Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nitơ và sinh tổng hợp indole 3 acetic acid (iaa) cao

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN DUY DŨNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH CỐ ĐỊNH NITƠ VÀ SINH TỔNG HỢP INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA) CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2023 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGUYỄN DUY DŨNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH CỐ ĐỊNH NITƠ VÀ SINH TỔNG HỢP INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA) CAO Nghành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN VĂN CHÍ TS BÙI TRI THỨC Thái Nguyên - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu luận văn riêng chưa công bố Tôi xin cam đoan tài liệu tham khảo trích dẫn đầy đủ giúp đỡ đề cảm ơn ii LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cần thiết kinh nghiệm quý báu cho suốt khoảng thời gian học tập nghiên cứu Trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun Để hồn thành nhiệm vụ giao, bên cạnh nỗ lực thân cịn có hướng dẫn tận tình thầy, cô bạn bè xung quanh Tôi chân thành cảm ơn TS Trần Văn Chí, TS Bùi Tri Thức người hướng dẫn cho suốt thời gian làm luận văn thạc sĩ Mặc dù công việc giảng dạy cịn nhiều bận rộn thầy khơng ngần ngại dẫn tơi, định hướng để tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Một lần chân thành cảm ơn thầy chúc thầy dồi sức khỏe Tuy nhiên, kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân chưa có nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung báo cáo không tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận góp ý, bảo thêm q thầy để báo cáo hoàn thiện Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln bên giúp đỡ, động viên tơi hồn thành khóa luận văn thạc sĩ Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 01 năm 2023 Học viên thực NGUYỄN DUY DŨNG iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn nitơ tự nhiên 1.2 Vai trò nitơ thực vật 1.3 Quá trình chuyển hóa nitơ tự nhiên 1.4 Vai trò đường sinh tổng hợp IAA vi sinh vật tự nhiên 1.5 Tổng quản nghiên cứu nước vi sinh vật cố định nitơ sinh tổng hợp IAA 12 1.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 22 Chương ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 28 2.2 Phạm vi nghiên cứu: 28 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 28 2.3.1 Vật liệu, hóa chất nghiên cứu: 28 2.3.2 Thiết bị nghiên cứu: 29 2.4 Nội dung nghiên cứu 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu .29 2.5.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn cố định đạm 29 iv 2.5.2 Phương Pháp đánh giá khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA vi khuẩn (bổ sung phương pháp định tính khả cố đinh ni tơ tổng hợp IAA) 32 2.5.3 Phương pháp giải trình tự 16S RNA 38 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .39 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA 39 3.1.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả cố định nitơ từ mẫu đất nơng nghiệp thu số địa phương 39 3.1.2 Kết định tính khả cố định nitơ tổng hợp IAA chủng phân lập 41 3.