặp bazơ purine (adenine và guanine) và pyrimidine (thymine và cytosine) Sự tương hợp giữa các cặp bazơ nitơ và tính đối song song của ADN là kết quả của yêu cầu định hướng của các nhóm.

Trong môi trường nội bào, adenine (A) liên kết hydro với thymine (T), trong khi guanine (G) liên kết với cytosine (C) Bên cạnh đó, các nguyên tử trên bề mặt của phần đường và phosphate thường hình thành các liên kết yếu với các phân tử nước xung quanh.

Các cặp bazơ nitơ (base) purine-pyrimidine luôn ở phần trung tâm của phân tử ADN

Sự sắp xếp của các bazơ nitơ cho phép chúng xếp chồng lên nhau, tạo thành bề mặt phân tử phẳng và chia sẻ điện tử (π - π), đồng thời giảm thiểu tiếp xúc với phân tử nước Sự liên kết của các cặp bazơ nitơ trong chuỗi xoắn kép duy trì hình dạng xoắn đều đặn nhờ khoảng cách ổn định giữa mỗi cặp bazơ.

Phân tử ADN dạng xoắn kép có tính ổn định cao nhờ vào việc các purine và pyrimidine kị nước không tiếp xúc với nước, cùng với việc sắp xếp các liên kết yếu theo trật tự nhất định Trong dung dịch, chuyển động phân tử có thể làm đứt gãy các liên kết hydro ở hai đầu, nhưng hiếm khi ảnh hưởng đến các liên kết bên trong Khi liên kết hydro bị đứt, chúng thường hình thành trở lại, trừ khi gặp điều kiện như nhiệt độ cao Khi nhiệt độ tăng, các liên kết yếu trở nên kém bền và sự đứt gãy diễn ra nhanh hơn Khi số lượng liên kết đứt gãy đạt ngưỡng nhất định, phân tử ADN mất cấu hình và hoạt tính, cho thấy cần có tương tác mới để duy trì cấu hình sợi kép trong điều kiện nhiệt độ cao.

1.4.1.2 ARN có nhiều dạng cấu trúc khác nhau

ARN thường tồn tại dưới dạng mạch đơn, trái ngược với cấu trúc ADN sợi kép ổn định Một số loại ARN, như mARN, hoạt động như phân tử vận chuyển thông tin tạm thời và thường không có cấu hình bậc 3 ổn định do liên kết với các protein khác Tuy nhiên, một số phân tử ARN có thể gấp nếp thành cấu hình bậc 3 đặc thù nhờ vào các tương tác nội phân tử giữa các đoạn khác nhau, bao gồm sự tương tác giữa các bazơ nitơ theo mô hình Watson-Crick và các kiểu kết cặp bazơ đặc trưng cho ARN Điểm khác biệt của ARN so với ADN là gốc C2’-OH trong đường ribose, gốc này tham gia vào các tương tác giúp ổn định cấu trúc phân tử Các ion hóa trị 2 như Mg²⁺, Mn²⁺, và Ca²⁺ khi gắn vào ARN có thể tăng cường độ bền cho cấu trúc gấp nếp của nó, nhờ vào khả năng che chắn các điện tích âm và tạo điều kiện cho các miền của phân tử tiếp cận gần nhau.

Cấu hình bậc 3 của ARN, đặc biệt là tARN, có cấu trúc chặt chẽ và gấp nếp đặc trưng, cho thấy sự xếp chồng lên nhau của các bazơ nitơ đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu hình ổn định Trong một phân tử ARN có khoảng 76 bazơ nitơ, trung bình có 72 bazơ nitơ tương tác xếp chồng lên nhau, tương tự như cấu trúc ADN sợi kép Cấu trúc bền vững này không chỉ dựa vào các vùng xoắn kép mà còn có thể có các tương tác bậc 3 khác, giúp củng cố tính ổn định của phân tử ARN.

1.4.1.3 Thuộc tính của các axit amin - thành phần cấu tạo nên các protein

Khác với 8 loại nucleotide (bao gồm 4 loại deoxyribonucleotide và 4 loại ribonucleotide) trong cấu trúc ADN và ARN, protein được hình thành từ 20 loại axit amin phổ biến, tạo nên sự đa dạng cao Tất cả các axit amin đều có một nguyên tử cacbon trung tâm, là đặc điểm chung của chúng.

(Cα) liên kết với một nguyên tử H, một nhóm amino (-NH 3 + ) và một nhóm cacboxyl (-COO - )

Liên kết thứ t− của Cα trong axit amin gắn với chuỗi bên có cấu trúc đa dạng, được gọi là gốc R Gốc R của các axit amin khác nhau về kích thước, hình dạng, thành phần hóa học và đặc tính hóa lý Dựa vào các thuộc tính hóa lý này, các chuỗi bên (gốc R) có thể phân loại thành nhiều nhóm khác nhau.

R) của các axit amin đ−ợc chia làm 4 nhóm: nhóm trung tính không phân cực, nhóm trung tính phân cực, nhóm có tính axit và nhóm có tính bazơ (bảng 1.5) Các gốc R thuộc nhóm trung tính không phân cực gồm các chuỗi cacbon hoặc cấu trúc vòng thơm có tính kị n−ớc

Các gốc R trung tính phân cực như hydroxyl, sulfhydryl, amit và imidazole có khả năng tạo liên kết hydro mạnh Trong khi đó, các gốc R mang điện tích, bao gồm amin và cacboxylate bậc một hoặc hai, có khả năng tạo ra cả liên kết hydro và ion.

Tất cả các loại chuỗi bên R đều có thể tham gia các liên kết Van der Waals

Liên kết peptide giữa các axit amin trong phân tử protein được hình thành giữa nhóm -NH2 của axit amin này và nhóm -COOH của axit amin liền kề Đây là một liên kết đôi, cho phép hạn chế mức độ quay của các nguyên tử Trong khi đó, các liên kết đơn khác trong trục polypeptide cho phép các nguyên tử quay tự do, dẫn đến khả năng tạo ra nhiều dạng cấu hình khác nhau cho chuỗi polypeptide.

Trong protein, sự hạn chế khả năng quay quanh các liên kết peptide do tác động phối trí (steric interference) giữa các liên kết này dẫn đến cấu hình không gian của protein có tính ổn định và linh hoạt tương đối Điều này cho phép protein tương tác hiệu quả với các phân tử khác.

1.4.1.5 Bốn cấp cấu hình của protein

Cấu hình bậc một của phân tử protein là trình tự axit amin, trong khi các axit amin gần nhau tạo ra liên kết thứ cấp, hình thành cấu hình bậc hai Hai dạng cấu hình bậc hai phổ biến là xoắn α và mặt phẳng β.

Cấu trúc, đặc tính, chức năng của các đại phân tử

Các axit nucleic - ADN và ARN

2.1.1 Axit nucleic là vật chất mang thông tin di truyền

Ngày 25 tháng 4 năm 1953 đánh dấu một bước ngoặt trong quá trình phát triển của lĩnh vực di truyền học hiện đại khi James Watson (nhà Sinh học người Mỹ) và Francis Crick (nhà Vật lý người Anh) là đồng tác giả công bố bài báo “Mô hình cấu trúc phân tử của axit nucleic: một cấu trúc của axit deoxyribose nucleic” trên tạp chí

Trong bài báo, các tác giả nhấn mạnh rằng nguyên tắc kết cặp bổ sung của các bazơ nitơ có thể chỉ ra cơ chế sao chép vật chất di truyền Công bố của Watson và Crick được xem là bước ngoặt quan trọng trong lĩnh vực di truyền học phân tử, nghiên cứu cấu trúc, chức năng và cơ chế vận động của vật chất di truyền ở mức độ phân tử và dưới tế bào Tuy nhiên, trước khi Watson và Crick công bố mô hình ADN, đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để khám phá cấu trúc và chức năng của các đại phân tử sinh học này.

Nghiên cứu đầu tiên đáng chú ý là công trình của Friedrich Miescher vào năm 1871, khi ông phát hiện ra axit nucleic từ nhân của tinh trùng cá hồi, mà ông gọi là nuclein Miescher đã nhận định về khả năng di truyền của axit nucleic, và công trình của ông được công bố gần thời điểm với các nghiên cứu của Gregor Mendel (1866), người đã khám phá các quy luật di truyền.

Các "gen", hay còn gọi là "nhân tố di truyền", đã được khám phá thông qua các thí nghiệm lai tạo ở cây đậu Hà Lan Điều thú vị là hai nhà khoa học đã công bố các công trình nghiên cứu mà không hề biết về phát hiện của nhau.

Các phát hiện của Gregor Mendel và Friedrich Miescher đã mở ra một thời kỳ mới cho Di truyền học, tạo nền tảng cho việc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc, chức năng và cơ chế vận động của vật chất di truyền Những năm cuối thế kỷ XVIII được xem là giai đoạn khai sinh của Di truyền học hiện đại, với hai hướng nghiên cứu chính: Di truyền học truyền thống, khởi đầu từ công trình của Mendel, tập trung vào cơ chế vận động của vật chất di truyền qua phương pháp lai tạo và thống kê toán học; và Di truyền học phân tử, bắt đầu từ nghiên cứu của Miescher, chú trọng vào cấu trúc và chức năng của vật chất di truyền Hai hướng nghiên cứu này đã phát triển song song và hỗ trợ lẫn nhau, hình thành nên nền tảng cơ bản của Di truyền học hiện đại.

Vào đầu thế kỷ XIX, Kossel đã xác định thành phần cấu tạo của axit nucleic, bao gồm các bazơ nitơ adenine, guanine, cytosine và thymine hoặc uracil, cùng với một tiểu phân tử đường và nhóm phosphate Đến năm 1930, Levene và cộng sự phát hiện rằng phân tử đường trong nuclein là deoxyribose, đồng thời chứng minh sự tồn tại của hai dạng axit nucleic trong tế bào: axit ribonucleic (ARN) và axit deoxyribonucleic (ADN) Thập kỷ 1930 được coi là thời kỳ quan trọng cho nghiên cứu thành phần của axit nucleic, từ đó, cấu trúc và chức năng của các axit nucleic ngày càng được hiểu rõ hơn, khẳng định vai trò của chúng trong việc mang thông tin di truyền.

2.1.2 Bằng chứng về vai trò mang thông tin di truyền của axit nucleic

Có rất nhiều bằng chứng chứng tỏ axit nucleic là vật chất mang thông tin di truyền Tuy vậy, ở đây chúng ta chỉ nêu 3 dẫn chứng điển hình:

1) Axit nucleic hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 260 nm Bước sóng này cũng là bước sóng mà tia tử ngoại gây tần số đột biến cao nhất ở các tế bào

Trong khi đó, độ hấp thụ cực đại của protein là ở bước sóng 280 nm

2) Năm 1928, một y sỹ quân y ng−ời Anh là Frederick Griffith khi nghiên cứu ở vi khuẩn Streptococcus pneumoniae phát hiện thấy có 2 chủng khác nhau: chủng S có khuẩn lạc nhẵn (S = smooth) làm chết chuột khi đem tiêm vào chuột Trong khi đó chủng R khuẩn lạc nhăn (R = rough) lại không gây chết chuột Ông tiến hành làm thí nghiệm nh− sau: a) Khi tiêm vi khuẩn chủng R vào chuột thấy chuột không chết Khi tiêm vi khuẩn chủng S vào chuột thấy chuột chết Khi tiêm vi khuẩn chủng S đã bị bất hoạt bởi nhiệt thấy chuột không chết Điều này chứng tỏ chủng S gây chết, còn chủng R không gây chết, đồng thời chủng S bị bất hoạt bởi nhiệt cũng không gây chết b) Tuy vậy, khi tiêm hỗn hợp các vi khuẩn chủng R còn sống với các vi khuẩn chủng S đã bị bất hoạt bởi nhiệt vào chuột thì chuột chết và từ chúng Griffith phân lập đ−ợc chủng vi khuẩn S sống Rõ ràng, đã có một tác nhân nào đó đ−ợc truyền từ vi khuẩn S bị bất hoạt vào vi khuẩn R để hình thành nên vi khuẩn S có tác dụng gây chết Quá trình này sau đó đ−ợc gọi là quá trình biến nạp

Sau thí nghiệm của Griffith, Alloway đã chứng minh rằng dịch chiết thô từ chủng vi khuẩn S, sau khi loại bỏ thành tế bào bằng phương pháp lọc, có khả năng thâm nhập vào tế bào chủng R Đến năm 1944, Avery, MacLeod và các cộng sự tiếp tục nghiên cứu và phát triển những phát hiện quan trọng này.

McCartey đã chứng minh đ−ợc nhân tố biến nạp trong thí nghiệm của Griffith chính là ADN

3) Năm 1957, Corat và Singer đã công bố thí nghiệm “lắp ráp” virut đốm thuốc lá là virut không chứa ADN, mà chỉ có ARN và vỏ protein Chúng có hai dạng A và B

ADN, và ở một số virut là ARN Đinh Đoàn Long

2.1.3 Thành phần cấu tạo của các axit nucleic

ADN và ARN đều là các polymer dài được cấu thành từ nhiều đơn phân Đơn phân của ADN được gọi là deoxyribonucleotide, trong khi đơn phân của ARN là ribonucleotide.

Mỗi nucleotide bao gồm ba thành phần chính: bazơ nitơ (adenine, guanine, thymine, cytosine, uracil), đường pentose và nhóm phosphate Các nguyên tử cacbon trên đường pentose được đánh số từ C-1’ đến C-5’ Nhóm phosphate ở vị trí C-5’ rất quan trọng cho cấu trúc và chức năng của ADN và ARN, giúp các phân tử này mang điện tích âm và có tính axit Trong điều kiện in vivo, nếu không có sự trung hòa điện tích, axit nucleic không thể đóng gói vào nhiễm sắc thể Sự trung hòa này xảy ra nhờ các protein kiềm có mặt trong cả sinh vật prokaryote và eukaryote; ở eukaryote, đó là protein histon, trong khi ở prokaryote là polyamin.

ADN được cấu tạo từ các đơn phân gọi là deoxyribonucleotide, bao gồm bốn loại khác nhau dựa trên loại bazơ nitơ: adenine (A), guanine (G), thymine (T) và cytosine (C) Mặc dù các deoxyribonucleotide này khác nhau về bazơ nitơ, nhưng chúng đều có cấu trúc đường pentose và nhóm phosphate giống nhau Tên của các bazơ nitơ thường được sử dụng để chỉ loại deoxyribonucleotide tương ứng.

Hình 2.2 Cấu trúc bazơ nitơ của các nucleotide

Protein

2.2.1 Protein là nhóm hợp chất quyết định phần lớn hoạt động sinh lý tế bào

Các phân tử ADN trong mọi tế bào chứa nhiều loại thông tin quan trọng, bao gồm các trình tự điều khiển, tín hiệu khởi đầu và kết thúc phiên mã, cũng như các đoạn trình tự có chức năng tăng cường hoặc kìm hãm phiên mã Ngoài ra, chúng còn mã hóa cho các loại ARN và protein cần thiết cho sự sống.

Phần lớn thông tin trong ADN chủ yếu để tổng hợp các phân tử protein Quá trình biểu hiện thông tin di truyền trong tế bào có thể được tóm tắt như sau: các gen mã hóa thông tin cần thiết để xác định cấu trúc protein; cấu trúc protein quyết định hoạt tính sinh học của chúng; và hoạt tính sinh học này ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của tế bào và cơ thể.

Mọi sự thay đổi trong cấu trúc ADN, như đột biến, đều ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý của tế bào thông qua sự biến đổi cấu trúc protein Sự thay đổi này dẫn đến sự thay đổi về hoạt tính của protein, từ đó tác động đến chức năng của tế bào và toàn bộ cơ thể Do đó, kiểu gen của tế bào, là cách lưu trữ thông tin di truyền, sẽ xác định kiểu hình của tế bào, tức là sự biểu hiện của kiểu gen thông qua protein.

2.2.2.1 Các đặc điểm cấu trúc cơ bản

Protein là nhóm phân tử sinh học quan trọng, thúc đẩy hầu hết các phản ứng hóa sinh trong tế bào và cơ thể Chúng không chỉ tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen mà còn xác định nhiều đặc tính cấu trúc của tế bào, mô và cơ quan, bao gồm cả virus, loại không có cấu trúc tế bào điển hình Trước khi khám phá các chức năng của protein, cần xem xét các đặc điểm cấu trúc cơ bản của loại đại phân tử này.

Một phân tử protein thường bao gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptide, trong đó mỗi chuỗi là dãy các axit amin liên kết qua liên kết peptit, một loại liên kết cộng hóa trị giữa nhóm carboxyl của axit amin này với nhóm amino của axit amin kế tiếp Cấu trúc này tạo ra tính phân cực cho chuỗi polypeptide, với đầu N là nhóm amino tự do và đầu C là nhóm carboxyl tự do Trong quá trình tổng hợp chuỗi polypeptide, các axit amin mới được bổ sung vào đầu carboxyl tự do, và thứ tự các axit amin được đánh số từ chiều N → C, tương ứng với chiều 5’ → 3’ của mạch mã hóa.

Trong tự nhiên, có 20 loại axit amin phổ biến cấu thành mọi protein ở các sinh vật khác nhau Thành phần và trình tự axit amin trong chuỗi polypeptide quyết định cấu trúc, chức năng và hoạt tính của protein Mỗi chuỗi polypeptide bao gồm từ hàng chục đến hàng nghìn axit amin, với số lượng và trật tự hoàn toàn ngẫu nhiên, dẫn đến sự đa dạng lớn của các loại protein trong tự nhiên.

Cấu tạo phân tử của 20 loại axit amin đều có một nguyên tử cacbon α, liên kết với nhóm -COOH, nhóm -NH2 và chuỗi bên gọi là gốc R, phân biệt các axit amin Gốc R có thể đơn giản như nguyên tử -H (Gly) hoặc -CH3 (Ala), đến phức tạp như cấu trúc vòng của Tyr hay Trp, quyết định đặc tính lý hóa của axit amin Dựa trên đặc tính này, 20 loại axit amin được chia thành 4 nhóm chính: 1) axit amin có tính axit (Asp và Glu), 2) axit amin có tính kiềm (Lys, Arg, His), 3) axit amin trung tính phân cực (Tyr, Ser).

Trong số các axit amin, Thr, Asn, Gln và Cys được mã hóa bởi 18 bộ ba, trong khi các axit amin trung tính không phân cực bao gồm 9 loại: Trp, Phe, Gly, Ala, Val, Ile, Leu và Met.

Glycine, với gốc R là nguyên tử -H, được phân loại riêng trong một số hệ thống do tính chất phân cực không rõ ràng Chức năng và hoạt tính của protein không chỉ phụ thuộc vào thành phần và trật tự của các axit amin trong chuỗi polypeptide, mà còn bị ảnh hưởng bởi loại axit amin có mặt tại các trung tâm hoạt động của protein.

Một xu hướng phổ biến trong tiến hóa là các đột biến thay thế axit amin trong cùng nhóm ít ảnh hưởng đến chức năng và hoạt tính của protein hơn so với các thay thế thuộc nhóm khác Phần lớn các protein thường có tính kiềm yếu, dẫn đến việc ADN thường xuyên kết hợp với các protein khác trong tế bào Điều này rất quan trọng cho việc biểu hiện chức năng của ADN và hoạt động của các protein trong quá trình biểu hiện gen.

Sau quá trình dịch mã, hầu hết các chuỗi polypeptide sẽ tiếp tục cuộn gập để hình thành các cấu trúc không gian bậc cao, đặc trưng cho từng loại protein Hình thức và mức độ gấp nếp, cuộn xoắn của các chuỗi này phụ thuộc vào thành phần và trình tự của các axit amin trong polypeptide.

Quá trình cuộn gập protein trong tế bào cần sự hỗ trợ từ các protein chaperon đặc biệt Cấu trúc không gian của protein quyết định chức năng và hoạt tính của chúng Trong môi trường nước, các chuỗi polypeptide thường cuộn gập sao cho các axit amin ưa nước hướng ra ngoài, trong khi các axit amin kị nước nằm ở bên trong Các vị trí hoạt động của enzym thường chứa các axit amin như Ser, His và các axit amin có tính kiềm hoặc axit.

Trong số các axit amin không phân cực, Met và Cys nổi bật với sự hiện diện của lưu huỳnh (S) Khi bắt đầu tổng hợp một chuỗi polypeptide, axit amin đầu tiên được lắp ráp luôn là Met.

Mã mở đầu Met (AUG) đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein, với axit amin Cys giữ vị trí then chốt trong việc xác định cấu hình không gian của protein nhờ khả năng hình thành liên kết disulfide Nhóm –SH của Cys là một gốc hóa học phản ứng mạnh, thường xuất hiện tại các trung tâm hoạt động của enzym và gắn kết các nhóm chức khác vào protein Ở cấp độ cấu trúc bậc hai, chuỗi polypeptide có hai dạng chính: cấu trúc xoắn α, giống như lò xo, được hình thành bởi liên kết hydro giữa nhóm (-NH) và nhóm (-CO) của các axit amin cách nhau khoảng bốn đơn vị, và cấu trúc mặt phẳng β, tương tự như dải “ruy băng” chạy song song, hình thành từ các liên kết giữa các axit amin có khoảng cách xa hơn Cấu trúc không gian của protein cũng được xác định bởi liên kết cộng hóa trị giữa các nguyên tử lưu huỳnh trong các cặp axit amin Cys từ các phần khác nhau của chuỗi polypeptide.

Hầu hết các protein được cấu tạo từ hai hoặc nhiều chuỗi polypeptide Ví dụ, hemoglobin, một loại protein chịu trách nhiệm vận chuyển oxy trong máu, bao gồm bốn chuỗi polypeptide, trong đó có hai cặp chuỗi khác nhau được gọi là hai chuỗi α và hai chuỗi β Lưu ý rằng ký hiệu α và β trong hemoglobin không liên quan đến cấu trúc xoắn α và mặt phẳng β trong protein.

2.2.2.2 Nucleoprotein, lipoprotein và glycoprotein là các protein phức hợp

Sao chép ADN sợi kép

3.1.1 Sao chép ADN là sự khởi đầu quá trình sinh sản

Các tế bào trong cơ thể đa bào duy trì sự sống thông qua sinh sản, là cơ chế đảm bảo sự ổn định của vật chất di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Trong quá trình này, vật chất di truyền cần được sao chép chính xác, giúp truyền tải thông tin di truyền thiết yếu từ tế bào bố và mẹ đến tế bào con gần như nguyên vẹn Ở tế bào eukaryote, phần lớn thông tin di truyền được lưu trữ trong ADN của hệ gen nhân, trong khi một phần nhỏ được lưu giữ trong các cơ quan tử trong tế bào chất như ti thể và lạp thể.

Cơ thể con người, giống như các sinh vật đa bào khác, bắt đầu từ một tế bào hợp tử nhỏ bé có đường kính khoảng 10nm Trong quá trình phát triển phôi, hợp

Tốc độ sao chép ADN ở eukaryote dao động từ 60 đến 90 nucleotide/giây, trong khi ở prokaryote, tốc độ này lên tới khoảng 850 nucleotide/giây Mặc dù bộ máy sao chép hoạt động với tốc độ cao, điều quan trọng hơn là thông tin di truyền cần được sao chép chính xác từ tế bào mẹ sang tế bào con Thực tế cho thấy độ chính xác trong sao chép vật chất di truyền rất cao, với tần số sao chép sai lệch ở E coli chỉ khoảng 1/10^9 nucleotide Do đó, phần lớn các gen của hai tế bào có cùng nguồn gốc sau nguyên phân hầu như giống nhau hoàn toàn, trừ những sai khác có thể xảy ra do đột biến hoặc lỗi trong bộ máy sửa chữa ADN.

Các phân tử ADN sợi kép có khả năng sao chép và truyền cho thế hệ con một cách chính xác nhờ vào cơ chế tự sao chép Quá trình này diễn ra thông qua việc tách đôi hai sợi ADN, sau đó mỗi sợi sẽ đóng vai trò là khuôn mẫu để tổng hợp các nucleotide mới, tạo ra hai phân tử ADN mới giống hệt nhau Điều này đảm bảo rằng thông tin di truyền được duy trì và truyền đạt một cách chính xác từ thế hệ này sang thế hệ khác.

Mô hình sao chép ADN sợi kép đầu tiên đ−ợc chính Watson và Crick đề xuất năm

Năm 1953, Watson và Crick đã mô tả mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN, mặc dù hiểu biết về quá trình sao chép ADN lúc đó còn rất hạn chế Mô hình của họ cho thấy cơ chế sao chép bán bảo toàn, trong đó mỗi mạch polynucleotide của ADN sợi kép gốc được sử dụng làm khuôn để tổng hợp một phân tử ADN mới Kết quả là mỗi ADN con mang một mạch cũ và một mạch mới Phải đến 5 năm sau, mô hình này mới được Meselson và Stahl chứng minh bằng thực nghiệm Các nghiên cứu sau đó chỉ ra rằng quá trình tổng hợp các mạch đơn của ADN diễn ra theo hai phương thức khác nhau: một mạch được tổng hợp liên tục (mạch dẫn đầu) và một mạch được tổng hợp gián đoạn qua các đoạn Okazaki (mạch theo sau) Quá trình sao chép ADN được chia thành ba giai đoạn: khởi đầu sao chép, kéo dài chuỗi và kết thúc.

Thí nghiệm của Meselson và Stahl (1958) đã kiểm tra ba kiểu sao chép ADN Kiểu sao chép bảo toàn (B) bị loại bỏ vì không tạo ra 50% chuỗi nặng (HH) và 50% chuỗi nhẹ (LL) ở thế hệ 1 Kiểu sao chép phân tán (C) cũng không phù hợp vì không thu được băng gradient hỗn hợp duy nhất ở thế hệ 2 Kết quả thí nghiệm xác nhận mô hình sao chép bán bảo toàn của Watson và Crick (1953), trong đó H là chuỗi ADN nặng được hình thành từ nucleotide chứa 15N, còn L là chuỗi ADN nhẹ được tổng hợp từ nucleotide chứa 14N.

LH HL LL LL LH

Phân tử ADN khuôn Sản phẩm sao chép ADN thế hệ 1

Sản phẩm sao chép ADN thế hệ 2

Kết quả ly tâm gradient mong đợi

Kết quả ly tâm gradient mong đợi

Kết quả ly tâm gradient mong đợi

A) KiÓu sao chÐp bán bảo toàn

B) KiÓu sao chÐp bảo toàn

C) KiÓu sao chÐp phân tán

Hỗn hợp trùng hợp chuỗi là một mô hình sao chép phân tử ADN sợi kép phổ biến ở hầu hết các loài sinh vật, bao gồm cả prokaryote và eukaryote Bên cạnh đó, chương này cũng sẽ khám phá một số mô hình sao chép vật chất di truyền ở các loại virus có vật chất di truyền không phải là ADN sợi kép.

3.1.2 Mô hình sao chép ADN sợi kép

Quá trình sao chép ADN ở prokaryote, đặc biệt là E coli, đã được hiểu biết đầy đủ hơn so với eukaryote, nơi mà sự phức tạp về kích thước và cấu trúc hệ gen vẫn còn nhiều khía cạnh chưa được làm rõ Mặc dù vậy, các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng quá trình sao chép ADN ở cả prokaryote và eukaryote có nhiều điểm tương đồng, đặc biệt là về nguyên tắc hóa sinh và sinh học phân tử Bài viết này sẽ tập trung vào mô hình sao chép ADN ở E coli và phân tích những đặc điểm đặc thù trong quá trình sao chép ADN ở eukaryote.

3.1.2.1 Các thành phần tham gia sao chép ADN ở E coli

Quá trình sao chép ADN sợi kép ở E coli diễn ra với sự tham gia của nhiều thành phần thiết yếu, bao gồm các yếu tố cơ bản như enzyme, nucleotides và các protein hỗ trợ.

1) ADN khuôn (template DNA): đó là trình tự các nucleotide thuộc phân tử ADN gốc đ−ợc sử dụng làm nguồn thông tin để tiến hành sao chép (tổng hợp) nên các phân tử ADN con dựa trên nguyên tắc liên kết bổ sung (liên kết Chargaff) giữa các nucleotide

2) Điểm khởi đầu sao chép (origin): đây là một trình tự nucleotide đặc hiệu trên mạch ADN khuôn đ−ợc phức hệ khởi đầu sao chép nhận ra, gắn vào và bắt đầu sao chÐp

Mạch dẫn đầu (leading strand) Mạch theo sau (lagging strand) Các đoạn Okazaki

Sự khởi đầu sao chép phân tử ADN sợi kép diễn ra khi phân tử ADN được giãn xoắn tại vị trí khởi đầu nhờ vào enzyme helicase (DnaB + Rep) Trong quá trình này, tiểu phần Rep gắn vào mạch khuôn để tổng hợp mạch dẫn đầu một cách liên tục, trong khi DnaB (helicase II) kết nối với mạch khuôn để tổng hợp mạch theo sau, dẫn đến việc hình thành các đoạn Okazaki Để ngăn cản hai mạch khuôn kết nối trở lại, protein SSB sẽ liên kết với chúng.

3) Các loại protein tham gia sao chép ADN:

Các protein DnaA, DnaB, DnaC, Rep, IHF và FIS là những protein quan trọng giúp nhận diện điểm khởi đầu của quá trình sao chép ADN Chúng có vai trò tách và giãn xoắn hai mạch đơn của phân tử ADN sợi kép sau khi chúng đã tách rời nhau trong giai đoạn khởi đầu sao chép.

Protein bám mạch đơn SSB (single strand binding protein) có vai trò quan trọng trong quá trình sao chép DNA bằng cách ngăn cản hai mạch đơn sau khi giãn xoắn không liên kết trở lại với nhau Sự hiện diện của SSB đảm bảo rằng quá trình sao chép diễn ra một cách suôn sẻ và hiệu quả.

4) Các nucleotide: đó là các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và dạng ribonucleotide triphosphate của các bazơ nitơ adenine, guanine, cytosine và uracil (NTP) Các phân tử này vừa đóng vai trò là các đơn vị cấu trúc nên ADN, vừa là nguồn cung cấp năng l−ợng cho quá trình sao chép (ví dụ: ATP, GTP, …)

Sao chép các loại axit nucleic khác

Mô hình sao chép ADN sợi kép là cơ chế chính trong quá trình nhân bản vật chất di truyền của các sinh vật có cấu trúc tế bào hoàn chỉnh, bao gồm cả prokaryote và eukaryote Tuy nhiên, cũng tồn tại những dạng sống không phải là tế bào hoàn chỉnh, đó là virus, với vật liệu di truyền và cơ chế sao chép đặc biệt riêng.

Có bốn loại axit nucleic được sử dụng làm vật liệu di truyền ở các dạng virus không có bản chất là ADN sợi kép: (1) ADN mạch đơn, (2) ADN sợi kép, (3) ARN mạch đơn, và (4) ARN dạng sợi kép hoặc nhiều sợi Những phân tử axit nucleic này có thể có cấu trúc dạng mạch thẳng (hở hai đầu) hoặc dạng vòng (khép kín) Tuy nhiên, mỗi loại virus chỉ sử dụng một dạng axit nucleic đặc thù làm vật chất mang thông tin di truyền.

Các loại virus có cấu trúc vật chất di truyền khác biệt, dẫn đến cơ chế sao chép riêng biệt so với mô hình sao chép ADN sợi kép thông thường Điểm chung của hệ gen virus là kích thước nhỏ, từ một gen duy nhất như virus thuốc lá STRV cho đến vài trăm gen, chẳng hạn như virus gây bệnh đậu mùa với 240 gen.

Tất cả các virus đều có đặc tính ký sinh bắt buộc, phụ thuộc vào tế bào chủ để sống, hoạt động và sinh sản Điều này xảy ra do virus thường thiếu các enzym và hệ thống chuyển hóa năng lượng, khiến chúng không thể sinh sản hoặc trao đổi chất độc lập, cũng như không tự sản xuất được các hợp chất cao năng như ATP, NAD+ hay các protein thiết yếu.

Virus có khả năng lây nhiễm tất cả các dạng tế bào sống, bao gồm vi khuẩn, thực vật và động vật Tuy nhiên, mỗi loại virus thường chỉ tấn công một hoặc một số loại cơ thể chủ nhất định Đặc biệt, một số virus như HIV chỉ có thể lây nhiễm vào những tế bào đặc trưng, chẳng hạn như tế bào lympho CD4+ trong máu.

Một câu hỏi quan trọng là: Các virus có vật chất di truyền không phải ADN sợi kép sao chép hệ gen của chúng như thế nào để duy trì sự sinh sản và tồn tại?

Trong phần tiếp theo, chúng ta sẽ khám phá cách thức sao chép vật chất di truyền của một số loại virus, trong đó vật liệu di truyền của chúng là các dạng axit nucleic đã được đề cập.

+ Phagơ ΦΦΦX174: hệ gen là một phân tử ADN mạch đơn, vòng kín Φ

+ Virut khảm thuốc lá (TMV): hệ gen là một phân tử ARN sợi đơn, mạch thẳng

Virus HIV gây suy giảm miễn dịch ở người, có cấu trúc gen là một phân tử ARN sợi đơn, mạch thẳng với hai bản sao Nó chứa trình tự mã hóa cho enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) đặc biệt.

+ Phagơ λλλ: hệ gen là phân tử ADN sợi kép, mạch thẳng λ

Trong quá trình sinh sản, các virus phải trải qua nhiều bước đặc biệt, bao gồm việc sao chép vật chất di truyền của chúng Các bước chính trong quá trình sinh sản của virus bao gồm:

1 Virut đính kết vào thành tế bào chủ

2 Toàn bộ virut xâm nhập vào cơ thể chủ (một số dạng virut ở eukaryote), hoặc vật liệu di truyền (axit nucleic) của virut đ−ợc “tiêm” vào tế bào chủ Đinh Đoàn Long

3 Virut làm thay đổi bộ máy sinh hóa của tế bào chủ làm cho bộ máy này phù hợp với hoạt động sao chép vật chất di truyền của virut

4 Quá trình sao chép axit nucleic của virut diễn ra trong tế bào chủ

5 Quá trình tổng hợp các protein thiết yếu của virut (ví dụ nh− các protein vỏ virut) diễn ra trong tế bào chủ

6 Quá trình đóng gói các thành phần virut (vật chất di truyền và các protein vỏ) để hình thành các hạt virut hoàn chỉnh

7 Virut thế hệ con giải phóng khỏi tế bào chủ

Hệ gen của phagơ ΦX174 bao gồm một phân tử ADN sợi đơn, mạch vòng với 5386 nucleotide, mã hóa cho 11 protein Quá trình sao chép hệ gen này phụ thuộc vào bộ máy sao chép của vi khuẩn E coli.

Khi lây nhiễm tế bào E coli, ΦX174 “tiêm” ADN của nó vào trong tế bào chủ Để phân biệt, phân tử ADN mạch đơn này đ−ợc đánh dấu (+)

Mạch ADN(+) này mã hoá cho các protein cần thiết của virut

Gen A * trong hệ gen của virut

(hình 3.6) mã hoá cho protein có vai trò ức chế sự sao chép

ADN của tế bào chủ bị cắt rời trong vòng 20 - 30 phút sau khi lây nhiễm, nhờ hoạt động của protein do gen A mã hóa, nhằm giải phóng các enzym sao chép cần thiết cho quá trình sao chép hệ gen của virus Để sao chép mạch ADN(+) trong khi mạch bổ sung ADN(-) không mang thông tin di truyền của virus, quá trình sao chép vật chất di truyền của ΦX174 trải qua ba giai đoạn.

1 Phiên mã thông tin di truyền trên mạch ADN(+) của virut (còn ký hiệu là SS single strand) thành dạng phân tử ADN sợi kép dạng sao chép (ký hiệu là RF replicative form) mang một mạch ADN(+) và một mạch bổ sung là ADN(-) (nh− vậy, giai đoạn 1 có thể viết tắt là SS → RF)

2 Sao chép phân tử ADN sợi kép ở dạng RF nhiều lần để tăng lên về số l−ợng, theo nguyên tắc sao chép vòng lăn Kết quả là từ một phân tử RF mẹ thu đ−ợc nhiều phân tử RF con (giai đoạn 2 = một RF mẹ → nhiều RF con)

Gen biểu hiện thông qua sự phiên mã và dịch mã

Cấu trúc và chức năng của cơ thể phụ thuộc vào protein có trong mô và tế bào Một phân tử protein có thể bao gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptide, với trình tự axit amin trong chuỗi được xác định bởi trình tự nucleotide trong gen.

Khi tế bào cần một loại protein, thông tin di truyền từ gen được dịch mã thành trình tự axit amin trong phân tử protein tương ứng Quá trình này đảm bảo sự truyền đạt thông tin di truyền một cách chính xác và hiệu quả.

(còn gọi là sự biểu hiện của gen) đ−ợc thực hiện qua hai giai đoạn là “phiên mã” và “dịch mã”

Phiên mã là quá trình tổng hợp ARN mạch đơn từ gen, trong khi dịch mã là quá trình tổng hợp protein từ ARN Khác với sao chép ADN chỉ diễn ra một lần trong mỗi chu trình tế bào, phiên mã và dịch mã diễn ra liên tục, mặc dù có giảm ở pha M Năm 1956, Crick đã giới thiệu "nguyên lý trung tâm", mô tả quá trình biểu hiện gen từ ADN sang ARN và cuối cùng là protein.

Trong quá trình phiên mã, ARN được tổng hợp từ mạch khuôn ADN, với mỗi gen thường chỉ được phiên mã từ một mạch của phân tử ADN sợi kép Tuy nhiên, các gen khác nhau có thể được phiên mã từ cả hai mạch của ADN Không phải tất cả các gen trong hệ gen đều mã hóa protein, và không phải mọi bản phiên mã ARN đều được dịch mã Có bốn loại ARN chính, mỗi loại được mã hóa bởi một nhóm gen khác nhau.

1) mARN (ARN thông tin) mã hóa cho trình tự axit amin của chuỗi polypeptide Các mARN chính là bản phiên mã của các gen mã hóa protein, còn gọi là gen cÊu tróc

2) rARN (ARN ribosome) kết hợp với các protein ribosome để tạo nên các ribosome hoàn chỉnh Ribosome chính là “bộ máy dịch mã” trình tự mARN thành protein

ARN có thể được phiên mã từ bất kỳ mạch nào của ADN sợi kép Đối với hầu hết các sinh vật, mỗi gen chỉ được phiên mã từ một mạch ADN, tuy nhiên, các gen khác nhau có thể được phiên mã từ một trong hai mạch ADN Mạch (+) theo quy định.

−ớc là mạch có trình tự giống với mARN mã hóa protein đặc tr−ng của vật chủ (ví dụ: protein vỏ virut), mạch còn lại là (-).

Các gen A và C đ−ợc phiên mã từ mạch (+), trong khi …

… gen B đ−ợc phiên mã từ mạch (-)

Phiên mã (sự tổng hợp ARN)

3) tARN (ARN vận chuyển) làm nhiệm vụ vận chuyển các axit amin tới ribosome trong dịch mã; đóng vai trò như “người phiên dịch” để chuyển “ngôn ngữ” của các nucleotide trên ARN thành “ngôn ngữ” của các axit amin trên phân tử protein

4) snARN (ARN nhân nhỏ) kết hợp với protein hình thành nên phức hệ hoàn thiện ARN (cắt các intron) sau phiên mã, gọi là spliceosome

Trong phần tiếp theo của chương này, chúng ta sẽ khám phá các khía cạnh của quá trình phiên mã và dịch mã ở cả prokaryote và eukaryote, cùng với việc tìm hiểu về các loại ARN khác nhau.

4.2 Phiên mã (tổng hợp ARN)

4.2.1 Các thành phần tham gia quá trình phiên mã

Trong quá trình phiên mã, ARN được tổng hợp theo chiều 5’ → 3’, trong khi mạch ADN (chiều 3’ → 5’) được ARN polymerase trượt trên đó để thực hiện phiên mã, gọi là mạch khuôn ADN Mạch ADN bổ sung (chiều 5’ → 3’) không tham gia vào quá trình phiên mã và được gọi là mạch không làm khuôn Mạch không làm khuôn có chiều phân cực và trình tự nucleotide giống với ARN được tạo thành, nên được gọi là mạch mã hóa, trong khi mạch khuôn được gọi là mạch đối mã Các thành phần cơ bản khác cũng tham gia vào quá trình phiên mã.

1) Enzym ARN polymerase (ARN pol): đây là enzym trực tiếp xúc tác phản ứng trùng hợp ARN Enzym này có khả năng tự tách hai mạch đơn của phân tử ADN sợi kép, tr−ợt dọc trên một mạch và xúc tác phản ứng trùng hợp ARN Cũng giống ADN pol, hoạt động xúc tác phản ứng của ARN pol đ−ợc cung cấp năng l−ợng từ chính sự đứt gãy nhóm ~ của các dNTP; vì vậy, sự tổng hợp chỉ diễn ra theo chiều 5’→3’ và ARN pol dịch chuyển trên mạch ADN trong phiên mã theo một chiều nhất định Tuy nhiên, khác với ADN pol, ARN pol có khả năng tự khởi đầu phản ứng trùng hợp mà không cần đoạn mồi ở prokaryote, toàn bộ hệ gen đ−ợc phiên mã bởi một loại ARN pol duy nhất; trong khi đó, ở eukaryote có ba loại (kí hiệu là ARN pol I, II và III)

2) Các ribonucleotide triphosphate (NTP): Giống nh− các dNTP trong sao chép ADN, các NTP vừa là thành phần cấu trúc nên ARN, vừa là nguồn cung cấp năng l−ợng cho quá trình phiên mã Cần phân biệt các nucleotide cấu tạo nên ARN và các nucleotide cấu tạo nên ADN Chúng là 8 loại nucleotide khác nhau Trong đó, cấu tạo nên ARN là các ribonucleotide có vị trí C-2’ ở phần đường ribose là nhóm –OH; còn ADN đ−ợc cấu tạo từ các deoxyribonucleotide có vị trí C-2’ ở phần đ−ờng là nhóm –H

3) Các trình tự điều hòa phiên mã: đó là các trình tự nucleotide đặc thù trên ADN đánh dấu vị trí gen đ−ợc bắt đầu và kết thúc phiên mã, hoặc là các trình tự điều khiển sự biểu hiện của gen Đoạn trình tự ADN mà ở đó ARN pol gắn vào và khởi đầu phiên mã đ−ợc gọi là trình tự khởi đầu phiên mã (hay promoter) Đoạn trình tự ADN mà ở đó sự phiên mã của gen kết thúc đ−ợc gọi là trình tự (hay tín hiệu) kết thúc phiên mã (terminator) Sự khởi đầu và kết thúc phiên mã ở prokaryote và eukaryote có những đặc điểm khác nhau (đ−ợc nêu ở phần sau) Nhìn chung, trong phiên mã, vì ARN pol chuyển dịch trên phân tử ADN theo một chiều, nên promoter th−ờng nằm ng−ợc dòng (tức là về phía đầu 5’) của đoạn trình tự mã hóa ở mỗi gen; ng−ợc lại, các terminator th−ờng nằm xuôi dòng (về phía đầu 3’) của đoạn trình tự mã hóa Ngoài các trình tự nêu trên, sự phiên mã ở nhiều gen còn phụ thuộc vào các trình tự khác là vị trí liên kết của các yếu tố hoạt hóa (ví dụ: enhancer) hoặc của các protein điều hòa sự biểu hiện gen (nh− operator, attenuator, v.v ; xem thêm ch−ơng 5)

4) Các yếu tố điều hòa phiên mã: sự phiên mã của phần lớn các gen ở cả prokaryote và eukaryote đều đ−ợc điều khiển bởi nhiều protein khác nhau Các protein này có thể là các protein hoạt hóa (điều hòa d−ơng tính) hoặc ức chế phiên mã (điều hòa âm tính), hoặc là các yếu tố tham gia bộ máy phiên mã Chúng đ−ợc mã hóa bởi các gen khác trong hệ gen, nh−ng t−ơng tác với các trình tự điều hòa để điều khiển sự biểu hiện gen

4.2.2 Các enzym ARN polymerase và quá trình phiên mã

Phiên mã và sao chép ADN có nhiều điểm tương đồng trong cơ chế hóa học và hoạt động của enzym, vì cả hai đều là phản ứng trùng hợp axit nucleic được xúc tác bởi enzym Trong quá trình này, một mạch axit nucleic mới được tổng hợp dựa trên một mạch ADN sẵn có Tuy nhiên, giữa phiên mã và sao chép ADN vẫn tồn tại một số khác biệt quan trọng.

ARN pol là enzym tổng hợp ARN không cần đoạn mồi như ADN pol, có khả năng tự khởi đầu quá trình tổng hợp chuỗi polyribonucleotide Tuy nhiên, sự khởi đầu này chỉ có thể xảy ra tại những vị trí cụ thể trên phân tử ADN, được gọi là promoter.

Để sao chép ADN, phức hệ sao chép gồm ADN pol hoạt động trên hai mạch của ADN sợi kép, trong khi việc tách hai mạch được thực hiện bởi các protein đặc biệt Ngược lại, trong quá trình phiên mã, ARN pol chỉ liên kết với một mạch của ADN, tự giãn xoắn cấu trúc ADN xoắn kép và xúc tác phản ứng phiên mã mà không cần các protein giãn xoắn và tách mạch đơn chuyên biệt.

Nguyên liệu để ARN polymerase tổng hợp ARN là các ribonucleotide triphosphate (ATP, GTP, CTP và UTP), gọi chung là NTP, trong khi ADN polymerase sử dụng deoxyribonucleotide (dNTP) để tổng hợp ADN Trong quá trình phiên mã, nucleotide được ARN polymerase bổ sung vào chuỗi ARN để kết cặp với A là U, thay vì T như trong trường hợp của ADN polymerase Ví dụ, nếu mạch khuôn ADN là [3’– ATACTGGAC – 5’] thì mạch ARN sẽ là [5’– UAUGACCUG – 5’].

Sản phẩm ARN được tạo ra từ quá trình phiên mã mà không duy trì liên kết hydro với mạch ADN ARN pol “đẩy” mạch ARN mới tổng hợp ngay sau khi một vài ribonucleotide được bổ sung Sự tách rời của ARN là cần thiết để nó có thể được sử dụng làm khuôn tổng hợp protein ở prokaryote hoặc chuyển đổi thành ARN thành thục cho dịch mã ở eukaryote Nhờ vào sự tách rời gần như ngay lập tức, một gen có thể được phiên mã bởi nhiều ARN pol, tạo ra nhiều bản phiên mã đồng thời Điều này giúp tế bào tổng hợp một lượng lớn protein từ một gen duy nhất trong thời gian ngắn.

Mặc dù ARN polymerase (ARN pol) cũng có chức năng đọc và sửa giống như ADN polymerase, nhưng độ chính xác trong việc ghép cặp nucleotide theo nguyên tắc Chargaff của ARN pol thấp hơn nhiều Tần số sai sót trong phiên mã dao động từ 10^-4 đến 10^-6, trong khi tần số này trong sao chép ADN chỉ từ 10^-7 đến 10^-9 ARN pol tồn tại ở nhiều dạng khác nhau trong tất cả các loại tế bào, nhưng chúng đều xúc tác cho cùng một phản ứng và có nhiều đặc điểm chung Từ vi khuẩn đến động vật có vú, ARN pol được cấu tạo từ nhiều chuỗi polypeptide, ngoại trừ một số phage và ở bào quan eukaryote Bảng 4.1 trình bày số lượng và kích thước các thành phần của ARN pol ở các giới sinh vật khác nhau, cho thấy ở prokaryote chỉ có một loại ARN pol, trong khi ở eukaryote có ba loại: ARN pol I, II và III.

III Trong đó ARN pol II đ−ợc quan tâm hơn cả bởi enzym này thực hiện phiên mã các gen mã hóa protein (chiếm phần lớn hệ gen) và tổng hợp nên các mARN Các enzym ARN pol I và III thực hiện phiên mã các gen tổng hợp nên các loại ARN khác Trong đó, ARN pol I phiên mã tổng hợp tiền-ARN từ đó hình thành nên các rARN 23S và 18S; ARN pol III phiên mã các gen mã hóa các tARN, rARN 5S và nhiều loại ARN kích th−ớc nhỏ khác

Enzym lõi ARN pol ở vi khuẩn là phần xúc tác cho phản ứng tổng hợp ARN, được cấu tạo từ 5 chuỗi polypeptide: 2 chuỗi α, 1 chuỗi β, 1 chuỗi β’ và 1 chuỗi ω Enzym này có mối quan hệ gần gũi với ARN pol ở sinh vật nhân thực, đặc biệt là hai tiểu phần lớn β và β’ tương đồng với ARN pol II (RPB1 và RPB2) Các chuỗi α tương tự như RPB3 và RPB11, trong khi chuỗi ω giống với RPB6 Cấu trúc ARN pol ở vi khuẩn tương tự như ARN pol II của nấm men, cho thấy sự tương đồng trong hoạt động của các ARN pol ở các sinh vật khác nhau.

Dịch mã (tổng hợp protein)

Dịch mã là quá trình chuyển đổi thông tin di truyền từ ARN thành chuỗi axit amin của protein, tiêu tốn nhiều năng lượng nhất trong tế bào và có tính bảo thủ cao giữa các loài Vi khuẩn trong giai đoạn tăng trưởng sử dụng đến 80% năng lượng tế bào và 50% chất khô để tổng hợp protein, cho thấy tầm quan trọng của quá trình này trong sinh vật.

100 loại ARN và protein khác nhau D−ới đây là một số nội dung cơ bản của dịch mã

4.3.1 Các thành phần tham gia tổng hợp protein

Bộ máy tổng hợp protein bao gồm mARN, tARN, enzym aminoacyl-tARN synthetase và ribosome, phối hợp để dịch mã thông tin từ ADN thành protein mARN mang thông tin mã hóa dưới dạng mã bộ ba (codon), mỗi mã quy định một axit amin trong chuỗi polypeptide tARN hoạt động như “người phiên dịch”, kết nối mã bộ ba của mARN với axit amin tương ứng Enzym aminoacyl-tARN synthetase đảm bảo sự chính xác trong quá trình dịch mã bằng cách tạo liên kết cộng hóa trị giữa axit amin và tARN Cuối cùng, ribosome, với cấu trúc lớn từ protein và rARN, điều phối quá trình nhận diện mã bộ ba trên mARN và thúc đẩy hình thành liên kết peptide.

4.3.2.1 mARN mang trình tự mã hóa protein

Trong quá trình dịch mã, bộ máy dịch mã giải mã vùng mã hóa của mARN, trong đó khung đọc mở (ORF) là trình tự nucleotide liên tiếp được đọc từ mã mở đầu (thường là AUG) đến mã kết thúc (UAA, UAG, UGA) Trình tự bắt đầu và kết thúc của một ORF tương ứng với điểm bắt đầu và kết thúc dịch mã, trong khi trình tự của mARN (không kể đuôi polyA) tương ứng với điểm bắt đầu và kết thúc phiên mã Dịch mã bắt đầu từ điểm bắt đầu của ORF và đọc liên tục từng mã bộ ba cho đến khi gặp mã kết thúc Ở prokaryote, mã bắt đầu thường là 5’-AUG-3’, nhưng cũng có thể là 5’-GUG-3’ hoặc 5’-UUG-3’ Tế bào eukaryote luôn sử dụng mã bắt đầu 5’-AUG-3’ Mã bắt đầu không chỉ xác định axit amin đầu tiên của chuỗi polypeptide mà còn xác định điểm bắt đầu của ORF Đột biến liên quan đến mã bắt đầu có thể làm mất nghĩa của ORF và ngăn cản tổng hợp protein Trên một mạch ADN có thể có tối đa 3 ORF khác nhau, và trên cả hai mạch ADN có thể có tối đa 6 ORF khác nhau Khi dịch mã bắt đầu, mỗi mã bộ ba tiếp theo luôn nằm kề sát mã bộ ba phía trước, xác định tất cả các bộ ba theo sau trong quá trình dịch mã.

Hầu hết sinh vật sử dụng ba mã kết thúc chính là 5’-UAA-3’, 5’-UAG-3’ và 5’-UGA-3’ Những mã kết thúc này không chỉ xác định ranh giới tận cùng của một ORF mà còn đóng vai trò là tín hiệu kết thúc quá trình dịch mã.

Mỗi phân tử mARN thường chứa ít nhất một ORF, với sự khác biệt trong số lượng ORF giữa eukaryote và prokaryote Hầu hết mARN eukaryote chỉ có một ORF duy nhất, trong khi mARN prokaryote thường có hai hoặc nhiều ORF, được gọi là mARN đa cistron và mARN đơn cistron Các mARN đa cistron mã hóa cho các protein có chức năng liên quan, như các protein tham gia tổng hợp axit amin hoặc nucleotide Để bắt đầu quá trình dịch mã, ribosome được huy động đến mARN, với vị trí đính kết ribosome (RBS) nằm ngược dòng so với mã bắt đầu của ORF Trình tự RBS ở prokaryote gọi là Shine-Dalgarno, thường cách mã bắt đầu từ 3 đến 6 nucleotide và bổ sung với rARN 16S Tốc độ dịch mã phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa RBS của mARN và vùng nhận biết mARN của rARN 16S.

Một số ORF ở prokaryote thuộc các mARN đa cistron có thể được dịch mã với cường độ cao mặc dù không có các RBS mạnh, nhờ vào việc mã bắt đầu nằm gối lên mã kết thúc của một ORF phía trước Thông thường, trình tự này là 5’-AUGA-3’, cho phép ribosome vừa hoàn thành dịch mã một ORF có thể ngay lập tức tiếp tục dịch mã ORF tiếp theo trên phân tử mARN đa cistron Hiện tượng này được gọi là kết cặp dịch mã.

Khác với prokaryote, mARN ở eukaryote không sử dụng RBS để huy động ribosome, mà thay vào đó, nó thường sử dụng mũ đầu 5’ Mũ đầu 5’ của mARN eukaryote được cấu tạo từ 7-methyl guanosine (m 7 G hoặc m 7 Gppp), đóng vai trò quan trọng trong quá trình dịch mã.

Ribosome được huy động đến mARN và liên kết vào đầu 5’ của mARN Sau đó, ribosome sẽ trượt dọc theo mARN, thực hiện quá trình quét từ 5’ đến 3’ cho đến khi gặp mã mở đầu 5’.

Các mARN ở eukaryote có hai đặc điểm quan trọng giúp tăng cường hiệu suất dịch mã Đặc điểm đầu tiên là sự hiện diện của một purine (A hoặc G) nằm ngược dòng cách mã bắt đầu (AUG) 3 nucleotide, cùng với một G ngay sau đó, tạo thành trình tự 5’-G/ANNAUGG-3’, được gọi là trình tự Kozak Mặc dù nhiều mARN không có trình tự này, nhưng khi có, hiệu suất dịch mã sẽ được cải thiện đáng kể Điều này khác biệt với trình tự Shine-Dalgarno, cho thấy sự độc đáo trong cơ chế dịch mã của eukaryote.

Kozak không tăng cường dịch mã thông qua tương tác với rARN của tiểu phần nhỏ ribosome, mà thay vào đó, nó tương tác với trình tự tARN Met khởi đầu dịch mã Một đặc điểm quan trọng khác giúp nâng cao hiệu suất dịch mã ở eukaryote là mARN của chúng luôn có đuôi polyA ở đầu 3’ Mặc dù trình tự polyA nằm xa điểm khởi đầu dịch mã, nhưng nó vẫn có tác dụng tăng cường tái hoạt động của ribosome, từ đó trực tiếp nâng cao hiệu suất dịch mã.

4.3.2.2 tARN dịch từng mã bộ ba (codon) thành axit amin

Mặc dù đã phát hiện hơn 300 loại tARN, mỗi loại chỉ liên kết với một axit amin cụ thể và nhận biết một hoặc một số mã bộ ba nhất định trên mARN Phần lớn tARN có kích thước khoảng 75 – 95 nucleotide.

Mặc dù, trình tự chi tiết của các tARN là khác nhau, nh−ng chúng đều có các đặc điểm chung sau:

Các tARN chứa nhiều ribonucleotide được biến đổi sau phiên mã, bao gồm pseudouridine (Ψ), dihydrouridine (DHU), hypoxanthine, thymine (T) và methylguanine (mG) Mặc dù các bazơ biến đổi này không cần thiết cho hoạt động của tARN, nhưng sự thiếu hụt chúng thường dẫn đến sự sinh trưởng kém của tế bào Đặc biệt, hypoxanthine có vai trò quan trọng trong việc nhận biết mã bộ ba của một số tARN.

Các tARN có cấu trúc bao gồm các đoạn trình tự xoắn kép kết hợp với các đoạn mạch đơn, tạo thành hình dạng giống như chiếc lá với bốn thùy chính: thùy tiếp nhận axit amin, thùy Ψ (ΨU), thùy D (DHU) và thùy đối mã Bên cạnh đó, còn có một thùy biến đổi với kích thước và trình tự nucleotide khác nhau giữa các tARN Các đặc điểm cơ bản của từng thùy có thể được mô tả chi tiết hơn.

Thùy tiếp nhận axit amin được hình thành từ sự kết cặp của các đoạn trình tự ở hai đầu 5’ và 3’ của phân tử tARN Tất cả tARN đều có trình tự đầu 3’ tận cùng là 5’-CCA-3’, đây là vị trí mà tARN liên kết với axit amin trong quá trình dịch mã, nhờ vào sự xúc tác của enzyme aminoacyl-tARN synthetase.

+ Thùy TΨC có đặc điểm đặc tr−ng là có một bazơ uridine đ−ợc biến đổi thành Ψ, và bazơ này th−ờng đ−ợc tìm thấy trong trình tự 5’-TΨCC-3’

+ Thùy DHU có đặc điểm đặc tr−ng là chứa bazơ dihydrouridine (DHU) Đinh Đoàn Long

Thùy đối mã trên phân tử tARN mang mã bộ ba đối mã (anticodon) tương ứng với mã bộ ba (codon) trên phân tử mARN Mỗi mã bộ ba đối mã luôn có một purine (A hoặc G) ở đầu 3’ và một uracil (U) ở đầu 5’ của phân tử tARN.

Tổng quan về sự điều hòa biểu hiện gen

Trong các chương trước, chúng ta đã tìm hiểu cách thông tin di truyền trong gen được sao chép và chuyển hóa thành tính trạng thông qua quá trình phiên mã và dịch mã Tuy nhiên, ở mọi loài sinh vật, không phải tất cả các gen đều được biểu hiện tại cùng một thời điểm.

Ngay cả những sinh vật bậc thấp như vi khuẩn cũng có khả năng thích ứng đặc biệt với môi trường biến động Khả năng này phụ thuộc vào việc "bật", "tắt" và "điều chỉnh" biểu hiện gen để đáp ứng các thay đổi môi trường, giúp tế bào chỉ tổng hợp các protein và enzym cần thiết tại từng thời điểm, từ đó sử dụng năng lượng hiệu quả Ở sinh vật đa bào, sự điều hòa gen không chỉ phản ứng với môi trường mà còn liên quan đến các hoạt động sống quan trọng như biệt hóa tế bào và phát triển cơ thể Mặc dù hầu hết các tế bào người chứa hệ gen giống nhau, nhưng sự biểu hiện gen khác nhau ở các tế bào và mô khác nhau dẫn đến phân hóa chức năng Tương tự như vi khuẩn, biểu hiện gen ở sinh vật nhân thực được điều khiển qua nhiều bước, với sự khởi đầu phiên mã là kiểu điều hòa cơ bản nhất.

Trong chương này, chúng ta sẽ khám phá các khái niệm cơ bản về điều hòa biểu hiện gen, bắt đầu từ các cơ chế đã biết ở prokaryote, đặc biệt là E coli Tiếp theo, chúng ta sẽ tìm hiểu về các cơ chế điều hòa gen ở eukaryote, từ nấm men đến các sinh vật đa bào phức tạp Bên cạnh đó, chúng ta sẽ phân tích những đặc điểm chính trong điều hòa gen ở eukaryote, bao gồm sự thay đổi cấu hình của chất nhiễm sắc và vai trò của các ARN kích thước nhỏ.

5.1.1 Khái niệm về các gen cơ định (constitutive) và cảm ứng (inducible)

Các sản phẩm của hệ gen như tARN, rARN, protein ribosome, ADN polymerase và nhiều enzym xúc tác là những thành phần thiết yếu cho sự tồn tại của mọi loại tế bào Các gen mã hóa cho những sản phẩm này thường được biểu hiện liên tục và thường xuyên ở hầu hết các tế bào, do đó được gọi là các gen cơ định (constitutive genes).

Nhiều sản phẩm của hệ gen chỉ cần được kích hoạt trong những thời điểm hoặc điều kiện môi trường nhất định, vì vậy việc hoạt động liên tục sẽ lãng phí năng lượng Qua hàng triệu năm tiến hóa, các tế bào đã phát triển cơ chế điều hòa biểu hiện gen, cho phép chỉ biểu hiện các gen cần thiết tại những thời điểm và vị trí cụ thể trong cơ thể Các cơ thể với cơ chế điều hòa hiệu quả sẽ có ưu thế chọn lọc cao hơn so với những cơ thể thiếu cơ chế này, điều này giải thích tại sao hầu hết các dạng sống hiện nay, bao gồm vi khuẩn và virus, đều sở hữu cơ chế biểu hiện gen rất hiệu quả.

E coli và phần lớn các vi khuẩn khác có thể sinh tr−ởng trong môi tr−ờng có nguồn năng l−ợng là các loại đ−ờng khác nhau Nếu môi tr−ờng có glucose, vi khuẩn có xu h−ớng −u tiên sử dụng đ−ờng này Nh−ng, khi không có glucose, vi khuẩn vẫn có thể sinh tr−ởng tốt nếu có một trong các loại đ−ờng khác, nh− sucrose, galactose, arabinose và lactose

Khi môi trường chỉ có lactose là nguồn hydrat carbon duy nhất, tế bào E coli sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase và protein permease để sử dụng lactose làm nguồn năng lượng thay thế cho glucose Permease giúp vận chuyển lactose vào trong tế bào, trong khi β-galactosidase phân cắt lactose thành glucose và galactose Hai protein này không có vai trò trong môi trường không có lactose Việc tổng hợp chúng cần năng lượng từ ATP và GTP, do đó, cơ chế điều hòa cho phép tế bào chỉ sản xuất các protein này khi có lactose và không có glucose, giúp tối ưu hóa việc sử dụng năng lượng cho hoạt động sống của tế bào.

Trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn E coli thường không gặp điều kiện thiếu glucose và thừa lactose, dẫn đến các gen mã hóa enzym chuyển hóa lactose ở trạng thái "tắt" Tuy nhiên, khi chuyển sang môi trường chỉ có lactose làm nguồn carbon, vi khuẩn nhanh chóng tổng hợp enzym chuyển hóa lactose chỉ sau khoảng 10 phút Quá trình này, được gọi là sự cảm ứng, là cách mà vi khuẩn "bật" biểu hiện gen để đáp ứng với tín hiệu môi trường Các gen được điều hòa theo cách này được gọi là gen cảm ứng, và sản phẩm mã hóa của chúng, nếu là enzym, được gọi là enzym cảm ứng, còn nếu là protein thì được gọi là protein cảm ứng.

Các enzym tham gia vào quá trình dị hóa như chuyển hóa lactose, galactose và arabinose thường là các gen cảm ứng điển hình Cần phân biệt giữa sự kích ứng biểu hiện gen mã hóa enzym và sự hoạt hóa enzym, vì hai hiện tượng này khác nhau về cơ chế Sự kích ứng làm thay đổi tốc độ tổng hợp enzym mà không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym, trong khi sự hoạt hóa enzym liên quan đến tương tác giữa enzym và các phân tử tín hiệu, làm thay đổi hoạt tính enzym mà không làm thay đổi mức độ biểu hiện gen mã hóa enzym.

Các vi khuẩn có khả năng tự tổng hợp nhiều phân tử hữu cơ thiết yếu cho sự sống, bao gồm axit amin, nucleotide và vitamin Chẳng hạn, hệ gen của E coli chứa 5 gen mã hóa enzym cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp tryptophan (Trp) Những gen này được biểu hiện khi E coli phát triển trong môi trường thiếu Trp, nhưng sẽ bị "tắt" khi có đủ Trp Các gen này được gọi là gen bị nén hoặc gen bị ức chế, và khi chúng được kích hoạt trở lại, quá trình này được gọi là sự giải nén.

Các gen mã hóa enzym trong quá trình đồng hóa thường được điều hòa biểu hiện theo kiểu bị nén, tương tự như điều hòa cảm ứng, chủ yếu diễn ra ở bước phiên mã Cần phân biệt giữa nén gen và ức chế phản hồi, vì ức chế phản hồi liên quan đến sự ức chế do sản phẩm cuối cùng của một con đường chuyển hóa gây ra đối với hoạt tính enzym, mà không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen mã hóa enzym.

5.1.2 Điều hòa d−ơng tính và điều hòa âm tính

Sự điều hòa biểu hiện gen diễn ra thông qua hai cơ chế chính: điều hòa dương tính và điều hòa âm tính, cả hai đều liên quan đến các gen điều hòa Các gen này mã hóa cho các sản phẩm giúp điều chỉnh biểu hiện của các gen khác Trong cơ chế điều hòa dương tính, sản phẩm của gen điều hòa tăng cường biểu hiện của các gen cấu trúc, trong khi ở cơ chế âm tính, sản phẩm này thường ức chế hoặc làm tắt biểu hiện của các gen cấu trúc Sự liên kết của ARN polymerase vào promoter của gen là điều kiện cần thiết để gen được biểu hiện Sản phẩm của gen điều hòa, gọi là protein điều hòa, có thể là protein hoạt hóa trong điều hòa dương tính hoặc protein ức chế trong điều hòa âm tính Sự liên kết của các protein này vào vị trí điều hòa (RPBS) phụ thuộc vào sự hiện diện của các phân tử tín hiệu, như axit amin hoặc đường; nếu các phân tử này tăng cường biểu hiện gen, chúng được gọi là phân tử kích ứng, ngược lại, nếu hạn chế biểu hiện, chúng là phân tử đồng ức chế.

Các phân tử kích ứng và đồng ức chế kết hợp với protein điều hòa, gây ra sự thay đổi cấu hình và dẫn đến biến đổi dị hình Biến đổi này ảnh hưởng đến hoạt tính và chức năng của protein, làm thay đổi ái lực liên kết của chúng với các vị trí RPBS gần promoter của các gen mà chúng điều khiển.

Trong hệ thống điều hòa kích ứng và âm tính, protein ức chế liên kết vào RPBS khi không có phân tử kích ứng, ngăn chặn quá trình phiên mã Ngược lại, khi có chất kích ứng, phức hệ [chất kích ứng/protein ức chế] không gắn được vào RPBS, cho phép ARN polymerase khởi đầu phiên mã Do đó, sự biểu hiện của gen cấu trúc chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của chất kích ứng.

Trong hệ thống điều hòa kìm hãm và âm tính, sự phiên mã các gen cấu trúc chỉ diễn ra khi có chất đồng ức chế Chất đồng ức chế tạo thành phức hệ với protein ức chế, liên kết vào RPBS và ngăn cản enzym ARN polymerase thực hiện phiên mã Ngược lại, khi không có chất đồng ức chế, protein ức chế không thể liên kết với RPBS, cho phép ARN polymerase kết nối với promoter và khởi đầu quá trình phiên mã gen cấu trúc.

Điều hòa biểu hiện gen ở prokaryote

ARN polymerase ở vi khuẩn, đặc biệt là loại mang yếu tố σ 70, nhận diện promoter thông qua ba trình tự liên ứng: “-10”, “-35” và “UP” Khi không có protein điều hòa, các trình tự này xác định hiệu suất liên kết của ARN polymerase với promoter và khởi đầu phiên mã Sự điều hòa biểu hiện gen có thể diễn ra ở nhiều giai đoạn, từ trước phiên mã đến sau dịch mã, nhưng bước khởi đầu phiên mã là kiểu điều hòa cơ bản nhất ở prokaryote Hơn nữa, tính linh hoạt trong các cơ chế điều hòa biểu hiện gen rất cao, bao gồm cả các kiểu điều hòa sau khởi đầu phiên mã, như ngăn cản kết thúc phiên mã và điều hòa dịch mã.

5.2.1 Các nguyên tắc điều hòa phiên mã

5.2.1.1 Biểu hiện gen đ−ợc điều khiển bởi các protein điều hòa

Sự biểu hiện của nhiều gen ở prokaryote và eukaryote phụ thuộc vào môi trường và các tín hiệu môi trường Ở vi khuẩn, các tín hiệu này thường là các phân tử trong môi trường sống, và thông tin từ chúng được truyền tới gen qua các protein điều hòa ARN polymerase liên kết với promoter trong phức hệ khởi đầu phiên mã “đóng”, sau đó chuyển sang dạng “mở” khi hai mạch ADN tại promoter tách ra, cho phép ARN polymerase bắt đầu phiên mã Các protein điều hòa, bao gồm protein hoạt hóa và ức chế, tác động vào các bước khác nhau của quá trình khởi đầu phiên mã, và điều này phụ thuộc vào từng promoter cụ thể và loại protein điều hòa.

5.2.1.2 Nhiều promoter đ−ợc điều khiển qua ái lực giữa ARN polymerase với ADN

Khi không có các protein điều hòa, ARN polymerase thường liên kết yếu với nhiều promoter do thiếu yếu tố trình tự liên ứng hoặc không hoàn chỉnh Tuy nhiên, ARN polymerase có thể vẫn liên kết với promoter và khởi đầu phiên mã, dẫn đến sự biểu hiện gen ở mức cơ bản Để điều hòa âm tính, một protein ức chế gắn vào trình tự điều hành (operator) làm ngăn cản ARN polymerase liên kết với promoter, do đó phiên mã không diễn ra Ngược lại, để điều hòa dương tính, một protein hoạt hóa giúp ARN polymerase dễ dàng liên kết với promoter bằng cách tương tác với ADN và ARN polymerase, đưa enzym này gần hơn với promoter Cơ chế này được gọi là sự liên hợp ADN/protein, với vai trò của chất hoạt hóa là tạo liên kết giữa ADN và ARN polymerase, cho phép sự hình thành phức hệ “mở” tại promoter và khởi đầu phiên mã.

Operon lac ở E coli được điều chỉnh bởi protein hoạt hóa và protein ức chế Chúng ta sẽ khám phá chi tiết về hoạt động của operon này trong các phần tiếp theo Qui tắc dị hình đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát quá trình sau khi ARN polymerase gắn vào promoter.

Không phải mọi promoter đều đ−ợc điều khiển bằng cơ chế giống nhau Theo một cơ chế khác,

ARN polymerase có khả năng liên kết với một phức hệ khởi đầu phiên mã ở trạng thái "đóng" Tuy nhiên, phức hệ này không thể chuyển sang trạng thái "mở" nếu không có sự tham gia của protein hoạt hóa Khi protein hoạt hóa xuất hiện, phức hệ "đóng" sẽ chuyển thành phức hệ "mở", và quá trình khởi đầu phiên mã sẽ diễn ra Các protein hoạt hóa thường tương tác với phức hệ khởi đầu phiên mã để kích thích quá trình này.

“đóng”, chúng kích ứng sự thay đổi cấu hình hoặc của

ADN theo qui tắc dị hình đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi phức hệ từ "đóng" sang "mở" Trong chương 1, chúng ta đã tìm hiểu rằng qui tắc dị hình là một trong những nguyên tắc cơ bản nhất trong việc điều hòa chức năng và hoạt tính của protein.

Một ví dụ là các protein

Cyclin hoạt hóa các enzym

Cdk tham gia vào việc điều khiển chu trình tế bào thông qua việc kích hoạt enzym bằng cách liên kết với cyclin, chuyển enzym từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Trong điều hòa phiên mã, qui tắc dị hình được áp dụng ở hai promoter glnA và metT Đối với glnA, chất hoạt hóa NtrC tương tác với ARN polymerase, giúp chuyển phức hệ khởi đầu phiên mã từ trạng thái “đóng” sang “mở” Trong khi đó, ở metT, chất hoạt hóa MerR tạo ra hiệu ứng tương tự bằng cách thay đổi cấu hình ADN của promoter.

Sự điều hòa phiên mã tại promoter thực sự rất đa dạng, với nhiều cơ chế khác nhau có thể hoạt động đồng thời Hơn nữa, sự kìm hãm phiên mã không nhất thiết phải xảy ra thông qua việc ngăn cản sự liên kết giữa ARN polymerase và promoter.

Hoạt hóa gen được thực hiện thông qua sự huy động ARN polymerase Khi không có protein điều hòa, ARN polymerase liên kết tự phát với promoter để khởi đầu phiên mã ở mức cơ bản Tuy nhiên, sự liên kết của protein ức chế vào operator sẽ ngăn cản ARN polymerase gắn vào promoter, dẫn đến ức chế phiên mã Ngược lại, ARN polymerase được các protein hoạt hóa huy động đến gen, từ đó làm tăng cường sự phiên mã và giúp gen biểu hiện ở mức tối đa.

Vị trí liên kết của protein hoạt hóa

Phiên mã ở mức cơ bản

Phiên mã ở mức t¨ng c−êng

ARN polymerase a) b) c) Đinh Đoàn Long

5.2.1.4 Sự điều khiển biểu hiện gen từ khoảng cách xa và cấu trúc vòng thắt ADN

Các protein điều hòa thường liên kết gần promoter của gen, nhưng đôi khi chúng lại gắn vào ADN ở vị trí xa Để tương tác với gen, protein điều hòa thường tạo ra các "vòng thắt" trên ADN Ví dụ, protein NtrC có thể hoạt hóa gen từ vị trí liên kết cách xa 150 bp hoặc thậm chí 1 kb Các vòng thắt ADN có thể dài tới 3 kb để điều khiển biểu hiện gen từ xa Một phương pháp khác để đưa các trình tự ADN xa lại gần nhau là thông qua các protein liên kết vào đoạn trình tự ở giữa, được tìm thấy trong cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu Kiểu điều khiển "từ xa" này cũng phổ biến hơn ở eukaryote.

5.2.1.5 Qui tắc dị hình và liên kết ADN - protein trong điều hòa biểu hiện gen

Sự hoạt hóa gen thường xảy ra thông qua tương tác giữa các đại phân tử, như ADN và ARN polymerase, giúp huy động bộ máy phiên mã tới promoter Trong một số trường hợp, gen được điều hòa bởi qui tắc dị hình, trong đó một protein hoạt hóa tương tác với enzym ARN polymerase đã liên kết với ADN, làm thay đổi cấu hình của enzym hoặc promoter, từ đó khởi đầu phiên mã có thể diễn ra.

Cả hai qui tắc liên kết ADN-protein và dị hình đều đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động của gen, với sự tương tác phức tạp giữa chúng Hai hoặc nhiều protein có thể tương tác với nhau và với ADN, từ đó tăng cường khả năng liên kết vào vị trí gen được điều khiển Tương tác này tạo ra tác dụng “hiệp lực”, giúp chuyển nhanh một gen từ trạng thái không biểu hiện sang trạng thái biểu hiện tối đa Sự “hiệp lực” của các protein hoạt hóa cũng tích hợp tín hiệu, cho phép các gen chỉ biểu hiện khi có mặt đồng thời nhiều tín hiệu khác nhau, như trong trường hợp biểu hiện các gen ở phagơ λ.

Hình 5.3 minh họa sự tương tác giữa các protein liên kết ADN, bao gồm: a) các protein điều hòa liên kết gần nhau; b) các protein điều hòa liên kết xa nhau, tạo thành "vòng thắt" trên phân tử ADN; c) protein bẻ cong ADN giúp đưa một protein hoạt hóa từ xa đến gần phức hệ khởi đầu phiên mã và tương tác với ARN polymerase.

5.2.1.6 Khởi đầu phiên mã không phải là cơ chế điều hòa duy nhất ở tất cả các gen

Sự điều hòa hoạt động của các gen qua bước khởi đầu phiên mã là cơ chế cơ bản nhất trong cả prokaryote và eukaryote Tuy nhiên, ở vi khuẩn, ngoài cơ chế này, còn tồn tại nhiều cơ chế điều hòa biểu hiện gen khác, bao gồm các bước kéo dài phiên mã, hoàn thiện mARN và dịch mã tổng hợp protein.

5.2.2 Sự điều hòa khởi đầu phiên mã ở vi khuẩn

Cụm gen mã hóa enzym phân giải đường lactose (operon Lac) ở vi khuẩn E coli hoạt động thông qua sự phối hợp của các protein điều hòa, bao gồm cả protein hoạt hóa và ức chế Điều này cho thấy cách mà các yếu tố này cùng nhau kiểm soát sự biểu hiện của các gen, đảm bảo quá trình tiêu hóa lactose diễn ra hiệu quả.

Đột biến là nguồn nguyên liệu của quá trình tiến hóa

Di truyền là hiện tượng các gen được truyền từ bố, mẹ sang con cái qua sinh sản, với gen là đơn vị lưu giữ thông tin di truyền từ trình tự deoxyribonucleotide trong ADN hoặc ribonucleotide trong ARN Quá trình sao chép ADN diễn ra theo nguyên tắc bán bảo toàn và được hỗ trợ bởi hoạt tính đọc sửa của các enzym ADN polymerase và ARN polymerase, đảm bảo thông tin di truyền được truyền tải chính xác từ tế bào mẹ sang tế bào con và từ thế hệ này sang thế hệ khác Tuy nhiên, trong quá trình sao chép, có thể xảy ra sai hỏng hoặc lỗi, và những thay đổi này, khi duy trì qua các thế hệ, được gọi là đột biến.

Đột biến là sự thay đổi trong vật chất di truyền, dẫn đến sự xuất hiện kiểu hình mới, gọi là thể đột biến Cần phân biệt đột biến với biến dị tổ hợp, vì biến dị tổ hợp là kết quả của tái tổ hợp các đột biến đã có Đột biến liên quan trực tiếp đến số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể, đặc biệt là cấu trúc của gen Đột biến điểm, một loại đột biến chỉ xảy ra tại một vị trí cụ thể trên gen, bao gồm sự thay thế, mất hoặc thêm cặp bazơ nitơ Đột biến được coi là nguồn gốc của mọi biến dị di truyền và là nguyên liệu sơ cấp cho tiến hóa Các cơ chế tái tổ hợp chỉ tổ hợp lại các biến dị, trong khi chọn lọc tự nhiên và nhân tạo định hướng duy trì các kiểu gen thích nghi Nếu không có đột biến, gen sẽ không tồn tại ở nhiều trạng thái, khiến quần thể không thể tiến hóa để thích nghi với môi trường Mặc dù đột biến cần thiết cho sự phát triển và thích nghi, tần số đột biến quá cao có thể làm mất tính nguyên vẹn của thông tin di truyền và hầu hết đột biến mới thường không có lợi cho sức sống của thể đột biến Tần số đột biến cũng phụ thuộc vào các yếu tố di truyền khác và cơ chế điều hòa mức độ đột biến.

Một số đặc điểm cơ bản của sự phát sinh đột biến

6.2.1 Đột biến tế bào mầm sinh dục và đột biến tế bào soma Đột biến có thể xuất hiện ở mọi tế bào, trong mọi giai đoạn của quá trình phát triển ở sinh vật Hiệu quả kiểu hình của đột biến phụ thuộc vào loại tế bào mà đột biến sinh ra, thời điểm phát sinh đột biến trong chu trình tế bào, trạng thái trội-lặn của nó (so với bản sao thứ hai trong tế bào l−ỡng bội) ở sinh vật bậc cao, trong giai đoạn đầu phát triển phôi, các tế bào mầm sinh dục sản sinh ra các tế bào sinh tinh và sinh trứng, từ đó hình thành nên các tế bào sinh dục tr−ởng thành (tinh trùng và trứng) Những tế bào này đ−ợc gọi chung là tế bào sinh dục Tất cả các tế bào khác của cơ thể đ−ợc gọi là tế bào soma Đột biến xảy ra trong các tế bào sinh dục đ−ợc gọi là đột biến giao tử, còn đột biến xảy ra trong tế bào soma đ−ợc gọi là đột biến soma Đột biến soma chỉ đ−ợc duy trì qua sự nguyên phân của tế bào đột biến mà không đ−ợc truyền qua giao tử cho các thế hệ sau Nhiều giống táo tây và và cam Navel có quả ngọt là kết quả của đột biến soma Những cây mang đột biến soma thường ở dạng khảm, không di truyền đ−ợc đặc tính đột biến qua sinh sản hữu tính Rất may, những loài cây trên đây có thể sinh sản sinh d−ỡng (vô tính) nhờ các kỹ thuật nh− chiết, ghép, giâm cành để duy trì đ−ợc các đặc tính “đột biến” mong muốn

Đột biến giao tử có thể là trội hoặc lặn, ảnh hưởng đến kiểu hình của thế hệ con Nếu đột biến trội, kiểu hình sẽ xuất hiện ngay ở thế hệ con, trong khi đột biến lặn không biểu hiện ở kiểu gen dị hợp tử Đột biến này có thể xảy ra ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình sinh sản Khi đột biến chỉ có ở một giao tử, chỉ một cá thể con mang gen đột biến Tuy nhiên, nếu đột biến xảy ra trong tế bào tiền sinh dục, nhiều giao tử sẽ nhận gen đột biến, tăng khả năng duy trì gen này qua các thế hệ Do đó, tính trội – lặn của gen và thời điểm xuất hiện đột biến trong chu kỳ sinh sản là yếu tố quyết định sự biểu hiện và lan tỏa của gen đột biến trong quần thể.

6.2.2 Đột biến tự phát và đột biến gây tạo Đột biến có thể xuất hiện do các tác nhân từ môi tr−ờng, kể cả từ môi tr−ờng nội bào Trong đó, đột biến tự phát là những đột biến mà tác nhân gây đột biến thường không cụ thể Chúng có thể do các sai hỏng của quá trình trao đổi chất trong cơ thể gây nên, hoặc do những tác nhân không xác định từ môi trường Đột biến gây tạo là đột biến xuất hiện khi tế bào hoặc cơ thể sinh vật đ−ợc xử lý với các tác nhân vật lý hoặc hóa học khác nhau, làm thay đổi cấu trúc và trình tự nucleotide trong phân tử ADN (hoặc ARN ở một số virut) Những tác nhân này đ−ợc gọi là tác nhân đột biến, bao gồm các bức xạ ion hóa, tia sáng cực tím (UV) và nhiều hóa chất gây đột biến khác nhau

Việc xác định đột biến là do tự phát hay gây tạo thường không rõ ràng, mặc dù đã được phân loại Trong nghiên cứu di truyền, các nhà nghiên cứu thường phải thực hiện thí nghiệm so sánh với “đối chứng” để phân biệt hai loại đột biến này Nếu một tác nhân nào đó làm tăng đột biến lên 100 lần, có thể kết luận rằng 99% là do tác nhân đột biến và chỉ 1% là do tự phát.

Đột biến tự phát thường xảy ra với tần số hiếm, khác nhau giữa các gen và các sinh vật Tần số này ở vi khuẩn và virus ước tính khoảng 10^-10 đến 10^-8 cho mỗi nucleotide trong một lần sao chép Do đó, với một gen có kích thước trung bình 1000 bp, tần số đột biến sẽ dao động từ 10^-7 đến 10^-4 trong mỗi thế hệ.

Việc xử lý các tác nhân đột biến làm tăng tần số đột biến rõ rệt, với hơn 1% gen của vi khuẩn và virus có khả năng mang ít nhất một đột biến Điều này có nghĩa là trong mỗi quần thể, hơn 1% số phagơ sẽ mang ít nhất một đột biến khi xem xét từng gen.

6.2.3 Đột biến có phải là ngẫu nhiên, vô h−ớng? ở các thành phố, nhiều quần thể chuột trở nên kháng với thuốc diệt chuột truyền thống Tương tự như vậy, nhiều quần thể côn trùng (sâu đục thân, sâu ăn lá ) trở nên kháng với các thuốc trừ sâu; ngày càng có nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh trở nên kháng các chất kháng sinh Việc con ng−ời đ−a vào sử dụng các loại thuốc trừ sâu và kháng sinh mới đã tạo nên môi trường sống mới ở các sinh vật này, và chính các đột biến đã tạo cho chúng khả năng kháng với các thuốc trừ sâu và kháng sinh nói trên Các cá thể không đột biến, mẫn cảm với thuốc thì bị chết; còn các thể đột biến thì sinh sản nhanh thành những quần thể kháng thuốc mới Đến nay, có nhiều bằng chứng khẳng định sự tiến hóa ở sinh vật là kết quả của chọn lọc các đột biến làm tăng khả năng thích nghi ở sinh vËt

Các ví dụ này đặt ra câu hỏi liệu sự xuất hiện đột biến có phải là sự kiện ngẫu nhiên hoàn toàn hay môi trường chỉ duy trì các đột biến sẵn có, hay liệu sự xuất hiện đột biến được điều khiển bởi các yếu tố môi trường Thực nghiệm cho thấy xu hướng đột biến hình thành theo cách ngẫu nhiên Ví dụ, việc cắt đuôi chuột qua nhiều thế hệ không bao giờ tạo ra "loài" chuột cụt đuôi Tuy nhiên, Lamarck và Lysenko từng tin rằng các yếu tố môi trường có vai trò quan trọng trong tiến hóa.

Ngày nay, việc Lysenko ủng hộ thuyết Lamarck về sự hình thành các tính trạng tập nhiễm, đặc biệt trong giai đoạn 1937 – 1964 tại Nga, vẫn gây khó hiểu Tuy nhiên, việc phủ nhận học thuyết Lamarck không phải là điều dễ dàng, nhất là khi xem xét nhiều trường hợp ở vi khuẩn Ví dụ, trong một quần thể E coli được nuôi cấy trong môi trường không có streptomycin và sau đó chuyển sang môi trường có kháng sinh, phần lớn vi khuẩn sẽ chết, nhưng một số tế bào lại có khả năng kháng và phát triển mạnh Điều này đặt ra câu hỏi về việc liệu đột biến kháng kháng sinh đã tồn tại trong quần thể hay chỉ xuất hiện khi có sự hiện diện của chất kháng sinh.

Năm 1952, Joshua và Lederberg phát triển phương pháp đóng dấu, chứng minh rằng các đột biến kháng kháng sinh đã tồn tại ở vi khuẩn trước khi chuyển sang môi trường có kháng sinh Lederberg hòa loãng dịch nuôi vi khuẩn, trải lên bề mặt agar và nuôi cho đến khi mỗi tế bào phát triển thành khuẩn lạc riêng biệt Các nhà nghiên cứu sử dụng "con dấu" bọc vải nhung để in dấu lên bề mặt môi trường, ghi lại vị trí khuẩn lạc Sau đó, họ in vi khuẩn lên môi trường chứa streptomycin và lặp lại quy trình với nhiều đĩa petri, mỗi đĩa chứa khoảng 200 khuẩn lạc Kết quả, sau khi nuôi qua đêm, họ phát hiện một số khuẩn lạc kháng streptomycin.

Lederberg đã tiến hành kiểm tra khả năng sống sót của các khuẩn lạc trong môi trường không có streptomycin khi chuyển sang môi trường có streptomycin Kết quả cho thấy các khuẩn lạc trong môi trường không có streptomycin thường có tế bào kháng kháng sinh, trong khi những khuẩn lạc không mọc trong môi trường chọn lọc rất hiếm khi có tế bào kháng Điều này chứng minh rằng đột biến kháng streptomycin đã tồn tại trong quần thể trước khi chuyển sang môi trường có streptomycin Các bằng chứng thực nghiệm sau này cũng chỉ ra rằng tác nhân môi trường không trực tiếp gây ra đột biến, mà chỉ chọn lọc các đột biến có sẵn ở tần số thấp, dẫn đến sự phát triển của các kiểu hình thích nghi hơn trong môi trường mới và lấn át các kiểu hình kém thích nghi.

6.2.4 Đột biến có thể đảo ng−ợc (đột biến phục hồi)

Một đột biến ở gen kiểu dại có thể tạo ra alen đột biến, dẫn đến kiểu hình bất thường Đột biến từ alen kiểu dại thành alen đột biến được gọi là đột biến thuận Tuy nhiên, alen đột biến cũng có thể trải qua một đột biến ngược để trở về dạng kiểu dại, được gọi là đột biến ngược hay đột biến phục hồi.