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nitơ sinh tổng hợp IAA cao số chủng phân lập 43 3.2.1 Kết đánh giá khả tổng hợp IAA chủng vi sinh vật phân lập .43 3.2.2 Kết đánh giá khả cố định nitơ chủng phân lập .45 3.3 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh đến lồi chủng vi khuẩn tuyển chọn 48 3.3.1 Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh lý chủng tuyển chọn 48 3.3.2 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng MN26 52 3.3.3 Định danh đến loài chủng vi khuẩn MN26 .54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 1.Kết luận 57 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ ngữ Viết tắt Indole-3-Acetic Acid IAA Optical density OD Ultraviolet UV Colony form units CFU Most probable number MPN Nitơ N2 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng 28 Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng 29 Bảng 2.3: Thành phần thuốc thử Salkowski .35 Bảng 2.4: Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc IAA 36 Bảng 3.1 Kết phân lập vi khuẩn có khả cố định nitơ mơi trường Ashby chọn lọc từ mẫu đất trồng nông nghiệp 39 Bảng 3.2 Kết đánh giá sơ đặc điểm chủng phân lập 42 Bảng 3.3 Kết đánh giá khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn phân lập 45 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả cố định nitơ chủng phân lập .47 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng MN26 50 Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng sàng lọc 51 Bảng 3.7 Một số đặc điểm sinh hóa chủng MN26 52 Bảng 3.8 So sánh tương đồng trình tự gen 16S rRNA chủng MN26 với loài gần công bố liệu EzTaxon 54 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Đường chuẩn tương quan hàm lượng IAA dung dịch độ hấp thụ tia UV 44 Hình 3.2 Đường chuẩn tương quan hàm lượng NH4+ dung dịch độ hấp thụ tia UV 46 Hình 3.3 Đường chuẩn tuyến tuyến mật độ tế bào dung dịch độ hấp thụ tia UV chủng MN26 48 Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng chủng MN26 49 Hình 3.5 Sơ đồ phả hệ chủng MN26 với loài gần thuộc chi Flavobacterium Các giá trị vị trí phân nhánh với tần số xuất (bootstrap) 1000 phép so sánh (chỉ giữ lại giá trị ≥50%); Chryseobacterium balustinum LMG 8329T (AY468447) chi Flavobacterium .55 MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Đạm nguyên tố quan trọng ảnh hưởng đến trình sinh trưởng, phát triển suất trồng chất dinh dưỡng thường bị thiếu hụt sản xuất nông nghiệp Đạm tham gia tạo nên protein acid amin giữ vai trò quan trọng hoạt động sống tế bào thực vật Tỷ lệ protein (%) nông phẩm thay đổi tiêu để đánh giá chất lượng nơng phẩm Đạm có nhiều hợp chất cần thiết cho phát triển diệp lục enzim, thúc đẩy trình quang hợp hoạt động sống Đạm với lân ảnh hưởng đến khả di truyền chúng nằm ADN ARN Đạm kích thích phát triển rễ, giúp trồng huy động mạnh thức ăn khác đất Ảnh hưởng đến suất chất lượng sản phẩm Sự cung cấp đạm có liên quan đến sử dụng carbohydrate trồng Khi khơng cung cấp đủ đạm, carbohydrate bị tích tụ tế bào sinh trưởng, làm cho chúng trở nên dày Auxin (trong có Indole-3-acetic acid (IAA)) hc mơn thực vật có tác dụng tốt đến trình sinh trưởng tế bào, hoạt động tầng phát sinh, hình thành rễ, tượng ưu ngọn, tính hướng thực vật, sinh trưởng tạo không hạt ảnh hưởng tới vươn dài xem then chốt IAA thúc đẩy hình thành rễ thân, rễ nhánh, rễ lá, dùng để thúc đẩy mọc rễ hạt giống, ươm giống sinh rễ giúp cây phát triển khỏe mạnh, phát triển tốt tăng khả hấp thu nước chất dinh dưỡng tốt Với tầm quan trọng đạm chất kích thích sinh trưởng IAA với trồng vậy, người ta nhận thấy để đạt xuất cao trồng lấy lượng Nitơ từ lớn Theo thống kê hàng năm sản phẩm nông nghiệp giới lấy khỏi đất khoảng 100-110 triệu Nitơ Trong lượng phân bón hấp thụ thường khoảng 30-40% Lạm dụng mức việc sử dụng phân bón hóa học làm đất xấu đi, 54 3.3.3 Định danh đến loài chủng vi khuẩn MN26 Kết phân tích trình tự gen 16S rRNA (1442 bp) cho thấy chủng MN26 thể mức độ tương đồng cao trình tự gen với lồi cơng bố thuộc chi Flavobacterium, cụ thể 