Việc phân biệt giữa kiểu hình đột biến và kiểu hình dại đôi khi không dễ dàng, vì chúng có thể có hệ số thích nghi tương đương Ví dụ, ở con người, các màu mắt đen, nâu và xanh đều được xem là kiểu hình dại Tuy nhiên, trong một quần thể mà màu mắt đen chiếm ưu thế, thì alen màu mắt xanh có thể được coi là một đột biến do số lượng cá thể màu mắt xanh rất ít.

Khi một đột biến thứ hai phục hồi kiểu hình ban đầu bị mất do đột biến thứ nhất, quá trình này được gọi là phục hồi đột biến Sự phục hồi đột biến có thể xảy ra theo hai cách: đột biến trở lại, khi đột biến thứ hai xảy ra tại cùng vị trí trên gen, khôi phục trình tự nucleotide ban đầu; và đột biến ức chế, khi đột biến thứ hai xảy ra ở vị trí khác trong hệ gen, ngăn chặn sự biểu hiện của đột biến thứ nhất.

Đột biến trở lại phục hồi trình tự nucleotide kiểu dại, trong khi đột biến ức chế không có khả năng này Đột biến ức chế có thể xảy ra tại các vị trí khác trong gen, ở các gen khác, hoặc thậm chí trên các nhiễm sắc thể khác.

Đột biến và hiệu quả kiểu hình

Hiệu quả kiểu hình của đột biến có thể rất yếu

Đột biến gen có thể được phát hiện thông qua phân tích di truyền hoặc hóa sinh, và có thể gây hậu quả nghiêm trọng, bao gồm cả cái chết của sinh vật Các đột biến trong vùng mã hóa của gen thường tạo ra alen mới, trong đó những alen không tạo ra hiệu ứng kiểu hình khác biệt với kiểu dại được gọi là alen đồng đẳng (isoallele) Ngược lại, các đột biến làm mất chức năng của gen hoặc ngăn cản quá trình dịch mã sẽ tạo ra alen vô nghĩa (null allele) Nếu alen vô nghĩa liên quan đến các gen thiết yếu, cá thể đồng hợp tử thường sẽ chết sớm, và chúng được gọi là alen lặn gây chết Cần phân biệt giữa đột biến alen vô nghĩa và đột biến vô nghĩa, trong đó đột biến vô nghĩa hình thành một trong ba bộ ba kết thúc (UAA, UAG và UGA) trong vùng mã hóa của gen.

Alen đột biến có thể ở trạng thái trội hoặc lặn Ở sinh vật đơn bội như vi khuẩn và virus, hiệu quả kiểu hình của alen đột biến thường biểu hiện ngay khi chúng hình thành, bất kể trạng thái trội hay lặn Trong khi đó, ở sinh vật lưỡng bội như ruồi giấm và con người, các đột biến lặn chỉ thay đổi kiểu hình khi ở trạng thái đồng hợp tử Phần lớn các đột biến lặn không biểu hiện kiểu hình ngay khi chúng xuất hiện, vì thường ở dạng dị hợp tử, ngoại trừ các đột biến lặn liên kết NST X, biểu hiện ngay ở cá thể dị giao tử (con đực) Các đột biến lặn gây chết có thể làm thay đổi tỉ lệ giới tính của thế hệ con, do cá thể dị giao tử mang alen gây chết không tồn tại.

6.3.1 Phần lớn đột biến là có hại và thường ở trạng thái lặn

Phần lớn các đột biến được phát hiện là có hại và thường ở trạng thái lặn, điều này liên quan đến cơ chế kiểm soát di truyền trong quá trình trao đổi chất Mỗi quá trình trao đổi chất bao gồm nhiều chuỗi phản ứng, mỗi bước cần một enzym đặc hiệu được mã hóa bởi các gen nhất định Các đột biến trong những gen này có thể cản trở quá trình trao đổi chất do thay đổi trình tự các bazơ nitơ, dẫn đến sự thay đổi trong chuỗi axit amin của protein Hệ quả là nhiều protein đột biến mất chức năng, tạo ra hiệu ứng đột biến phổ biến nhất Alen kiểu dại mã hóa cho các enzym hoạt động, trong khi alen đột biến mã hóa cho các enzym mất hoạt tính hoàn toàn hoặc một phần.

Hình 6.2 cho thấy sự thay đổi tỉ lệ giới tính ở ruồi giấm do đột biến lặn gây chết liên kết với NST X, với tỉ lệ con cái dị hợp tử về alen đột biến là 2 cái : 1 đực Đinh Đoàn Long chỉ ra rằng các alen đột biến thường mang tính lặn Trong một tế bào có cả hai dạng enzym, dạng có hoạt tính vẫn có khả năng xúc tác các phản ứng diễn ra bình thường, ngay cả khi dạng mất hoạt tính tồn tại.

Đột biến câm, hay còn gọi là đột biến trung tính, không gây ra hiệu ứng kiểu hình do tính thoái hóa của mã bộ ba Hầu hết các đột biến quan sát được thường dẫn đến sản phẩm mất hoặc giảm hoạt tính, có thể do các alen kiểu dại đã được chọn lọc qua hàng triệu năm tiến hóa để đạt hiệu quả thích nghi tối ưu Do đó, các đột biến ngẫu nhiên thường làm thay đổi trình tự axit amin đã được tối ưu hóa, giống như một cỗ máy phức tạp, nơi mọi thay đổi đều có khả năng làm giảm hiệu quả của hệ thống Quan điểm này lý giải tại sao phần lớn đột biến quan sát là các alen lặn và có hại.

6.3.2 Hiệu quả kiểu hình các gen mã hóa globin ở ng−ời

Các đột biến gen mã hóa hemoglobin ở người chủ yếu mang tính chất có hại, với hemoglobin ở người trưởng thành chủ yếu tồn tại dưới dạng A, bao gồm hai chuỗi α và hai chuỗi β Mỗi chuỗi α chứa 141 axit amin, trong khi mỗi chuỗi β có 146 axit amin Các gen mã hóa globin (α, β, γ, ε và δ) có nguồn gốc chung do trình tự tương đồng Nhiều đột biến ở gen mã hóa globin đã được phát hiện ở các quần thể người khác nhau, phần lớn đều gây hại Ví dụ, bệnh hồng cầu hình liềm (HbS) xảy ra do đột biến thay thế axit amin số 6 từ Glu (axit amin tính axit) thành Val (axit amin trung tính) trên chuỗi β, dẫn đến những biến đổi nghiêm trọng trong cấu trúc hemoglobin.

Các alen lặn đột biến thường gây cản trở các con đường trao đổi chất bằng cách ảnh hưởng đến hoạt động của enzym Những alen kiểu dại ở mỗi gen mã hóa cho enzym bình thường, nhưng khi xảy ra đột biến, chúng dẫn đến việc hình thành các enzym bị biến đổi, giảm hoạt tính hoặc mất hoàn toàn chức năng Khi ở trạng thái đồng hợp tử, các alen đột biến sản sinh ra enzym không còn khả năng hoạt động, gây cản trở cho quá trình trao đổi chất do thiếu hoạt tính enzym cần thiết.

Tiền chất Chất trung gian 1 Chất trung gian 2 Sản phẩm

Gen A alen kiểu dại A Gen B alen kiểu dại B Gen C alen kiểu dại C

Alen đột biến a Alen đột biến b Alen đột biến c §ét biÕn §ét biÕn §ét biÕn

Enzym a mất hoạt tính ở cơ thể đồng hợp tử Enzym b mất hoạt tính ở cơ thể đồng hợp tử Enzym c mất hoạt tính ở cơ thể đồng hợp tử

Sự thay đổi cấu hình của hemoglobin do liên kết nội phân tử mới dẫn đến tế bào hồng cầu có hình liềm Cơ sở phân tử của hiện tượng này là sự thay đổi axit amin trên chuỗi β, được gây ra bởi đột biến thay thế cặp nucleotide A=T trên alen kiểu dại (Hb A β) thành T=A trên alen đột biến (Hb S β) Sự thay thế nucleotide này đã được dự đoán từ trình tự axit amin và sau đó được xác nhận qua giải trình tự các gen (alen).

Hb A β và Hb S β Đến nay, đã có trên 100 dạng đột biến khác nhau liên quan đến chuỗi β đ−ợc phát hiện

Nhiều đột biến gen dẫn đến sự thay thế axit amin, như được minh họa trong hình 6.4 Bên cạnh đó, ở con người còn tồn tại nhiều loại đột biến khác liên quan đến chuỗi α.

6.3.3 Phần lớn đột biến ở người ngăn cản các con đường trao đổi chất

Các đột biến gen mã hóa enzym có thể cản trở các con đường trao đổi chất, và hiện tượng này xảy ra ở tất cả các loài sinh vật.

Chúng ta sẽ khám phá các đột biến liên quan đến gen mã hóa enzym trong các con đường chuyển hóa phenylalanine (Phe) và tyrosine (Tyr), và tác động của chúng đến kiểu hình ở người Phe và Tyr là hai axit amin thiết yếu mà cơ thể người không thể tự tổng hợp, mà phải được cung cấp qua chế độ ăn uống, khác với vi khuẩn có khả năng tự tổng hợp chúng.

Bệnh di truyền phổ biến nhất liên quan đến chuyển hóa phenylalanine (Phe) và tyrosine (Tyr) là phenyl keto niệu, do thiếu enzym phenylalanine hydroxylase, dẫn đến sự chuyển hóa Phe thành Tyr không hiệu quả Bệnh này có nguyên nhân từ đột biến lặn trên nhiễm sắc thể thường, và nếu không có chế độ dinh dưỡng hợp lý, người bệnh có thể gặp triệu chứng thiểu năng trí tuệ Ngoài phenyl keto niệu, alkapto niệu cũng là một bệnh di truyền liên quan đến chuyển hóa Phe và Tyr, gây ra bởi đột biến lặn trên nhiễm sắc thể thường, ảnh hưởng đến enzym homogentisic acid oxidase.

Ngoài các bệnh di truyền liên quan đến con đường chuyển hóa Phe-Tyr, còn có hai bệnh di truyền khác do đột biến lặn trên nhiễm sắc thể thường, đó là bệnh cường tyrosine (tyrosinosis) và bệnh tyrosine.

Vị trí axit amin trong chuỗi β - globin

Hình 6.4 minh họa một số dạng thay thế axit amin trong chuỗi β-globin của người, tất cả đều do đột biến thay thế đơn nucleotide ở gen Hb A β Nhiều dạng thay thế axit amin này có khả năng làm thay đổi tổng điện tích của chuỗi, mặc dù chỉ có một số ít trường hợp được nêu.

Năm trong số 20 axit amin phổ biến có điện tích ở pH trung tính, và các đột biến thay thế axit amin có thể làm thay đổi tổng điện tích, dẫn đến sự thay đổi cấu hình không gian của protein và chức năng của nó Bệnh đinh Đoàn Long huyết, hay tyrosinemia, xảy ra do thiếu hụt các enzym tyrosine transaminase và p-hydroxyphenylpyruvic acid oxidase Bệnh cường tyrosine rất hiếm gặp và chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng người mắc bệnh này có hàm lượng tyrosine cao trong máu và nước tiểu, cùng với một số dị tật bẩm sinh khác Trẻ sơ sinh mắc chứng tyrosine huyết thường không sống sót qua 6 tháng đầu do tổn thương gan.

Các cơ chế sửa chữa ADN

Các đột biến tự phát và gây tạo được coi là sai hỏng của gen hay ADN, đặc biệt khi tiếp xúc với liều cao của các tác nhân đột biến Đột biến là những biến đổi của ADN không được các hệ thống sửa chữa phục hồi, có thể được diễn đạt qua công thức: “đột biến = sai hỏng ADN – sửa chữa ADN” Cả sinh vật prokaryote và eukaryote đều sở hữu các hệ thống sửa chữa ADN với nhiều enzym khác nhau Khi hệ thống sửa chữa không khắc phục được sai hỏng, sẽ hình thành các tế bào hay cơ thể đột biến, và nếu sai hỏng quá nhiều, các cơ thể này thường chết Sự sống phụ thuộc vào sự cân bằng giữa chính xác trong sao chép thông tin di truyền và sự xuất hiện của đột biến, mà đột biến có thể là nguồn nguyên liệu cho tiến hóa Các hệ thống sửa chữa ADN đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự hài hòa này.

Dựa trên cơ chế hoạt động, các cơ chế sửa chữa ADN được phân chia thành ba nhóm chính: 1) cơ chế phục hồi trực tiếp, 2) cơ chế sửa chữa bằng cắt bỏ, và 3) một số cơ chế sửa chữa khác Dưới đây là một số mô hình sửa chữa ADN.

6.5.1 Các cơ chế phục hồi trực tiếp

6.5.1.1 Cơ chế sửa chữa ghép đôi sai nhờ chức năng đọc sửa của ADN polymerase

Tần số đột biến thay thế nucleotide ở các gen vi khuẩn dao động từ 10^-11 đến 10^-7 mỗi lần phân bào, trong khi thực nghiệm cho thấy lỗi sao chép của ADN polymerase có thể cao hơn, khoảng 10^-5 Sự khác biệt này được giải thích nhờ chức năng đọc sửa của hoạt tính exonuclease 3’→5’ có trong hầu hết các enzym ADN polymerase ở prokaryote và eukaryote Khi một nucleotide được kết cặp sai trong quá trình sao chép ADN, enzym ADN polymerase có khả năng nhận diện lỗi, dẫn đến việc sao chép tạm dừng để loại bỏ và thay thế nucleotide sai Sau khi sửa chữa, enzym ADN polymerase tiếp tục quá trình sao chép trên mạch ADN.

Hoạt tính đọc sửa và exonuclease 3’→5’ của ADN polymerase đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì độ ổn định của gen, điều này được chứng minh qua các đột biến gây đột biến (mutator mutation) ở E coli Các chủng vi khuẩn mang đột biến này có tần số đột biến cao hơn so với các chủng đối chứng, đặc biệt liên quan đến các gen mã hóa cho protein sửa chữa ADN thiết yếu Một ví dụ điển hình là gen mutD của E coli, mã hóa cho tiểu phần ε của enzym ADN polymerase III, trong đó đột biến mutD làm mất hoạt tính đọc sửa chiều 3’→5’ của enzym này.

Do vậy, nhiều nucleotide đ−ợc lắp ráp sai mà không đ−ợc sửa chữa, dẫn đến đột biến Đinh Đoàn Long

6.5.1.2 Sửa chữa phức kép pyrimidine bằng cơ chế quang phục hoạt

Cơ chế quang phục hoạt (photoreactivation repair) cho phép phục hồi các đột biến phức kép pyrimidine, đặc biệt là T::T, trở về dạng nguyên thủy khi tiếp xúc với ánh sáng có bước sóng từ 320 - 370nm Enzym photolyase, được mã hóa bởi gen phr, sẽ được kích hoạt bởi phôtôn ánh sáng, giúp "phá vỡ" liên kết cộng hóa trị giữa các pyrimidine liền kề trong phân tử ADN Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang đột biến gen phr thường mất khả năng sửa chữa quang phục hoạt Enzym photolyase có mặt ở vi khuẩn và một số eukaryote, nhưng không tồn tại ở người và các động vật có vú khác.

6.5.1.3 Sửa chữa sai hỏng ADN gây ra do alkyl hóa

Các hợp chất alkyl hóa như MMS và EMS có khả năng chuyển nhóm alkyl vào các bazơ nitơ tại các vị trí khác nhau, chẳng hạn như nguyên tử O của C-6 trong guanine Ở E coli, những tổn thương ADN do alkyl hóa tại vị trí này của guanine được sửa chữa bởi một enzym đặc biệt.

O 6 -methylguanine methyltransferase, đ−ợc gen ada mã hóa Enzym này có khả năng nhận ra

6-methylguanine là một hợp chất có thể bị loại bỏ nhóm methyl, giúp khôi phục bazơ nitơ này về dạng gốc Cơ chế tương tự cũng được phát hiện để sửa chữa các thymine bị alkyl hóa.

Những đột biến ở những gen mã hóa những enzym sửa chữa ADN này th−ờng làm tăng tần số đột biến tự phát

6.5.2 Cơ chế sửa chữa bằng cắt bỏ

Cơ chế sửa chữa DNA chủ yếu liên quan đến việc loại bỏ các bazơ nitơ và nucleotide sai hỏng, sau đó thay thế bằng các bazơ và nucleotide đúng Các cơ chế này được phân chia thành hai loại chính: sửa chữa bằng cắt bỏ bazơ nitơ và sửa chữa bằng cắt bỏ nucleotide, mỗi loại có thành phần và cách thức hoạt động riêng biệt.

6.5.2.1 Sửa chữa bằng cắt bỏ bazơ nitơ (BER)

Trong cơ chế sửa chữa bằng cắt bỏ bazơ nitơ (BER), enzym glycosylase nhận diện và loại bỏ các bazơ bị hỏng khỏi phân tử DNA.

ADN được phục hồi bằng cách cắt bỏ liên kết glycoside giữa bazơ và đường deoxyribose của nucleotide hỏng Sau đó, các enzym sẽ cắt bỏ phần khung đường-phosphate ở trước và sau vị trí thiếu bazơ nitơ, giải phóng khung đường và tạo ra một đoạn mạch ADN đơn "rỗng".

The empty DNA strand will later be filled with correctly paired nucleotides through the action of the enzyme DNA polymerase, which uses the complementary DNA strand as a template, along with the enzyme DNA ligase.

Bazơ sai hỏng a) Các vị trí cắt bazơ sai hỏng theo kiểu BER

Hình 6.14 Sơ đồ minh họa mô hình sửa chữa ADN bằng cắt bỏ bazơ nitơ (BER) ở E coli.

Vị trí cắt 2 b) Các b−ớc của quá trình sửa chữa kiểu BER

(1) ADN glycosylase cắt bazơ sai hỏng (cắt 1)

(2) AP endonuclease cắt khung ADN tại vị trí thiếu bazơ (cắt 2)

(3) ADN phosphodiesterase cắt một đoạn khung tại vị trí sai hỏng

(4) ADN polymeraseI tổng hợp theo chiÒu 5’ → 3’

(5) ADN ligase “hàn kín” mạch ADN đ−ợc sửa chữa

6.5.2.2 Sửa chữa bằng cắt bỏ nucleotide (NER)

Năm 1964, hai nhóm nghiên cứu đã phát hiện các đột biến mẫn cảm với chiếu xạ UV ở E coli, được gọi là thể đột biến uvrA, có tần số đột biến cao hơn so với các chủng khác Các thể đột biến này chỉ có khả năng sửa chữa sai hỏng ADN kiểu “phức kép thymine” khi có ánh sáng, cho thấy cơ chế sửa chữa có thể là quang phục hoạt Tuy nhiên, các chủng kiểu dại vẫn có thể sửa chữa sai hỏng này trong bóng tối, dẫn đến giả thuyết về sự tồn tại của một hệ thống sửa chữa ADN không phụ thuộc vào ánh sáng, hiện nay được biết đến là hệ thống sửa chữa bằng cắt bỏ nucleotide (NER).

Hệ thống NER không chỉ khắc phục các sai hỏng kiểu "phức kép thymine" mà còn sửa chữa nhiều sai hỏng nghiêm trọng khác trong phân tử ADN sợi kép Hệ thống này, được mô tả trong Hình 6.15, hoạt động ở E coli và bao gồm bốn protein UvrA, UvrB, UvrC và UvrD, được mã hóa bởi các gen tương ứng uvrA, uvrB, uvrC và uvrD Một phức hệ bao gồm hai tiểu phần UvrA và một tiểu phần UvrB (Uvr2A-B) di chuyển dọc theo phân tử ADN Khi phức hệ này phát hiện "phức kép pyrimidine" hoặc các sai hỏng nghiêm trọng khác, các tiểu phần UvrA sẽ tách ra khỏi phức hệ Uvr2A-B.

B, và thay vào đó là sự đính kết của 1 UvrC

Sự liên kết của UvrB-C tại vị trí sai hỏng gây ra việc cắt mạch đơn ADN khoảng 4 nucleotide về phía đầu 3’ do UvrB thực hiện và 7 nucleotide về phía đầu khác.

UvrB sau đó rời khỏi phân tử ADN và UrvD liên kết vào đoạn phía đầu 5’ có đầu 3’-

UvrD là một helicase có chức năng giãn xoắn ADN giữa hai vị trí cắt, giúp giải phóng đoạn cắt Sau đó, ADN polymerase I lấp đầy đoạn rỗng bằng nucleotide theo chiều 5’→3’ Cuối cùng, ADN ligase thực hiện việc nối liên kết phosphodieste giữa hai đoạn ADN Hệ thống sửa chữa này dựa trên quá trình cắt bỏ nucleotide.

Hình 6.15 Sơ đồ minh họa mô hình sửa chữa ADN bằng cắt bỏ nucleotide (NER) ở E coli.

 Phức hệ UvrAB tr−ợt dọc phân tử ADN và phát hiện vị trí sai háng

UvrC thay thÕ UvrA tại vị tri sai háng

Vị trí cắt đầu 5’ Vị trí cắt đầu 3’

Cắt đoạn ADN sai hỏng tại các đầu 5’ và 3’ t−ơng ứng bởi UvrB và UvrC

UvrD giãn xoắn vùng ADN bị cắt, giải phóng đoạn sai hỏng

ADN pol I tổng hợp bù đoạn ADN rỗng

 ADN ligase nèi đoạn sửa đổi

Quá trình sửa ADN kÕt thóc

Các bệnh di truyền ở ng−ời do sai hỏng trong bộ máy sửa chữa ADN

Bệnh khô da sắc tố (XP) là một trong những bệnh di truyền đầu tiên do sai hỏng trong cơ chế sửa chữa ADN, khiến bệnh nhân có nguy cơ cao mắc ung thư da khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời XP liên quan đến đột biến ở ít nhất 9 gen khác nhau, trong đó 6 gen (XPA, XPB, XPC, XPD, XPF và XPG) là thiết yếu cho hệ thống sửa chữa ADN kiểu NER Các nghiên cứu cho thấy các gen này là thành phần của phức hệ NER có hoạt tính excinulase, với ít nhất 17 chuỗi polypeptide Ngoài XP, còn có hai hội chứng khác liên quan đến sai hỏng cơ chế NER là hội chứng Cockayne, gây ra sự chậm phát triển và thiểu năng trí tuệ mà không làm tăng nguy cơ ung thư da, và chứng loạn dưỡng biểu bì lông, đặc trưng bởi chiều cao thấp, tóc dễ gãy, và trí tuệ kém phát triển Cả hai hội chứng này đều có liên quan đến cơ chế sửa chữa NER và bước phiên mã các gen có liên quan.

Bệnh nhân XP không chỉ gặp các bất thường về tế bào da mà còn có rối loạn thần kinh do sự chết sớm của tế bào thần kinh Nghiên cứu về hiệu ứng này cho thấy sự tích lũy đột biến tế bào soma có thể là nguyên nhân dẫn đến quá trình già hóa Nếu giả thuyết này đúng, thì sự hỏng hóc trong hệ thống sửa chữa ADN sẽ thúc đẩy sự già hóa, điều này đã được ghi nhận ở bệnh nhân XP Tuy nhiên, hiện tại vẫn còn rất ít bằng chứng về mối tương quan giữa sự tích lũy đột biến soma và quá trình già hóa.

Ba bệnh di truyền liên quan đến sai hỏng trong sửa chữa ADN ở người bao gồm bệnh mất điều hòa giãn mạch (ataxia-telangiectasia), bệnh thiếu máu Fanconi và hội chứng Bloom Cả ba bệnh này đều do các alen đột biến lặn trên NST thường gây ra, với nguy cơ ung thư ác tính cao, đặc biệt là bệnh bạch cầu ác tính Bệnh nhân mất điều hòa giãn mạch có độ nhạy cao với tia xạ ion hóa do sai hỏng trong cơ chế sửa chữa ADN, trong khi bệnh nhân thiếu máu Fanconi gặp khó khăn trong việc loại bỏ các cấu trúc vắt chéo giữa các mạch ADN Hội chứng Bloom làm tăng nguy cơ đứt gãy NST, dẫn đến biến dạng và trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc tử Cơ chế bệnh lý của mất điều hòa giãn mạch liên quan đến sai hỏng enzym kinase, trong khi hội chứng Bloom do sai hỏng enzym ADN helicase Ngoài ra, sai hỏng trong cơ chế sửa chữa MMR cũng có thể dẫn đến ung thư di truyền không polip Những sai hỏng này cho thấy mối liên hệ giữa các cơ chế sửa chữa ADN và nguy cơ ung thư ở người Để tìm hiểu thêm về các gen liên quan, có thể tham khảo trang web www3.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM/.

Các cơ chế tái tổ hợp ADN

Trong quá trình giảm phân, hiện tượng trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể tương đồng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường biến dị tổ hợp ở các loài sinh sản hữu tính Nhiều gen liên quan đến sửa chữa ADN cũng tham gia vào quá trình này, cho thấy mối liên hệ giữa tái tổ hợp và sửa chữa ADN Ở sinh vật nhân thực, trao đổi chéo xảy ra khi hình thành phức hệ tiếp hợp trong kì đầu giảm phân I, cấu trúc này bao gồm ribonucleoprotein Tuy nhiên, hiện tượng trao đổi chéo gần như không xảy ra ở ruồi giấm đực, trong khi ở ruồi giấm cái, các đột biến liên quan đến gen c3G dẫn đến việc không hình thành phức hệ tiếp hợp và không có trao đổi chéo Điều này cho thấy sự hình thành phức hệ tiếp hợp có mối liên hệ mật thiết với hiện tượng trao đổi chéo và tái tổ hợp ADN.

6.7.1 Trao đổi chéo là sự đứt - nối của các đoạn ADN tương đồng

Nghiên cứu về trao đổi chéo giữa các phân tử ADN chủ yếu dựa vào E coli và S cerevisiae Các phân tích hóa sinh cho thấy các dòng đột biến này thiếu protein và enzym quan trọng cho quá trình tái tổ hợp ADN.

Nhiều mô hình nghiên cứu tái tổ hợp ADN hiện nay dựa trên mô hình do Holliday công bố năm 1964, người đã có những giải thích tiên phong về hiện tượng đứt ra, nối lại và sửa chữa ADN Hình 6.16 minh họa mô hình Holliday cùng với các sửa đổi dựa trên những hiểu biết gần đây.

Sự trao đổi chéo giữa hai phân tử ADN bắt đầu khi enzym endonuclease cắt một mạch đơn trên cả hai phân tử ADN tương đồng Các đoạn mạch đơn ADN ở hai bên vị trí cắt được chuyển chỗ nhờ vào protein liên kết mạch đơn (SSB) và enzym helicase Enzym helicase giúp giãn xoắn phân tử ADN sợi kép gần vị trí cắt Tại E coli, phức hệ RecBCD có hai hoạt tính quan trọng, bao gồm endonuclease để cắt mạch đơn ADN và helicase để giãn xoắn ADN tại vị trí đứt.

Các mạch đơn trong ADN có khả năng trao đổi vị trí với nhau và sau đó sẽ kết hợp với các thành phần bổ sung tương ứng trên hai mạch bổ sung nguyên vẹn Quá trình này được xúc tác bởi các protein kiểu RecA, có mặt ở cả prokaryote và eukaryote Các protein kiểu RecA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tái tổ hợp mạch đơn, cho phép một mạch đơn của ADN sợi kép này thay thế một đoạn tương đồng trên phân tử ADN sợi kép khác.

RecA thóc ®Èy sù trao đổi tương đồng giữa các mạch đơn của hai phân tử

ADN sợi kép t−ơng đồng qua hai bước

Trong b−ớc thứ nhất, một mạch đơn của chuỗi xoắn kép đứt ra rồi đổi chỗ với mạch t−ơng đồng hoàn toàn

Quá trình này bao gồm việc kết cặp bổ sung với mạch nguyên vẹn còn lại Ở bước thứ hai, sự đổi chỗ tương tự diễn ra trên mạch đơn tại vị trí đổi chỗ đầu tiên Protein đóng vai trò quan trọng trong các bước này.

RecA điều hòa quá trình trao đổi chéo bằng cách liên kết với mạch ADN không kết cặp, giúp mạch này tìm kiếm trình tự tương đồng Khi trình tự tương đồng được phát hiện, RecA thúc đẩy sự đổi chỗ của một mạch đơn với mạch không kết cặp Đặc biệt, nếu trình tự tương đồng có sẵn ở dạng mạch đơn, khả năng tạo ra "trao đổi chéo" của RecA sẽ tăng lên hơn 50 lần.

ADN ligase nối lại các mạch đơn bị đứt thông qua liên kết phosphodiester Khi các vị trí đứt trên hai phân tử ADN không tương đồng, cần thực hiện thêm một số biến đổi trước khi ADN ligase có thể xúc tác phản ứng nối Những biến đổi này bao gồm việc cắt bỏ nucleotide bởi enzym exonuclease và hoạt động tổng hợp sửa chữa của ADN polymerase Các sự kiện này được mô tả thông qua các dạng tái tổ hợp trung gian gọi là các dạng χχχχ.

(a) Kết cặp NST tương đồng

(b) Hình thành “vết đứt" trên mỗi mạch đơn

Helicase và protein liên kết mạch đơn

(c) Các mạch đơn đổi chỗ sau khi đứt

(d) Các mạch đơn trao đổi chéo

ADN ligase (cã thÓ cã exonuclease và ADN polymerase hoạt động trước đó)

(e) Hình thành “cầu” liên kết cộng hóa trị mạch đơn

(f) Cấu hình không gian 3-D sau khi hình thành “cầu” liên kết

Cấu hình không gian t−ơng ứng

ADN ligase (cã thÓ cã exonuclease và ADN polymerase hoạt động trước đó)

Cơ chế tái tổ hợp giữa các nhiễm sắc thể tương đồng được mô hình hóa bởi Robin Holliday (1964) và được cập nhật với những hiểu biết gần đây Quá trình này diễn ra khi các mạch ADN kết cặp bổ sung nhờ hoạt động của enzym, dẫn đến sự hình thành hai phân tử ADN tái tổ hợp Ở E coli, sự giải phóng dạng χ phụ thuộc vào sự biểu hiện của gen recG hoặc gen ruvC, có vai trò trong việc sửa chữa sai hỏng ADN do tia UV Mỗi gen này mã hóa một endonuclease, xúc tác phản ứng cắt mạch đơn tại vị trí đứt-nối.

Có nhiều cơ chế tái tổ hợp tương đồng, như mô hình đứt-nối mạch kép ở S cerevisiae do Jack Szostak và Franklin Stahl cùng đồng nghiệp đề xuất năm 1983 Trong mô hình này, sự đứt-nối xảy ra trên một trong hai phân tử ADN tương đồng, nhưng trên cả hai mạch Tại vị trí đứt nối, một đoạn ADN “rỗng” được hình thành trên cả hai mạch Mỗi đầu của một mạch đơn tại vị trí đứt “xâm lấn” vào chuỗi kép nguyên vẹn, thay thế các mạch tương đồng trong vùng này Cuối cùng, các trình tự mạch đơn “rỗng” được lấp đầy nhờ hoạt động tổng hợp của hệ thống sửa chữa ADN, với sự hình thành đồng thời của hai mạch.

"Cầu" trao đổi chéo trên hai mạch đơn của các đoạn NST tương đồng bị đứt bởi enzym endonuclease, tương tự như mô hình Holliday Cả hai mô hình này giúp giải thích sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp của các dấu chuẩn di truyền bên cạnh các vị trí trao đổi chéo.

6.7.2 Trao đổi chéo trong cơ chế sửa chữa ADN Đến đây, chúng ta mới chỉ nói đến sự tái tổ hợp di truyền do sự đứt-nối của các nhiễm sắc tử và sự trao đổi tương hỗ giữa các phần tương đồng của chúng Tuy vậy, các phân tích bộ bốn ở Ascomycetes cho thấy sự trao đổi nh− vậy không phải lúc nào cũng tương hỗ Điều này được phát hiện thấy trong phép lai giữa hai dạng đột biến liên kết gần ở Neurospora Cụ thể là, khi người ta tiến hành lai hai dạng đột biến liên kết gần m1 và m2 là m1m2 + với m1 +m2 (alen có dấu “ + ” là kiểu dại), ng−ời ta thu đ−ợc 4 cặp nang có kiểu hình sau: 1) cặp số 1 là m1 +m2; 2) cặp số 2 là m1 +m2 +; 3) cặp số 3 là m1m2 + và 4) cặp số 4 là m1m2 + (giống cặp số 3) Nh− vậy, xuất hiện kiểu hình kiểu dại m1 +m2 +, nhưng đáng lưu ý nhất là không xuất hiện kiểu hình đột biến kép m1m2 Nếu sự tái tổ hợp tương đồng xảy ra, thì bất cứ khi nào thu được kiểu hình kiểu dại m1 +m2 + thì cũng phải thu đ−ợc kiểu hình đột biến kép m1m2 ở đây, điều này không xảy ra; đồng thời, tỉ lệ kiểu hình m2 + : m2 đ−ợc mong đợi là 2 : 2, mà trong thực tế lại là 3 : 1 Các nghiên cứu phân tử sau này cho thấy, đã có hiện t−ợng

“chuyển đổi” một alen m2 thành m2 +, và sự tái tổ hợp không tương đồng này được gọi là sự đổi gen

Sự đổi gen không phải do đột biến ngược, mà tần số tái tổ hợp của các dấu chuẩn gần vị trí trao đổi chéo đạt 50% Hiện tượng sửa chữa ADN diễn ra đồng thời với quá trình trao đổi chéo, dẫn đến sự kết cặp sai trong quá trình này.

Các chuỗi dị xoắn kép a) b) a + m + b + m + m a b m + m a + b + m + m + a b m +

Cắt bỏ và tổng hợp sửa sai

Hình 6.17 Sửa chữa ADN kiểu “đổi gen” đồng thời với trao đổi chéo tương đồng.

Trong nghiên cứu về đột biến gen his1 ở nấm men, các dấu chuẩn liên kết gần cho thấy việc đổi gen diễn ra thường xuyên hơn so với tái tổ hợp tương đồng, với 980 trường hợp được phân tích.

1081 nang ph©n tÝch cã kiÓu h×nh kiÓu dại his1 + là do đổi gen, trong khi chỉ có

101 nang là kết quả của tái tổ hợp tương đồng Đặc điểm nổi bật nhất của việc

Các yếu tố di truyền vận động (TE)

6.8.1 Cây ngô và hiện t−ợng “gen nhảy”

Ngô là một trong những cây lương thực quan trọng nhất ở Việt Nam và trên thế giới, với lịch sử trồng trọt bắt đầu từ khoảng 5000 năm trước tại Trung Mỹ Khi Columbus phát hiện ra Châu Mỹ, người dân bản địa đã sở hữu nhiều giống ngô đa dạng về màu sắc như đỏ, xanh lam, vàng, trắng, tím, sọc và đốm Năm 1948, nhà khoa học Barbara McClintock đã công bố nghiên cứu về các giống ngô “sọc” và “đốm”, cho thấy chúng là kết quả của đột biến do yếu tố di truyền vận động, và bà đã nhận giải Nobel vào năm 1983 cho công trình này Các trình tự ADN có khả năng vận động cũng đã được phát hiện trong hệ gen của hầu hết các loài sinh vật, chiếm một tỷ lệ đáng kể, ví dụ như ở ngô, hơn một nửa hệ gen liên quan đến hoạt động của các yếu tố di truyền vận động (TE), trong khi ở người, khoảng 40% trình tự hệ gen cũng liên quan đến các yếu tố TE.

6.8.2 Các loại yếu tố di truyền vận động

Có nhiều loại TE (transposable elements) với cấu trúc và đặc điểm hoạt động đa dạng, được phát hiện ở vi khuẩn, nấm, sinh vật đơn bào, thực vật và động vật.

Khi các yếu tố di truyền (TE) vận động, chúng có thể gây đứt đoạn nhiễm sắc thể (NST) và dẫn đến đột biến Mặc dù mỗi loại TE có những đặc tính riêng, nhưng chúng được phân loại thành ba nhóm chính dựa trên cách thức vận động trong hệ gen Nhóm đầu tiên bao gồm các TE kiểu cắt-dán.

NST, hay các nhiễm sắc thể khác nhau, luôn được tác động bởi enzyme đặc biệt là transposase Nhóm yếu tố TE, khi di chuyển, đồng thời thực hiện quá trình sao chép.

Bảng 6.1 Phân loại các yếu tố di truyền vận động (TE) theo cơ chế vận động

Kiểu ví dụ Sinh vật chủ

I Các TE kiểu cắt - dán

Các loại yếu tố IS (ví dụ: IS50) Vi khuẩn Các yếu tố composite (vi dụ: Tn5) Vi khuẩn

Các yếu tố Ac/Ds Ngô

Các yếu tố P Ruồi giấm

Các yếu tố mariner Ruồi giấm

Các yếu tố hobo Ruồi giấm

Các yếu tố Tc1 Giun tròn

II Các TE kiểu sao chép

Các yếu tố Tn3 Vi khuẩn

III Các TE kiểu phiên mt ng−ợc

A Các TE kiểu phiên mã ng−ợc (còn gọi là retrotransposon, hay LTR = long tandem repeats)

Ty1 NÊm men copia Ruồi giấm gypsy Ruồi giấm

Các yếu tố F, G và I Ruồi giấm

Các retrosposon kéo dài đầu mút nhiễm sắc thể (ví dụ: HeT-A, TART)

LINE (vÝ dô: L1) Ng−êi

SINE (vÝ dô: Alu) là nhóm yếu tố di truyền (TE) thứ hai, mã hóa cho enzym transposase, giúp điều khiển sự tương tác với vị trí đích trong hệ gen Trong quá trình này, TE được sao chép và một bản sao được gắn vào vị trí mới, trong khi bản gốc vẫn giữ nguyên vị trí cũ, do đó chúng được gọi là TE kiểu sao chép Nhóm TE thứ ba thực hiện quá trình di chuyển thông qua việc gắn bản sao của trình tự TE được phiên mã ngược từ ARN vào vị trí mới, với sự tham gia của enzym phiên mã ngược reverse transcriptase, và được gọi là retrotransposon Nhiều TE trong nhóm này liên quan đến retrovirus, do đó còn được gọi là TE kiểu retrovirus, trong khi một số TE khác có cấu trúc giản lược được gọi là retroposon Hiện nay, TE kiểu cắt-dán được tìm thấy ở cả prokaryote và eukaryote, trong khi TE kiểu sao chép chỉ thấy ở prokaryote và TE kiểu phiên mã ngược chỉ thấy ở eukaryote.

6.8.3 Các yếu tố di truyền vận động ở prokaryote

Mặc dù các yếu tố di truyền (TE) đầu tiên được phát hiện ở các loài eukaryote, nhưng các TE được hiểu rõ nhất ở mức độ phân tử lại là từ vi khuẩn Trong vi khuẩn, có ba loại TE chính: (1) các trình tự cài (yếu tố IS), (2) các yếu tố composite (dạng tích hợp) và (3) các yếu tố Tn3 Các yếu tố IS có cấu trúc đơn giản, chỉ chứa gen mã hóa cho các protein liên quan đến vận động của TE, trong khi các yếu tố composite và Tn3 có cấu trúc phức tạp hơn với nhiều gen mã hóa cho các sản phẩm không liên quan đến hoạt động vận động của TE.

6.8.3.1 Các yếu tố cài IS Đây là các TE có cấu tạo đơn giản nhất Chúng đ−ợc gọi là các yếu tố cài vì chúng có thể gắn vào nhiều vị trí khác nhau trên NST hoặc trên plasmid của vi khuẩn Các yếu tố

Các yếu tố IS có kích thước nhỏ, thường dưới 2500 bp, và chứa các gen liên quan đến sự vận động của chúng Loại nhỏ nhất, IS1, dài 768 bp, được giới hạn bởi hai trình tự lặp lại ngược chiều gọi là ITR (inverted terminal repeat) Mỗi yếu tố IS có trình tự ITR đặc thù với độ dài từ 9 đến 40 bp, và khi trình tự này bị đột biến, yếu tố IS mất khả năng vận động Điều này cho thấy ITR đóng vai trò quan trọng trong sự vận động của các yếu tố IS Nhiều yếu tố IS mang gen mã hóa cho enzym transposase, enzyme này gắn vào vị trí đầu của trình tự vận động và cắt ADN sợi kép tại vị trí gốc Việc cắt này giúp tách trình tự vận động khỏi NST hoặc plasmid, cho phép chúng di chuyển đến vị trí mới Khi gắn vào vị trí mới, IS gây ra sự nhân đôi một trình tự ngắn ở hai đầu, tạo ra hai bản sao nằm hai bên yếu tố di truyền vận động.

Những trình tự này (th−ờng gồm từ 2 đến 13 cặp nucleotide) đ−ợc gọi là các trình tự nhân đôi tại vị trí đích (hình 6.19)

NST vi khuẩn có thể chứa nhiều bản sao khác nhau của cùng một loại yếu tố IS Ví dụ, mỗi tế bào E coli thường mang từ 6 đến 10 bản sao của yếu tố IS1.

Plasmid còng cã thÓ mang yÕu tè

IS Chẳng hạn, plasmid F điển hình th−ờng chứa ít nhất hai yếu tố IS khác nhau là IS2 và IS3

Khi yếu tố IS xuất hiện trên cả nhiễm sắc thể (NST) và plasmid, hiện tượng "tái tổ hợp tương đồng" giữa các phân tử ADN khác nhau xảy ra Sự tái tổ hợp này có vai trò quan trọng trong việc kết hợp plasmid F vào NST ở E coli.

E coli có ADN sợi kép, mạch vòng Khi NST và plasmid tái tổ hợp tại vị trí IS, plasmid nhỏ kết hợp vào NST, tạo thành ADN vòng tròn duy nhất trong tế bào Sự kết hợp này hình thành các dòng Hfr, có khả năng chuyển NST sang tế bào khác qua tiếp hợp Các dòng Hfr khác nhau có vị trí gắn kết plasmid F khác nhau trên NST, do các yếu tố IS điều hòa gắn kết nằm ở các vị trí khác nhau Các yếu tố IS không chỉ tạo ra dòng Hfr mà còn tăng khả năng trao đổi gen giữa các chủng vi khuẩn, dẫn đến nhiều biến dị tổ hợp Đây là một cơ chế cơ bản, cùng với đột biến, tạo ra nguyên liệu phong phú cho sự tiến hóa ở vi khuẩn.

Các TE kiểu composite, hay còn gọi là gen nhảy tích hợp, là các trình tự vận động cắt – dán có ở vi khuẩn, ký hiệu Tn, được hình thành từ sự hiện diện của hai trình tự IS gần nhau Khi các yếu tố IS này di chuyển trong hệ gen, các vùng trình tự nằm giữa chúng cũng được vận động, dẫn đến việc hai yếu tố IS có khả năng "bắt giữ" một đoạn ADN không có khả năng vận động và "truyền" khả năng vận động cho đoạn này Ví dụ, trong Tn9, hai yếu tố IS vùng biên (768 bp) nằm cùng chiều, trong khi ở Tn5, chúng nằm ngược chiều (1533 bp) Đoạn trình tự giữa hai yếu tố IS có thể chứa các gen không liên quan đến sự vận động của gen, nhưng thực tế cho thấy, đoạn này ở cả ba loại yếu tố Tn đều mang các gen kháng kháng sinh.

Trong một số trường hợp, các yếu tố IS ở hai đầu vùng biên của trình tự vận động kiểu composite có thể khác nhau Ví dụ, ở yếu tố Tn5, trình tự IS vùng biên phải là IS50R, chứa mã hóa cho transposase và thúc đẩy sự vận động của gen, trong khi đó, trình tự IS vùng biên trái (IS50L) lại không có đặc tính này Sự khác biệt giữa chúng nằm ở một cặp nucleotide duy nhất, đóng vai trò quyết định hoạt tính của transposase.

Hai mạch đơn của trình tự ADN đích đ−ợc cắt tại các vị trí khác nhau (mũi tên)

Yếu tố IS cài vào đoạn rỗng ADN đ−ợc tạo ra do enzym cắt kiểu chữ chi

Sự đa dạng về cấu trúc của nhiễm sắc thể (NST)

7.1.1 Các nhiễm sắc thể có thể ở dạng mạch thẳng hoặc vòng

Trước đây, người ta cho rằng tế bào prokaryote chỉ có một NST mạch vòng, trong khi tế bào eukaryote có nhiều NST mạch thẳng Tuy nhiên, nghiên cứu về nhiều loài prokaryote đã chỉ ra rằng quan điểm này không còn chính xác Mặc dù hầu hết các prokaryote như E coli và B subtilis chỉ có một NST mạch vòng, nhưng cũng có nhiều tế bào prokaryote chứa nhiều NST mạch thẳng hoặc cả hai loại Số lượng NST ở prokaryote có thể dao động từ 2 đến dưới 50, trong khi ở một số eukaryote, số lượng NST trong mỗi tế bào có thể lên tới hàng nghìn, như ở động vật nguyên sinh Tetrahynema.

Bảng 7.1 Số l−ợng nhiễm sắc thể (NST) ở các sinh vật khác nhau

NST Số bản sao mỗi NST Dạng

NST KÝch th−íc hệ gen (Mb) Prokaryote

Caenorhabditis elegans (giun tròn) 6 2 thẳng 97

Arabidopsis thaliana (cải dại) 5 2 thẳng 125

Drosophila melanogaster (ruồi giấm) 4 2 thẳng 180

Nh©n nhá: 2 Nh©n lín: 10 - 10.000 thẳng 220

Fugu rubripes (cá xem sao) 22 2 thẳng 365

Mus musculus (chuột) 19 + X và Y 2 thẳng 2500

Homo sapiens (ng−ời) 22 + X và Y 2 thẳng 2900

Dù ở dạng mạch thẳng hay vòng, nhiễm sắc thể (NST) đều gặp những thách thức trong việc sao chép và duy trì thông tin di truyền NST mạch vòng cần enzym topoisomerase để tách các phân tử ADN con sau khi sao chép, tránh tình trạng chúng lồng vào nhau Ngược lại, các phân tử ADN của NST mạch thẳng cần được bảo vệ khỏi enzym phân giải (nuclease) có sẵn trong tế bào trong quá trình sao chép.

7.1.2 Đặc tr−ng số l−ợng nhiễm sắc thể của tế bào

Các tế bào prokaryote thường chỉ có một bản sao NST hoàn chỉnh trong vùng nhân (nucleoid) Khi phân chia nhanh, nhiều phần của NST đang sao chép có thể tồn tại dưới dạng hai hoặc bốn bản sao Ngoài ra, prokaryote còn có một hoặc nhiều phân tử ADN dạng vòng nhỏ gọi là plasmid, thường không mang gen thiết yếu cho sự sinh trưởng nhưng chứa gen cần thiết cho các hoạt động khác như khả năng kháng kháng sinh Một tế bào vi khuẩn có thể chứa nhiều bản sao của các plasmid này.

Phần lớn tế bào eukaryote là lưỡng bội, chứa hai bản sao của mỗi NST, với một bản từ bố và một bản từ mẹ Tuy nhiên, không phải tất cả đều lưỡng bội; một số tế bào là đơn bội (như tinh trùng và trứng) chỉ có một bản sao của mỗi NST, trong khi tế bào đa bội có nhiều hơn hai bản sao Một số sinh vật duy trì tế bào trưởng thành ở dạng đa bội, với số bản sao của NST có thể lên đến hàng trăm hoặc hàng nghìn Sự tăng bội số này cho phép tế bào sản sinh nhanh lượng lớn ARN và protein Chẳng hạn, tế bào nhân khổng lồ trong tủy xương người là tế bào đa bội chuyên hóa, chứa khoảng 128 bản sao của mỗi NST, có khả năng sản sinh hàng nghìn tiểu cầu, thành phần quan trọng trong máu Các tế bào nhân khổng lồ duy trì mức độ trao đổi chất cao để sản xuất nhanh tiểu cầu, nhưng sau khi biệt hóa sẽ ngừng phân chia do sự khó khăn trong phân ly số lượng lớn NST.

NST ở tế bào eukaryote luôn đ−ợc “bao gói” trong nhân tế bào

Bộ máy Golgi Nh©n NhiÔm sắc thể

Vùng nhân Nhiễm sắc thể

Tế bào prokaryote (nhân sơ) và eukaryote (nhân thật) có sự khác biệt rõ rệt về kích thước và cấu trúc Tế bào eukaryote có đường kính khoảng 10 µm, trong khi tế bào prokaryote chỉ khoảng 1 µm Trong tế bào eukaryote, nhiễm sắc thể (NST) nằm trong vùng nhân, chiếm phần lớn không gian tế bào và được bao bọc bởi màng nhân, trong khi vùng nhân của tế bào prokaryote không có màng bao bọc và còn chứa plasmid Ngoài ra, tế bào đơn bội có một bản sao của mỗi NST, trong khi tế bào lưỡng bội có hai bản sao.

Giá trị C của một loài, đại diện cho ADN tổng số của hệ gen đơn bội, phản ánh kích thước hệ gen và mức độ tổ chức phức tạp của cơ thể sinh vật Các loài prokaryote thường có hệ gen nhỏ hơn 10 Mb, trong khi eukaryote đơn bào có hệ gen thường nhỏ hơn 50 Mb Nguyên sinh động vật với cấu trúc cơ thể phức tạp có thể sở hữu hệ gen lớn hơn 200 Mb, và các sinh vật đa bào có hệ gen lớn hơn nhiều, có thể lên tới 100.000 Mb.

Mối tương quan giữa kích thước hệ gen và mức độ tổ chức phức tạp của cơ thể không hoàn toàn chính xác Nhiều sinh vật có mức độ tổ chức tương tự nhưng lại có kích thước hệ gen khác nhau Chẳng hạn, ruồi giấm có hệ gen nhỏ hơn châu chấu, mặc dù cả hai đều có mức độ tổ chức gần giống nhau.

Lúa nước có hệ gen nhỏ hơn lúa mì đến 40 lần, cho thấy rằng số lượng gen có thể liên quan mật thiết đến mức độ tổ chức phức tạp của sinh vật hơn là kích thước của hệ gen Phân tích mật độ gen từ các hệ gen đã làm rõ xu hướng này.

Bảng 7.2 Giá trị C, số gen −ớc tính và mật độ gen ở một số loài sinh vật

−ớc tính Mật độ gen

Schizosaccharomyces pombe 12 4.900 410 b) Động vật nguyên sinh

Tetrahynema thermophilus 220 > 20.000 >90 c) Động vật không x−ơng sống

Locusta migratoria 5.000 Ch−a xác định Ch−a xác định d) Động vật có x−ơng sống

Fugu rubripes (cá xem sao) 365 > 31.000 >85

Mus musculus (chuét) 2.500 23.000 9,2 e) Thùc vËt

Fritilaria assyriaca (tulip) 120.000 Ch−a xác định Ch−a xác định Đỗ Lê Thăng - Đinh Đoàn Long

7.1.4 Các gen chiếm hầu hết hệ gen vi khuẩn

Hệ gen vi khuẩn chủ yếu được nghiên cứu thông qua vi khuẩn mô hình E coli, trong đó các gen mã hóa protein chiếm phần lớn Trình tự không mã hóa chủ yếu là các trình tự điều hòa phiên mã, với số lượng trình tự khởi đầu phiên mã rất ít do E coli sử dụng một vị trí khởi đầu để điều khiển sự biểu hiện đồng thời của nhiều gen Điểm khởi đầu sao chép trên NST không nằm trong gen mà là một vùng ngắn trên NST, chỉ chiếm vài trăm cặp bazơ nitơ trong tổng số 4,6 Mb của hệ gen, nhưng vẫn đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển bộ máy sao chép ADN.

7.1.5 Các sinh vật bậc cao có mật độ gen trong hệ gen giảm

Mật độ gen trong hệ gen sinh vật bậc cao giảm do hai yếu tố chính: kích thước mỗi gen và chiều dài đoạn trình tự liên gen tăng lên Độ dài gen tăng vì sinh vật trở nên phức tạp hơn, với các cơ chế điều hòa biểu hiện nghiêm ngặt, dẫn đến việc tích lũy thêm thông tin trong các trình tự điều hòa Thêm vào đó, các gen mã hóa protein ở eukaryote thường có tính “phân mảnh”, xen kẽ giữa các exon và intron, làm tăng đáng kể độ dài gen Ví dụ, ở người, đoạn trình tự được phiên mã trung bình khoảng 27 kb, trong khi đoạn trình tự mã hóa chỉ dài khoảng 1,3 kb, cho thấy chỉ khoảng 5% nucleotide là mã hóa Ngược lại, các gen ở eukaryote bậc thấp như nấm men Saccharomyces cerevisiae có ít intron hơn, với khoảng 3% số gen chứa intron và không có intron nào dài quá 1 kb.

Các đoạn trình tự liên gen ở sinh vật bậc cao góp phần quan trọng vào việc giảm mật độ gen ADN liên gen là phần không trực tiếp liên quan đến sự biểu hiện của gen, bao gồm tổng hợp protein và ARN cấu trúc Hơn 60% hệ gen của con người là các đoạn trình tự liên gen, và chức năng của phần lớn các trình tự này vẫn chưa được xác định rõ.

Có hai loại trình tự ADN liên gen: trình tự đơn nhất và trình tự lặp lại, trong đó khoảng 1/4 là trình tự đơn nhất Những trình tự này bao gồm các đoạn ADN là "vết tích" của gen không còn hoạt động chức năng, như các gen đột biến mất chức năng, các phân đoạn của gen và các gen giả Sự xuất hiện của các gen đột biến và phân đoạn gen thường do đột biến ngẫu nhiên hoặc sai sót trong tái tổ hợp ADN Một cơ chế hình thành gen giả liên quan đến enzym phiên mã ngược, mà chỉ một số virus nhất định sử dụng để chuyển đổi ARN thành ADN sợi kép (cADN) Khi tế bào chủ bị nhiễm virus này, mARN có thể được sao chép thành cADN và sau đó lồng ghép vào hệ gen, nhưng không biểu hiện chức năng.

TiÒn-mARN mARN hoàn thiện (sau cắt intron)

Hình 7.2 Sơ đồ hóa quá trình xén intron (hoàn thiện mARN)

Bảng 7.3 Intron và trình tự lặp lại trong hệ gen các sinh vật khác nhau

(sè gen / Mb) Sè intron trung bình ở mỗi gen Tỷ lệ trình tự ADN lặp lại (%)

Saccharomyces cerevisiae 480 0,04 3,4 b) Động vật không x−ơng sống

Drosophila melanogaster 60 3 12 c) Động vật có x−ơng sống

Arabidopsis thaliana 125 3 Ch−a xác định

Oryza sativa 470 Ch−a xác định 42

Các đoạn trình tự liên gen ở sinh vật bậc cao đóng vai trò quan trọng trong việc giảm mật độ gen ADN liên gen không trực tiếp liên quan đến sự biểu hiện của gen, bao gồm tổng hợp protein và các ARN cấu trúc Hơn 60% hệ gen của con người là các đoạn trình tự liên gen, và phần lớn trong số đó vẫn chưa được hiểu rõ về chức năng.

Có hai loại trình tự ADN liên gen: trình tự đơn nhất và trình tự lặp lại Khoảng 25% trình tự ADN liên gen là các trình tự đơn nhất, bao gồm "vết tích" của các gen không còn hoạt động chức năng, như gen đột biến mất chức năng, phân đoạn gen và gen giả Các gen đột biến và phân đoạn gen hình thành do đột biến ngẫu nhiên hoặc sai sót trong tái tổ hợp ADN Một cơ chế phát sinh gen giả là nhờ enzym phiên mã ngược, mà chỉ một số virus nhất định sử dụng để chuyển đổi ARN thành ADN sợi kép (cADN) trong quá trình sinh sản.

Hệ gen ng−ời (3.200 Mb)

Gen và trình tự liên quan đến gen (1.200 Mb)

Tr×nh tù ADN liên gen (2.000 Mb) Các trình tự lặp lại phân bố khắp hệ gen (1.400 Mb)

Các trình tự liên gen khác

Các trình tự liên quan đến gen (1.152 Mb)

Các trình tự lặp lại số l−ợng biến động

Các trình tự đơn nhất

Intron và các trình tự không đ−ợc phiên m\ của gen

Các phân đoạn không hoàn chỉnh của gen

Hình 7.3 Tổ chức hệ gen ng−ời

Hệ gen của con người bao gồm nhiều loại trình tự ADN khác nhau, chủ yếu là các đoạn không mã hóa protein Theo Đỗ Lê Thăng và Đinh Đoàn Long, mARN từ tế bào chủ có thể được sao chép thành cADN, sau đó đoạn cADN này có thể được lồng ghép vào hệ gen, tuy nhiên không biểu hiện chức năng.

7.1.6 Phần lớn các trình tự liên gen ở ng−ời là các đoạn trình tự lặp lại

Sự nhân đôi và phân ly của các nhiễm sắc thể

7.2.1 Tâm động, đầu mút và các điểm khởi đầu sao chép cần thiết để duy trì các nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào ở eukaryote

Trên mỗi nhiễm sắc thể (NST) của eukaryote, các điểm khởi đầu sao chép cách nhau khoảng 30 - 40 kb và thường nằm trong các vùng trình tự không mã hóa Ngược lại, prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu sao chép duy nhất Tâm động đóng vai trò quan trọng trong việc phân ly chính xác các nhiễm sắc tử trong quá trình phân bào, điều khiển sự hình thành phức hệ nucleoprotein gọi là thể động, tương tác với bộ máy phân chia tế bào để tách các nhiễm sắc tử về hai tế bào con Mỗi NST bình thường chỉ có một tâm động; nếu không có tâm động, các NST có thể phân ly ngẫu nhiên, dẫn đến mất hoặc lặp đoạn Sự hiện diện của nhiều tâm động có thể gây ra đứt gãy NST Kích thước của tâm động rất khác nhau, từ dưới 200 bp ở S cerevisiae đến vài Mb ở nhiều eukaryote khác, thường bao gồm các đoạn ADN lặp lại.

Tâm động đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân ly nhiễm sắc thể (NST) về các tế bào con trong phân bào Mỗi NST trong cặp tương đồng có một tâm động phân ly về một tế bào con, đảm bảo sự phân chia chính xác Tuy nhiên, sự phân ly ngẫu nhiên của NST không có tâm động có thể dẫn đến mất NST, gây ra các vấn đề di truyền Ngoài ra, sự hiện diện của nhiều tâm động có thể dẫn đến sự đứt gãy của NST sau khi phân bào, ảnh hưởng đến sự ổn định di truyền của tế bào.

Kích thước và cấu trúc tâm động của một số loài được thể hiện trong Hình 7.5 Tâm động ở S cerevisiae có kích thước nhỏ và không có trình tự lặp lại, trong khi tâm động ở hầu hết các loài khác như S pombe lại có sự khác biệt rõ rệt.

D melanogaster và ng−ời) có kích th−ớc lớn hơn nhiều và mang nhiều trình tự lặp lại, trừ một đoạn ngắn

(4 – 7 kb) ở giữa tâm động – cen 1 - của S pombe không có trình tự lặp lại a) NST có một tâm động b) NST không có tâm động c) NST có hai tâm động

Mỗi nhiễm sắc tử phân ly về một tế bào con

Sự phân ly ngẫu nhiên của nhiễm sắc thể

Sự đứt gãy NST xảy ra do có nhiều hơn một tâm động a) S cerevisiae cen1

Từ 240 Kb đến vài Mb Đỗ Lê Thăng - Đinh Đoàn Long

Giống các điểm khởi đầu sao chép và tâm động, các đầu mút của

NST được kết nối bởi nhiều loại protein, trong đó các protein ở đầu mút thực hiện hai chức năng quan trọng Đầu tiên, chúng phân biệt các đầu mút thực sự của NST.

Các đoạn đứt gãy trên nhiễm sắc thể (NST) có thể xảy ra giữa các đoạn trên cùng NST hoặc giữa các NST khác trong tế bào ADN ở đầu mút có tần số tái tổ hợp cao và dễ bị phân giải, nhưng các protein gắn kết giúp bảo vệ chúng khỏi các sự kiện này Đầu mút cũng hoạt động như điểm khởi đầu sao chép, cho phép tế bào sao chép phần đầu mút Bộ máy sao chép ADN thông thường không thể sao chép hoàn chỉnh các đầu mút của NST mạch thẳng, và quá trình sao chép “bù” được thực hiện bởi enzym telomerase Khác với các phần khác của NST, phần đầu mút chỉ tồn tại ở trạng thái mạch đơn Hầu hết các đầu mút có trình tự lặp lại đơn giản, khác nhau giữa các loài, thường ngắn và giàu TC; ví dụ, đầu mút NST ở người có đơn vị trình tự lặp lại là 5’-TTAGGG-3’.

7.2.2 Sự sao chép và phân ly nhiễm sắc thể trong chu trình tế bào

Hình 7.7 tóm tắt 4 pha (giai đoạn) cơ bản của chu trình tế bào

Trong quá trình phân bào (pha M), các NST phải đ−ợc nhân đôi và phân ly về các tế bào con ở vi khuẩn, sự nhân đôi và phân li

Quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể (NST) diễn ra đồng thời và được điều hòa chặt chẽ, mặc dù cơ chế điều hòa chi tiết vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn Ở sinh vật nhân thực (eukaryote), hai quá trình này diễn ra tách biệt trong các pha khác nhau của chu trình tế bào ADN được tổng hợp trong pha S, dẫn đến sự nhân đôi NST Mỗi NST trong cặp NST nhân đôi được gọi là nhiễm sắc tử, và hai nhiễm sắc tử này được gọi là nhiễm sắc tử chị em Hai nhiễm sắc tử chị em gắn kết với nhau nhờ một nhóm phân tử gọi là cohesin, giúp duy trì sự kết dính cho đến khi chúng phân ly ở pha M.

Cấu trúc đầu mút nhiễm sắc thể ở eukaryote có đặc điểm nổi bật với hình dạng "thòng lọng", trong đó đầu 3' của mạch đơn có thể dài hàng trăm nucleotide Ở người, trình tự đơn vị lặp lại tại đầu mút nhiễm sắc thể được xác định là 5' - [TTAGGG]n - 3'.

Sự bắt cặp giữa 2 đoạn ADN sợi kép Sự bắt cặp giữa 2 đoạn ADN sợi kép

Yếu tố liên kết trình tự lặp lại đầu mút NST

Chu trình tế bào ở eukaryote bao gồm bốn giai đoạn chính: pha S, nơi NST được sao chép, và pha M, trong đó NST phân ly về các tế bào con Hai giai đoạn chuẩn bị cho các sự kiện này là pha G1 và G2 Ngoài ra, G0 là trạng thái biệt hóa của tế bào, khi tế bào không tiếp tục phân chia.

NST diễn ra ở pha M (hay nguyên phân) của chu trình tế bào Có hai sự kiện chính liên quan đến sự ph©n ly NST (h×nh 7.8)

Cặp nhiễm sắc tử chị em gắn với thoi vô sắc, được cấu tạo từ các sợi protein dài dạng vi ống Một đầu của vi ống kết nối với trung tâm tổ chức vi ống ở hai cực đối diện của tế bào Sự gắn kết của các nhiễm sắc tử với thoi vô sắc được thực hiện nhờ thể động tại tâm động.

Sự giải kết dính các nhiễm sắc tử dẫn đến sự kiện quan trọng là phân ly các nhiễm sắc tử Mỗi nhiễm sắc tử chị em được kéo về các cực đối diện của thoi

7.2.3 Cấu trúc nhiễm sắc thể thay đổi khi tế bào eukaryote phân chia

Trong chu trình tế bào, cấu trúc nhiễm sắc thể (NST) liên tục thay đổi, nhưng có hai trạng thái chính Trong quá trình nguyên phân hoặc giảm phân, NST kết đặc và xoắn chặt để đảm bảo phân ly NST diễn ra thuận lợi Ngược lại, trong giai đoạn gian kỳ giữa hai chu trình tế bào (bao gồm ba pha G1, S và G2), NST giãn xoắn để thực hiện sao chép và phiên mã.

7.2.4 Sự kết dính các nhiễm sắc tử và kết đặc nhiễm sắc thể do các protein duy trì cấu trúc nhiễm sắc thể (SMC) thực hiện

Các phức hệ protein, bao gồm các protein SMC, đóng vai trò quan trọng trong việc kết dính nhiễm sắc tử và kết đặc NST Các protein SMC tương tác với nhau qua các miền xoắn-xoắn dài, tạo thành phức hệ kết dính hai chuỗi ADN Cohesin, một phức hệ chứa SMC, là thiết yếu để gắn kết hai nhiễm sắc tử chị em Cấu trúc của cohesin được cho là một vòng lớn, bao gồm hai phân tử protein SMC và một protein phi-SMC Bằng chứng cho thấy sự kết dính này xảy ra khi hai phân tử ADN cùng “chui” qua trung tâm vòng cohesin.

Trong pha S, phân tử ADN sợi kép thực hiện quá trình nhân đôi, sau đó protein yếu tố cohesin gắn kết với cấu trúc dạng vòng quanh hai phân tử ADN mới được tạo thành, hình thành phức hệ nhiễm sắc tử chị em Trong pha M, thể động gắn vào thoi vô sắc, tiếp theo là sự giải kết dính của cohesin và phân ly các nhiễm sắc tử về hai cực tế bào.

Trung tâm tổ chức vi ống (trung tử)

Sự khởi đầu sao chÐp ADN

Sao chép kéo dài và hình thành cohesin

Nhiễm sắc tử chị em Cohesin

2 mạch đơn ADN Phân tử

ADN sợi kép, do Đỗ Lê Thăng và Đinh Đoàn Long nghiên cứu, cho thấy rằng protein phi-SMC hoạt động nhờ enzym để mở vòng cohesin Sự kết đặc của nhiễm sắc thể (NST) cần một phức hệ chứa protein SMC, được gọi là condensin Mặc dù cấu trúc và chức năng của condensin vẫn chưa được làm rõ, nhưng nó có thể có đặc điểm tương tự như cohesin và cũng tồn tại dưới dạng vòng Với cấu trúc vòng này, condensin có khả năng co ngắn NST bằng cách liên kết đồng thời với các vùng khác nhau trên NST.

Cấu trúc và vai trò của nucleosome (thể nhân)

7.3.1 Nucleosome là đơn vị cấu trúc cơ bản của nhiễm sắc thể ở eukaryote

ADN của các eukaryote đ−ợc bao gói thành các nucleosome (còn đ−ợc gọi là thể nhân) Đây chính là mức cuộn xoắn đầu tiên của ADN để tạo thành

Nucleosome là cấu trúc cơ bản của nhiễm sắc thể, bao gồm một lõi hình được tạo thành từ 8 phân tử protein histon và đoạn ADN quấn quanh chúng Trong tất cả các loài eukaryote, đoạn ADN này quấn quanh lõi protein khoảng 1,65 vòng, tạo nên sự tổ chức và bảo vệ cho vật chất di truyền.

ADN lõi luôn có chiều dài ổn định gồm

ADN nối giữa các nucleosome có chiều dài bất định, thường dao động từ 20 - 60 cặp bazơ nitơ, với giá trị trung bình đặc trưng cho mỗi loài eukaryote Cấu trúc nucleosome ảnh hưởng đến chiều dài phân tử ADN.

ADN giảm đi khoảng sáu lần, và mặc dù mức độ "nén" chưa thật cao, nucleosome vẫn đóng vai trò quyết định trong các cấu trúc tiếp theo của nhiễm sắc thể (NST) Trong mọi tế bào, có một phần ADN không được bao gói trong nucleosome, đó là những vùng ADN tham gia vào quá trình biểu hiện gen, sao chép hoặc tái tổ hợp Mặc dù không nằm trong cấu trúc nucleosome, những vùng này thường liên kết với các protein phi histon, thực hiện chức năng điều hòa trực tiếp hoặc tham gia vào các sự kiện sinh học quan trọng.

Bảng 7.4 Mật độ nucleosome và chiều dài trung bình các đoạn ADN nối ở một số loài sinh vật

Loài Mật độ nucleosome theo chiều dài lặp lại trên ADN (bp) Độ dài trung bình đoạn ADN nèi (bp) NÊm men 160 - 165 13 -18 NhÝm biÓn ~ 260 ~ 110 Ruồi giấm ~ 180 ~ 33 Ng−êi 185 - 200 38 - 53

Hình 7.10 Sơ đồ tổ chức nucleosome

Cohesin và codensin, hai thành phần quan trọng của bộ khung tế bào, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phân bào Mô hình dự đoán cho thấy chúng có cấu trúc vòng, cho phép liên kết chặt chẽ nhưng vẫn linh hoạt với các vùng khác nhau của nhiễm sắc thể.

Kú ®Çu Kú gi÷a Kú sau

Histon là nhóm protein liên kết ADN phổ biến nhất ở eukaryote, bao gồm năm loại: H1, H2A, H2B, H3 và H4 Bốn loại histon H2A, H2B, H3 và H4 tạo thành lõi nucleosome, với mỗi nucleosome gồm 8 phân tử histon (octamer), trong đó mỗi loại đóng góp 2 phân tử Histon H1, liên kết vào vùng ADN nối, được gọi là histon nối và có số lượng bằng một nửa so với các histon lõi Các histon chứa nhiều axit amin tích điện dương, cho phép chúng liên kết ổn định với ADN tích điện âm, với khoảng 20% axit amin là Lys và Arg Các protein lõi có khối lượng khoảng 11 - 15 kD, trong khi histon H1 nặng khoảng 20 kDa.

Bảng 7.5 Các đặc điểm cơ bản của các protein histon Loại histon Histon Khối l−ợng l−ợng phân tử (Da) Tỉ lệ lysine và arginine

Lâi nucleosome cã cÊu trúc hình đĩa và chỉ hình thành khi liên kết với ADN

Khi không liên kết với

ADN, các histon hình thành các tập hợp ở mức thấp hơn

Mọi histon lõi đều chứa một vùng bảo thủ cao được gọi là miền gấp nếp histon, bao gồm ba chuỗi xoắn α và hai đoạn nối không đặc trưng Sự gấp nếp giữa các cặp histon tạo ra các “dị phức kép”.

C và đuôi N khác nhau H3 và H4 tạo thành “dị phức kép H3 – H4”, rồi hai “dị phức kép” nh− vậy kết hợp với nhau tạo nên “tứ phức”

H2A và H2B cũng kết hợp với nhau tạo nên “dị phức kép H2A - H2B”, nh−ng không tạo thành “tứ phức”

Các phức kép H3 - H4 kết hợp với ADN theo một trật tự nhất định để hình thành nucleosome Quá trình này bắt đầu bằng việc tứ phức H3 - H4 gắn kết vào ADN.

Phức kép H2A-H2B kết hợp để hình thành nucleosome hoàn chỉnh Đuôi N của histon, hay còn gọi là đuôi histon, có cấu trúc dễ biến đổi và là phần dễ tiếp cận nhất trong nucleosome khi ở trong dung dịch Khả năng tiếp cận này rất rõ ràng.

Hình 7.11 mô tả cấu trúc và sự tạo phức kép của các histon lõi a) Sơ đồ duỗi thẳng của bốn histon lõi cho thấy vùng xoắn α được thể hiện bằng hình ống, với các histon có vùng xoắn α bổ sung liền kề b) Hình ảnh các dạng phức kép của histon lõi, bao gồm đuôi histon (đầu N).

Phức kép H2A-H2B và tứ phức H3-H4 được hình thành khi xử lý nucleosome bằng enzym trypsin, một loại protease cắt protein ngay sau các axit amin tích điện dương Enzym trypsin có khả năng cắt đuôi histon nhưng không tác động đến miền cuộn xoắn chặt, như miền gấp nếp Đuôi N không phải là vùng thiết yếu cho sự liên kết giữa các thành phần này.

ADN lõi kết hợp với octamer histon đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen thông qua việc thay đổi cấu trúc nucleosome Các biến đổi này bao gồm quá trình phosphoryl hoá, acetyl hoá và methyl hoá các gốc Ser và Lys ở vùng đầu N của histon.

7.3.2 Cấu trúc phân tử của nucleosome

Cấu trúc ba chiều của hạt lõi nucleosome cho thấy hoạt động chức năng của nó, với mối tương tác giữa histon và ADN giải thích lực hấp dẫn cao giữa nucleosome và ADN Sự tương tác này cũng lý giải khả năng biến dạng của ADN khi gắn vào nucleosome và sự thiếu tính đặc hiệu trong các trình tự ADN lõi Hơn nữa, nó cung cấp cái nhìn về bản chất động học và quá trình lắp ráp nucleosome Mặc dù không hoàn toàn đối xứng, nucleosome có thể được coi là có tính đối xứng hai bên, với bề mặt đĩa octamer tương tự như mặt đồng hồ, trong đó điểm giữa của đoạn 147 bp nằm ở vị trí 12 giờ.

ADN sẽ ở các vị trí 1 giờ và 11 giờ Quay nucleosome quanh trục đó

180 o sẽ thu đ−ợc hình ảnh giống với tr−ớc khi quay Mỗi “tứ phức H3-

H4 và phức kép H2A-H2B tương tác với các vùng khác nhau trên phân tử ADN Cụ thể, vùng gấp nếp histon của tứ phức H3-H4 tương tác với vùng trung tâm 60 bp trong số 147 bp của nucleosome Vùng đầu N của H3 tạo chuỗi xoắn α thứ tư để tương tác với 13 bp cuối cùng ở mỗi đầu của đoạn ADN liên kết Nếu tưởng tượng octamer histon như mặt đồng hồ, tứ phức H3-H4 chiếm nửa trên của đồng hồ, cho thấy vai trò quan trọng của nó trong nucleosome khi vừa gắn với đoạn giữa vừa gắn với hai đầu của ADN lõi.

Phức hợp H2A-H2B liên kết với khoảng 30 bp ở một bên của đoạn trung tâm dài 60 bp Nếu hình dung như một chiếc đồng hồ, vị trí kết nối của ADN với phức hợp H2A-H2B tương ứng với khoảng thời gian từ 5 giờ đến

9 giờ trên cả hai mặt đồng hồ Nh− vậy 2 phức kép H2A-H2B tạo nên phần đáy của octamer Sự tương tác ở phạm vi rộng hơn giữa “tứ phức

Tứ phức H3-H4 gắn kết với ADN lõi tại đoạn giữa và hai đầu, tạo ra sự uốn cong của phân tử ADN Điều này giúp giải thích thứ tự lắp ráp các histon vào nucleosome, đặc biệt là sự tương tác giữa phức kép H2A-H2B và ADN.

ADN để “phức kép H2A-H2B” dễ dàng gắn vào Nh−ng nếu “phức kép

H2A-H2B” liên kết với ADN trước, thì đoạn ADN liên kết tương đối

Hình 7.13 Sự đối xứng của nucleosome

Các bậc cấu trúc cao hơn của chất nhiễm sắc

7.4.1 Histon H1 gắn với đoạn ADN nối

Protein H1 là một loại protein nhỏ, tích điện dương, có vai trò quan trọng trong việc tăng cường sự liên kết giữa ADN và nucleosome Nó bảo vệ thêm khoảng 20 bp ADN nối khỏi sự phân huỷ bởi nuclease, ngoài 147 bp ADN lõi quấn quanh histon H1 liên kết với ADN tại hai vị trí khác nhau trên chuỗi xoắn kép, một ở đầu ra/vào của nucleosome và một ở giữa đoạn trình tự trung tâm Sự bảo vệ ADN của H1 chỉ diễn ra ở một phía của nucleosome, giúp kéo hai vùng ADN lại gần nhau và tăng cường sự quấn chặt quanh octamer histon H1 tạo ra một góc ổn định cho phần ADN đi vào và ra khỏi nucleosome, tuy nhiên, góc này có thể bị ảnh hưởng bởi nồng độ muối, độ pH và sự có mặt của các protein khác.

7.4.2 Sự sắp xếp các nucleosome hình thành sợi nhiễm sắc 30 nm

Histon H1 đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc bậc cao của chất nhiễm sắc Khi nồng độ muối tăng và Histon H1 được bổ sung trong ống nghiệm, các nucleosome hình thành sợi có đường kính 30 nm, đánh dấu bước tiếp theo trong quá trình đóng gói ADN Từ cấu trúc này, nhiều enzym như ARN polymerase gặp khó khăn trong việc tiếp cận ADN.

Có hai mô hình giải thích cho bậc cấu trúc của ADN: mô hình solenoid và mô hình zigzag Mô hình solenoid cho rằng các nucleosome tạo thành cấu trúc siêu xoắn với mỗi bước xoắn chứa khoảng sáu nucleosome, trong khi mô hình zigzag dựa trên dạng zigzag khi histon H1 gắn vào ADN nối Kích thước của sợi 30 nm, với dải xoắn rộng 11 nm, cho thấy ADN nằm ở ngoài các đĩa octamer histon, trong khi ADN nối không đi qua trục của sợi mà chạy quanh trục chính Mô hình zigzag yêu cầu ADN nối đi qua trục trung tâm của sợi, tạo ra cấu trúc giống “lò xo”.

ADN có kích thước trung bình khoảng 30 nm và ở dạng thẳng, cho thấy rằng ADN nối dài có thể phù hợp hơn với mô hình này Độ dài trung bình của ADN nối khác nhau giữa các loài, điều này ảnh hưởng đến cấu trúc của sợi ADN.

30 nm có thể khác nhau ít nhiều giữa các loài

7.4.3 Để hình thành sợi nhiễm sắc 30 nm cần có đuôi N của histon

Nếu histon lõi thiếu đuôi N, sợi nhiễm sắc 30 nm sẽ không hình thành Đuôi N có thể đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc sợi 30 nm thông qua tương tác với nucleosome lân cận Cấu trúc ba chiều của nucleosome cho thấy sự hiện diện của các đuôi N trên histon.

Các histon H2A, H2B, H3 và H4 tương tác với nucleosome liền kề, trong đó đầu N của H4 tạo nhiều liên kết hydro với H2A và H2B trên bề mặt nucleosome bên cạnh Các vùng của histon H2A và H2B tương tác với đuôi N của H4 thể hiện tính bảo thủ cao khi phân tích ở các sinh vật khác nhau, tuy nhiên, chúng không ảnh hưởng đến khả năng liên kết ADN.

Nucleosome sau khi H1 liên kết

H×nh 7.14 Histon H1 cè định chuỗi xoắn ADN với nucleosome H1 có hai vị trí liên kết ADN: một ở đầu ra/vào nucleosome, một ở vùng trung tâm nucleosome

Hình 7.15 mô tả hai mô hình sợi nhiễm sắc 30 nm, bao gồm mô hình solenoid và mô hình zigzag Trong mô hình solenoid, ADN nối không di chuyển qua trục trung tâm và không tiếp cận được các điểm vào và ra của nucleosome Ngược lại, mô hình zigzag cho phép ADN nối đi qua trục trung tâm, dễ dàng tiếp cận các điểm vào và ra khỏi nucleosome.

Mô hình về sự ổn định của sợi nhiễm sắc 30 nm nhờ vào đuôi N của histon cho thấy sự tương tác giữa các đuôi N của histon ở các nucleosome gần nhau, cũng như giữa các histon xa hơn Sự hình thành octamer có thể liên quan đến các vùng được "bảo tồn" của H2A và H2B, nhằm duy trì tương tác giữa các nucleosome thông qua đuôi N của H4 Như đã đề cập ở chương 5, cải biến đuôi N của histon là một cơ chế quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen ở eukaryote, và những cải biến này ảnh hưởng đến việc hình thành các sợi nhiễm sắc có kích thước 30 nm cùng với các cấu trúc nucleosome bậc cao hơn.

7.4.4 Các cấu trúc thòng lọng gồm nhiều nucleosome làm ADN tiếp tục kết đặc hơn

Nucleosome và sợi 30 nm giúp giảm chiều dài phân tử ADN xuống khoảng 40 lần, nhưng ADN cần được kết đặc hơn để vừa vặn trong nhân tế bào Các sợi 30 nm tiếp tục cuộn xoắn thành các thòng lọng khoảng 40 - 90 kb từ một cấu trúc protein gọi là khung nhân Mặc dù bản chất của sự cuộn xoắn này chưa rõ ràng, nhưng đã xác định được hai lớp protein tham gia, đó là topoisomerase II và protein SMC, có vai trò quan trọng trong cấu trúc nhiễm sắc thể.

7.4.5 Các dạng biến đổi của histon làm thay đổi chức năng nucleosome

Các histon lõi thuộc nhóm các protein có tính bảo thủ cao nhất (xem thêm ch−ơng

Nucleosome của mọi eukaryote có cấu trúc tương tự nhau, nhưng có sự xuất hiện của một số biến thể histon Những histon này có thể thay thế một trong bốn loại histon tiêu chuẩn, tạo ra các dạng nucleosome biến đổi, giúp phân biệt các vùng NST và tạo ra chức năng mới cho nucleosome Ví dụ, H2A.z, một biến thể của H2A, thường xuất hiện trong nucleosome của một số loài eukaryote và liên quan đến các vùng ADN đang được phiên mã Mặc dù H2A.z không làm thay đổi cấu trúc tổng thể của nucleosome, nhưng nó ức chế hiện tượng “nén” chất nhiễm sắc, giúp bộ máy phiên mã dễ dàng tiếp cận ADN.

CENP-A là một biến thể của histon thay thế H3 trong các nucleosome vùng tâm động, giúp hình thành thể động (kinetochore) và gắn kết NST vào thoi phân bào Mặc dù không làm thay đổi cấu trúc nucleosome như H2A.z, CENP-A có phần đuôi N mở rộng với nhiều vị trí liên kết mới cho các protein thuộc thể động Sự thay đổi ở phần đuôi N của histon này không chỉ ảnh hưởng đến cấu trúc nucleosome mà còn tác động đến sự tương tác giữa nucleosome và thể động.

Cấu trúc bậc cao của sợi nhiễm sắc bao gồm ADN được gói gọn thành các thòng lọng từ sợi 30 nm, gắn vào bộ khung nhân Khi ADN hoạt động, nó có thể ở dạng sợi 10 nm hoặc thậm chí là ADN trần.

Khung nh©n (khung x−ơng nhiễm sắc thể) Sợi nhiễm sắc

Điều hòa biểu hiện gen qua cấu trúc chất nhiễm sắc

7.5 Điều hoà biểu hiện gen qua cấu trúc chất nhiễm sắc

7.5.1 T−ơng tác giữa ADN với octamer histon là linh hoạt

Sự kết hợp của ADN vào nucleosome ảnh hưởng đến việc điều hòa biểu hiện gen, đòi hỏi nucleosome phải dịch chuyển hoặc rãnh cuốn ADN trở nên lỏng lẻo để máy phiên mã tiếp cận ADN Liên kết giữa ADN và octamer histon có tính linh hoạt, và trong nhân tế bào có nhiều yếu tố tác động đến nucleosome, làm tăng hoặc giảm sự linh hoạt này Các yếu tố này cho phép nucleosome thay đổi vị trí và mức độ tương tác, đáp ứng nhu cầu biến đổi của chất nhiễm sắc Liên kết giữa ADN và octamer histon không bền vững, cho phép ADN được luân chuyển và giải phóng khỏi trạng thái liên kết Tính linh hoạt này rất quan trọng vì nhiều protein liên kết ADN cần ADN ở trạng thái không liên kết với histon để tiếp cận các vị trí liên kết của chúng.

ADN có thể được giải phóng khỏi nucleosome, cho phép protein tiếp cận các vị trí liên kết với tần số dao động từ 1/100.000 đến 1/1.000, tùy thuộc vào vị trí của liên kết trong nucleosome Các vị trí liên kết gần trung tâm ADN lõi của nucleosome sẽ khó tiếp cận hơn Cụ thể, các vị trí nằm trong khoảng cặp bazơ từ 73 đến 147 là khó tiếp cận nhất.

Các vị trí gần đầu (vị trí 1 hoặc 147) dễ tiếp cận hơn, cho thấy rằng cơ chế bộc lộ ADN chủ yếu là do sự "cởi bỏ" ADN khỏi nucleosome, chứ không phải từ các yếu tố khác.

“níi láng” ADN (h×nh 7.18) Nh−ng, đây chỉ là mô hình tìm thấy trong điều kiện invitro với những nucleosome đơn lẻ Sự giải phóng

ADN khỏi nucleosome trong tế bào có thể phức tạp hơn

7.5.2 Phức hệ cải biến nucleosome thúc đẩy sự dịch chuyển của nucleosome

Tính bền vững của liên kết histon-ADN bị ảnh hưởng bởi các phức hệ protein lớn, được gọi là phức hệ tái cấu trúc nucleosome Các phức hệ này sử dụng năng lượng từ ATP để tương tác với ADN hoặc thay đổi vị trí của nucleosome Có ba kiểu cải biến nucleosome cơ bản: 1) octamer trượt dọc theo phân tử ADN, 2) octamer được chuyển từ phân tử (hoặc đoạn) ADN này sang phân tử (hoặc đoạn) ADN khác.

3) nucleosome đ−ợc cấu trúc lại để làm tăng khả năng tiếp cận ADN (mà không làm thay đổi vị trí của nó trên ADN) Mọi phức hệ tái cấu trúc nucleosome đều có thể làm nó tr−ợt dọc phân tử ADN, nh−ng chỉ có rất ít phức hệ có khả năng chuyển hoặc cấu trúc lại nucleosome Sự cải biến nucleosome chi tiết thế nào còn ch−a biết đầy đủ Nh−ng điều đã đ−ợc xác nhận là ADN đ−ợc tiếp cận nhiều hơn sau sự cải biến nucleosome

Trong tế bào, có nhiều loại phức hệ tái cấu trúc nucleosome, với số lượng tiểu đơn vị từ 2 đến 10 chuỗi polypeptide Mỗi phức hệ đều có tiểu đơn vị thủy phân ATP, cùng với các tiểu đơn vị khác, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái cấu trúc nucleosome.

Hình 7.18 Mô hình tiếp cận ADN nucleosome của protein Để protein tiếp cận ADN, ADN cần đ−ợc “ cởi bỏ ” khỏi octamer

Vị trí liên kết protein 1

Vị trí liên kết protein 2

Sự kiện th−ờng xảy ra

Sự kiện ít xảy ra với chức năng chuyên biệt có thể được minh họa qua các tiểu đơn vị giúp gắn phức hệ vào các vị trí đích đặc thù trên ADN, hoặc tương tác với các yếu tố liên kết ADN trong bộ máy phiên mã.

Bảng 7.6 Một số phức hệ cải biến và tái cấu trúc nucleosome sử dụng năng l−ợng từ ATP

Phức hệ Số tiểu đơn vị Đặc điểm cấu tạo Kiểu cải biến nucleosome Miền bromo / Miền chromo Tr−ợt Chuyển Cấu trúc lại

SWI/SNF 8 -11 MiÒn bromo Cã Cã Cã

ISWI 2 - 4 Không có Có Không Không

Mi2/NuRD 8 -10 Miền chromo Có Không Không

Sự "năng động" trong tương tác giữa histon và ADN dẫn đến việc các nucleosome trên NST không có vị trí cố định Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, việc định vị nucleosome là cần thiết để duy trì vị trí liên kết của protein điều hòa trên vùng ADN nối, giúp protein điều hòa dễ dàng tiếp cận ADN Các protein liên kết ADN hoặc trình tự ADN đặc thù có thể kiểm soát sự định vị nucleosome Trong tế bào, thường xảy ra sự cạnh tranh giữa nucleosome và các protein liên kết ADN khác; nếu một phân tử protein liên kết vào ADN trước, nó sẽ ngăn cản histon lõi liên kết với ADN và ngược lại.

Nucleosome không thể hình thành nếu ADN lõi không có mặt, và sự liên kết liên tục của nhiều protein vào các vùng ADN liền kề sẽ làm tăng chiều dài của sợi ADN mà không tạo ra nucleosome Ngược lại, một số protein khác có khả năng liên kết với ADN lại thúc đẩy quá trình hình thành nucleosome ngay bên cạnh vị trí mà chúng gắn kết.

Một cơ chế quan trọng trong việc định vị nucleosome là sự tồn tại của các vùng ADN có ái lực cao với octamer histon Khi ADN liên kết với octamer, nó sẽ bị uốn cong, do đó nucleosome có xu hướng ưu tiên các vùng ADN dễ uốn cong hơn Các đoạn ADN giàu A:T tại các khe phụ thường uốn cong về phía octamer, trong khi các đoạn ADN giàu G:C có xu hướng uốn cong ngược lại Nucleosome được hình thành một cách tối ưu dựa trên sự sắp xếp này Tuy nhiên, cần lưu ý rằng các đoạn ADN có sự luân chuyển giữa các khe phụ giàu A:T và G:C.

G:C nh− vậy là rất hiếm Và, những trình tự nh− vậy không phải là bắt buộc để hình thành nucleosome

Hai mô hình định vị nucleosome phụ thuộc vào protein liên kết ADN Trong mô hình đầu tiên, hai protein liên kết ADN cạnh tranh với histon, dẫn đến việc nucleosome không thể hình thành ở đoạn ADN dài 130 bp, vì nucleosome cần đoạn ADN dài hơn 147 bp Trong mô hình thứ hai, một số protein liên kết ADN thúc đẩy sự hình thành nucleosome tại vị trí liên kết của chúng.

Nucleosome đ−ợc “ cố định ” Đỗ Lê Thăng - Đinh Đoàn Long

Các cơ chế định vị nucleosome ảnh hưởng đến tổ chức nucleosome trong hệ gen, với phần lớn nucleosome không cố định Nucleosome cố định thường nằm tại các vị trí khởi đầu phiên mã, giúp ngăn cản sự tiếp cận ADN liên tục Do đó, định vị nucleosome có thể tác động tích cực hoặc tiêu cực đến khả năng tiếp cận ADN của các protein.

7.5.4 Sự sửa đổi đuôi N của histon làm thay đổi khả năng tiếp cận ADN

Khi histon được tách ra khỏi tế bào, phần đuôi N của chúng thường trải qua các biến đổi Một trong những biến đổi phổ biến là sự gắn thêm nhóm acetyl vào lysine (Lys, K).

(acetyl hóa) hoặc methyl (methyl hóa); còn serine (Ser, S) thường được biến đổi bằng gắn thêm nhóm photsphate (phosphoryl hóa)

Nucleosome thường được acetyl hóa ở các vùng nhiễm sắc thể (NST) có hoạt động phiên mã tích cực, trong khi các nucleosome bị khử acetyl thường liên quan đến những vùng bị ức chế phiên mã.

Sự methyl hoá các phần khác nhau của đuôi N có thể gây ra các hiệu ứng khác nhau trong phiên mã, tùy thuộc vào axit amin được methyl hóa, khác với sự acetyl hoá Phosphoryl hoá đuôi N của H3 thường xuất hiện ở vùng chất nhiễm sắc kết đặc cao trong nguyên phân Những cải biến ở đuôi histon được coi là một dạng “mã” mà các protein điều hòa biểu hiện gen có khả năng nhận biết.

Sự lắp ráp nucleosome

7.6.1 Nucleosome đ−ợc lắp ráp ngay sau khi

Sự nhân đôi NST không chỉ đòi hỏi sự nhân đôi

ADN yêu cầu quá trình nhân đôi và lắp ráp lại các protein cấu trúc của nhiễm sắc thể, bao gồm cả protein histon và phi-histon, vào mỗi phân tử ADN con mới được hình thành.

Trong quá trình nhân đôi NST ở eukaryote, việc sao chép ADN yêu cầu các nucleosome tạm thời được gỡ bỏ Sau khi ADN được sao chép hoàn tất, các phân tử nucleosome sẽ được tái lắp lại.

ADN được đóng gói lại ngay lập tức thông qua một chuỗi sự kiện diễn ra theo trật tự nhất định Bước đầu tiên trong quá trình lắp ráp nucleosome là sự liên kết của tứ phức H3-H4 vào ADN Khi tứ phức này đã liên kết thành công với ADN, quá trình tiếp theo sẽ diễn ra.

Phức kép H2A-H2B kết hợp để hình thành nucleosome mới hoàn chỉnh Trong quá trình tạo ra các cấu trúc bậc cao hơn của chất nhiễm sắc, H1 có thể gắn vào phức hệ nucleosome cuối cùng Để nhân đôi NST, ít nhất một nửa số nucleosome trên các NST con cần được tổng hợp mới Điều này đặt ra câu hỏi liệu tất cả các nucleosome cũ có mất đi và các nucleosome ở tế bào con đều được tổng hợp mới hay không.

Các histon cũ đóng góp quan trọng vào cấu trúc của nucleosome mới, ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tiếp cận của chất nhiễm sắc mới hình thành Sự tham gia của các histon này là yếu tố then chốt trong quá trình cải biến nucleosome, từ đó tác động đến chức năng và hoạt động của gen.

Nếu histon cũ bị loại bỏ hoàn toàn, sự sao chép NST sẽ xóa bỏ "bản ghi nhớ" về cải biến nucleosome trước đó Ngược lại, nếu nucleosome cũ chỉ được giữ lại ở một trong hai phân tử ADN con mới, hai bản sao NST sẽ có kiểu tập hợp nucleosome với sự cải biến hoàn toàn khác nhau.

Các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng các histon cũ đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc nucleosome, với sự phân bố đồng đều ở cả hai tế bào con Sự lắp ráp này cho thấy tính ổn định và sự di truyền của các histon trong quá trình phân chia tế bào.

Sợi nhiễm sắc 30nm Phức hệ tái cÊu tróc chÊt nhiễm sắc

Protein liên kết ADN 2 huy động enzym histon acetylase

Các phức hệ tái cấu trúc chất nhiễm sắc và enzym cải biến histon tương tác để thay đổi cấu trúc nucleosome, giúp tăng khả năng tiếp cận ADN Protein 1 gắn vào ADN và huy động phức hệ tái cấu trúc, cho phép histon acetylase gắn vào ADN, từ đó sửa đổi đuôi N của nucleosome liền kề và chuyển đổi cấu hình chất nhiễm sắc từ dạng 30 nm sang 10 nm dễ tiếp cận hơn Trong quá trình sao chép ADN, nucleosome bị “phá vỡ”, nhưng tứ phức H3-H4 vẫn duy trì nguyên vẹn và liên kết ngẫu nhiên vào một trong hai phân tử ADN con, trong khi phức kép H2A-H2B được giải phóng khỏi ADN và tham gia vào quỹ dự trữ histon tự do để tổng hợp nucleosome mới.

Sự phân phối histon cũ vào các nucleosome ở tế bào con đảm bảo rằng các NST duy trì kiểu cải biến histon của tế bào mẹ Cơ chế này giúp các histon cũ liên kết đúng vùng ADN mà chúng đã liên kết ở tế bào mẹ, dẫn đến sự di truyền cục bộ kiểu cải biến histon Nhờ đó, quá trình cải biến histon chỉ cần diễn ra hạn chế tại các vị trí NST tương ứng ở tế bào con Mỗi kiểu cải biến histon huy động các enzym xúc tác hoạt động đó tới các nucleosome lân cận để thực hiện cải biến tương tự Cơ chế này giúp duy trì trạng thái cải biến nucleosome giống nhau giữa các tế bào con và tế bào mẹ sau nhân đôi NST, góp phần duy trì trạng thái chất nhiễm sắc qua nhiều thế hệ phân bào ở eukaryote đa bào.

7.6.2 Sự lắp ráp nucleosome cần “histon chaperon”

Sự lắp ráp nucleosome không xảy ra một cách tự phát, vì thí nghiệm cho thấy việc thêm histon tự do vào ADN trong điều kiện in vitro thông thường không tạo ra nucleosome Thay vào đó, các histon thường kết hợp thành một phức hợp không có chức năng sinh học Để nucleosome được lắp ráp, cần phải tăng nồng độ muối lên rất cao (> 1M NaCl) và sau đó giảm dần sau nhiều giờ Tuy nhiên, trong điều kiện in vivo, quá trình lắp ráp nucleosome không phụ thuộc vào sự thay đổi nồng độ muối.

Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự lắp ráp nucleosome đã chỉ ra rằng trong tế bào có một số yếu tố thiết yếu cho sự hình thành nucleosome Các yếu tố này bao gồm phức hệ “tứ phức H3-H4” và “phức kép H2A-H2B” Những protein này mang điện tích âm và đóng vai trò quan trọng trong việc "dẫn đường" cho quá trình lắp ráp nucleosome.

“hộ tống” các tứ phức H3-H4 và phức kép H2A-H2B đến các vị trí lắp ráp nucleosome trên phân tử ADN Chúng đ−ợc gọi là các histon chaperone

Các histon chaperone, như CAF-1, đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự lắp ráp nucleosome trên phân tử ADN tại các vị trí cụ thể Nghiên cứu cho thấy rằng sự lắp ráp nucleosome do CAF-1 điều khiển chỉ xảy ra khi ADN đang trong quá trình sao chép CAF-1 nhận diện ADN đang sao chép thông qua các cơ chế đánh dấu ADN, và điều thú vị là các yếu tố đánh dấu này sẽ dần biến mất khi quá trình sao chép kết thúc.

Bảng 7.8 Thuộc tính của các histon chaperone

Tên Số tiểu đơn vị Loại histon liên kết T−ơng tác với thành phần của bộ máy sao chép (PCNA)

ADN sao chép điều khiển hoạt động của CAF-1 thông qua PCNA, một protein dạng vòng giúp giữ ADN polymerase gắn vào ADN trong quá trình sao chép Khi ADN polymerase hoàn tất sao chép, PCNA rời khỏi nhưng vẫn liên kết với ADN, cho phép nó tương tác với các protein khác, bao gồm CAF-1 CAF-1, sau khi liên kết với PCNA, huy động "tứ phức H3-H4" đến vị trí ADN đang liên kết với PCNA Nhờ vào sự tương tác này, CAF-1 điều khiển sự lắp ráp nucleosome tại vị trí ADN vừa mới sao chép.

Chu trình tế bào và cở sở Di truyền học ung th−

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hàng năm có hơn 9 triệu người tử vong do bệnh ung thư, bên cạnh đó, khoảng 15 triệu người mới được chẩn đoán mắc bệnh Vậy ung thư xuất hiện như thế nào và tại sao nó được coi là căn bệnh nan y nguy hiểm nhất của thế kỷ?

Bệnh ung thư có thể di truyền theo dòng họ, nhưng không phải tất cả các loại ung thư đều có yếu tố di truyền Các yếu tố môi trường như chế độ dinh dưỡng, tia cực tím và ô nhiễm cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh ung thư Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng ung thư thường xuất hiện do các rối loạn di truyền, với các đột biến ở các gen thiết yếu làm rối loạn quá trình trao đổi chất và kiểm soát sự phân chia tế bào Khi các tế bào ung thư phân chia không ngừng, chúng tạo thành khối u Nếu các tế bào này xâm lấn vào mô xung quanh, khối u được gọi là ác tính; nếu không, nó được xem là u lành.

Bảng 8.1 nêu các đặc điểm phân biệt cơ bản giữa u ác tính và u lành tính

Các dạng biểu hiện của bệnh ung th−

Ung thư không phải là một bệnh duy nhất mà là một nhóm các dạng bệnh lý khác nhau, với hơn 200 dạng đã được mô tả Các dạng ung thư có thể xuất phát từ nhiều loại mô khác nhau trong cơ thể, với tốc độ phát triển nhanh hoặc chậm Một số dạng có thể được điều trị hiệu quả, trong khi một số khác vẫn chưa có phương pháp điều trị Trong số các loại ung thư, ung thư tiền liệt tuyến là phổ biến nhất ở nam giới, tiếp theo là ung thư vú ở phụ nữ, trong khi ung thư phổi là dạng phổ biến nhất ở cả hai giới Nguy cơ mắc ung thư có thể biểu hiện khác nhau tùy thuộc vào từng trường hợp.

Bảng 8.1 Phân biệt u lành và u ác theo đặc điểm sinh học

Tế bào biệt hóa cao Phân bào ít và chậm Không xâm lấn xung quanh Không có hoại tử

Có vỏ bọc Rất ít tái phát Không di căn ít ảnh hưởng đến cơ thể

Tế bào ít biệt hóa Phân chia nguyên phân liên tục X©m lÊn lan réng

Th−ờng có hoại tử trung tâm Không có vỏ bọc

Di truyền có ảnh hưởng lớn đến cơ thể, nhưng ung thư thường phát sinh từ sự tích lũy ngẫu nhiên các đột biến trong tế bào soma.

Mặc dù tỷ lệ tử vong do ung thư vẫn còn cao, nhưng những tiến bộ trong khoa học kỹ thuật trong 20 năm qua đã mang lại những bước tiến vượt bậc trong chẩn đoán sớm và điều trị các loại ung thư Các phương pháp di truyền phân tử hiện nay cho phép xác định nguy cơ mắc một số loại ung thư mà trước đây không thể thực hiện, từ đó giúp định hướng các biện pháp phòng ngừa, ngăn chặn và điều trị hiệu quả.

Trong phòng thí nghiệm, tế bào ung thư được thu nhận bằng cách nuôi cấy tế bào bình thường và xử lý chúng bằng các tác nhân gây ung thư như carcinogen Những tác nhân này thường bao gồm các yếu tố vật lý như chiếu xạ, hóa học như hóa chất gây đột biến, hoặc tác nhân sinh học như virus Sự khác biệt giữa tế bào bình thường và tế bào ung thư trong nuôi cấy thể hiện qua cách chúng phát triển; tế bào bình thường chỉ hình thành một lớp trên bề mặt môi trường nuôi cấy, trong khi tế bào ung thư tạo thành nhiều lớp kết cụm, hình thành các khối lớn Điều này xảy ra do tế bào ung thư không phản ứng với tín hiệu ức chế phân bào, dẫn đến sự hình thành cấu trúc không có tổ chức và sự tổng hợp protein bất thường, cùng với biến đổi về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể.

Dạ dày Ruét kÕt Tôy Các ống tiêu hóa khác

Khí quản, phế quản, phổi

Các phần khác của hệ hô hấp

X−ơng và các mô liên kết

Tuyến tiền liệt (nam) / Tử cung (nữ)

Các phần khác của hệ sinh dục

Bàng quang Thận và các ống tiết niệu

Mắt, não và thần kinh trung −ơng

Tỉ lệ tương đối giữa các nhóm bệnh ung thư khác nhau

Hình 8.1 Tần số mắc bệnh và tỉ lệ tử vong của các bệnh nhân thuộc các nhóm bệnh ung th− khác nhau

(theo thống kê của Sở y tế Bang Winconsin, Hoa Kỳ, năm 1999)

Số ng−ời mắc bệnh

Số ng−ời tử vong Ghi chó Đinh Đoàn Long

Ung th− là hậu quả của sai hỏng trong điều hòa chu trình tế bào

Chu trình tế bào bình thường bao gồm hai pha sinh trưởng G1 và G2, được xen kẽ bởi pha sao chép ADN (pha S) và pha phân bào.

M) Thời gian kéo dài của mỗi chu trình tế bào cũng nh− từng pha của nó đ−ợc điều khiển “chặt chẽ” bởi các phân tử tín hiệu nội bào và ngoại bào Sự chuyển đổi từ pha này sang pha kia trong chu trình tế bào do sự điều khiển phối hợp của nhiều phân tử tín hiệu nhất định và biểu hiện bằng những đáp ứng chính xác và đặc tr−ng của tế bào với từng loại phân tử tín hiệu t−ơng ứng Nếu có sai sót trong quá trình truyền tín hiệu, hoặc đáp ứng của tế bào thiếu chính xác, các tế bào có thể phân chia vô hạn và chuyển sang trạng thái ung th−

Chu trình tế bào được kiểm soát bởi các điểm kiểm tra, nơi tế bào tạm dừng để xác nhận sự sẵn sàng cho pha tiếp theo, như việc hoàn thành sao chép ADN và sửa chữa sai hỏng Cơ chế phân tử tại các điểm kiểm tra này khá phức tạp, nhưng hai nhóm protein chính, bao gồm cyclin và kinase phụ thuộc cyclin (CDK), đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.

Các CDK là enzym quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào thông qua hoạt động xúc tác, bằng cách phosphoryl hóa các protein mục tiêu Tuy nhiên, hoạt tính của CDK phụ thuộc vào sự hiện diện của cyclin, với nồng độ cyclin thay đổi theo chu kỳ trong các pha của chu trình tế bào Cyclin đóng vai trò thiết yếu trong việc hình thành phức hệ cyclin/CDK, giúp CDK thực hiện chức năng của mình Nếu không có cyclin, phức hệ này sẽ không hình thành và CDK sẽ ở trạng thái không hoạt động Sự chuyển tiếp giữa các pha của chu trình tế bào phụ thuộc vào chu kỳ hình thành và phân hủy của các phức hệ cyclin/CDK khác nhau.

Điểm kiểm tra quan trọng trong chu trình tế bào là điểm START, nằm gần cuối pha G1, nơi tế bào nhận tín hiệu từ môi trường để xác định khả năng chuyển sang pha S Điểm START được điều khiển bởi protein cyclin D, kích hoạt enzym CDK4 Khi phức hệ cyclin D/CDK4 đạt đủ lượng, tế bào sẽ vượt qua điểm START và bắt đầu pha S Tuy nhiên, nếu tế bào chưa sẵn sàng do thiếu dinh dưỡng hoặc ADN hỏng, các protein ức chế sẽ được kích hoạt để phá hủy phức hệ cyclin D/CDK4, ngăn cản tế bào chuyển vào pha S.

Các pha của chu trình tế bào Điểm bắt đầu (START)

Hình 8.3 minh họa sự biến thiên của hàm lượng các phức hệ protein Cyclin và enzym kinase phụ thuộc cyclin (CDK) trong các pha của chu trình tế bào ở động vật có xương sống Các điểm kiểm tra quan trọng bao gồm điểm kiểm tra G1 (điểm START), điểm kiểm tra G2 và điểm kiểm tra M.

Hình 8.2 Chu trình tế bào ở sinh vật đa bào

Hệ thống điều khiển chu trình tế bào cần thiết để đảm bảo ADN được sao chép chính xác và chuyển giao sang chu trình tế bào mới Tuy nhiên, ở nhiều tế bào ung thư, sự điều khiển này không diễn ra hoặc sai lệch do các sai hỏng di truyền ảnh hưởng đến phức hệ cyclin D/CDK4 Các đột biến trong gen mã hóa cyclin D, CDK4, và các protein điều hòa có thể dẫn đến sự mất khả năng điều khiển tại điểm START, làm rối loạn quá trình phân chia tế bào Điều này cho thấy rằng nhiều kiểu sai hỏng khác nhau trong hệ gen có thể "hỏng" bộ máy điều hòa chu trình tế bào, góp phần dẫn đến sự phát triển của ung thư.

Sự rối loạn tại điểm kiểm tra START trong chu trình tế bào có thể dẫn đến nguy cơ cao chuyển đổi tế bào thành ung thư Điểm kiểm tra này quyết định xem tế bào có vào pha S hay không; nếu hoạt động không chính xác, ADN sai hỏng sẽ dễ dàng được sao chép và truyền cho các thế hệ tế bào sau Trong khi các tế bào bình thường tạm dừng chu trình tế bào để sửa chữa sai hỏng ADN, những tế bào có chức năng sai tại điểm kiểm tra START sẽ bước vào pha S với nguy cơ mang theo sai hỏng ADN Qua nhiều chu trình tế bào, các đột biến này tích lũy, dẫn đến mất khả năng điều hòa phân bào bình thường Do đó, các tế bào hỏng chức năng tại điểm kiểm tra START có khả năng cao trở thành tế bào ung thư phát triển mạnh.

Bản chất di truyền của ung th−

Các bằng chứng thực nghiệm dưới đây đã chứng minh phần nào bản chất di truyền của các bệnh ung th−:

Khi nuôi cấy tế bào ung thư, mọi tế bào con được hình thành đều mang đặc tính ung thư, chứng tỏ rằng trạng thái ung thư đã được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Hiện tượng này cho thấy ung thư có bản chất di truyền.

Một số loại virus có khả năng gây ung thư do các gen virus mã hóa những protein liên quan chặt chẽ đến sự hình thành tế bào ung thư.

Các hợp chất gây đột biến mạnh thường liên quan đến việc gây ung thư Nghiên cứu cho thấy các hợp chất đột biến và tác nhân chiếu xạ ion hóa là những yếu tố gây ung thư hiệu quả trong các thí nghiệm Ngược lại, một số điều tra chỉ ra rằng các tác nhân gây ung thư trong môi trường sống cũng có khả năng gây đột biến mạnh khi thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.

Một số dạng ung thư có xu hướng di truyền theo dòng họ, được gọi là ung thư di truyền, như ung thư ruột kết và ung thư nguyên bào võng mạc Ngược lại, các bệnh ung thư không biểu hiện di truyền theo dòng họ được xem là ung thư đơn phát, thường xuất hiện với tần suất cao hơn so với ung thư di truyền.

Vào ngày thứ năm, một số dạng ung thư máu có mối liên hệ chặt chẽ với các sai hỏng của những nhiễm sắc thể cụ thể Nhiều loại ung thư khác cũng được xác định là có liên quan trực tiếp đến các sai hỏng nhiễm sắc thể và các đột biến gen.

Vào những năm 1980 - 1990, nghiên cứu tế bào ung thư đã chỉ ra rằng nhiều dạng ung thư xuất phát từ các sai hỏng gen, và thường cần nhiều sai hỏng xảy ra đồng thời để chuyển đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư Các nhà nghiên cứu đã phân loại hai nhóm gen chính liên quan đến sự phát sinh tế bào ung thư: nhóm gen gây khối u (oncogene) thúc đẩy phân chia tế bào không kiểm soát, thường được tìm thấy ở retrovirus, và nhóm gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào và tham gia vào sửa chữa ADN Khi các gen ức chế khối u bị đột biến, chúng có thể làm tăng tần số đột biến của các gen khác, được gọi là gen gây đột biến (mutator gene) Bài viết sẽ đề cập đến tác động của các nhóm gen này đối với sự phát sinh ung thư dựa trên hiểu biết hiện tại.

Khái niệm về các gen gây khối u

Các gen gây khối u (oncogene) là nhóm gen đa dạng, sản phẩm của chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động sinh hóa của tế bào liên quan đến phân bào Những gen này lần đầu tiên được phát hiện trong hệ gen của các retrovirus gây khối u ở vật chủ khi lây nhiễm, và sau đó, các gen tương tự đã được tìm thấy ở nhiều sinh vật khác, từ ruồi giấm đến con người.

8.4.1 Retrovirut và các gen gây khối u ở virut

Virut Rous sacôm (RSV), được Peyton Rous phát hiện vào năm 1910, là virut đầu tiên gây khối u Hệ gen ARN của RSV bao gồm 4 gen: gen gag mã hóa protein vỏ virut, gen pol mã hóa enzym reverse transcriptase, gen env mã hóa protein màng trong, và gen v-src mã hóa enzym kinase Enzym kinase của virut có khả năng phosphryl hóa nhiều protein khác nhau Trong số các gen này, v-src có vai trò trực tiếp trong việc hình thành khối u ở tế bào chủ; khi gen này bị cắt bỏ, virut vẫn có thể lây nhiễm nhưng không gây hình thành khối u Gen v-src là một ví dụ điển hình về gen gây khối u.

Nghiên cứu về các loại virus gây khối u đã phát hiện nhiều gen gây khối u khác nhau, được viết tắt là v-onc Một số gen này liên quan đến các yếu tố tăng trưởng, chẳng hạn như gen v-sis, là nguyên nhân gây khối u sacôm ở khỉ, mã hóa cho yếu tố tăng trưởng PDGF (platelet-derived growth factor) PDGF thường được sản xuất bởi các tế bào tiểu cầu, hỗ trợ quá trình làm lành vết thương bằng cách thúc đẩy sự phân chia tế bào tại vị trí vết thương Tuy nhiên, gen v-sis của virus mã hóa cho một protein giống PDGF, nhưng khi lây nhiễm vào tế bào chủ, gen này biểu hiện không kiểm soát, dẫn đến sự phân chia tế bào hỗn loạn và hình thành khối u.

Các gen gây khối u mã hóa cho protein giống yếu tố tăng trưởng hoặc thụ thể hormone, như gen v-erbB trong virus gây tăng hồng cầu ở chim, mã hóa cho protein tương tự thụ thể EGF Tương tự, gen v-fms trong virus gây khối u sacôm ở mèo mã hóa cho protein giống thụ thể CSF-1 Cả hai thụ thể này đều là protein xuyên màng, với vị trí kết nối yếu tố tăng trưởng bên ngoài màng và miền hoạt tính kinase bên trong Miền kinase có chức năng phosphoryl hóa các axit amin, chủ yếu là Tyr, khi tương tác với protein.

Nhiều gen gây khối u như v-src mã hóa cho enzym tyrosine kinase, không phải là protein xuyên màng, mà nằm ở mặt trong của màng tế bào và có chức năng phosphoryl hóa Một số gen khác như v-ras mã hóa cho protein đính kết GTP, tương tự như G-protein của tế bào, tham gia điều hòa lượng cAMP trong tế bào, một phân tử tín hiệu nội bào quan trọng trong việc điều khiển sự biểu hiện của các gen.

Bảng 8.2 Một số gen gây khối u (oncogene) ở retrovirut

Tên gen và loại virus liên quan đến các chức năng sinh học khác nhau ở động vật Gen abl, thuộc virus bạch cầu Abelson, mã hóa protein kinase đặc hiệu tyrosine ở chuột ErbA và erbB, liên quan đến virus gây tăng hồng cầu ở gà, tương ứng với thụ thể hormone thyroid và yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGF) Các gen fes, fgr và fms từ các virus sacôm ở mèo đều mã hóa kinase đặc hiệu tyrosine Fos và jun, từ virus sacôm ở gà, tham gia vào hoạt hóa phiên mã Gen mil (mbt) và mos, từ virus MH2 và sacôm Moloney, mã hóa kinase đặc hiệu serine/threonine ở gà và chuột Cuối cùng, myb và myc, từ virus tế bào tủy xương và tế bào máu MC29, mã hóa protein yếu tố phiên mã ở gà, trong khi raf từ virus sacôm 3611 mã hóa kinase đặc hiệu serine/threonine ở chuột.

H-ras Virut sacôm Harvey Chuột đồng protein liên kết GTP

K-ras Virut sacôm Kirsten Chuột đồng protein liên kết GTP rel Virut l−ới nội mô Gà tây protein yếu tố phiên mã ros Virut sacôm URII Gà kinase đặc hiệu tyrosine sis Virut sacôm khỉ Khỉ giống yếu tố sinh tr−ởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF) src Virut sacôm gà Gà kinase đặc hiệu tyrosine yes Virut sacôm Y73 Gà kinase đặc hiệu tyrosine Đinh Đoàn Long

Một nhóm gen gây khối u của virus mã hóa các protein điều hòa phiên mã, bao gồm v-jun, v-fos, v-erbA và v-myc, được phát hiện ở nhiều loại virus khác nhau Những protein này tương tự như các protein liên kết đặc hiệu ADN và đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình phiên mã.

Phần lớn các gen virus gây khối u mã hóa protein có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh biểu hiện gen liên quan đến tăng trưởng và phân bào Một số protein hoạt động như phân tử tín hiệu thúc đẩy các hoạt động tế bào, trong khi những protein khác đóng vai trò là thụ thể nhận tín hiệu tăng sinh tế bào hoặc truyền tín hiệu từ tế bào chất vào nhân Ngoài ra, một số protein được mã hóa bởi các gen gây khối u còn là yếu tố điều hòa phiên mã, thúc đẩy sự biểu hiện của các gen khác.

8.4.2 Các tiền gen gây khối u của tế bào chủ

Các gen trong tế bào chủ tương đồng với gen gây khối u ở virus được gọi là tiền gen gây khối u của tế bào chủ, viết tắt là c-onc Ví dụ, tiền gen c-src tương đồng với v-src, với sự khác biệt chỉ 18 nucleotide; v-src mã hóa protein 526 axit amin, trong khi c-src mã hóa protein 533 axit amin Nghiên cứu sử dụng gen v-onc làm mẫu dò đã giúp phân lập nhiều gen c-onc từ các cơ thể vật chủ khác nhau, bao gồm cả người Một phát hiện quan trọng là các tiền gen gây khối u từ các tế bào chủ khác nhau có cấu trúc tương tự, như các tiền gen ở ruồi giấm rất giống với các gen c-abl, c-erbB, c-fps, c-raf và c-myb ở động vật có xương sống Sự tương đồng này cho thấy các tiền gen gây khối u thường có chức năng quan trọng.

Một câu hỏi thú vị là tại sao c-onc có intron trong khi v-onc lại không có Giải thích hợp lý nhất cho hiện tượng này là các v-onc phát sinh từ các c-onc tương ứng thông qua quá trình phiên mã, trong đó bản sao ARN của c-onc được hình thành và gắn vào hệ gen.

ADN vật chủ (gen c-src)

Virut RSV gag pol env

Exon1 Exon2 Exon3 Exon4 Exon5

Gen v-src gag pol env

Virus RSV mang theo các gen gây khối u (oncogene) và tiền gen gây khối u (proto-oncogene) từ cơ thể chủ, đặc biệt là ở gà Khi virus retrovirus đóng gói, nó chứa vật chất di truyền tái tổ hợp cùng với bản phiên mã của gen c-onc, đã trở thành v-onc sau khi loại bỏ các intron Trong quá trình lây nhiễm tế bào chủ, virus có khả năng truyền gen v-onc sang các tế bào mới ARN tái tổ hợp được phiên mã ngược thành ADN và gắn vào hệ gen của tế bào chủ, khiến gen v-onc không còn bị cắt intron trong quá trình phiên mã.

Gen v-onc gây khối u do có hiệu suất tổng hợp protein cao hơn so với gen c-onc, nhờ vào hoạt động của các trình tự tăng cường trong hệ gen virus Ví dụ, gen v-src trong tế bào khối u gà tổng hợp enzym tyrosine kinase mạnh gấp 100 lần so với c-src, dẫn đến rối loạn cơ chế truyền tín hiệu và tăng sinh tế bào không kiểm soát Ngoài ra, các gen v-onc có thể gây khối u khi protein được tổng hợp không đúng thời điểm trong chu trình tế bào, hoặc do đột biến gen tạo ra các dạng biến đổi protein khác nhau.

8.4.3 Các tiền gen gây khối u có thể đột biến thành gen gây khối u

Khái niệm về các gen ức chế khối u

Các alen bình thường của gen c-ras và c-myc mã hóa cho protein tham gia điều hòa sự phân bào, thúc đẩy tăng sinh tế bào Khi các gen này biểu hiện cao bất thường hoặc sản sinh protein có tác động như chất hoạt hóa mạnh, tế bào dễ hình thành khối u Tuy nhiên, sự chuyển đổi từ tế bào bình thường sang ung thư không chỉ do tăng biểu hiện của các gen đơn lẻ mà còn cần có các đột biến bổ sung ở các gen ức chế phân bào, được gọi là gen ức chế khối u hay gen chống ung thư.

8.5.1 Các bệnh ung th− theo dòng họ và giả thiết hai mục tiêu của Knudson

Nhiều gen ức chế khối u đã được phát hiện thông qua phân tích các bệnh ung thư hiếm gặp có tính di truyền trong gia đình Trong các phả hệ, sự xuất hiện của những bệnh ung thư này thể hiện dưới dạng kiểu hình trội hoặc lặn Ung thư thường xảy ra ở những cá thể dị hợp tử mang alen đột biến làm mất chức năng của các gen ức chế khối u Tuy nhiên, để ung thư phát triển, cần có một đột biến thứ hai trong tế bào soma, làm hỏng chức năng của alen kiểu dại còn lại Điều này cho thấy sự phát sinh khối u yêu cầu ít nhất hai đột biến mất chức năng, mỗi đột biến xảy ra ở một trong hai bản sao của gen ức chế khối u.

Năm 1971, Knudson đã đưa ra giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh u nguyên bào võng mạc (retinoblastoma), một bệnh ung thư hiếm gặp ở trẻ em với tần suất 5/100.000 Phân tích phả hệ cho thấy khoảng 40% trường hợp có xu hướng di truyền, trong khi 60% còn lại không có căn nguyên di truyền rõ rệt, được gọi là nhóm đơn phát Knudson nhận định rằng cả hai nhóm đều liên quan đến đột biến kép xảy ra ở gen ức chế khối u Trong trường hợp di truyền, một đột biến được truyền từ bố mẹ sang con, còn trong nhóm đơn phát, cả hai đột biến xuất hiện ngẫu nhiên trong quá trình phát triển của mắt Do đó, cả hai trường hợp đều cần hai đột biến đồng thời để làm bất hoạt cả hai bản sao của gen ức chế khối u.

Sù ®iÒu khiÓn chu tr×nh tế bào bình th−ờng

Sự kiện thứ nhất §ét biÕn

Tái tổ hợp trong nguyên phân / đột biến thứ 2 Mất nhiễm sắc thể do rối loạn phân bào

Cả 2 alen mất chức năng

Giả thuyết hai mục tiêu của Knudson giải thích rằng sự bất hoạt của cả hai bản sao gen ức chế khối u có thể dẫn đến sự phát triển của bệnh ung thư.

Nhiều nghiên cứu đã xác nhận nhận định của Knudson về u nguyên bào võng mạc, cho thấy bệnh này liên quan đến đột biến mất đoạn NST số 13, dẫn đến mất gen ức chế khối u RB Gen RB được xác định nằm ở vị trí 13q14.2 và đã được phân lập từ tế bào mô mắt bị ung thư Thí nghiệm nuôi cấy tế bào cho thấy khi chuyển trình tự cADN của alen kiểu dại gen RB vào tế bào ung thư, tế bào này chuyển đổi từ trạng thái ung thư sang bình thường Hơn nữa, sản phẩm protein của gen RB (pRB) là một protein quan trọng, tham gia điều hòa chu trình tế bào ở nhiều mô khác nhau thông qua tương tác với các yếu tố phiên mã.

Giả thuyết "hai mục tiêu" của Knudson đã chứng minh tính chính xác khi giải thích sự xuất hiện của nhiều bệnh ung thư theo dòng họ, đặc biệt là ung thư ruột kết và ung thư vú Trong những loại ung thư này, các gen ức chế khối u thường liên quan đến các bệnh ung thư đặc thù.

8.5.2 Vai trò của một số gen ức chế khối u trong tế bào

Mặc dù ung thư di truyền chỉ chiếm khoảng 1% tổng số trường hợp, hầu hết bệnh nhân có biểu hiện di truyền đều mang đột biến ở các gen ức chế khối u Các gen này mã hóa cho các protein tham gia vào nhiều hoạt động quan trọng của tế bào, bao gồm việc điều khiển sự phát triển và phân chia tế bào.

Bảng 8.3 Các hội chứng ung th− di truyền và các gen ức chế khối u có liên quan

Tên hội chứng Vị trí u nguyên phát Gen Vị trí trên NST Chức năng protein t−ơng ứng trong tế bào

U nguyên bào l−ới di truyền Nguyên bào l−ới RB 13q14.3 Điều hòa phiên mã và điều hòa chu trình tế bào Hội chứng

Li-Frameni Tế bào sacôm

U vú TP53 17p13.1 Yếu tố phiên mã

Hội chứng u tuyến không polyp theo dòng họ (FAP)

U ruột kết APC 5q21 Điều hòa β-catenin

Ung th− ruét kết không polyp di truyÒn

Tham gia sửa chữa ADN theo cơ chế MMR (xem ch−ơng 6)

U xơ thần kinh kiểu 1 U xơ thần kinh NF1 17q11.2 Điều hòa quá trình truyền tín hiệu qua protein Ras

U xơ thần kinh thính giác liên quan đến u màng não NF2 tại vị trí 22q12.2, kết nối protein màng tế bào với khung xương tế bào Ung thư vú di truyền kiểu 1 có liên quan đến gen BRCA1 tại vị trí 17q21, có vai trò quan trọng trong việc sửa chữa ADN.

Ung th− vó di truyền kiểu 2 U vú BRCA2 13q12 Sửa chữa ADN

Lindau U tế bào thận VHL 3p25 Điều hòa sự kéo dài phiên mã

Bệnh hắc tố ác tính di truyền U tế bào melanin p16 9p21 Chất ức chế CDK

Mất điều hòa giãn mạch U tế bào lymphô ATM 11q22 Sửa chữa ADN

Enzym ADN helicase Bloom U cứng BLM 15q26.1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân bào, biệt hóa tế bào, sửa chữa ADN và chết theo chương trình của tế bào Các protein được mã hóa bởi các gen ức chế khối u thực hiện nhiều chức năng thiết yếu trong các quá trình này.

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng protein ức chế khối u pRB, được mã hóa bởi gen RB, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào Ban đầu được phát hiện ở bệnh ung thư mắt ở trẻ em, đột biến gen RB sau đó đã được xác định là nguyên nhân gây ra nhiều loại ung thư ở các mô và cơ quan khác nhau, bao gồm ung thư phổi, thực quản, bàng quang, cổ tử cung và tiền liệt tuyến Thêm vào đó, nghiên cứu trên chuột có gen RB bị bất hoạt cho thấy hầu hết chuột chết ngay trong giai đoạn phôi, cho thấy vai trò thiết yếu của protein pRB trong sự phát triển cá thể.

Protein pRB là một protein trọng yếu trong nhân, có khối lượng 105 kDa, liên quan đến sự điều hòa chu trình tế bào Trong hệ gen động vật có vú, ngoài gen RB, còn có hai gen liên quan là p107 và p130, với khối lượng phân tử tương ứng là 107 và 130 kDa Nghiên cứu cho thấy, khi một trong hai gen này bị bất hoạt, chuột vẫn sống, nhưng nếu cả hai gen đều bị bất hoạt, chuột sẽ chết sau sinh Điều này chỉ ra rằng p107 và p130 có vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào, mặc dù chưa có báo cáo nào về sự đột biến đồng thời ở hai gen này gây ra ung thư ở người.

Nghiên cứu về pRB đã chỉ ra vai trò quan trọng của nó trong việc điều hòa chu trình tế bào Trong giai đoạn đầu của pha G1, pRB kết hợp với các yếu tố E2F, ngăn cản chúng liên kết với trình tự tăng cường và hoạt hóa các gen cần thiết cho sự tiến triển qua chu trình tế bào Khi pha G1 kết thúc, pRB bị phosphoryl hóa bởi các phức hệ Cyclin/CDK, giải phóng E2F để kích hoạt các gen thúc đẩy sự chuyển tiếp từ pha G1 sang pha S và sau đó là pha M Sau khi phân bào kết thúc, pRB lại bị loại nhóm phosphate, đưa tế bào trở về trạng thái G1 và khởi động chu trình tế bào mới.

pRB đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào tại điểm kiểm tra giữa pha G1 và pha S Khi pRB liên kết với các yếu tố phiên mã E2F, nó ngăn chặn tế bào tiến vào pha S bằng cách "dừng" tế bào ở cuối pha G1 Tuy nhiên, khi pRB bị phosphoryl hóa bởi phức hệ enzym Cyclin/CDK, nó sẽ "giải phóng" các yếu tố phiên mã E2F Ở dạng tự do, E2F kích hoạt các gen đích mã hóa protein, giúp tế bào vượt qua điểm kiểm tra G1 và tiến vào pha S.

Sau khi đ−ợc hoạt hóa, E2F bật các gen sao chÐp ADN

Thóc ®Èy sao chÐp ADN

Cdk4/6 Đinh Đoàn Long ở nhiều tế bào ung thư không chỉ ở u nguyên bào võng mạc, hoạt động của chúng bị phá vỡ do mất chức năng của cả hai bản sao gen RB, mất đoạn NST, hoặc đột biến làm mất khả năng liên kết của pRB với E2F Khi pRB không còn liên kết với E2F, yếu tố phiên mã E2F sẽ kích hoạt liên tục các gen đích, dẫn đến tổng hợp ADN và phân bào không ngừng Trong điều kiện bình thường, tế bào có cơ chế tự nhiên để dừng chu trình tế bào và sửa chữa, hoặc đưa tế bào vào con đường "chết theo chương trình" Tuy nhiên, khi các cơ chế này bị hỏng, tế bào sẽ phân chia liên tục và chuyển sang trạng thái ung thư.

Protein ức chÕ khèi u p53 cã khối l−ợng 53 kDa đ−ợc tìm thấy khi nghiên cứu sự phát sinh khối u gây nên bởi các virut có hệ gen ADN

Protein này đ−ợc mã hóa bởi gen

TP53 là nguyên nhân cơ bản gây nên hội chứng

Hội chứng Li-Fraumeni là một tình trạng di truyền hiếm gặp, thường đi kèm với nguy cơ cao mắc các loại ung thư khác nhau Nghiên cứu cho thấy rằng những người mắc hội chứng này thường có các đột biến soma làm bất hoạt cả hai bản sao của gen.

TP53 Sau này, những đột biến t−ơng tự liên quan đến p53 đ−ợc tìm thấy ở hầu hết các bệnh

Các đột biến trội ức chế hoạt động a) Cấu trúc các miền của protein p53

Sai hỏng ADN làm tăng sự biểu hiện của gen TP53 p53 b) Cơ chế hoạt động của p53 trong đáp ứng của tế bào với sai hỏng ADN

Các đột biến lặn mất chức năng p21 BAX

Con ®−êng "dõng" chu trình tế bào

Con đ−ờng "tế bào chết theo ch−ơng trình”

 Với vai trò yếu tố phiên mã, p53 làm tăng sự tổng hợp p21

 p21 ức chế hoạt tính phosphoryl hóa của các enzym CDK pRB pRB- 

 Protein pRB ở trạng thái không đ−ợc phosphoryl hóa hoặc chỉ đ−ợc phosphoryl hóa ở mức thấp

 pRB không đ−ợc phosphoryl ức chế hoạt động của yếu tố phiên mã E2F E2F

 Thiếu E2F, các gen đích (thúc đẩy sự diễn tiến của chu trình tế bào) không đ−ợc biểu hiện Các gen đích

Các protein thúc đẩy chu trình tế bào

 Các gen đích của E2F mã hóa không đ−ợc biểu hiện dẫn đến sự

“dừng lại” của chu trình tế bào

Chu trình tế bào bị chặn lại

 Với vai trò yếu tố phiên mã, p53 làm tăng sự tổng hợp gen mã hóa protein BAX

 BAX là chất đối vận của BCL-2; trong khi BCL-2 là protein ức chế hoạt động của con đ−ờng "Tế bào chết theo ch−ơng trình"

Tế bào chết theo ch−ơng trình

Tế bào bị tiêu diệt

 Khi thiÕu BCL-2, con đ−ờng "diệt” tế bào theo ch−ơng trình hoạt động và tế bào chứa ADN sai hỏng bị tiêu diệt

Các cơ chế di truyền liên quan đến sự phát sinh ung th−

Tế bào biểu mô ruột b×nh th−êng

Tế bào biểu mô rối loạn phân bào

Tế bào u tuyÕn nguyên phát

Tế bào u tuyÕn trung gian

Tế bào u tuyÕn thứ phát

Tế bào khèi u ác tính

Tế bào ung th− di c¨n

Gen ức chế khèi u pAPC bị bất hoạt

Sự hoạt hóa của gen gây khèi u K-ras

Bất hoạt gen ức chế khối u trên NST 18q

Bất hoạt gen ức chế khối u TP53

Bất hoạt các gen ức chế khối u khác

Tế bào biểu mô tuyến tiền liệt b×nh th−êng

Tế bào ung th− quan sát đ−ợc d−íi kÝnh hiÓn vi

Tế bào ung th− tuyến tiền liệt định vị

Tế bào ung th− tuyến tiền liệt di c¨n

• Bất hoạt gen ức chÕ khèi u HPC1

• Gen ức chế khối u TP53 bị bất hoạt bởi hoạt động methyl hóa

• Bất hoạt một số gen ức chế khối u khác (ví dụ RB)

• Bất hoạt gen ức chÕ khèi u CDH1

• Bất hoạt gen ức chÕ khèi u TP53

• Bất hoạt gen ức chÕ di c¨n KAI1

• Biểu hiện mạnh của gen gây khối u BCL-2

• Biến đổi thụ thể adrogen

Tế bào thần kinh đệm b×nh th−êng

Tế bào u thần kinh ác tính cÊp II

Tế bào u thần kinh ác tính cÊp III

Ung th− tế bào xèp thÇn kinh thứ cấp

• Sự tăng bản sao của gen gây khối u MDM2

• Bất hoạt các gen ức chế khối u trên các NST 10 p và 10q

• Sự tăng bản sao của gen gây khối u EGFR

Ung th− tế bào xèp thÇn kinh sơ cấp

• Biểu hiện cao bất th−ờng của gen g©y khèi u PDGF

• Bất hoạt gen ức chÕ khèi u TP53

• Bất hoạt gen ức chế khối u trên

• Sự tăng bản sao của gen gây khối u CDK4

• Bất hoạt các gen ức chế khối u trên các NST 13q (RB?), 9p (p15/p16?) và 19q

Bất hoạt các gen ức chế khối u trên nhiễm sắc thể 10p và 10q có thể dẫn đến sự hình thành ung thư ruột kết di căn, ung thư tuyến tiền liệt “vô cảm” với androgen, cũng như các bệnh ung thư tế bào xốp thần kinh sơ cấp và thứ cấp.

Hình 8.9 Một số ví dụ minh họa về các cơ chế di truyền phát sinh ung th− Đinh Đoàn Long

NST 18 và 2 đột biến bất hoạt gen ức chế khối u TP53) Ngoài ra, quá trình di căn có thể còn cần một số đột biến gen khác nữa

Một số cơ chế di truyền liên quan đến ung thư đã được làm rõ, đặc biệt là trong ung thư tiền liệt tuyến Đột biến ở gen HPC1 trên NST số 1 được xác định là nguyên nhân gây bệnh, trong khi các đột biến ở các gen ức chế khối u trên các NST số 13, 16, 17 và 18 có thể làm chuyển đổi các khối u tiền liệt tuyến nguyên phát thành dạng ác tính di căn Sự biểu hiện tăng cường của các tiền gen ung thư như BCL-2 có thể khiến tế bào ung thư trở nên kháng với liệu pháp cắt giảm hormone androgen, hormone cần thiết cho sự sống của tế bào biểu mô tiền liệt tuyến Thông thường, khi thiếu hormone này, tế bào sẽ chết theo chương trình, nhưng ở bệnh nhân ung thư, tế bào ung thư vẫn sống sót nhờ sự biểu hiện tăng cường của gen BCL-2, ức chế quá trình tự chết Các dạng ung thư tiền liệt tuyến không còn đáp ứng với liệu pháp hormone thường dẫn đến tử vong.

Douglas và Robert Weinberg đề xuất sáu giai đoạn trong quá trình phát sinh ung th− ác tính Có thể tóm tắt nh− sau:

1 Giai đoạn khởi phát Các tế bào ung th− nhận đ−ợc các tín hiệu thúc đẩy sự tăng sinh và phân bào Các tín hiệu này có thể xuất hiện do sự thay đổi của các yếu tố ngoại bào hoặc do sự thay đổi bên trong hệ thống truyền tín hiệu nội bào dẫn đến thúc đẩy sự tăng sinh và phân bào Trong những trường hợp “cực đoan” nhất, các tín hiệu kích thích phân bào lại do chính các tế bào ung th− tự sản sinh ra Lúc đó, tế bào đ−ợc kích thích phân chia không giới hạn

2 Giai đoạn thúc đẩy Các tế bào trở nên vô cảm một cách bất th−ờng với các tín hiệu ức chế phân bào Như đã trình bày ở trên, trong các tế bào bình thường, sự phân bào thường được kích hoạt bởi các tín hiệu nhất định; và tồn tại song song với chúng là các tín hiệu ức chế phân bào Bình th−ờng, hai cơ chế này phối hợp với nhau ở mức cân bằng, nhờ vậy sự phân bào diễn ra ổn định, có tổ chức Trong khi đó, ở các tế bào ung th−, sự tăng sinh và phân bào không kiểm soát đ−ợc do các tín hiệu kích thích trở nên có −u thế v−ợt trội Trong quá trình di căn, hầu hết các tế bào ung th− mất hoàn toàn khả năng đáp ứng các tín hiệu ức chế phân bào Chẳng hạn, các tế bào ung thư ruột thường không đáp ứng với yếu tố TGFβ là yếu tố “dẫn đường” để pRB làm ngừng quá trình phân bào Khi sự ngăn cản phân bào bị tê liệt, tế bào sẽ luôn đ−ợc chuyển từ pha G1 sang pha S để tiến hành sao chép ADN và b−ớc vào một chu trình tế bào mới bất kể các sai hỏng ADN có đ−ợc khắc phục hay không Các tế bào sau giai đoạn tăng tr−ởng này sẽ tiếp tục phát triển thành các khối u ác tính

3 Giai đoạn chuyển biến Các tế bào ung th− thoát khỏi cơ chế “chết theo ch−ơng trình” Nh− chúng ta đã biết, protein p53 giữ vai trò quan trọng trong quá trình bảo vệ cơ thể chống lại sự tích lũy các sai hỏng ADN có thể gây nguy hiểm cho cơ thể Tuy ch−a biết đầy đủ về cơ chế phân tử, nh−ng một chức năng của p53 đã biết là chuyển các tế bào bị sai hỏng vào một quá trình tự phá hủy và nhờ vậy loại bỏ chúng ra khỏi cơ thể Khi protein p53 mất chức năng này thì con đ−ờng tự phá hủy của các tế bào hỏng không hoạt động Vì vậy, tế bào hỏng có thể sống và tiếp tục nhân lên nhanh chóng Những tế bào này có xu h−ớng tạo ra các thế hệ tế bào con có mức độ sai hỏng còn cao hơn chính nó Hậu quả là mỗi tế bào con hình thành đều có nguy cơ chuyển thành các tế bào ung th− Nh− vậy, có thể nói, khả năng thoát khỏi cơ chế chết theo ch−ơng trình là “cột mốc” quan trọng để một tế bào khối u phát triển thành ung th− ác tính

4 Giai đoạn lan tràn Các tế bào ung th− có khả năng sao chép vô tận ở ng−ời, mỗi tế bào soma th−ờng chỉ có khả năng sao chép khoảng 60 - 70 lần Giới hạn về khả năng sao chép là do sự mất dần đi của ADN ở vùng đầu mút NST sau mỗi chu kỳ sao chép ADN (xem chương 3) Cơ chế này dẫn đến việc mọi tế bào chỉ có một số lần phân bào giới hạn Các tế bào đã v−ợt qua mức giới hạn về số lần phân bào thường kém ổn định và chết Tuy nhiên, các tế bào ung thư lại có thể v−ợt qua giới hạn phân bào này nhờ việc ADN phần đầu mút NST đ−ợc kéo dài nhờ hoạt động mạnh của enzym ADN telomerase Khi các tế bào ung th− đạt đến giai đoạn này, chúng đ−ợc gọi là các tế bào bất tử

5 Giai đoạn củng cố Các tế bào ung th− phát triển hệ thống tự nuôi d−ỡng Các mô trong cơ thể đa bào đều cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh d−ỡng Các tế bào khối u tiền ác tính th−ờng tăng tr−ởng chậm do chúng đ−ợc nuôi dưỡng bởi hệ tuần hoàn bình thường (có giới hạn phân bố nhất định) Nh−ng, ở các tế bào ung th−, khi khối u đã phát triển đến một mức nhất định thì xuất hiện sự hình thành các mạch máu mới Lúc này, các khối u đ−ợc nuôi d−ỡng và phát triển rất mạnh Nh− vậy, một trong những b−ớc “củng cố” các tế bào ung th− ác tính là sự hình thành các mạch máu mới nuôi d−ỡng các khối u Liên quan đến sự hình thành các mạch máu có các yếu tố tăng cường và các yếu tố ức chế sự hình thành các mạch máu ở các mô bình th−ờng, các yếu tố này đ−ợc duy trì ở mức cân bằng, nhờ vậy các mạch máu đ−ợc hình thành phù hợp với yêu cầu của cơ thể Nh−ng ở các khối u ác tính, sự cân bằng này mất đi theo chiều h−ớng chiếm −u thế của các yếu tố kích thích hình thành mạch máu Vì vậy, sự hình thành mạch máu ở các tế bào ung th− diễn ra nhanh và mạnh Khi đã đ−ợc cung cấp đủ chất dinh d−ỡng, các tế bào ung th− tiếp tục phát triển mạnh và gây nguy hiểm cho cơ thể

6 Giai đoạn xâm lấn và di căn ở giai đoạn này, các tế bào ung th− có khả năng xâm lấn vào các vùng mô khác và hình thành ổ ung th− mới Hơn 90% số bệnh nhân bị ung th− đều chết vào giai đoạn khi các tế bào ung th− đã di căn tới các phần khác nhau của cơ thể Khi các khối u di căn, các tế bào ung th− rời khỏi khối u nguyên phát và di chuyển dọc theo đ−ờng máu (hay gặp trong ung th− tế bào liên kết) hoặc đ−ờng bạch huyết (hay gặp trong ung th− tế bào biểu mô) tới các vị trí khác trong cơ thể tr−ớc khi chúng trú ngụ ở vị trí mới và hình thành ổ ung th− mới Nh− vậy, kết quả của sự di căn là sự hình thành các khối u thứ cấp ở vị trí có thể cách rất xa vị trí khối u nguyên phát ban đầu Khi ung th− đã tiến triển đến giai đoạn này, sự kiểm soát và điều trị sẽ cực kỳ khó khăn Vì vậy, có thể nói di căn là giai đoạn cuối cùng và nguy hiểm nhất trong quá trình phát triển của ung th−

Hiện nay, nhiều nước phát triển đã triển khai các chương trình chẩn đoán sớm các tác nhân gây đột biến và ung thư, như phép thử Ames để xác định các chất gây đột biến hóa học trong môi trường sống và làm việc Khi phát hiện các tác nhân này, các biện pháp phòng ngừa sẽ được đề ra nhằm giảm thiểu khả năng tiếp xúc của con người Tuy nhiên, trong xã hội hiện đại, hầu như không có môi trường nào hoàn toàn tránh được các tác nhân gây đột biến và ung thư, bên cạnh đó, nhiều thói quen sinh hoạt như hút thuốc, phơi nắng quá mức, chế độ dinh dưỡng không hợp lý và xả thải độc hại cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh.

Trong ba thập kỷ qua, nghiên cứu di truyền phân tử đã mang lại những hiểu biết cơ bản về quá trình phát sinh ung thư, nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần làm sáng tỏ Các chuyên gia trong lĩnh vực y học, sinh học và dược học hy vọng rằng những hiểu biết mới về ung thư trong thập kỷ tới sẽ giúp phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn so với hiện tại.

Điều hòa gen hệ miễn dịch ở động vật có xương sống

Tổng quan về hoạt động miễn dịch

Khi cơ thể động vật có vú bị lây nhiễm bởi các tác nhân sinh học như nấm, vi khuẩn, virus hoặc tế bào ngoại lai, chúng sẽ kích hoạt các đáp ứng miễn dịch Quá trình này thường diễn ra qua ba bước cơ bản.

1 Nhận ra sự xâm nhập của các thể lây nhiễm (ví dụ: tế bào hoặc virut)

2 Truyền tín hiệu nhận biết tới những tế bào thích hợp của hệ miễn dịch

3 Loại bỏ các thực thể lạ

Hệ miễn dịch có hai loại đáp ứng chính: đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Đáp ứng không đặc hiệu bao gồm việc tăng tuần hoàn máu và huy động các thể thực bào đến vùng bị lây nhiễm để tiêu diệt virus, vi khuẩn và tế bào ngoại lai Ngược lại, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu liên quan đến việc tổng hợp protein và sản sinh tế bào đặc hiệu để bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân lây nhiễm cụ thể Hai kiểu đáp ứng này không hoạt động độc lập mà có sự phối hợp chặt chẽ để đạt hiệu quả cao trong việc bảo vệ cơ thể Quá trình đáp ứng miễn dịch là phức tạp và bao gồm nhiều thành phần tham gia, cùng với sự điều hòa các gen của hệ miễn dịch.

Các thành phần tham gia đáp ứng miễn dịch ở động vật có vú

Đáp ứng miễn dịch có đặc điểm nổi bật là tính đặc hiệu, được quy định bởi ba thành phần chính của hệ miễn dịch Thứ nhất, có một nhóm các tế bào biệt hóa, mỗi loại tế bào đảm nhận chức năng riêng nhưng hoạt động theo cơ chế điều phối chung Thứ hai, hệ miễn dịch bao gồm hai nhóm protein chức năng: kháng thể và thụ thể tế bào T, mỗi loại có khả năng nhận biết đặc hiệu các hợp chất lạ khác nhau một cách không giới hạn.

(3) một tập hợp các protein biệt hóa đ−ợc gọi là các kháng nguyên t−ơng hợp mô

MHC (Major Histocompatibility Complex) là các protein quan trọng trong việc giao tiếp giữa các tế bào, giúp hệ miễn dịch nhận diện các hợp chất lạ và phân biệt tế bào của cơ thể với tế bào ngoại lai Hệ miễn dịch của một người trưởng thành trung bình chứa khoảng 10^12 tế bào bạch cầu và hơn 10^15 protein đặc thù, tất cả đều được điều phối một cách đồng bộ để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm bệnh khỏi cơ thể Bảng 9.1 cung cấp danh sách các nhóm protein và tế bào chủ yếu trong hệ miễn dịch cùng với chức năng cơ bản của chúng.

Khi một tác nhân lạ như virus hoặc vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể, hệ miễn dịch nhận diện và kích thích sản sinh kháng thể cùng protein thụ thể tế bào T để tiêu diệt tác nhân lây nhiễm Tác nhân lạ này được gọi là kháng nguyên (antigen), và nếu nó có khả năng khởi động phản ứng miễn dịch, nó sẽ được xem là chất sinh miễn dịch (immunogen) Hầu hết các hợp chất sinh học như polypeptide, polysaccharide, axit nucleic và các hợp chất tổng hợp ngoại lai đều có thể hoạt động như kháng nguyên và chất sinh miễn dịch khi vào cơ thể Đáp ứng miễn dịch ở động vật có vú bao gồm hai thành phần chính: đáp ứng miễn dịch thể dịch, do kháng thể điều khiển, và đáp ứng miễn dịch tế bào, do tế bào lympho T điều khiển Đáp ứng miễn dịch thể dịch liên quan đến việc sản xuất và tiết ra kháng thể.

Bảng 9.1 Các thành phần của hệ thống miễn dịch ở động vật có vú

Tên thành phần Chức năng cơ bản

Kháng nguyên là các chất kích hoạt đáp ứng miễn dịch, còn đ−ợc gọi là các chất hoạt hóa sản sinh kháng thể

Kháng thể là protein do hệ miễn dịch sản xuất, có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên, từ đó kích thích hệ miễn dịch tiêu diệt các kháng nguyên.

Thụ thể tế bào T là các protein do hệ miễn dịch sản sinh để phản ứng với kháng nguyên Sau khi tổng hợp, các protein này gắn lên bề mặt tế bào độc T và liên kết đặc hiệu với kháng nguyên nhờ sự hỗ trợ của kháng nguyên phức hệ tương hợp mô (MHC).

MHC (Complexes chính của Histocompatibility) là các protein bề mặt tế bào có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch, giúp phân biệt các hợp chất lạ với các chất tự nhiên của cơ thể Chúng cũng đóng vai trò trong việc thúc đẩy sự truyền tín hiệu giữa các tế bào, góp phần vào quá trình phản ứng miễn dịch hiệu quả.

II Các loại tế bào

Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa trong tủy xương, có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên hóa khác nhau trong hệ miễn dịch.

Thể thực bào là các tế bào lớn có khả năng bắt giữ, tiêu hóa và phân hủy các tác nhân lạ như virus, vi khuẩn và nấm Trong số đó, đại thực bào là một nhóm thể thực bào đặc biệt có khả năng tiêu hóa các kháng nguyên và bộc lộ chúng lên bề mặt tế bào, từ đó tương tác với các tế bào khác trong hệ miễn dịch.

Tế bào lympho B, sau khi trải qua quá trình biệt hóa tại tủy xương của động vật có vú, sẽ phát triển thành các tế bào huyết tương (tương bào) có khả năng sản sinh kháng thể và các tế bào nhớ B.

T−ơng bào là các tế bào bạch cầu sinh kháng thể có nguồn gốc từ các tế bào lympho B

Tế bào nhớ B là loại tế bào B có khả năng sản xuất nhanh chóng kháng thể cụ thể khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên đã quen thuộc, đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch thứ cấp.

Tế bào lympho T được hình thành và biệt hóa trong tuyến ức, sau đó phát triển thành nhiều loại tế bào T khác nhau, bao gồm bốn loại chính.

Trợ bào T là loại tế bào T có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch, chúng nhận diện các kháng nguyên được trình diện bởi đại thực bào Sau khi nhận biết, trợ bào T kích thích tế bào lympho B sản xuất kháng thể và đồng thời thúc đẩy tế bào lympho T phát triển các thụ thể tế bào T.

Tế bào ức chế T là nhóm tế bào T có chức năng quan trọng trong việc ức chế tế bào B sản sinh kháng thể và ngăn chặn tế bào T tạo ra thụ thể tế bào T sau khi quá trình đáp ứng miễn dịch kết thúc.

Tế bào độc T, hay còn gọi là tế bào giết T, là nhóm tế bào T có thụ thể tế bào T chuyên trách trong việc tiêu diệt các tế bào mang kháng nguyên mà chúng nhận diện.

Tế bào nhớ T là nhóm tế bào T có khả năng sản xuất nhanh các thụ thể tế bào T trong đáp ứng miễn dịch thứ cấp, giúp chúng liên kết và "cô lập" kháng nguyên trong hệ tuần hoàn Phức hệ "kháng nguyên - kháng thể" sau đó được tiêu hóa bởi các tế bào bạch cầu đặc biệt Hệ thống đáp ứng miễn dịch thể dịch bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm và virus trước khi chúng có thể xâm nhập sâu vào tế bào Đáp ứng miễn dịch tế bào liên quan đến việc sản xuất thụ thể trên bề mặt tế bào lympho T, cho phép nhận biết và tiêu diệt tế bào lạ Hệ thống này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể động vật khỏi sự lây nhiễm virus Trong phần tiếp theo, chúng ta sẽ tìm hiểu về các loại tế bào và đại phân tử tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch.

Đáp ứng miễn dịch thể dịch (điều hòa trung gian bởi kháng thể)

Khi một kháng nguyên lạ, như một phân tử glycoprotein trên bề mặt tế bào vi khuẩn, xâm nhập vào mạch máu của động vật có vú, nó sẽ kích thích một hệ thống phản vệ được gọi là đáp ứng miễn dịch thể dịch.

Hệ miễn dịch thể dịch đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân lây nhiễm như vi khuẩn, nấm và virus Quá trình này bắt đầu khi đại thực bào phát hiện và tiêu diệt hợp chất lạ, đồng thời bộc lộ epitop để các trợ bào T nhận diện Các trợ bào T sau khi được kích hoạt sẽ thúc đẩy tế bào B biệt hóa thành tương bào sản xuất kháng thể hoặc tế bào nhớ B, giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch khi tái nhiễm Tuy nhiên, ở bệnh nhân AIDS, virus HIV tấn công và phá hủy các trợ bào T, làm suy yếu hệ miễn dịch và khiến người bệnh dễ mắc các bệnh truyền nhiễm khác.

Epitop là phần kháng nguyên quan trọng trong đáp ứng miễn dịch, giúp kích thích sự sản sinh kháng thể Nhờ vào cấu trúc này, kháng thể có khả năng nhận diện và gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên Một kháng nguyên có thể chứa một hoặc nhiều epitop, trong đó epitop của một protein kháng nguyên thường là đoạn peptide ngắn, có thể chỉ gồm khoảng 6 axit amin.

Các kháng thể gắn vào kháng nguyên sẽ kích hoạt đáp ứng miễn dịch, giúp bất hoạt và loại bỏ chúng khỏi cơ thể Phức hợp kháng nguyên/kháng thể có thể được loại bỏ qua hai con đường chính.

Các thực bào "nuốt" và phân hủy các tác nhân gây bệnh, trong khi các kháng thể IgG và IgM kích hoạt các protein bổ thể để tạo thành phức hệ tiêu diệt virus và các hợp chất protein khác.

Sù x©m nhËp của thể lây nhiÔm

Phức hệ MHC/kháng nguyên

Kháng nguyên liên kết màng

Tế bào B thuÇn khiÕt (ch−a biệt hóa)

T−ơng bào (sản sinh kháng thể)

Hình 9.6 minh họa sự biệt hóa của các tế bào B trong đáp ứng miễn dịch thể dịch Đinh Đoàn Long cho biết rằng quá trình này liên quan đến việc phân hủy protein và tiêu diệt vi khuẩn, nấm thông qua sự phân giải tế bào.

Khi tế bào lympho B biệt hóa, mỗi tương bào chỉ sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu Tất cả kháng thể từ cùng một tương bào đều giống nhau và có khả năng liên kết với cùng một kháng nguyên Câu hỏi đặt ra là làm thế nào cơ thể có thể sản sinh lượng lớn kháng thể để chống lại tác nhân gây bệnh? Hệ tuần hoàn ở động vật có vú chứa hàng triệu tế bào B, cho phép tạo ra hàng triệu tương bào và kháng thể khác nhau Khi một tế bào B sản xuất kháng thể liên kết với kháng nguyên, nó sẽ được kích hoạt để phân chia và biệt hóa thành một quần thể lớn các tương bào sản sinh cùng loại kháng thể, quá trình này gọi là nhân dòng chọn lọc tế bào B.

Mỗi dòng tương bào trong cơ thể có khả năng sản xuất từ 2000 đến 20.000 kháng thể mỗi giây, đủ để chống lại các thể lây nhiễm Khi các kháng nguyên lạ được loại bỏ, tế bào ức chế T sẽ gửi tín hiệu cho các tương bào ngừng sản sinh kháng thể cho đến khi cơ thể tái nhiễm với cùng loại kháng nguyên.

Bệnh thiếu gamma globulin liên kết NST X là một trong những bệnh di truyền nghiêm trọng ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch thể dịch, đặc biệt là do sự thiếu hụt hoàn toàn các tế bào lympho B Bệnh nhân có thể có tế bào B nhưng chúng không hoàn thiện và không thể biệt hóa thành tế bào sản sinh kháng thể Vì gen bị sai hỏng trên NST X, đa số bệnh nhân là nam giới Những người mắc bệnh này rất nhạy cảm với vi khuẩn và nấm, nhưng hệ thống bổ thể và miễn dịch tế bào vẫn hoạt động bình thường, giúp bảo vệ cơ thể khỏi các virus.

Đáp ứng miễn dịch tế bào (điều hòa trung gian bởi tế bào T)

Hệ thống đáp ứng miễn dịch tế bào, hay đáp ứng miễn dịch được điều hòa bởi tế bào T, là một phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch của động vật có vú Cơ chế này chủ yếu được điều chỉnh bởi các tế bào độc T, có khả năng tấn công và tiêu diệt các tế bào bộc lộ kháng nguyên đặc hiệu Tế bào độc T có thể phát hiện và phá hủy các tế bào nhiễm virus, vi khuẩn và các tác nhân gây bệnh khác, cũng như một số tế bào ung thư Chúng sở hữu các thụ thể tế bào T trên bề mặt, cho phép nhận biết các kháng nguyên đặc trưng là các đoạn peptide của vi khuẩn và virus, được trình diện trên bề mặt tế bào nhiễm cùng với protein MHC.

Các tế bào độc T hoàn thiện gắn vào các tế bào đích có kháng nguyên và tiêu diệt chúng thông qua các cơ chế phân hủy tế bào Chúng tiết ra các protein gọi là perforin, có khả năng tạo ra lỗ thủng trên màng tế bào đích Sự thoát ra của sinh chất qua các lỗ thủng này dẫn đến cái chết của tế bào.

Sự ghi nhớ của hệ miễn dịch

Khi cơ thể bị nhiễm lần đầu với một kháng nguyên lạ, hệ miễn dịch th−ờng cần từ

Hệ miễn dịch cần từ 7 đến 10 ngày để sản sinh đủ lượng kháng thể đặc hiệu, và mất 2 - 3 tuần để đạt mức tổng hợp tối đa Khi lần đầu tiếp xúc với kháng nguyên lạ, cơ thể chỉ tạo ra đáp ứng miễn dịch sơ cấp với mức độ thấp Tuy nhiên, khi gặp lại kháng nguyên, đáp ứng miễn dịch thứ cấp diễn ra nhanh chóng và mạnh mẽ hơn, nhờ vào khả năng "ghi nhớ" của hệ miễn dịch Điều này là nền tảng cho hiệu quả của vắc-xin trong phòng chống bệnh truyền nhiễm Mặc dù chúng ta đã hiểu phần nào cơ sở tế bào học liên quan đến khả năng ghi nhớ này, nhưng cơ sở phân tử vẫn chưa được khám phá đầy đủ Các tế bào lympho B và T chưa gặp kháng nguyên được gọi là tế bào thuần khiết, và khi tiếp xúc với kháng nguyên, chúng sẽ biệt hóa thành tế bào ghi nhớ và tế bào B hoặc T hoạt hóa Tế bào hoạt hóa sau đó phân chia và biệt hóa thành các tương bào sinh kháng thể và tế bào T sinh thụ thể.

Hình 9.7 Đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào

Các vi sinh vật lây nhiễm (vÝ dô: virut)

Tế bào bộc lộ kháng nguyên

Kháng nguyên đ−ợc bộc lộ (epitop) MHC

Các hợp chất cytokine đ−ợc tiết ra

Sự nhân dòng và hoạt hóa nhanh các tế bào độc T và các thực bào

Phân giải các tế bào bị lây nhiễm Đinh Đoàn Long

Tế bào ghi nhớ B và T có thời gian sống lâu dài, từ vài tháng đến vài năm, khác với các tương bào và tế bào độc T vốn chỉ tồn tại vài ngày đến một tuần Chúng luôn ở trạng thái hoạt hóa, cho phép phát triển thành tương bào sinh kháng thể và tế bào độc T khi cơ thể tiếp xúc lại với cùng loại kháng nguyên Khi đó, tế bào nhớ B và T được kích hoạt để phân chia và biệt hóa, dẫn đến đáp ứng miễn dịch thứ cấp nhanh chóng, tạo ra một lượng lớn tương bào và tế bào độc T trong thời gian ngắn.

Sự sắp xếp lại hệ gen trong quá trình biệt hóa tế bào lympho B

Hệ miễn dịch của con người nổi bật với khả năng tổng hợp kháng thể đặc thù cho từng loại kháng nguyên đa dạng Điều này đặt ra câu hỏi về cách mà hệ gen có thể lưu trữ thông tin di truyền phong phú để mã hóa tất cả các loại kháng thể Câu trả lời nằm ở cơ chế "sắp xếp lại hệ gen" trong quá trình biệt hóa tế bào miễn dịch.

Trong hệ gen, thông tin di truyền trên ADN mã hóa cho các chuỗi nặng và nhẹ của kháng thể được lưu giữ thành các phân đoạn nhỏ Những phân đoạn này có thể tổ hợp thành các trình tự phù hợp trong quá trình biệt hóa tế bào sản sinh kháng thể Tế bào gốc chứa đầy đủ thông tin di truyền cho tất cả các loại kháng thể, nhưng ở dạng phân đoạn Khi tế bào gốc biệt hóa thành tế bào lympho B và tương bào ở tủy xương, các phân đoạn gen được “cắt” và “lắp ghép” lại với nhau thành các gen mã hóa cho từng loại kháng thể Quá trình tái sắp xếp hệ gen diễn ra thông qua việc nối các phân đoạn gen theo kiểu tái tổ hợp, trong khi các phân đoạn ADN ở giữa được cắt bỏ một cách đặc thù tương ứng với từng loại kháng nguyên.

Các gen mã hóa chuỗi nhẹ lambda, chuỗi nhẹ kappa và chuỗi nặng đều được cắt và tái tổ hợp theo cơ chế tương tự, nhưng khác nhau ở số phân đoạn ADN sử dụng: 2 cho chuỗi nhẹ lambda, 3 cho chuỗi nhẹ kappa, và 4 cho chuỗi nặng Thêm vào đó, các locut gen mã hóa cho các chuỗi này nằm trên ba nhiễm sắc thể khác nhau ở người, cụ thể là NST số 22, 2 và 14, cho thấy sự lắp ráp của chúng diễn ra độc lập.

9.6.1 Các gen mã hóa chuỗi nhẹ lambda (λλλλ) đ−ợc ráp nối từ hai phân đoạn gen ở các tế bào gốc, các trình tự ADN mã hóa cho các chuỗi nhẹ λ gồm hai phân đoạn khác nhau (hình 9.8a) Phân đoạn thứ nhất đ−ợc gọi là Lλ λ λ λVλ λ λ λ mã hóa cho hai đoạn trình tự polypeptide Trình tự thứ nhất là đoạn polypeptide đầu N kị n−ớc, gọi là đoạn dẫn đầu (kí hiệu là Lλ); đoạn này đ−ợc cắt bỏ khi chuỗi λ sau dịch mã đi qua mạng l−ới nội chất Trình tự thứ hai là vùng biến đổi (kí hiệu Vλ) gồm 97 axit amin đầu tiên ở đầu N của chuỗi nhẹ lambda (sau khi Lλ đã đ−ợc cắt bỏ) Phân đoạn thứ hai đ−ợc gọi là Jλ λ λ λCλ λ λ λ, mã hóa cho hai trình tự, đ−ợc gọi là trình tự kết nối (Jλ) và trình tự vùng ổn định đầu

C của chuỗi nhẹ lambda (Cλ) và Jλ mã hóa cho đoạn polypeptide gồm 13 - 15 axit amin thuộc vùng biến đổi của chuỗi lambda Gen mã hóa chuỗi nhẹ λ hoàn chỉnh được lắp ráp bằng cách “cắt và nối” phân đoạn LλVλ với phân đoạn gen JλVλ trên NST số 22, trong quá trình này, đoạn trình tự ở giữa bị cắt bỏ Sự cắt - nối gen diễn ra trong quá trình biệt hóa tế bào lympho B, được điều khiển bởi các sự kiện tái tổ hợp dựa trên trình tự ADN đặc thù của locut gen mã hóa chuỗi immunoglobulin Mỗi tế bào gốc ở người chứa khoảng 300 phân đoạn LλVλ khác nhau gần tâm động NST số 22 và 9 phân đoạn JλCλ (ít nhất 6 phân đoạn hoạt động) nằm xa tâm động Trong quá trình biệt hóa, một phân đoạn LλVλ sẽ được nối với một phân đoạn JλCλ, cắt bỏ đoạn ADN ở giữa, tạo thành tổ hợp gen mới (LλVλJλCλ) ban đầu có hai intron.

1200 bp nằm giữa các exon mã hóa Jλ và Cλ, và hai intron này được cắt bỏ khỏi tiền-mARN trong quá trình hoàn thiện mARN mã hóa kháng thể, tương tự như hầu hết các mARN khác ở eukaryote.

9.6.2 Các gen mã hóa chuỗi nhẹ kappa (κκκκ) đ−ợc ráp nối từ ba phân đoạn gen

Việc tổng hợp chuỗi κ được điều khiển bởi ba phân đoạn gen: (1) phân đoạn LκVκ mã hóa polypeptide dẫn đầu (Lκ) và 95 axit amin ở đầu N của vùng biến đổi (Vκ), (2) phân đoạn Jκ mã hóa chuỗi 13 axit amin của vùng biến đổi, và (3) phân đoạn Cκ mã hóa vùng ổn định đầu C của chuỗi κ Ở người, NST số 2 chứa 300 phân đoạn gen LκVκ khác nhau (một số có thể không còn hoạt động), 5 phân đoạn gen Jκ và một phân đoạn Cκ duy nhất, với các phân đoạn Jκ nằm giữa các phân đoạn khác.

LκVκ và Cκ (hình 9.8b) a) Các gen mW hóa chuỗi nhẹ lambda (λ λ λ λ), n = 300

Protein chuỗi nhẹ (L) tiền thân V J C b) Các gen mW hóa chuỗi nhẹ kappa (κ κ κ κ), n = 300

Sắp xếp lại các gen trong tế bào lympho B

Hoàn thiện mARN mARN hoàn thiện

Hoàn thiện protein (cắt bỏ đoạn dẫn đầu và glycosyl hóa)

Hình 9.8 minh họa quá trình tái tổ hợp ADN trong sự biệt hóa tế bào lympho B và sự chuyển đổi protein chuỗi nhẹ của kháng thể (λ hoặc κ) Trong hình, các chữ viết tắt P và E đại diện cho promoter và trình tự tăng cường (enhancer) Các gen mã hóa chuỗi nhẹ J λ C λ bao gồm 9 phân đoạn, tuy nhiên hình (a) chỉ thể hiện 4 phân đoạn đầu tiên là J λ C λ.

Trong tế bào gốc, năm phân đoạn Jk được tách biệt với các phân đoạn LkVk bởi một đoạn ADN không mã hóa dài, đồng thời cách biệt với phân đoạn Cκ bởi một đoạn không mã hóa ngược dòng khoảng 2000 bp Quá trình biệt hóa tế bào diễn ra với sự tương tác của các phân đoạn này.

B, gen mã hóa chuỗi nhẹ λ có thể đ−ợc hình thành từ một tổ hợp bất kỳ của một phân đoạn LkVk với một phân đoạn Jk và phân đoạn Ck duy nhất Trong quá trình tái tổ hợp ADN nh− vậy, bất kỳ một phân đoạn L k V k nào trong số 300 phân đoạn L k V k có trong tế bào đều có thể nối với bất kỳ một trong năm phân đoạn J k và cắt bỏ đoạn trình tự ADN nằm giữa để tạo nên gen dung hợp LkVkJk mã hóa cho toàn bộ vùng biến đổi của chuỗi nhẹ κ Vùng không mã hóa nằm giữa các phân đoạn Jk và Ck (tức là phân đoạn nằm giữa gen dung hợp L k V k J k và C k ) đ−ợc duy trì trong cấu trúc ADN của các t−ơng bào Trình tự ADN đầy đủ này (L k V k J k - đoạn không mã hóa - C k ) sau đó sẽ đ−ợc phiên mã và đoạn không mã hóa sẽ đ−ợc cắt bỏ trong quá trình hoàn thiện mARN sau phiên mã giống nh− một intron Phân tử mARN hoàn thiện sẽ đ−ợc dùng để dịch mã và đoạn polypeptide dẫn đầu (Lκ) đ−ợc cắt khỏi chuỗi κ khi nó đ−ợc vận chuyển qua mạng l−ới nội chất a) Locut gen mW hóa chuỗi nặng trên NST số 14

Protein chuỗi nặng (H) tiền thân b) Sắp xếp lại hệ gen trong quá trình biệt hóa tế bào lympho B

Hoàn thiện protein (cắt bỏ đoạn dẫn đầu và glycosyl hóa)

Hình 9.9 minh họa quá trình tái tổ hợp gen mW hóa chuỗi nặng của kháng thể và sự biểu hiện của chúng trong tế bào B Trong đó, P đại diện cho promoter và E là trình tự tăng cường (enhancer) Các ký hiệu khác sẽ được giải thích chi tiết trong bài viết.

C à C δ C γ3 C γ1 C γ2 C γ4 C ε C α1 C α2 c) Sự biểu hiện gen mW hóa chuỗi nặng trong t−ơng bào

Hoàn thiện mARN mARN hoàn thiện

C H 1 C H 2 C H 3 C H 4 C H 5 Các intron phân tách các exon(ví dụ : C H 1-5) mã hóa vùng C của chuỗi nặng

9.6.3 Các gen mã hóa chuỗi nặng đ−ợc ráp nối từ bốn phân đoạn gen

Thông tin di truyền mã hóa cho chuỗi nặng của kháng thể được tổ chức thành bốn phân đoạn gen: LHVH, JH, CH và phân đoạn D Ba phân đoạn LHVH, JH, CH có cấu trúc tương tự như các locut gen mã hóa chuỗi nhẹ κ, trong khi phân đoạn D mã hóa cho đoạn peptide từ 2 đến 13 axit amin thuộc vùng biến đổi Vùng biến đổi của chuỗi nặng được mã hóa bởi ba phân đoạn tách biệt: LHVH, JH và D, và chúng được nối với nhau trong quá trình biệt hóa của tế bào B Thêm vào đó, có từ 1 đến 4 phân đoạn khác cũng tham gia vào quá trình này.

CH ở mỗi lớp Ig ở ng−ời, trên NST số 14 có 9 phân đoạn gen C H , đ−ợc kí hiệu theo thứ tự là C H à,

C H δ, C H γ 3, C H γ 1, C H α 1, C H γ 2, C H γ 4, C H ε, và C H α 2 là các phân đoạn gen quan trọng trên vùng 957 Kb của NST, trong đó có 123 phân đoạn L H V H, nhưng chỉ 39 phân đoạn còn hoạt động NST số 15 và 16 cũng chứa một số phân đoạn L H V H không hoạt động, trong khi NST số 14 có 27 phân đoạn D, với 25 phân đoạn còn hoạt động và 2 không hoạt động, cùng với 6 phân đoạn JH Trong quá trình biệt hóa tế bào B, sự tái tổ hợp gen diễn ra thông qua việc ghép nối một phân đoạn L H V H với một phân đoạn D và một phân đoạn JH, cắt bỏ hai đoạn ADN giữa chúng để tạo thành trình tự ADN liên tục (L H V H DJ H) mã hóa cho vùng biến đổi của chuỗi nặng.

9.6.4 Sự tái tổ hợp các gen trong quá trình biệt hóa các tế bào sinh kháng thể đ−ợc điều khiển bởi các "tín hiệu" trên ADN

Một câu hỏi đặt ra là: bằng cách nào hệ gen điều khiển đ−ợc các b−ớc tái tổ hợp

ADN đảm bảo rằng một phân đoạn V luôn kết nối với một phân đoạn J, không kết nối với phân đoạn V khác hoặc trực tiếp với phân đoạn C Quá trình tái tổ hợp này được điều khiển bởi các trình tự tín hiệu kết nối V-D và D-J Các tín hiệu tái tổ hợp tương tự được tìm thấy ở vùng biên của tất cả các phân đoạn gen V Tương tự, tất cả các phân đoạn J đều có tín hiệu tái tổ hợp giống nhau, tuy nhiên, các tín hiệu tái tổ hợp của J khác với tín hiệu tái tổ hợp của V.

D và C cũng có các trình tự tín hiệu đặc thù của chúng

Các tín hiệu tái tổ hợp điều khiển sự kết nối V-D và D-

Gen mW hóa chuỗi nặng có chiều dài 7 bp và 9 bp, được ngăn cách bởi các đoạn ADN đệm Các trình tự ADN này đóng vai trò quan trọng trong việc nhận biết và tái tổ hợp các phân đoạn V, D và J.

ADN Đoạn ADN không mã hóa

Tín hiệu 7 bp Tín hiệu 9 bp Các trình tự tín hiệu kết nèi V-D Đoạn ADN đệm

ADN đệm ADN đệm Đoạn ADN mã hóa Đoạn ADN không mã hóa

Tái tổ hợp ADN Tái tổ hợp ADN

Sự chuyển đổi lớp kháng thể

Vào thời điểm mà sự tổng hợp các kháng thể bắt đầu diễn ra ở các tế bào lympho

Khi B đang biệt hóa, hệ gen chứa các phân đoạn C H tách biệt với phân đoạn ADN dung hợp L H V H DJ H Lớp kháng thể được quy định bởi trình tự mã hóa vùng ổn định (CH) gần phân đoạn LHVHDJH nhất, do đó, lớp kháng thể đầu tiên được sản sinh để đáp ứng một kháng nguyên mới luôn là IgM, sản phẩm của phân đoạn này.

Các tương bào bắt đầu sản xuất các lớp kháng thể khác nhau, bao gồm IgD, IgG, IgE và IgA, trong một quá trình được gọi là chuyển đổi lớp kháng thể.

Sự chuyển đổi lớp kháng thể ban đầu xảy ra khi một số tương bào có khả năng sản xuất đồng thời hai loại kháng thể IgM và IgD Cả hai loại kháng thể này chỉ khác nhau ở vùng đáp ứng miễn dịch, cụ thể là ở vùng ổn định đầu C, trong khi vùng liên kết kháng nguyên của chúng lại giống nhau, do đều được hình thành từ sự dung hợp giữa các phân đoạn VκJκ hoặc VλJλ.

V H DJ H cùng loại) ở các tế bào này, một tiền- mARN duy nhất bao gồm cả hai đoạn CH à và CH δ đ−ợc hình thành trong quá trình phiên mã

Trong giai đoạn hoàn thiện mARN, trình tự

V H DJ H đ−ợc ghép nối hoặc với C H à hoặc với C H δ tạo nên hai loại mARN hoàn thiện khác nhau

Kết quả cho thấy cả hai loại kháng thể được sản xuất trong cùng một tế bào Ở các tương bào khác, quá trình chuyển đổi lớp kháng thể diễn ra từ IgM sang IgG, IgE và IgA Sự chuyển đổi này liên quan đến tái tổ hợp hệ gen, trong đó các phân đoạn CH gần đoạn L H V H DJ H được cắt bỏ Lớp kháng thể được tạo ra sau mỗi lần tái tổ hợp được xác định bởi phân đoạn C H còn lại gần nhất với đoạn L H V H DJ H.

Sự tái tổ hợp ở các gen mã hóa thụ thể tế bào T

Giống nh− các chuỗi nặng của kháng thể, hai chuỗi polypeptide của thụ thể tế bào

Thụ thể tế bào T được mã hóa bởi các phân đoạn L-V, D, J và C, trong đó vùng biến đổi của thụ thể được tạo thành từ nhiều loại phân đoạn L-V, D và J khác nhau Ngược lại, vùng ổn định chỉ được mã hóa bởi một số ít phân đoạn C Các gen mã hóa thụ thể tế bào T được ráp nối để tạo thành cấu trúc hoàn chỉnh.

Chuyển đổi thành lớp kháng thể IgG IgG IgE IgA

Tế bào B sản sinh kháng thể IgM

T−ơng bào sản sinh kháng thể IgG

Chuyển đổi thành lớp kháng thể IgE

T−ơng bào sản sinh kháng thể IgE Chuyển đổi thành lớp kháng thể IgE

IgA T−ơng bào sản sinh kháng thể IgA

Sự chuyển đổi các lớp kháng thể diễn ra qua cơ chế tái tổ hợp ADN trong tế bào soma, với lớp kháng thể đầu tiên được sản sinh là IgM để đáp ứng với kháng nguyên mới Lớp kháng thể được xác định bởi trình tự mã hóa vùng ổn định của chuỗi nặng (C H) gần phân đoạn L H V H DJ H Quá trình chuyển đổi này liên quan đến việc cắt bỏ các đoạn trình tự giữa phân đoạn J và các phân đoạn C H khác loại Đinh Đoàn Long cho biết rằng việc sắp xếp lại các phân đoạn ADN trong tế bào soma diễn ra song song với quá trình biệt hóa tế bào T từ tế bào gốc, tương tự như sự hình thành các gen mã hóa kháng thể trong tế bào lympho B Các chuỗi polypeptide thụ thể kiểu α và β được mã hóa bởi các phân đoạn gen trong các cụm locut, tương tự như các phân đoạn ADN mã hóa cho chuỗi nặng và nhẹ của kháng thể Ở người, cụm locut gen mã hóa cho chuỗi α và β của thụ thể tế bào T nằm trên các NST số 14 và 7.

Điều hòa sự biểu hiện của các gen mã hóa kháng thể

Trong tế bào gốc máu, các phân đoạn gen mã hóa kháng thể thường chỉ được phiên mã ở mức rất thấp hoặc không được phiên mã Ngược lại, ở các tương bào, 10-20% tổng số mARN là phiên mã của gen mã hóa kháng thể Câu hỏi đặt ra là yếu tố nào đã kích hoạt các gen này trong quá trình biệt hóa tế bào lympho? Đồng thời, lý do mỗi loại tương bào chỉ sản sinh một loại kháng thể đặc trưng cho kháng nguyên duy nhất cũng cần được làm rõ.

9.9.1 Loại bỏ alen là cơ chế để mỗi tế bào chỉ biểu hiện một bản sao của gen

Mỗi tương bào chỉ tạo ra một loại kháng thể do chúng mang hai bản sao khác nhau của gen mã hóa chuỗi polypeptide kháng thể Các tế bào soma ở động vật có vú thường ở dạng lưỡng bội, nhưng sau quá trình biệt hóa, mỗi tương bào sẽ tập trung vào việc sản xuất một loại kháng thể duy nhất, góp phần vào khả năng miễn dịch của cơ thể.

B, chỉ có một chuỗi nhẹ duy nhất và chuỗi nặng duy nhất đ−ợc tạo ra Hiện t−ợng này đ−ợc gọi là sự loại bỏ alen (vì một trong hai bản sao không biểu hiện) Điều này xảy ra nh− thế nào? Cơ chế chi tiết liên quan đến hiện t−ợng này đến nay ch−a rõ Nh−ng, một số bằng chứng cho thấy, ở phần lớn tr−ờng hợp sự tái tổ hợp trình tự ADN xảy ra trên cả hai alen trong một tế bào (theo cơ chế mô tả ở trên), tuy vậy chỉ có một kiểu tái tổ hợp (một alen) đ−ợc biểu hiện Các alen không biểu hiện th−ờng chỉ đ−ợc ráp nối một phần hoặc bị cắt bỏ đi một số trình tự quan trọng Hậu quả của sự loại bỏ alen là nguyên lý cơ bản của việc có thể tạo ra một l−ợng lớn kháng thể nhất định có khả năng gắn kết đặc thù với một loại epitop nào đó Kháng thể đ−ợc tạo ra nh− vậy đ−ợc gọi là các kháng thể đơn dòng

9.9.2 Sự tăng c−ờng biểu hiện các gen mã hóa chuỗi nặng ở các mô

Các gen mã hóa kháng thể được hoạt hóa mạnh mẽ thông qua quá trình ráp nối các phân đoạn gen, trong đó các promoter được đưa gần hơn đến trình tự enhancer hoạt động mạnh trong vùng intron giữa hai phân đoạn J và C Trước khi tái tổ hợp gen, các promoter nằm cách xa các enhancer hàng trăm ngàn bazơ nitơ, dẫn đến việc không có sự tổng hợp kháng thể Tuy nhiên, trong quá trình biệt hóa tế bào B, sự ghép nối này giúp các promoter tiếp cận các enhancer trong khoảng cách dưới 2 Kb, cho phép enhancer kích hoạt mạnh mẽ các promoter và tăng cường tổng hợp kháng thể Đặc biệt, hoạt động của enhancer thường mang tính đặc trưng mô, chỉ hoạt động trong các loại mô nhất định.

Hoạt động của các tế bào B và tương bào là đặc trưng, không xuất hiện ở các tế bào khác Sự kích hoạt này có thể cần một hoặc nhiều yếu tố phiên mã, mà chỉ được tổng hợp trong các tế bào của hệ miễn dịch.

285 di truyền học phân tử và tiến hóa

Năm 1859, Charles Darwin công bố tác phẩm “Nguồn gốc các loài”, đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong thuyết tiến hóa Trong thời gian từ 1931 đến 1936, ông đã cùng đoàn thám hiểm Beagle thu thập nhiều dữ liệu, hình ảnh và mẫu hóa thạch từ các loài động, thực vật ở nhiều khu vực khác nhau trên thế giới Sau đó, Darwin đã dành nhiều năm để phân tích và so sánh các dữ liệu này Ông là người đầu tiên nhận định rằng tất cả các dạng sống hiện có trên Trái đất có thể xuất phát từ một tổ tiên chung, và rằng các loài sinh vật không bất biến mà biến đổi liên tục theo thời gian, dẫn đến sự hình thành các loài mới thông qua chọn lọc tự nhiên Đây chính là những nội dung cốt lõi của Thuyết tiến hóa Darwin.

Mặc dù tác phẩm của Darwin đã bán hết 1250 bản ngay trong ngày đầu công bố, lý thuyết của ông đã gặp nhiều hoài nghi Đến nay, sau 150 năm từ khi "Nguồn gốc các loài" được phát hành, thuyết tiến hóa Darwin vẫn là lý thuyết cốt lõi của sinh học hiện đại Kể từ năm 1953, khi Watson và Crick khám phá cấu trúc ADN, nghiên cứu di truyền học phân tử đã phát triển mạnh mẽ, cung cấp các bằng chứng khoa học cho thấy tiến hóa bắt đầu từ cấp độ phân tử, cụ thể là từ các chuỗi xoắn kép ADN và ARN Chương này sẽ đề cập đến những nội dung cơ bản của Tiến hóa phân tử.

Sự giống nhau trong hệ gen hầu hết các loài động vật

Sự bảo thủ trong hệ gen của các loài động vật có xương sống (ĐVCXS) mở rộng đến một số loài khác như sứa biển Ciona intestinalis, với khoảng một nửa số gen của sứa này tương đồng với các loài ĐVCXS Tổ tiên chung của chúng phân li khoảng 500 triệu năm trước Nghiên cứu di truyền gần đây cho thấy sự gia tăng số lượng gen ở ĐVCXS chủ yếu do sự lặp lại của các gen đã tồn tại từ thời kỳ tổ tiên chung Ví dụ, sứa biển có 6 gen mã hóa yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF, trong khi các gen này được lặp lại trung bình 4 lần ở động vật có vú, với chuột và người chứa ít nhất 22 gen FGF Sự bảo thủ này còn mở rộng đến các ngành khác, như hệ gen của ba loài động vật thuộc liên ngành động vật lột xác (Ecdysozoa) gồm giun tròn, ruồi giấm và muỗi, đều có khoảng 15.000 gen, tương đương với hệ gen của sứa biển.

Sự gia tăng số lượng gen ở động vật có xương sống (ĐVCXS) tương đồng với các loài động vật lột xác chủ yếu là kết quả của sự lặp lại các gen, không phải do sự hình thành các gen mới.

Theo cách thứ nhất, gen nguyên thủy trải qua nhiều lần nhân đôi, tạo ra nhiều bản sao khác nhau Các bản sao này sau đó bị đột biến ở vùng mã hóa, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính hoặc chức năng của gen Thay đổi này không nhất thiết tạo ra các gen hoàn toàn mới, mà thường tạo ra các loại protein có chức năng liên quan, chủ yếu khác nhau về hoạt tính hoặc hoạt lực.

Theo cách thứ hai, các gen lặp lại có thể xảy ra đột biến không liên quan đến vùng mã hóa, mà thay vào đó, chúng kết hợp với các trình tự ADN điều hòa mới hoặc các trình tự điều hòa cũ đã biến đổi Điều này dẫn đến sự biểu hiện khác nhau của các bản sao gen trong quá trình phát triển của từng loài.

Gen FGF ở động vật có xương sống (ĐVCXS) có 22 bản sao, cho thấy sự biểu hiện đa dạng hơn so với chỉ một bản sao ở ruồi Drosophila Trong quá trình phát triển phôi, gen FGF được biểu hiện ở cả cơ quan hô hấp của ruồi giấm và ĐVCXS, nhưng ở ĐVCXS, gen này còn được biểu hiện ở chân, điều mà ruồi giấm không có Sự "tiến hóa" của các trình tự điều hòa đóng vai trò quan trọng, thay đổi cách biểu hiện của các bản sao khác nhau của cùng một gen ở các mô và cơ quan khác nhau, cũng như giữa các loài khác nhau.

Sự đa dạng sinh học có thể được tạo ra từ sự lặp lại của các gen thông qua hai cách tiến hóa Đầu tiên, chức năng của gen có thể được cải biến bởi các đột biến trong vùng mã hóa gen Thứ hai, các bản sao khác nhau của gen có thể được biểu hiện khác nhau ở các cơ quan khác nhau trong cùng một cơ thể Ở một số gen, cả hai cơ chế này đều hoạt động Chẳng hạn, ở cụm gen mã hóa globin của người, sự lặp lại của các gen không chỉ tạo ra sự đa dạng chức năng mà còn ảnh hưởng đến cách biểu hiện của chúng Mặc dù tất cả các protein do các gen globin mã hóa đều có chức năng liên kết và vận chuyển oxy trong hemoglobin, mỗi loại globin lại khác nhau về ái lực liên kết với oxy và được biểu hiện vào các giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể.

Figure 10.1 illustrates the evolutionary repetition of β-globin gene family members in vertebrates, highlighting the presence of β-globin in various species such as sharks, chickens, and otters, alongside ε and γ-globin in humans This genetic analysis, as referenced in Griffiths et al (2000), emphasizes the significance of gene duplication and divergence in vertebrate evolution.

"γ" (bò) β (bò) δ (ng−êi) β (ng−êi) β (khỉ rezut) gen δ -globin Linh tr−ởng

Thó cã nhau thai §éng vËt cã vó gen γ gen “ γ ” gen ε Thú đơn huyệt

L−ỡng c− và chim Động vật có x−ơng sống Các loài cá mập

Gen β-globin ở người bao gồm bốn gen: ε-, γ-, δ- và β-globin, được hình thành qua cơ chế lặp lại Các gen này khác nhau về biểu hiện và cấu trúc protein mà chúng mã hóa Chuỗi ε- và γ-globin có ái lực với oxy cao hơn so với δ- và β-globin, và được tổng hợp trong giai đoạn bào thai, khi chức năng phổi chưa hoàn thiện Ngược lại, chuỗi δ- và β-globin có ái lực thấp hơn và được tổng hợp ở giai đoạn sơ sinh và trưởng thành Sự tiến hóa trong trình tự mã hóa và trình tự điều hòa của các gen globin đã góp phần vào sự chuyên hóa của các loại chuỗi globin khác nhau trong động vật có xương sống.

Sự tiến hóa của sinh vật không chỉ dựa vào sự lặp lại của các gen, mà vi khuẩn, với hệ gen đa dạng nhất, đã phát triển để sống trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau Các vi khuẩn xuất hiện cách đây khoảng 3 tỉ năm, trong khi động vật cổ xưa chỉ hình thành cách đây khoảng 500 triệu năm Đặc điểm tiến hóa nhanh chóng của hệ gen vi khuẩn đã tạo ra nhiều cơ chế trao đổi chất, cho phép chúng tồn tại ở những môi trường khắc nghiệt như miệng núi lửa dưới đáy biển hay suối nước nóng chứa nhiều lưu huỳnh Số lượng và loại gen trong hệ gen của các loài vi khuẩn rất đa dạng, với mycoplasma chỉ có khoảng 500 gen, trong khi Streptomyces có trên 10.000 gen.

Số lượng gen trong hệ gen của các loài vi khuẩn có sự khác biệt lớn, lên đến hàng chục lần, trong khi ở động vật, sự khác biệt này chỉ tối đa khoảng 2 lần Ngay cả các loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi cũng thể hiện mức độ khác biệt cao về hệ gen Ví dụ, vi khuẩn Staphylococcus và E coli đã tách ra từ tổ tiên chung khoảng 50 triệu năm trước, tương đương với thời gian phân ly giữa tổ tiên của con người và chuột Mặc dù vậy, các gen mã hóa protein của hai vi khuẩn này chỉ giống nhau 75%, trong khi 25% còn lại là các gen đặc thù không có ở loài kia.

Động vật có môi trường sống hạn chế và các con đường trao đổi chất tương tự, khiến sự đa dạng kiểu hình phụ thuộc vào hoạt tính của các tổ hợp gen Ngược lại, hệ gen của vi khuẩn có mức độ tương đồng thấp, cho thấy rằng sự hình thành các gen mới về chức năng là yếu tố quyết định giúp chúng tồn tại và phát triển trong các môi trường sống khác nhau.

Các con đường thay đổi sự biểu hiện của gen trong tiến hóa

Các gen điều hòa đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự biểu hiện của các gen khác trong hệ gen của sinh vật Chúng mã hóa các protein, chủ yếu là các yếu tố điều hòa phiên mã, nhưng cũng có những protein ảnh hưởng đến các giai đoạn khác của quá trình biểu hiện gen, từ phiên mã đến sau dịch mã Gần đây, một nhóm gen điều hòa mới đã được phát hiện, mở ra hướng nghiên cứu mới trong tiến hóa và điều hòa gen.

Các gen quy định kiểu biểu hiện đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và hình thành các đặc điểm hình thái ở động vật Sự thay đổi hoạt tính của các gen này trong quá trình tiến hóa có thể dẫn đến những sai lệch trong cấu trúc cơ thể Chức năng của những gen này là điều khiển sự hình thành chính xác các cấu trúc trong quá trình phát triển Nếu hoạt động không chính xác, các cấu trúc có thể được hình thành sai vị trí, như trường hợp của gen Pax6 ở ruồi giấm, khi không biểu hiện đúng dẫn đến "đột biến" hình thành mắt ở chân Trong phần tiếp theo, chúng ta sẽ khám phá thêm một số ví dụ khác.

Một hệ gen động vật trung bình chứa khoảng 1000 gen mã hóa protein điều hòa, nhưng chưa có số liệu chính xác về số lượng “gen xác định kiểu biểu hiện” trong mỗi hệ gen Những gen này được coi là một nhóm nhỏ trong các gen điều hòa Để xác định số lượng “gen quy định kiểu biểu hiện”, cần tạo ra đột biến ở các gen điều hòa và theo dõi sự bất thường trong quá trình phát sinh hình thái động vật Hiện tại, ước tính khoảng 10% gen điều hòa ở động vật có thể là “gen quy định kiểu biểu hiện”, tương đương với khoảng 100 gen trong một hệ gen động vật trung bình Sự thay đổi hoạt tính và cách huy động các “gen quy định kiểu biểu hiện” có thể tạo ra sự đa dạng sinh học trong quá trình tiến hóa.

Nhìn chung, có ba cách cơ bản làm thay đổi hoạt tính của gen quy định kiểu biểu hiện:

1) Bản thân một “gen quy định kiểu biểu hiện” có thể đ−ợc biểu hiện theo một cách mới Sự thay đổi này dẫn đến việc những gen khác mà nó điều khiển (gọi là các gen đích) cũng sẽ biểu hiện theo các cách mới

2) Các protein điều hòa đ−ợc các “gen quy định kiểu biểu hiện” mã hóa có thể có chức năng mới Chẳng hạn, miền hoạt hóa phiên mã của một yếu tố phiên mã trở thành một miền ức chế phiên mã Vì vậy, một protein điều hòa vốn là yếu tố hoạt hóa phiên mã của một nhóm gen trở thành yếu tố ức chế phiên mã của chính nhóm gen đó Một điểm đáng chú ý là sự thay đổi ở đây liên quan đến chức năng của protein điều hòa, nh−ng hậu quả gây ra đối với quá trình tiến hóa lại là sự thay đổi kiểu biểu hiện của các gen đích

3) Các gen đích của một “gen quy định kiểu biểu hiện” có thể “nhận” một trình tự (ADN) điều hòa mới, dẫn đến việc nó đ−ợc điều khiển bởi một gen điều hòa mới Bằng cách này, kiểu biểu hiện của gen đích cũng thay đổi

10.2.1 Đột biến “gen quy định kiểu biểu hiện” làm thay đổi hình thái động vật 10.2.1.1 Sự thay đổi kiểu biểu hiện của gen Pax6 gây nên sự hình thành mắt sai vị trí

Gen Pax6 là gen quy định kiểu biểu hiện nổi bật, đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của mắt ở hầu hết các loài động vật Sự biến đổi trong biểu hiện của gen Pax6 có thể là nguyên nhân chính dẫn đến sự đa dạng về kiểu hình mắt giữa các loài khác nhau.

Gen Pax6 thường chỉ biểu hiện trong mô mắt trong quá trình phát triển phôi Tuy nhiên, khi gen này được biểu hiện ở mô khác, nó có khả năng thúc đẩy sự hình thành các cấu trúc mới.

Sự thay đổi biểu hiện gen Pax6 có thể dẫn đến sự hình thành "mắt phụ" ở vị trí bất thường, như ở cánh và chân của ruồi giấm Điều này cho thấy gen Pax

Sự thay đổi trong biểu hiện gen Pax6 không ảnh hưởng đến chức năng của protein Pax6, mà chủ yếu tạo ra sự đa dạng về vị trí hình thành mắt ở các loài khác nhau Nghiên cứu chuyển gen Pax6 từ mực ống vào ruồi giấm đã chứng minh rằng ruồi giấm có thể phát triển "mắt phụ" ở cánh và chân, tương tự như những cá thể ruồi giấm có gen Pax6 của chính nó biểu hiện bất thường ở các mô này, mặc dù hai protein Pax6 từ mực ống và ruồi giấm chỉ có 30% trình tự axit amin tương đồng.

10.2.1.2 Sự thay đổi kiểu biểu hiện của gen Antp làm "ăngten" chuyển thành "chân"

Gen Antp ở ruồi giấm điều khiển sự phát triển phần thân giữa của côn trùng trong quá trình phát triển phôi, dẫn đến sự hình thành cặp chân khác biệt so với chân trước và chân sau Gen này mã hóa một protein điều hòa chỉ được biểu hiện ở phần thân giữa, không ở phần đầu Tuy nhiên, nếu có một đột biến trội do đảo đoạn NST đưa trình tự mã hóa protein Antp gần một trình tự ADN điều hòa mới, điều này có thể gây ra sự phát triển chân thay vì ăng ten tại vị trí ăng ten.

10.2.1.3 Chuyển đoạn t−ơng hỗ giữa hai gen ftz và Antp cho thấy vai trò quan trọng về chức năng của protein điều hòa Để tạo ra sự đa dạng hình thái, các “gen quy định kiểu biểu hiện” không nhất thiết phải hoạt động tại các vị trí khác nhau trong cơ thể Một cơ chế thứ hai tạo nên sự đa dạng trong quá trình tiến hóa là những thay đổi về trình tự axit amin và chức năng của các protein điều hòa do những gen này mã hóa ở đây, chúng ta sẽ xem ví dụ về hai “gen quy định kiểu biểu hiện” có liên quan với nhau ở ruồi giấm là ftz (điều khiển sự phân đốt) và Antp (điều khiển sự hình thành các cơ quan phần thân giữa) Hai gen này hình thành và phân li xuất phát từ một sự kiện

Sự kiện "nhân đôi" gen tổ tiên diễn ra khoảng 400 triệu năm trước, trước khi có sự tách biệt tiến hóa giữa các loài giáp xác và côn trùng Hai protein tương ứng được mã hóa bởi các gen này liên quan đến ấu trùng.

Drosophila tr−ởng thành Đĩa mầm mắt Đĩa mầm chân

Cá thể bình th−ờng (kiểu dại) Cá thể mang gen "hình thành mắt" Pax6 đ−ợc biểu hiện ở tế bào tiền phôi hình thành chân

Tế bào tiền phôi mắt Tế bào tiền phôi chân Tế bào tiền phôi chân có gen Pax6 đ−ợc biểu hiện “bất th−ờng”

Gen Pax6, còn gọi là gen ey, đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành mắt ở ruồi giấm Hình 10.2 minh họa sự biểu hiện của gen Pax6, cho thấy sự hình thành mắt bình thường ở ruồi kiểu dại và sự xuất hiện "mắt phụ" bất thường ở chân do sự biểu hiện sai vị trí của gen này (theo Albert B et al, 2002, Molecular Biology of the Cell, tr.426).

Các h−ớng nghiên cứu tiến hóa phân tử

10.3.1 So sánh các trình tự ADN

10.3.1.1 Sự thay thế các nucleotide và mô hình Jukes - Cantor

Trong quá trình tiến hóa, khi hai trình tự nucleotide tách li, chúng bắt đầu tích lũy các đột biến độc lập Số nucleotide thay thế (K) thường được sử dụng trong các nghiên cứu tiến hóa để xác định sự khác biệt giữa các gen của các loài hoặc cá thể khác nhau, với các gen có ít nucleotide thay thế được xem là có quan hệ gần Tuy nhiên, T Jukes và C Cantor đã chỉ ra rằng việc so sánh trình tự chỉ dựa trên các đơn phân đơn lẻ có thể dẫn đến đánh giá sai về quan hệ di truyền Ở những vị trí dễ xảy ra thay thế nucleotide, có khả năng xảy ra nhiều lần đột biến thuận và ngược Để phản ánh khả năng này, Jukes và Cantor đã giả thiết rằng mỗi loại nucleotide có thể được thay thế bởi 3 loại nucleotide khác với khả năng tương đương.

Sự thay thế nucleotide tại cùng một vị trí trong hai tình huống khác nhau có thể dẫn đến sai số trong ước lượng tần suất đột biến nucleotide xảy ra ở một gen theo thời gian.

C t = 1 A T t = 2 T C nucleotide sẽ chuyển thành một trong ba loại nucleotide còn lại là α, dẫn đến tỉ lệ thay thế chung của nucleotide là 3α Theo mô hình này, nếu tại thời điểm 0 (t = 0) nucleotide là C, xác suất (P) tại thời điểm 1 (t = 1) nucleotide vẫn là C sẽ là PC(1) = 1 – 3α Ở các thời điểm tiếp theo, như t = 2, cần tính đến khả năng đột biến “ngược” hay còn gọi là đột biến “phục hồi”.

Nếu nucleotide gốc là C chuyển thành một nucleotide khác (ví dụ là A) tại t = 1, thì tại t 2, giá trị PC(2) sẽ bằng (1 - 3α)PC(1) + α[1 – PA(1)]

Tiếp tục mở rộng công thức này, vào thời điểm bất kỳ trong t−ơng lai (t), khả năng một vị trí trên mạch ADN mang nucleotide C sẽ là:

Công thức này được sử dụng để tính giá trị của α, từ đó phản ánh tần số thay thế nucleotide tại một vị trí cụ thể trên phân tử ADN.

Mặc dù công thức Jukes - Cantor cung cấp một cái nhìn tổng quát về sự thay thế nucleotide, nhưng nó quá đơn giản so với thực tế Các đột biến đồng hoán, tức là sự thay thế giữa các purine hoặc pyrimidine tương đồng, xảy ra thường xuyên hơn so với các đột biến dị hoán, nơi một purine được thay thế bằng một pyrimidine và ngược lại Tuy nhiên, việc mở rộng công thức Jukes – Cantor cho phép xác định số lần thay thế nucleotide thực sự (K) đã xảy ra tại một vị trí nucleotide trên mạch ADN thông qua một phương trình cụ thể.

Công thức K = - 3 / 4 ln [1 – ( 4 / 3 )p] được sử dụng để tính toán tần suất thay thế nucleotide giữa hai trình tự ADN, trong đó p là tỷ lệ nucleotide khác nhau sau một lần đếm độc lập Khi hai trình tự ADN có ít vị trí khác biệt, giá trị p sẽ nhỏ, dẫn đến khả năng thay thế tại một vị trí cũng thấp Ví dụ, với mạch ADN có 100 nucleotide và p = 0,02, K sẽ là 0,02 Ngược lại, nếu số nucleotide khác nhau giữa hai trình tự càng lớn, tần suất thay thế thực tế sẽ cao hơn tần suất quan sát Chẳng hạn, với p = 0,50 trên mạch ADN 100 nucleotide, K sẽ đạt giá trị 0,82.

10.3.1.2 Tốc độ thay thế các nucleotide

Số lần thay thế nucleotide giữa hai trình tự ADN từ khi tách ra khỏi tổ tiên là thông số quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa ADN Khi kết hợp số lần thay thế nucleotide (K) với khoảng thời gian tiến hóa (T), ta có thể xác định tần số thay thế nucleotide (r) theo công thức r = K/(2T) Để ước tính giá trị K, cần thu thập dữ liệu từ ít nhất hai loài So sánh tần số thay thế nucleotide trong một gen hoặc giữa các gen khác nhau giúp dự đoán cơ chế phân tử dẫn đến sự thay thế nucleotide Nếu tốc độ tiến hóa trong một nhóm loài ổn định, tần số thay thế nucleotide có thể dự đoán thời gian xảy ra một sự kiện tiến hóa.

10.3.1.3 Tốc độ tiến hóa của các phần khác nhau trong gen

Kết quả so sánh trình tự ADN cho thấy rằng các phần khác nhau trong gen có tần số biến đổi không đồng nhất, cho thấy sự tác động của chọn lọc tự nhiên lên từng phần của gen Một gen sinh vật nhân thực điển hình bao gồm các trình tự mã hóa (quy định axit amin trong protein) và các trình tự không mã hóa, như intron và các đoạn vùng dẫn đầu, theo sau vùng mã hóa, cũng như các vùng biên không được phiên mã Hệ gen còn chứa các gen giả, là trình tự không mã hóa đã mất khả năng biểu hiện do tích lũy đột biến Trong trình tự mã hóa, không phải mọi thay thế nucleotide đều dẫn đến thay đổi axit amin, đặc biệt là sự thay thế tại vị trí thứ ba trong mã bộ ba thường không ảnh hưởng đến thành phần axit amin do hiện tượng thoái hóa của mã bộ ba.

10.3.1.4 Các vị trí đồng nghĩa và khác nghĩa trong gen

Bảng 10.1 minh họa sự thay đổi tương đối trong các gen động vật có vú, cho thấy tần số thay thế nucleotide đồng nghĩa cao hơn gấp 5 lần so với nucleotide khác nghĩa Các đột biến đồng nghĩa không làm thay đổi trình tự axit amin của protein, do đó không ảnh hưởng đến chức năng của protein Tất cả các biến đổi nucleotide trong ADN thường xuất phát từ sai sót trong quá trình sao chép hoặc sửa chữa ADN, và các enzym liên quan không thể phân biệt giữa đột biến đồng nghĩa và khác nghĩa Vì vậy, khả năng xuất hiện của các đột biến này được cho là tương đương.

Các đột biến khác nghĩa thường gây hại và bị chọn lọc tự nhiên đào thải, trong khi các đột biến đồng nghĩa vượt qua được các "hàng rào" chọn lọc và được duy trì Do đó, đột biến đồng nghĩa phản ánh tốc độ đột biến trong một hệ gen, trong khi đột biến khác nghĩa không có ý nghĩa tương tự.

10.3.1.5 Sự biến đổi ở các vùng biên của gen

Bảng 10.1 cho thấy mức độ biến đổi cao ở vùng biên đầu 3’ của các gen Các đột biến đồng nghĩa trong trình tự này không ảnh hưởng đến axit amin của protein và ít tác động đến biểu hiện gen Do đó, nhiều đột biến thay thế ở vùng này được duy trì qua chọn lọc tự nhiên Mặc dù tần số thay thế nucleotide trong vùng intron của gen cũng cao, nhưng vẫn thấp hơn so với đột biến đồng nghĩa.

Bảng 10.1 Tốc độ thay thế nucleotide trung bình trong các vùng trình tự ADN khác nhau thuộc gen ở động vật có vú

Tr×nh tù ADN Sè nucleotide trung b×nh thay thế tại mỗi vị trí hàng năm (x 10 -9 )

Các gen biểu hiện chức năng

Vùng biên đầu 5’ của gen 2,36 Đoạn trình tự dẫn đầu gen 1,74

Trình tự mã hóa, đồng nghĩa 4,65

Trình tự mã hóa, khác nghĩa 0,88

Các trình tự intron 3,70 Đoạn trình tự theo sau gen 1,88

Vùng biên đầu 3’ của gen 4,46

Các gen giả 4,85 của Đinh Đoàn Long liên quan đến nghĩa và đột biến thay thế ở vùng biên đầu 3’ Mặc dù intron không mã hóa axit amin, nhưng vùng tiếp giáp giữa intron và exon có vai trò quan trọng trong việc cắt intron và kết nối exon Một số trình tự trong intron, như trình tự phân nhánh, là cần thiết cho quá trình này Một số intron bị cắt bỏ ở một mô nhưng lại mã hóa axit amin ở mô khác, theo mô hình “các cách cắt intron khác nhau” Thêm vào đó, một số intron còn là vị trí liên kết của yếu tố phiên mã, ảnh hưởng đến khả năng và tốc độ phiên mã của gen Do đó, không phải mọi thay đổi trong trình tự intron đều vượt qua được “hàng rào” chọn lọc tự nhiên Tuy nhiên, tần số thay đổi của chúng chỉ thấp hơn một chút so với các đột biến đồng nghĩa và đột biến thay thế ở vùng biên đầu 3’ của gen.

Vùng biên đầu 5’ của gen có mức độ thay đổi thấp hơn so với vùng biên đầu 3’, mặc dù cả hai vùng này đều không tham gia vào quá trình phiên mã và dịch mã Vùng 5’ chứa trình tự khởi đầu phiên mã (promoter) cùng với các trình tự điều hòa khác, đóng vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của gen Những thay đổi nhỏ trong promoter, như hộp TATA, có thể ngăn cản phiên mã và gây hại cho thể đột biến Do đó, chọn lọc tự nhiên thường loại bỏ những đột biến này nhằm duy trì tính ổn định của các vùng quan trọng trong hệ gen, bao gồm cả các promoter.

Tần số biến đổi ở các vùng dẫn đầu và theo sau vùng mã hóa của gen thường thấp hơn, mặc dù những vùng này không được dịch mã nhưng lại được phiên mã và có vai trò quan trọng trong việc mang tín hiệu điều khiển cũng như quá trình hoàn thiện mARN và tổng hợp protein Do đó, các đột biến thay thế nucleotide trong các vùng này thường ít được duy trì Trong một gen, các đột biến khác nghĩa trong vùng mã hóa có tần số thấp nhất, vì phần lớn protein kiểu dại đã trải qua quá trình chọn lọc tự nhiên để thích nghi với môi trường sống hiện tại Hầu hết các thay đổi trong trình tự axit amin dẫn đến sự kém thích nghi và bị loại bỏ bởi chọn lọc tự nhiên Mức độ tác động của chọn lọc tự nhiên không đồng đều giữa các axit amin trong phân tử protein và còn phụ thuộc vào tính chất hóa học của axit amin thay thế so với axit amin gốc.

Tần số đột biến cao nhất được phát hiện ở các gen giả, như ở các gen giả globin của người, với tần số thay đổi nucleotide cao gấp 5 lần so với các nucleotide khác trong vùng mã hóa của gen globin thật Điều này xảy ra vì các gen giả không còn chức năng tổng hợp protein, dẫn đến các thay đổi trong gen giả hầu như không bị ảnh hưởng bởi chọn lọc tự nhiên.

Đồng hồ phân tử và xây dựng cây chủng loại phát sinh

10.4.1 Thuyết đồng hồ phân tử

10.4.1.1 Cơ sở hình thành thuyết đồng hồ phân tử

Mức độ thay thế nucleotide trong từng vùng ADN của hệ gen và sự thay thế axit amin trong các phân tử protein được mã hóa bởi gen là khác nhau, phụ thuộc vào áp lực chọn lọc tự nhiên và chức năng của sản phẩm gen Tuy nhiên, ở những locut có áp lực chọn lọc tương đương, tốc độ thay đổi trong các trình tự ADN lại ổn định khi xem xét trong thời gian tiến hóa dài.

Vào những năm 1960, Zuckerkandl và Linus Pauling đã so sánh trình tự protein và nhận thấy rằng tốc độ thay thế axit amin trong protein ổn định qua hàng triệu năm tiến hóa Họ gọi hiện tượng này là thuyết đồng hồ phân tử, ví sự tích lũy đột biến như nhịp đếm của đồng hồ tiến hóa Mặc dù đồng hồ phân tử có thể chạy với tốc độ khác nhau ở các protein khác nhau, nhưng sự khác biệt giữa hai protein tương đồng lại tương quan chặt chẽ với thời gian phân li của các loài từ tổ tiên chung Thuyết này đã thúc đẩy nghiên cứu tiến hóa, giúp xác định mối quan hệ di truyền và ước tính thời gian phân li giữa các loài, tương tự như phương pháp xác định tuổi hóa thạch bằng đồng vị phóng xạ Tuy nhiên, thuyết đồng hồ phân tử cũng gặp phải sự phản đối, đặc biệt từ các nhà tiến hóa kinh điển, khi họ cho rằng nhịp điệu tiến hóa của nhiều đặc điểm hình thái không nhất quán với tốc độ thay đổi ổn định ở mức phân tử.

−ớc tính thời gian phân li tiến hóa dựa trên các ph−ơng pháp kinh điển và phân tử không thèng nhÊt víi nhau Đinh Đoàn Long

10.4.1.2 Cách tính tốc độ tiến hóa tương đối

Trong nghiên cứu tiến hóa, thời gian tiến hóa phân li giữa các loài thường được tính toán dựa trên mẫu hóa thạch không hoàn chỉnh, dẫn đến giá trị T thường chỉ là tương đối và có thể có sai số lớn Để giảm thiểu sai số này, Sarich và Wilson (1973) đã phát triển phương pháp tính tốc độ tiến hóa tương đối Phương pháp này sử dụng một loài ngoài nhóm có quan hệ xa hơn để xác định tốc độ thay thế nucleotide giữa hai loài thuộc cùng một dòng tiến hóa Ví dụ, nếu loài (1) là người và loài (2) là khỉ Gorilla, thì loài ngoài nhóm có thể là khỉ đầu chó Thời điểm tách li giữa hai loài được ký hiệu là A, và số nucleotide khác biệt giữa các loài có thể được tính toán từ tổng số nucleotide thay đổi kể từ thời điểm A Các phương trình đại số đơn giản cho phép xác định số nucleotide khác biệt giữa các loài dựa trên các dữ liệu thực nghiệm.

Sự tách li giữa tổ tiên thực vật và động vật diễn ra cách đây khoảng 1,2 tỷ năm, dẫn đến sự phát triển độc lập của cả hai nhóm Động vật có xương sống đã xuất hiện và phát triển khoảng 600 triệu năm trước, trong khi cá xương và cá miệng tròn đã có mặt từ khoảng 500 triệu năm trước.

B ò sá t / c á ( 40 0 tr iệ u nă m ) Đ ộn g vậ t c ó vú / bò s át ( 30 0 tr iệ u nă m )

C hi m / b ò sá t ( 24 0 tr iệ u nă m )

Ph ân li ti ến h óa c ủa c ác lo ài đ ộn g vậ t c ó vú

S ố ax it am in th ay đ ổi tr on g 10 0 ax it am in

Tốc độ tiến hóa của các protein khác nhau thể hiện rõ sự khác biệt trong áp lực chọn lọc tự nhiên Protein Fibrinogen có áp lực chọn lọc tự nhiên thấp, dẫn đến tần số đột biến trung tính thay thế nucleotide cao, trong khi cytochrom C chịu áp lực chọn lọc tự nhiên cao hơn với tần số đột biến trung tính thấp Số liệu này được tính toán từ nhiều sinh vật khác nhau, cho thấy sự thay đổi nucleotide tương đối ở mỗi loài từ thời điểm A, khi chúng bắt đầu phân li từ tổ tiên chung, với các phương trình dA1 = (d12 + d13 – d23)/2 và dA2 = (d12 + d23 – d13)/2.

Theo thuyết đồng hồ phân tử, khoảng thời gian giữa hai loài (1) và (2) là giống nhau, tức là d A1 = d A2 Khi dữ liệu về trình tự hệ gen của các loài ngày càng phong phú, thuyết này cho rằng tốc độ tiến hóa của mỗi gen sẽ ổn định qua thời gian trong tất cả các dòng tiến hóa Thực nghiệm cho thấy tốc độ thay thế nucleotide ở chuột đồng và chuột nhắt tương đương, trong khi ở nhóm linh trưởng, người và các loài vượn người có mức độ thay thế nucleotide chỉ bằng một nửa so với các loài khỉ kể từ khi phân li tiến hóa Sử dụng phương pháp tính tốc độ tiến hóa tương đối giữa người và chuột đồng, tốc độ thay thế nucleotide của linh trưởng chỉ bằng một nửa so với gặm nhấm kể từ khi các động vật có vú phân li cách đây 80 đến 100 triệu năm Điều này cho thấy sự khác biệt về tốc độ đồng hồ phân tử giữa các nhóm loài, làm cho việc xác định chính xác thời điểm xuất hiện và quãng thời gian tồn tại của các loài tổ tiên trở nên khó khăn Để tính toán chính xác, cần xác định các loài được so sánh và đối chiếu với nhau.

“chung” một đồng hồ phân tử (nh− các loài chuột nêu trên) hay không?

10.4.1.3 Tại sao tốc độ tiến hóa lại khác nhau giữa các nhóm loài?

Một số nguyên nhân giải thích hiện tượng tiến hóa nhanh chóng của các loài như khỉ và chuột so với con người bao gồm vòng đời và chu trình sinh sản ngắn hơn Số lần sao chép ADN trong mỗi thế hệ của các dòng tế bào phát sinh giao tử có sự khác biệt lớn giữa các loài, ảnh hưởng đến tần số thay thế nucleotide của các gen Thêm vào đó, từ khi tiến hóa phân li, các nhóm loài ngày càng khác biệt về cơ chế di truyền và sinh sản, bao gồm hiệu quả sửa chữa ADN, tốc độ và quy mô sinh sản, mức phơi nhiễm với tác nhân đột biến và khả năng thích nghi với môi trường sống.

10.4.2 Xây dựng cây tiến hóa dựa trên các dấu hiệu phân tử

10.4.2.1 Các dấu hiệu đ−ợc dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại

Dựa trên thuyết đồng hồ phân tử, mối quan hệ di truyền giữa các dạng sống có thể được xác định bằng cách so sánh các dấu hiệu phân tử Các loài có nhiều dấu hiệu giống nhau sẽ có mối quan hệ gần gũi hơn.

H×nh 10.11 X©y dùng c©y tiÕn hãa dùng loài đối chứng ngoài nhóm Loài

3 là loài đối chứng ngoài nhóm (tiến hóa độc lập trước khi có sự phân li của hai loài 1 và 2) A là tổ tiên chung của hai loài 1 và 2

Trước đây, mối quan hệ di truyền giữa các loài chủ yếu được xác định thông qua việc so sánh các dấu hiệu hình thái Quan điểm này cho rằng các dấu hiệu hình thái tương đồng chỉ ra rằng các gen chi phối chúng cũng tương tự Ngoài các dấu hiệu hình thái, các yếu tố khác như tập tính, cấu trúc tế bào và hóa sinh cũng được tích cực sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa Phương pháp này đã chứng minh hiệu quả trong việc nghiên cứu tiến hóa ở nhiều nhóm động vật và thực vật bậc cao, và vẫn giữ vai trò quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa hiện nay.

Việc sử dụng đơn thuần các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu tiến hóa có những hạn chế nhất định, như hiện tượng tiến hóa đồng qui, khi các loài khác nhau nhưng có kiểu hình giống nhau, ví dụ như chim, dơi và côn trùng đều có cánh nhưng không có quan hệ gần gũi Điều này cho thấy rằng kiểu hình tương tự không nhất thiết phản ánh mối quan hệ di truyền Hơn nữa, trong một số trường hợp, đặc điểm kiểu hình của vi sinh vật, như vi khuẩn và virus, rất khó quan sát và so sánh với các loài động vật khác Do đó, các dấu hiệu phân tử, đặc biệt là ADN, có thể giúp giải quyết những khó khăn này, nhưng không thể hoàn toàn thay thế các dấu hiệu hình thái, tập tính hay hóa sinh trong nghiên cứu tiến hóa.

Việc sử dụng các dấu hiệu phân tử cho thấy tốc độ tiến hóa khác nhau ở các dòng tiến hóa, vì vậy cần kết hợp các dấu hiệu này với những loại dấu hiệu khác để xác định thời điểm phân li tiến hóa của nhiều nhóm sinh vật Các dấu hiệu ADN giúp xây dựng cây phát sinh chủng loại hiệu quả và chính xác nhất khi được áp dụng cho các nhóm loài đã phân loại sơ bộ qua các dấu hiệu hình thái và hóa sinh Trong trường hợp các dấu hiệu hình thái và phân tử không đồng nhất, đây là cơ hội để xác định mức độ tác động của chọn lọc tự nhiên đối với các kiểu hình thái khác nhau.

Trước khi có công cụ sinh học phân tử, các phương pháp như xây dựng sơ đồ hình cây đã được sử dụng để xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Cây phát sinh chủng loại mô tả mối quan hệ giữa các dạng sống, cho thấy rằng tất cả sinh vật trên Trái đất đều có tổ tiên chung cách đây khoảng 4 tỉ năm Mỗi cây phát sinh thường chỉ đại diện cho một phần của cây tiến hóa từ tổ tiên chung, với các cành tận cùng chứa một hoặc nhiều taxon Điểm phân nhánh trong cây đại diện cho tổ tiên chung trước khi xảy ra phân li tiến hóa Chiều dài của cành phản ánh mức độ khác biệt giữa các taxon, trong khi cây tiến hóa có gốc cho thấy tổ tiên chung của các nhánh Ngược lại, cây không gốc chỉ phản ánh mối quan hệ giữa các taxon mà không chỉ ra nguồn gốc tiến hóa Việc xây dựng cây tiến hóa cần các mẫu taxon đối chứng ngoài nhóm, như sử dụng loài khỉ Papio khi nghiên cứu mối quan hệ giữa người và khỉ Gorilla.

Số lượng cây phát sinh chủng loại tăng lên tương ứng với số lượng taxon được so sánh Khi nghiên cứu đồng thời n taxon, số cây tiến hóa có gốc (N R) và không gốc (N U) có thể có sự tương ứng nhất định.

Phương trình 10.9 áp dụng cho n ≥ 2, trong khi phương trình 10.10 áp dụng cho n ≥ 3 Trong thực tế, cây tiến hóa thường được sử dụng để thể hiện mối quan hệ giữa nhiều mẫu khác nhau, từ hàng chục đến hàng trăm cá thể hoặc taxon Do đó, số lượng cây tiến hóa có thể tồn tại là rất lớn.

Cây tiến hóa gen và cây tiến hóa loài là hai khái niệm quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa Cây tiến hóa gen được xây dựng dựa trên việc so sánh trình tự gen giữa các loài hoặc cá thể khác nhau, phản ánh lịch sử tiến hóa của một gen cụ thể nhưng không nhất thiết tương quan với sự phát sinh của các loài tương ứng Ngược lại, cây tiến hóa loài thường được hình thành từ việc phân tích nhiều gen khác nhau, phản ánh sự phát sinh của các loài Mặc dù có vẻ như hai loại cây này không tương đồng, nhưng thực tế, sự phân li của các gen thường xảy ra trước sự cách li của các quần thể, dẫn đến sự hình thành các loài mới.

Tiến hóa hệ gen và nguồn gốc loài ng−ời

10.5.1 Hệ gen người chứa một số gen ít đến ngạc nhiên

Những năm cuối thế kỷ XX đã chứng kiến một bước ngoặt quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa và phân tích chức năng hệ gen của người hiện đại (Homo sapiens) Đặc biệt, hệ gen của con người đã được giải trình tự hoàn chỉnh, đánh dấu một thành tựu đáng kể trong lĩnh vực di truyền học.

Dự án hệ gen người (HGP) được thực hiện từ năm 1990 đến 2006 với các mục tiêu chính như xác định trình tự toàn bộ hệ gen người, nhận diện tất cả các gen, lưu trữ thông tin trong cơ sở dữ liệu, cải tiến công cụ quản lý dữ liệu, và tuyên truyền nguyên tắc đạo đức sinh học Mặc dù bản thảo đầu tiên được công bố vào ngày 26 tháng 6 năm 2000, dự án chỉ thực sự hoàn thành vào cuối năm 2003, với việc giải mã NST số 1 hoàn tất vào tháng 6/2006 Đến nay, số lượng gen trong hệ gen người ước tính chỉ khoảng 20.000 – 25.000, gây sốc cho nhiều nhà di truyền học, vì trước đó họ dự đoán con số này có thể lên đến 100.000 Các phần mềm máy tính đã được sử dụng để dự đoán số gen, nhưng chưa có phần mềm nào xác định đầy đủ tất cả các gen do sự phức tạp trong cấu trúc gen và những lỗi trong việc nhận diện các exon và intron.

Các loài động vật có vú, bao gồm cả con người, sở hữu các cơ chế điều khiển gen phức tạp cho phép biểu hiện gen đa dạng Sự phức tạp của cơ thể không chỉ phụ thuộc vào số lượng gen mà còn vào số kiểu biểu hiện của chúng Ví dụ, giun tròn (C elegans) có khoảng 20.000 gen, trong khi ruồi giấm (D melanogaster) chỉ có dưới 14.000 gen, nhưng ruồi giấm lại thể hiện sự đa dạng hình thái và tập tính cao hơn Điều này cho thấy rằng sự phong phú trong biểu hiện kiểu hình có thể đến từ số lượng kiểu biểu hiện gen tăng lên Một gen ở ruồi giấm có thể được điều khiển bởi 3 đến 4 trình tự enhancer khác nhau, tạo ra khoảng 50.000 kiểu biểu hiện, trong khi giun tròn chỉ có 1 đến 2 trình tự enhancer cho mỗi gen, dẫn đến khoảng 30.000 kiểu biểu hiện gen.

10.5.2 Hệ gen ng−ời giống hệ gen chuột và không khác mấy hệ gen tinh tinh

Người và chuột có khoảng 20.000 – 25.000 gen tương đồng, với 80% số gen trong hệ gen của hai loài này giống nhau Các protein được mã hóa bởi các gen này có tính bảo thủ cao, với 80% trình tự axit amin hoàn toàn giống nhau Sự khác biệt trong 20% số gen còn lại chủ yếu do các sự kiện lặp đoạn Chẳng hạn, chuột có nhiều bản sao gen cytochrome P450 hơn người, trong khi một số họ gen ở người có mức độ "mở rộng" cao hơn ở chuột Tuy nhiên, điểm nổi bật khi so sánh hệ gen của người và chuột là sự hiện diện rất ít của các gen "mới" trong hệ gen của người.

Hệ gen của con người có sự tương đồng cao với hệ gen của các loài linh trưởng, đặc biệt là tinh tinh, với chỉ khoảng 2% sự khác biệt trong trình tự gen Điều này có nghĩa là trong một đoạn trình tự 100bp ngẫu nhiên, trung bình chỉ có một số lượng nhỏ các điểm khác biệt giữa gen của con người và tinh tinh.

Hai nucleotide thay đổi cho thấy tính bảo thủ cao trong hệ gen của động vật có xương sống So sánh ngẫu nhiên giữa hai cá thể mực ống trong cùng một quần thể cho thấy hệ gen của chúng khác nhau khoảng 1%, trong khi đó sự khác biệt giữa hai quần thể là khoảng 2,5% Ở người và tinh tinh, tính bảo thủ trong liên kết gen cũng rất cao, với trật tự và khoảng cách giữa các gen liên kết tương tự nhau Thực tế, các trình tự ADN điều hòa biến đổi nhanh hơn so với các trình tự protein Sự tiến hóa phân li giữa người và tinh tinh có thể chỉ là những thay đổi nhỏ trong hệ gen, nhưng đủ để làm thay đổi hoạt tính của các trình tự ADN điều hòa chủ chốt.

10.5.3 Ng−ời và mối quan hệ di truyền với các loài linh tr−ởng cỡ lớn

Người có những đặc điểm ngoại hình khác biệt so với các loài linh trưởng lớn như tinh tinh và khỉ Gorilla Các loài vượn người có răng cửa và răng nanh lớn hơn, xương hàm nặng hơn, và não nhỏ hơn so với não người Điểm gắn giữa não và tủy sống ở vượn người nằm ở vị trí xa hơn so với người Hình dáng và tỷ lệ cơ thể cũng khác biệt, với phần thân vượn người mở rộng về phía dưới, trong khi ở người, kích thước phần thân ổn định từ vai đến thắt lưng Tỷ số chiều dài chân/thân của vượn người nhỏ hơn, và xương chậu của chúng không hỗ trợ tư thế đứng thẳng Mặc dù vượn người có thể đi bằng hai chân, bàn chân của chúng không đủ vững để duy trì tư thế này lâu dài, trong khi người hoàn toàn đi bằng hai chân Bàn tay và bàn chân của người và vượn người cũng khác nhau, với ngón tay cái của vượn người không ôm được vào lòng bàn tay như ở người.

Dù có nhiều đặc điểm hình thái khác nhau, hệ gen của người vẫn tương đồng với hệ gen của vượn người, đặc biệt là tinh tinh Sự tương đồng này cho thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa loài người và các loài vượn.

Hệ gen của con người và tinh tinh có sự tương đồng lên tới 98 - 99%, cho thấy rằng sự phân li tiến hóa giữa hai loài này từ tổ tiên chung chỉ diễn ra gần đây, ước tính từ 5 đến 9 triệu năm trước Trong khi đó, các loài vượn người khác như khỉ Gorilla có mối quan hệ di truyền với con người xa hơn.

10.5.4 Nguồn gốc loài ng−ời theo bằng chứng hóa thạch

Mặc dù hiếm, các bằng chứng hóa thạch đã cung cấp thông tin quan trọng về nguồn gốc và sự tiến hóa của loài người Bằng chứng hóa thạch lâu đời nhất liên quan đến dòng tiến hóa của loài người được tìm thấy ở Châu Phi, có tuổi niên đại khoảng 4 - 5 triệu năm Sinh vật có dạng giống người đầu tiên, được gọi là người vợt Ađipitếc, đánh dấu bước khởi đầu trong quá trình tiến hóa của loài người.

(Ardipithecus ramidus) Hãa thạch có tuổi niên đại lâu đời tiếp theo hình thành cách đây khoảng

3 - 4 triệu năm thuộc một dạng hominid khác, đ−ợc đặt tên là ng−ời v−ợn Ôxtralôpitếc

(Australopithecus afarensis) Ng−êi v−ợn Ôxtralôpitếc có chiều cao khoảng 1 – 1,5m, đi bằng hai chân

(ít nhất một đoạn ngắn)

Các loài đầu tiên đ−ợc xếp cùng chi Homo với người hiện đại

H sapiens có nguồn gốc từ hóa thạch khoảng 2 – 2,5 triệu năm trước, được phân loại thành hai loài là H rudolfensis (người rudolfen) và H habilis (người habilis) Cả hai loài này đều thuộc nhóm người vượn.

“xuất hiện sớm” này có nhiều đặc điểm hình thái giống v−ợn ng−ời

So với người vượn Ôxtralôpitếc, hai dạng người vượn này có điểm tiếp xúc giữa não bộ và tủy sống gần giữa hộp sọ hơn, với hộp sọ giảm chiều dài và tăng chiều rộng, giống như người hiện đại Tuy nhiên, nhiều nhà cổ sinh vật học không đồng ý xếp hai loài này vào chi Homo, mà cho rằng chúng thuộc chi Australopithecus Loài duy nhất có bằng chứng hóa thạch chắc chắn thuộc chi Homo là Homo ergaster, hay còn gọi là người Egaxtơ, với mẫu hóa thạch có niên đại từ 1,5 đến 1,9 triệu năm trước Người Egaxtơ sở hữu nhiều đặc điểm hình thái tương đồng với con người, bao gồm hình dáng cơ thể, tỷ lệ kích thước chân-thân, cấu trúc hàm và kích thước răng.

Tất cả các mẫu hóa thạch được tìm thấy ở Châu Phi, trong đó mẫu hóa thạch hominid đầu tiên ngoài Châu Phi thuộc về người Homo erectus, khoảng 1 triệu năm

Người hiện đại có thể đã tiến hóa từ các quần thể người cổ xưa ở Châu Âu, Châu Á và Châu Phi, hoặc chỉ từ một châu lục duy nhất.

Cây phát sinh loài người dựa trên bằng chứng hóa thạch cho thấy tổ tiên chung của người, các dạng người vượn và tinh tinh đã tiến hóa theo hai dòng độc lập Dòng tiến hóa của người dẫn đến sự hình thành Homo sapiens, trong khi dòng tinh tinh phát triển từ vượn người Dấu hỏi trong nghiên cứu phản ánh những "bước" tiến hóa chưa được khẳng định.

Homo erectus Homo ergaster Homo habilis

Tổ tiên chung của ng−ời, ng−ời v−ợn và tinh tinh

Dòng tiÕn hãa v−ợn ng−ời

Dòng tiÕn hãa ng−êi Tinh tinh

Sự tiến hóa lời nói (ngôn ngữ) ở ng−ời

10.6.1 Tính trạng “lời nói” ở ng−ời và gen FOX2P

Tinh tinh, loài động vật gần gũi nhất với con người, có khả năng giao tiếp bằng một hình thức ngôn ngữ đơn giản, nhưng vẫn kém phát triển hơn so với ngôn ngữ của con người Điều này đặt ra câu hỏi về quá trình hình thành ngôn ngữ trong sự phát triển của loài người.

Khả năng nói phụ thuộc vào sự điều phối hoạt động chính xác của các cơ trong thanh quản và miệng

Sự biểu hiện giảm đi của một protein điều hòa có tên là

Hình 10.16 mô tả sự tiến hóa của protein FOX2P, trong đó (a) thể hiện mối quan hệ giữa các loài dựa trên sự khác biệt về trình tự axit amin trong protein FOX2P ở chuột và các loài linh trưởng, với các chỉ số (2, 3) biểu thị số axit amin bị thay thế Phần (b) chỉ ra các axit amin được thay thế trong protein FOX2P giữa chuột, tinh tinh và con người.

Tổ tiên chung Đ−ời −ơi

Khỉ Gorilla Tinh tinh lùn Tinh tinh Ng−êi

Chuét Tinh tinh Ng−êi (a)

Gen FOXP2 được xác định là nguyên nhân gây ra nhiều dạng rối loạn về khả năng nói, với những cá thể thiếu hụt protein này gặp khó khăn trong phát âm và diễn đạt ngôn ngữ FOXP2 không chỉ được tìm thấy ở con người mà còn ở các loài động vật khác như chuột, tinh tinh và đười ươi, tuy nhiên, cấu trúc protein FOXP2 của người có sự khác biệt nhỏ so với các loài linh trưởng và động vật có vú khác Đặc biệt, có hai sự thay thế axit amin duy nhất ở protein FOXP2 của người: Thr → Asn tại vị trí 303 và Asn → Ser tại vị trí 325, có thể dẫn đến sự thay đổi chức năng của protein này Một số nghiên cứu cho thấy vùng điều hòa của protein FOXP2 ở người không còn khả năng điều khiển một số gen mục tiêu vốn bị ức chế ở tinh tinh và chuột, hiện tượng này tương tự với sự xuất hiện của đoạn peptide “phản ức chế” trong protein Ubx ở giáp xác.

Các thay đổi trong biểu hiện của gen FOX2P hoặc trong trình tự của các gen đích có thể là nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự phát triển khả năng nói ở con người.

10.6.2 Gen FOX2P thóc ®Èy sự phát triển ngôn ngữ ở ng−ời nh− thế nào? ở đây, chúng ta cũng đề cập đến 3 cơ chế làm thay đổi chức năng protein điều hòa vốn đã được nêu trong trường hợp gen Ubx Những nguyên lý này cũng đ−ợc áp dụng đối với gen

Có thể có sự kết hợp của ba cơ chế: thay đổi kiểu biểu hiện của gen điều hòa, thay đổi trình tự axit amin của protein do gen điều hòa mã hóa, và những thay đổi trong trình tự các gen đích, dẫn đến sự biến đổi của protein.

FOX2P “đột xuất” trở thành một chất “môi giới” quan trọng cho sự hình thành ngôn ngữ ở ng−ời

Một đột biến trong trình tự điều hòa của gen FOX2P đã được xác định là nguyên nhân gây ra sự thay đổi trong kiểu biểu hiện của gen này trong não người Trong khi đó, ở tinh tinh, gen FOX2P không được biểu hiện tại vị trí thích hợp.

Protein FOX2P, được biểu hiện trong vỏ não của người và tinh tinh, có hoạt tính khác nhau giữa hai loài Ở người, gen này hoạt động mạnh mẽ trong giai đoạn phát triển trung khu "nói", kích hoạt ba gen đích A, B và C, những gen này mã hóa chất dẫn truyền thần kinh thiết yếu cho sự hình thành trung khu "nói" Ngược lại, ở tinh tinh, gen FOX2P không được biểu hiện vào thời điểm tối ưu, và sự khác biệt trong cấu trúc axit amin của protein này làm giảm khả năng kích hoạt các gen đích Do đó, tinh tinh chỉ có khả năng giao tiếp bằng ngôn ngữ "cổ xưa".

Vỏ não mới ở các loài linh tr−ởng

Miền liên kết ADN sợi kép

Gen "BËt" trong não có vai trò quan trọng trong sự phát triển khả năng nói ở trẻ em, với biểu hiện phù hợp về vị trí và thời gian Protein FOX2P ở người và tinh tinh có các nhóm gen đích khác nhau, điều này dẫn đến giả thuyết rằng những thay đổi nhỏ trong gen điều hòa có thể tạo ra tính trạng “độc đáo” như ngôn ngữ ở con người.

Gen FOX2P điều khiển các gen mã hóa chất dẫn truyền thần kinh và protein tín hiệu quan trọng cho sự phát triển thanh quản Biến đổi ở những gen này có thể làm thay đổi thời điểm và mức độ biểu hiện, giúp hình thành các tín hiệu thiết yếu tại thanh quản vào thời điểm trẻ phát triển khả năng nói, khi mà khả năng tiếp thu ngôn ngữ trở nên nhạy cảm nhất Trong khi đó, các gen tương ứng ở tinh tinh chỉ biểu hiện ở mức thấp, sai vị trí và muộn hơn trong quá trình phát triển thanh quản.

Gen FOX2P là một ví dụ về gen điều hòa liên quan đến sự phát triển khả năng nói ở con người Mặc dù khó xác định số lượng gen điều hòa ngôn ngữ từ khi có sự phân li tiến hóa giữa người và tinh tinh, nhưng chúng ta đã thấy rằng chỉ cần dưới 100 gen điều hòa để tạo ra sự đa dạng hình thái lớn ở động vật chân đốt Do đó, có thể chỉ cần một số gen điều hòa nhất định để dẫn đến sự phát triển ngôn ngữ ở con người.

Sự tiến hóa các gen cảm nhận màu sắc và bệnh di truyền liên quan

10.7.1 Cơ sở tế bào của sự cảm nhận màu sắc ở mắt

Hình ảnh được cảm nhận qua các nơron thần kinh võng mạc ở phía sau nhãn cầu, bao gồm hai loại tế bào: tế bào hình nón và tế bào hình que Tế bào hình que chiếm 95% số lượng tế bào cảm nhận ánh sáng, hoạt động tốt trong điều kiện ánh sáng yếu Khi cường độ ánh sáng tăng cao, tế bào hình que bị bão hòa và không gửi tín hiệu bổ sung, lúc này tế bào hình nón đảm nhận vai trò xử lý ánh sáng mạnh và giúp phân biệt màu sắc Tế bào hình nón có ba loại: loại cảm nhận ánh sáng đỏ, loại xanh lục và loại xanh lam Quá trình cảm nhận ánh sáng diễn ra khi các tế bào thụ quan hấp thụ photon, chuyển đổi thông tin về số lượng và năng lượng của chúng thành tín hiệu điện tử, và truyền tín hiệu đó qua tế bào thần kinh thị giác đến não bộ.

10.7.2 Hệ gen ng−ời có bốn gen mã hóa bốn protein cảm nhận màu sắc

Rhodopsin là protein cảm nhận photon và khởi đầu tín hiệu ở tế bào hình nón, với chuỗi polypeptide duy nhất gồm 348 axit amin tạo thành cấu trúc zigzag xuyên màng tế bào Trong chuỗi này, một axit amin Lys liên kết với phân tử carotenoid sắc tố trên võng mạc, có khả năng hấp thụ photon Các axit amin xung quanh vùng liên kết võng mạc hình thành miền hoạt động của rhodopsin, giúp quy định kiểu đáp ứng ánh sáng của tế bào võng mạc thông qua cơ chế thay đổi vị trí võng mạc Mỗi tế bào hình que chứa khoảng 100 triệu phân tử rhodopsin, và gen mã hóa rhodopsin ở người nằm trên nhiễm sắc thể số 3.

Protein có vai trò quan trọng trong việc cảm nhận và khởi đầu quá trình truyền tín hiệu ở tế bào hình nón đối với photon màu xanh lam, có mối quan hệ tiến hóa với rhodopsin Đinh Đoàn Long cho biết rằng protein này có một chuỗi polypeptide duy nhất gồm 348 axit amin, bao quanh một phân tử sắc tố ở võng mạc Đặc biệt, gần 50% trình tự axit amin của protein cảm nhận ánh sáng xanh lam tương đồng với rhodopsin, trong khi phần còn lại được chuyên hóa để cảm nhận ánh sáng xanh lam.

10.18b) Gen mã hóa protein này nằm trên NST số 7

Protein rhodopsin có mối quan hệ tiến hóa với các protein cảm nhận ánh sáng đỏ và xanh lục, được tìm thấy trong các tế bào hình nón màu đỏ và xanh lục Cả hai protein này đều có cấu trúc chuỗi polypeptide duy nhất với chiều dài 364 axit amin Chúng liên kết với võng mạc và nằm xuyên màng tế bào.

Các protein cảm nhận màu đỏ và xanh lục có khoảng 50% trình tự axit amin tương đồng với rhodopsin, chỉ khác nhau trung bình 4 trên 100 axit amin.

Các protein này, mặc dù chỉ khác biệt nhỏ, đã phân hóa các tế bào hình nón thành hai loại khác nhau, tương ứng với khả năng cảm ứng ánh sáng có bước sóng khác nhau, được gọi là tế bào hình nón màu đỏ và xanh lục.

Cả hai gen mã hóa cho protein cảm nhận màu đỏ và xanh lục đều nằm trên nhiễm sắc thể X, sắp xếp theo chuỗi liên tiếp Mỗi nhiễm sắc thể X ở người thường mang một gen duy nhất mã hóa protein cảm nhận ánh sáng đỏ, trong khi có từ 1 đến 5 bản sao của gen mã hóa protein cảm nhận ánh sáng xanh lục nằm liền kề.

10.7.3 Họ gen rhodopsin tiến hóa do hiện t−ợng lặp đoạn và phân li chức năng

Bốn loại protein rhodopsin có cấu trúc và chức năng tương đồng, cho thấy rằng các gen mã hóa cho những protein này xuất hiện nhờ hiện tượng lặp đoạn của một gen thụ thể.

Các tế bào hình nón và hình que á nh sáng ánh sáng Võng mạc

Tế bào thụ cảm ánh sáng H×nh que

Vâng mạc Rhodopsin a) b) 1- Protein Rhodopsin 2- Protein cảm nhận màu xanh lam

4-Protein cảm nhận màu đỏ 3-Protein cảm nhận màu lục

Các gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ

1 2 2 2 d) Sự tiến hóa của các gen cảm nhận màu sắc Gen tiÒn th©n

Cơ sở phân tử của sự cảm nhận màu sắc chủ yếu liên quan đến các tế bào hình nón và hình que trong võng mạc, nơi chứa hàng triệu protein thụ thể liên kết màng tế bào giúp cảm nhận ánh sáng Tế bào hình que sử dụng rhodopsin làm thụ thể cảm nhận ánh sáng, trong khi các tế bào hình nón có các protein thụ thể cho màu đỏ, xanh lam và lục, mặc dù chúng có cấu trúc tương tự rhodopsin nhưng vẫn khác biệt đủ để cho phép cảm nhận màu sắc khác nhau Ngoài ra, các gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ và lục được sắp xếp thành chuỗi trên nhiễm sắc thể.

X Ng−ời bình th−ờng có 1 bản sao gen mã hóa protein cảm nhận màu đỏ và từ 1 đến 5 bản sao gen mã hóa protein cảm nhận màu lục (d) sự tiến hóa của các protein cảm nhận màu sắc cho thấy chúng cùng xuất phát từ một gen tiền thân, trải qua ba đột biến lặp đoạn gen độc lập, sau đó là sự phân ly về chức năng của các gen

Lộc giác đã phát triển khả năng cảm nhận ánh sáng từ nguồn gốc của nó, tiếp tục phân li do sự tích lũy đột biến Các đột biến này đã tạo ra khả năng cảm nhận màu sắc, được ưu tiên chọn lọc qua hàng triệu năm tiến hóa Hai loại protein cảm nhận ánh sáng đỏ và xanh lục có sự tương đồng cao, chỉ khác nhau 15 axit amin, cho thấy chúng phân li gần đây Ngược lại, sự khác biệt giữa protein cảm nhận màu xanh lam và rhodopsin cho thấy hai loại protein này đã xuất hiện và phân li sớm hơn trong quá trình tiến hóa.

10.7.4 Đột biến ở họ gen rhodopsin ảnh hưởng đến thị lực và khả năng nhận biết màu

10.7.4.1 Nhiều đột biến thay thế axit amin ở rhodopsin gây mù toàn phần hay một phần

Đã phát hiện ít nhất 29 dạng đột biến axit amin trong protein rhodopsin, gây ra các bệnh di truyền trội trên NST thường, được gọi là loạn sắc tố võng mạc (retinitis pigmentosa) Các đột biến này dẫn đến mất chức năng của tế bào hình que, sau đó là thoái hóa các tế bào võng mạc ngoại vi Chúng làm cho rhodopsin gấp nếp sai hoặc giảm độ bền, khiến protein không gắn vào màng tế bào hình que và không thực hiện chức năng bình thường Thiếu rhodopsin trên màng tế bào dẫn đến cái chết của tế bào hình que, dẫn đến mù hoàn toàn hoặc một phần cho người bệnh, tùy thuộc vào số lượng tế bào hình que bị chết.

Các đột biến ở gen mã hóa rhodopsin có thể gây ra bệnh mù ban đêm, một dạng bệnh lý ít nghiêm trọng hơn Những đột biến này làm thay đổi trình tự axit amin trong protein, dẫn đến việc tăng ngưỡng ánh sáng cần thiết để kích hoạt chuỗi truyền tín hiệu cảm nhận ánh sáng Kết quả là, trong điều kiện ánh sáng yếu, mắt không thể nhận diện màu sắc.

10.7.4.2 Các đột biến gen ở tế bào hình nón làm giảm thị lực theo kiểu dự đoán đ−ợc

Các rối loạn thị lực do đột biến gen sắc tố trong tế bào hình nón thường ít nghiêm trọng hơn so với những rối loạn do đột biến ở gen rhodopsin trong tế bào hình que, vì tế bào hình que chiếm 95% số nơron cảm nhận màu sắc ở người Đột biến liên quan đến gen mã hóa protein cảm nhận màu xanh lam trên NST số 7 gây ra hội chứng tritanopia, trong khi đột biến ở gen cảm nhận sắc tố đỏ trên NST X có thể dẫn đến mù màu đỏ Ngoài ra, các đột biến nhỏ khác trong gen quy định protein cảm nhận màu đỏ có thể gây ra mù màu đỏ một phần hoặc hoàn toàn, tùy thuộc vào vị trí của đột biến.

10.7.4.3 Trao đổi chéo không cân giữa các gen mã hóa protein cảm nhận màu xanh lục và đỏ trên NST X gây ra phần lớn các rối loạn thị lực về cảm nhận màu

Giới thiệu chung

Trong các chương trước, chúng ta đã khám phá các cơ chế di truyền ở cấp phân tử và tế bào, bao gồm sự điều hòa biểu hiện gen, giúp giải thích sự tiến hóa của sinh vật dựa trên quy luật biến đổi của vật chất di truyền như ADN và NST Chương này sẽ trình bày một số phương pháp cơ bản trong sinh học phân tử và hóa sinh học, được áp dụng để phân tích gen (ADN) cũng như các sản phẩm của gen như ARN và protein.

Trong bối cảnh công nghệ sinh học và sinh học phân tử phát triển mạnh mẽ, giáo trình này chỉ đề cập đến một số phương pháp cơ bản trong nghiên cứu di truyền học ở cấp độ phân tử Chương đầu mô tả các phương pháp phân tích axit nucleic, từ tách chiết ADN, phân lập gen đến giải trình tự và so sánh hệ gen (genomics) Phần sau đề cập đến kỹ thuật tách chiết và phân tích protein, sản phẩm của hầu hết các gen, bao gồm tinh sạch protein và phân tích hoạt tính protein trong tế bào và mô (proteomics) Mặc dù được trình bày tách biệt, các kỹ thuật phân tích ADN và protein dựa trên nguyên lý chung và thường được sử dụng phối hợp trong nghiên cứu.

Các kỹ thuật phân tích axit nucleic

11.2.1 Tách chiết và tinh sạch ADN

Việc tách chiết và tinh sạch ADN là bước đầu tiên trong hầu hết các nghiên cứu phân tích gen, bắt đầu bằng việc "giải phóng" các thành phần tế bào vào dung dịch Tách chiết ADN từ vi khuẩn thường đơn giản do chúng tồn tại ở dạng tế bào đơn, trong khi ADN từ động vật và thực vật cần phải nghiền nhỏ trong nitơ lỏng Đối với tế bào động vật, enzym phân hủy mô liên kết có thể được sử dụng để tăng hiệu quả giải phóng Tế bào thực vật với thành cứng thường cần biện pháp cơ học hoặc enzym đặc hiệu để tách ADN Đặc biệt, việc loại bỏ các hợp chất sinh học thứ cấp trong tế bào thực vật thường yêu cầu bổ sung các hợp chất như CTAB Quy trình tách chiết ADN từ vi khuẩn thường bắt đầu bằng việc xử lý tế bào với enzym lysozyme để phân hủy lớp peptidoglycan, sau đó sử dụng các hợp chất tẩy để phân rã lipid và EDTA để loại bỏ ion kim loại, cuối cùng ADN được giải phóng và tinh sạch.

Có hai phương pháp phổ biến để tinh sạch ADN là ly tâm và chiết xuất bằng dung môi Phương pháp ly tâm hoạt động dựa trên nguyên lý quay ở tốc độ cao, tạo ra lực ly tâm giúp lắng đọng các thành phần tế bào có khối lượng lớn Khi thành tế bào vi khuẩn bị phân giải, các thành phần nhỏ sẽ hòa tan trong dịch chiết, trong khi ADN và các chất có khối lượng phân tử lớn sẽ lắng xuống đáy ống ly tâm Sau đó, dịch chiết chứa các thành phần tế bào bị phân hủy được hút ra và loại bỏ dễ dàng.

Hạt kết tủa mang ADN được hòa tan trong dung dịch đệm, nhưng thường lẫn ARN và protein Để loại bỏ các hợp chất này, phenol là dung môi hiệu quả, mặc dù độc hại, giúp tách protein khỏi ADN Khi phenol được bổ sung vào nước, hai chất lỏng không hòa tan mà tách thành lớp riêng Sau khi lắc mạnh, protein hòa vào phenol, và khi để yên, hai pha lại tách ra, với ADN và ARN chủ yếu ở pha nước Việc hút nước ra giúp tách axit nucleic khỏi protein, và quá trình chiết xuất có thể lặp lại để giảm protein còn sót Gần đây, các quy trình tách chiết ADN đã cải tiến để tránh phenol, phổ biến nhất là sử dụng cột chứa chất nền liên kết đặc hiệu ADN, như silic dioxide và hợp chất trao đổi anion Silic dioxide liên kết với ADN ở nồng độ muối thấp và pH cao, trong khi các chất nền trao đổi anion như diethylaminoethyl-cellulose liên kết mạnh với khung đường-phosphate của ADN, giúp “bắt giữ” ADN trong cột và rửa trôi khi nồng độ muối tăng.

Bước tiếp theo trong quá trình tinh sạch ADN là loại bỏ ARN, thường thực hiện bằng enzym ribonuclease như RNase A, có khả năng nhận diện và phân giải ARN mà không ảnh hưởng đến ADN Trong quá trình này, hỗn hợp ADN và ARN được ủ ở nhiệt độ tối ưu của enzym, sau đó bổ sung alcohol (etanol hoặc isoamylalcohol) để kết tủa các phân tử lớn, chủ yếu là ADN Các đoạn ARN nhỏ vẫn hòa tan và dễ dàng được loại bỏ, tuy nhiên, cần lưu ý rằng alcohol kết tủa đại phân tử một cách không đặc hiệu.

Hình 11.1 Dùng phenol loại protein khỏi dịch chiết ADN và ARN

ADN, ARN và protein trong pha n−íc

Phenol Lắc mạnh Ly tâm

ADN và ARN trong n−íc

Protein trong phenol, cùng với carbohydrate và protein, có khả năng kết tủa với ADN và ARN Do đó, quá trình kết tủa bằng alcohol thường chỉ được thực hiện sau khi các thành phần khác của tế bào đã được loại bỏ khỏi dịch chiết thông qua ly tâm và/hoặc chiết xuất bằng phenol.

Sau khi xử lý hỗn hợp ADN và ARN bằng ribonuclease và bổ sung etanol, quá trình ly tâm sẽ thu được kết tủa ADN, trong khi ARN sẽ hòa tan trong dịch chiết và được loại bỏ Kết tủa ADN thường rất nhỏ, thậm chí không nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng chứa hàng triệu phân tử ADN, đủ cho các nghiên cứu tiếp theo ADN lúc này có độ tinh khiết cao, được hòa tan trong dung dịch đệm nước và sẵn sàng cho các thí nghiệm phân tích ADN sau này.

11.2.2 Sử dụng quang phổ để xác định nồng độ ADN và ARN

Cấu trúc vòng thơm của nucleotide trong ADN và ARN cho phép các phân tử này hấp thụ tia cực tím tối đa ở bước sóng 260 nm Khi chiếu tia UV vào dung dịch axit nucleic, mức hấp thụ (A260) tỷ lệ thuận với nồng độ axit nucleic Đây là nguyên lý cơ bản để sử dụng máy quang phổ xác định nồng độ ADN và ARN Bằng cách sử dụng các dung dịch chuẩn có nồng độ biết trước, các giá trị A260 được sử dụng để xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ axit nucleic và chỉ số A260, từ đó xác định nồng độ ADN hoặc ARN trong mẫu sau khi đo chỉ số A260.

Protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280nm do cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan Độ tinh sạch của dịch chiết ADN được xác định qua tỉ số A260/A280, với giá trị khoảng 1,8 cho ADN tinh sạch Nếu tỉ số này thấp hơn 1,8, có thể có sự hiện diện của protein, trong khi tỉ số lớn hơn 1,8 cho thấy sự có mặt của ARN Dịch chiết ARN tinh sạch có tỉ số A260/A280 xấp xỉ 2,0.

Trong dung dịch chỉ chứa nucleotide đơn lẻ, cường độ hấp thụ tia UV cao hơn so với khi chúng nằm trong phân tử ADN và ARN, do các nucleotide hòa tan khắp dung dịch Cường độ hấp thụ này chủ yếu đến từ các vòng purine và pyrimidine, không phải từ phần đường và phosphate Trong ADN sợi kép, các vòng purine và pyrimidine bị che chắn bởi khung đường-phosphate, dẫn đến giảm cường độ hấp thụ tia UV Các phân tử ARN và ADN có cấu trúc mạch đơn với một số vùng có thể có cấu trúc sợi kép, do đó có mức hấp thụ trung bình Hàm lượng ADN và ARN trong dung dịch thường được xác định dựa trên chỉ số A260.

1 A 260 của dung dịch ADN sợi kép (dsADN) = 50 àg

1 A 260 của dung dịch ADN mạch đơn (ssADN)/ARN = 40 àg

1 A260 của dung dịch dNTP/oligonucleotide = 33 àg

11.2.3 Điện di phân tích axit nucleic

Điện di trên gel là phương pháp phân tích ADN phổ biến nhất hiện nay nhờ tính nhanh chóng và đơn giản Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc các phân tử axit nucleic (tích điện âm) sẽ di chuyển qua gel dưới tác động của điện trường, với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử Qua quá trình này, các phân đoạn ADN sẽ dần được tách ra, cho phép thu thập và phân tích từng đoạn ADN hoặc gen riêng biệt Các phân đoạn ADN nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn trên gel, và sau khi điện di kết thúc, chúng có thể được quan sát bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang như ethidium bromide (EtBr) Mỗi băng điện di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có kích thước tương đồng.

Có hai loại gel điện di phổ biến là agarose và polyacrylamide Gel polyacrylamide cung cấp độ phân giải cao và có khả năng phân tách các đoạn ADN chỉ với một cặp nucleotide (1 bp), nhưng thường chỉ thích hợp cho các đoạn ADN nhỏ từ 5 đến 1000 bp Ngược lại, gel agarose có độ phân giải thấp đối với đoạn ADN nhỏ, nhưng lại rất hiệu quả trong việc phân tách các đoạn ADN lớn, với kích thước từ 200 bp đến 20 kb (1 kb = 1000 bp).

Các đoạn ADN lớn không thể di chuyển qua các lỗ nhỏ trên gel, mà thay vào đó, chúng "trườn" qua mạng lưới gel với một đầu đi trước Điều này dẫn đến việc các đoạn ADN lớn (từ 10 kb đến 10 Mb) có tốc độ dịch chuyển tương đương và khó phân tách bằng điện di thông thường Để tách các đoạn ADN lớn, phương pháp điện di xung trường (PFGE) được sử dụng, với hai cặp điện cực đặt chéo nhau, cho phép ADN thay đổi chiều dịch chuyển Các đoạn ADN lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn, giúp tách biệt các kích thước khác nhau Kỹ thuật PFGE có thể xác định kích thước nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm men Đối với các đoạn ADN nhỏ chỉ khác nhau vài bp, phương pháp điện di biến tính gradient (DGGE) được áp dụng, trong đó ADN sợi kép bị biến tính bởi nhiệt hoặc hóa chất trong quá trình điện di.

G ra di en t b iÕ n tÝn h 40 % 70 %

C hi ều d ịc h ch uy ển c ủa A D N

Thể đột biến 1 dễ biến tính hơn

Thể đột biến 2 khó biến tính hơn

ADN kiểu dại Điện cực

Hình 11.2 Kỹ thuật điện di xung tr−ờng

A và B là hai bộ điện cực hoạt động luân phiên Khi bộ A được bật, phân tử ADN sẽ di chuyển về phía góc phải dưới Ngược lại, khi bộ A tắt và bộ B được bật, phân tử ADN sẽ chuyển động theo hướng khác.

ADN di chuyển về góc trái phía d−ới Mũi tên mô tả h−ớng di chuyển của phân tử ADN trong điện di xung tr−êng.

Kỹ thuật điện di biến tính gradient (DGGE) cho phép phân tích hỗn hợp ba đoạn ADN, bao gồm đoạn kiểu dại và hai đoạn đột biến Trong phương pháp này, các đoạn ADN được đưa vào giếng dài nằm ngang trên bản gel Sự tác động của chất gây biến tính với nồng độ khác nhau dẫn đến sự định vị của các đoạn ADN, tạo ra dạng đường cong sigma Kết quả của điện di DGGE song song sẽ tạo ra phổ điện di tương tự như điện di trên gel thông thường.

DGGE vuông góc DGGE song song

Trong quá trình điện di, nồng độ urê và formamide được điều chỉnh theo chiều song song (DGGE song song) hoặc vuông góc (DGGE vuông góc) với chiều điện di Kết quả của DGGE song song tạo ra các băng tách biệt tương tự như điện di trên gel agarose, trong khi DGGE vuông góc cho phép phân tán các phân tử ADN khác biệt chỉ một hoặc vài bp, hình thành chuỗi băng cong sigma Phương pháp điện di không chỉ phân tách ADN dựa trên kích thước mà còn cả hình dạng và cấu hình của chúng Các phân tử ADN dạng mạch vòng duỗi xoắn hoặc bị "đứt gãy" thường di chuyển chậm hơn so với các phân tử ADN dạng mạch thẳng có cùng khối lượng, trong khi các phân tử ADN siêu xoắn thường di chuyển nhanh hơn so với các dạng khác có cùng khối lượng.

Các kỹ thuật phân tích protein

Mặc dù biểu hiện gen thường được đánh giá qua mức độ phiên mã bằng cách phân tích mARN, nhưng lượng mARN trong tế bào không luôn tương đồng với lượng và hoạt tính protein cuối cùng Sự không tương đồng này có thể do nhiều nguyên nhân, như một số ARN không được dịch mã, tiền-ARN có thể mã hóa nhiều protein khác nhau, và tốc độ dịch mã khác nhau Hoạt tính protein còn thay đổi do các biến đổi sau dịch mã, như biến đổi axit amin và thêm hoặc mất các nhóm chức Nhiều protein cũng trải qua quá trình "cắt tỉa" và bổ sung gốc đường hoặc lipid để trở thành glycoprotein và lipoprotein Độ bền và tốc độ phân hủy của protein rất khác nhau, và các biến đổi này còn phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng và tương tác với các gen và protein khác Do đó, để đánh giá biểu hiện gen, cần xem xét cả mức độ dịch mã Sau khi nhiều hệ gen được giải trình tự, phần lớn các gen vẫn chưa rõ chức năng, dẫn đến quan điểm rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ của hệ protein học Dưới đây là một số phương pháp phân tích protein cơ bản.

11.3.1 Chuẩn bị dịch nghiền tế bào để tinh sạch protein

Việc phân lập và tinh sạch các protein riêng rẽ là rất quan trọng để hiểu rõ chức năng của chúng Mặc dù có thể nghiên cứu chức năng của protein trong hỗn hợp phức tạp, nhưng thường dẫn đến kết luận không rõ ràng Chẳng hạn, khi nghiên cứu hoạt tính của enzym ADN pol trong hỗn hợp protein thô, các enzym và protein khác có thể ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp ADN Do đó, tinh sạch protein là bước cần thiết trong quá trình tìm hiểu chức năng của chúng.

Mỗi loại protein có những đặc tính riêng biệt, dẫn đến quy trình tinh sạch thường mang tính đặc thù Điều này khác với ADN, có cấu trúc và thành phần tương đồng, chỉ khác nhau ở trình tự nucleotide Các bước tinh sạch protein thường dựa vào kích thước, hình dạng, điện tích và đôi khi là chức năng của chúng.

Vật liệu khởi đầu cho quá trình tinh sạch protein thường là dịch nghiền tế bào, vì protein dễ bị biến tính và phân hủy sau khi rời khỏi tế bào Do đó, các bước chuẩn bị dịch chiết và tinh sạch protein cần được thực hiện ở nhiệt độ lạnh (dưới 4°C) Có nhiều phương pháp để chuẩn bị dịch nghiền tế bào, bao gồm sử dụng hóa chất, biện pháp cơ học để làm vỡ tế bào, hoặc xử lý với dung dịch nhược trương Tất cả các phương pháp này đều nhằm mục đích làm vỡ tế bào và giải phóng protein Trong nhiều trường hợp, tế bào cần được đông lạnh trước khi nghiền và tiến hành chiết xuất protein.

11.3.2 Sử dụng sắc ký cột để tinh sạch protein

Cách tinh sạch protein phổ biến nhất là sử dụng các phương pháp sắc ký cột, trong đó protein được chạy qua cột chứa mạng lưới từ các hạt agarose, polyacrylamide hoặc dextran (Sephadex®) Tùy thuộc vào đặc tính của protein, có thể áp dụng các phương pháp và quy trình kỹ thuật khác nhau Ba phương pháp sắc ký cột cơ bản bao gồm sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel và sắc ký ái lực.

11.3.2.1 Sắc ký trao đổi ion

Phương pháp tách protein dựa trên điện tích ion hóa bề mặt cho phép phân loại chúng bằng cách sử dụng vật liệu nhồi cột, hay còn gọi là pha tĩnh, bao gồm các hạt mang nhóm tích điện âm hoặc dương.

11.16a) Các protein t−ơng tác yếu với pha tĩnh (chẳng hạn, protein tích điện d−ơng đ−ợc cho chạy qua pha tĩnh mang điện âm) ban đầu đ−ợc giữ lại trong cột, sau đó sẽ đ−ợc rửa chiết bằng một dung dịch muỗi loãng chảy qua cột (dung dịch đệm chạy mẫu đ−ợc gọi là pha động) Các protein tương tác với pha tĩnh càng mạnh, càng cần nồng độ muối cao để rửa chiết Bằng việc tăng gradient nồng độ muối trong các dung dịch đệm rửa chiết, các protein khác nhau về kích thước, khối lượng và mức độ ion hóa bề mặt sẽ phân tách khỏi nhau thành các phân đoạn khi chúng đi qua cột

Sắc ký lọc gel là một phương pháp phân tách các protein dựa trên hình dạng và kích thước của chúng Khác với sắc ký trao đổi ion, vật liệu nhồi cột không chứa các nhóm tích điện mà tạo thành một mạng lưới với các kích thước lỗ khác nhau Các phân tử protein nhỏ có khả năng thâm nhập vào nhiều lỗ hơn, dẫn đến thời gian chạy qua cột dài hơn và được rửa chiết muộn hơn Ngược lại, các phân tử protein lớn sẽ được rửa chiết sớm hơn.

Trong sắc ký cột, các phân đoạn protein được thu thập ở nồng độ muối và thời gian khác nhau, nhằm tối ưu hóa hoạt tính protein và tăng độ tinh khiết Để đạt được mức độ tinh sạch cao hơn, thường cần sử dụng nhiều loại cột sắc ký, vì một cột đơn lẻ thường không đủ để tinh sạch protein mong muốn, ngay cả khi quy trình được lặp lại Do đó, việc áp dụng nhiều kỹ thuật sắc ký là cần thiết để thu hồi phân đoạn chứa lượng protein lớn Mặc dù có nhiều phân tử protein được rửa chiết từ cột tích điện dương hoặc qua sắc ký lọc gel, những kỹ thuật đơn lẻ này thường không đủ để sản xuất protein tinh sạch hoàn toàn.

11.3.2.3 Sắc ký ái lực hỗ trợ tinh sạch protein Đặc tính của mỗi loại protein có thể đ−ợc dùng nhằm làm tinh sạch loại protein tương ứng Chẳng hạn, nếu một loại protein có tính liên kết đặc hiệu với ATP, thì có thể

Hình 11.16 Sắc ký cột để tinh sạch protein a) Sắc ký trao đổi ion, b) Sắc ký lọc gel (vẽ theo Watson et al., 2004)

Hạt nhồi cột tích điện âm

Sắc ký ái lực là kỹ thuật tinh sạch protein hiệu quả, sử dụng cột sắc ký với vật liệu gắn kết ATP để phân tách protein Chỉ những protein liên kết với ATP mới được giữ lại trên cột, trong khi hầu hết các protein không liên kết sẽ bị rửa trôi Để nâng cao hiệu quả tinh sạch, có thể sử dụng nhiều chất khác nhau như ADN để tinh sạch protein liên kết ADN, hoặc các protein khác có tương tác đặc thù Do đó, việc hiểu biết về đặc tính lý hóa của protein là cần thiết để thực hiện quá trình tinh sạch thành công.

Sắc ký ái lực miễn dịch là một phương pháp phổ biến trong sắc ký ái lực, trong đó kháng thể đặc hiệu được gắn với protein mục tiêu trên vật liệu cột Trong lý tưởng, kháng thể chỉ liên kết với protein cần tinh sạch, và protein này được rửa chiết bằng dung dịch muối hoặc chất tẩy nhẹ Tuy nhiên, đôi khi liên kết kháng thể - protein quá bền vững, dẫn đến việc protein cần phải biến tính để thu hồi sản phẩm, và protein sau biến tính thường không hoạt động chức năng Để cải thiện hiệu suất tinh sạch, có thể bổ sung đoạn peptide ngắn vào đầu C hoặc N của protein, thực hiện qua kỹ thuật di truyền Các trình tự peptide đánh dấu này thay đổi thuộc tính của protein, giúp tinh chế dễ dàng hơn, ví dụ như chuỗi peptide 6 His làm tăng tương tác với cột Ni 2+ Ngoài ra, sử dụng epitop đặc hiệu cũng giúp tinh sạch protein có ái lực cao Những cải tiến này cho phép tinh sạch protein dựa trên nguyên tắc miễn dịch, với ưu điểm là tính liên kết kháng thể có thể thay đổi theo điều kiện môi trường.

Ca 2+ , và tăng khi không có Ca 2+ ) Điều này giúp hạn chế việc sử dụng các yếu tố gây biến tính khác

Nguyên tắc sắc ký ái lực miễn dịch cho phép kết tủa nhanh chóng một loại protein đặc hiệu từ dịch chiết thô Phản ứng kết tủa miễn dịch diễn ra khi kháng thể được gắn vào vật liệu pha tĩnh trong sắc ký cột.

Các hạt lớn lắng nhanh trong ống nghiệm chứa dung dịch đệm, mang theo các protein liên kết qua kháng thể Kỹ thuật này, gọi là kết tủa miễn dịch, ngày càng phổ biến trong việc tinh sạch protein Mặc dù phương pháp này hiếm khi cho sản phẩm protein tinh sạch hoàn toàn khi sử dụng riêng lẻ, nhưng nó rất hiệu quả trong việc xác định các loại protein hoặc hợp chất khác, như trình tự ADN, có tương tác với protein đích.

11.3.3 Phân tích protein trên gel polyacrylamide

11.3.3.1 Kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)

Protein không giống như các axit nucleic, thường không có điện tích đồng đều hay cấu trúc bậc hai đồng nhất Chúng được cấu thành từ 20 loại axit amin cơ bản, bao gồm 15 axit amin trung tính, 3 axit amin tích điện dương và 2 axit amin tích điện âm Đa phần protein là trung tính, trong khi một số có điện tích dương và một số khác có điện tích âm Ngoài cấu trúc bậc hai, protein hoạt động thường có cấu trúc bậc ba hoặc bậc bốn Khi tiếp xúc với các chất tẩy ion hóa mạnh, cấu trúc của chúng có thể bị thay đổi.