98,88% mức độ giống với Flavobacterium tistrianum GB 56.1T (KT223144), 98,61% với Flavobacterium sharifuzzamanii A7.6T (QJGZ01000021) 98,33% với Flavobacterium zhairuonense A5.7T (MK248099) (Bảng 3.8) Bảng 3.8 So sánh tương đồng trình tự gen 16S rRNA chủng MN26 với lồi gần cơng bố liệu EzTaxon Loài gần Mức độ tương đồng (%) Flavobacterium tistrianum GB 56.1T (KT223144) 98,88 Flavobacterium sharifuzzamanii A7.6T (QJGZ01000021) 98,61 Flavobacterium zhairuonense A5.7T (MK248099) 98,33 Flavobacterium anhuiense D3T (EU046269) 98,00 Flavobacterium nitrogenifigens NXU-44T (KP711654) 97,80 Flavobacterium ginsenosidimutans THG 01T (GU138377) 97,77 Flavobacterium chungangensis MAH-10T (KY964277) 97,40 Flavobacterium defluvii EMB117T (DQ372986) 97,28 Flavobacterium daemonense THG-DJ7T (KF532125) 97,28 55 Hình 3.5 Sơ đồ phả hệ chủng MN26 với loài gần thuộc chi Flavobacterium Các giá trị vị trí phân nhánh với tần số xuất (bootstrap) 1000 phép so sánh (chỉ giữ lại giá trị ≥50%); Chryseobacterium balustinum LMG 8329T (AY468447) chi Flavobacterium Theo báo cáo Browne cs (2016) giới hạn giá trị so sánh trình tự gen 16S-rRNA chủng phân lập với lồi cơng bố lớn 98,7% chủng MN26 thuộc chi Flavobacterium gần với loài Flavobacterium tistrianum GB 56.1T Tuy nhiên, sơ đồ phả hệ (phylogenetic tree) thiết lập (Hình 5) cho thấy chủng MN26 xếp thuộc chi Flavobacterium gần với loài Flavobacterium tistrianum GB 56.1T (KT223144), chủng MN26 giữ trí độc lập với Flavobacterium tistrianum GB 56.1T Dựa vào liệu so sánh trình tự gen sơ đồ phả hệ cho 56 thấy chủng MN26 coi ứng viên loài thuộc chi Flavobacterium, với danh pháp khoa học Flavobacterium sp MN26 Hầu hết nghiên cứu khả cố định nitơ sản sinh IAA công bố nước ta chủ yếu tập trung vào chi Rhizobium, Azospirillum, Bacillus, Azotobacter,… chi Flavobacterium gần chưa có cơng bố Các nghiên cứu gần cho thấy, thành viên Flavobacterium chứng minh có khả cố định nitơ, sản sinh IAA (Kämpfer cs, 2015; Walitang cs, 2017; Youseif, 2018) an toàn với người, động vật môi trường Tiêu biểu, Flavobacterium nitrogenifigens có khả cố định nitơ với tốc độ 48 nM ethylen/ml 24 (Kämpfer cs, 2015), Flavobacterium sp strain JS2 sản sinh IAA hàm lượng 40,27 µg/ml (tăng lên 82,8 µg/ml mơi trường có bổ sung 0,5 mg/ml Tryptophan) (Youseif, 2018) Sự có mặt chủng Flavobacterium sp IC27-25, Flavobacterium sp FL478-19 Flavobacterium sp IR29-16 tác động tích cực tăng chiều dài rễ lúa từ 8-12% (Walitang cs, 2017) Một báo cáo khác cho thấy chủng Flavobacterium sp NGB-31 có tác động tăng chiều dài chồi chiều dài rễ ngô 47,68 37,93% so với đối chứng (Youseif, 2018) Như vậy, qua so sánh với cơng bố trước thấy chủng MN26 có tiềm nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất chế phẩm sinh học có chức cố định nitơ sinh kích thích sinh trưởng IAA hỗ trợ trồng phát triển Đây nguồn gen quý cần tiếp tục nghiên cứu bảo tồn khai thác để đưa vào thực tiễn sản xuất 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ , 1.Kết luận - Đã phân lập 22 chủng vi khuẩn có khả cố định nitơ sinh kích thích sinh trưởng IAA từ 75 mẫu đất trồng lúa cà chua - Phân tuyển chọn MN26 có hoạt tính cố định nitơ tổng hợp IAA cao 22 chủng phân lập được, với hoạt tính cố định nitơ tổng hợp IAA 20,882 µg/ml 77,23446 µg/ml; - Đã nghiên cứu số đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh đến loài chủng MN26, cụ thể + Về đặc điểm sinh lý, chủng MN26 có khuẩn lạc hình hình trịn, màu trắng ngà, bề mặt bóng, có ria gọn, nhớt, tế bào hình phảy Trong mơi trường Ashby phát triển tốt nhiệt độ 28oC pH 6,5 cho khả tích lũy sinh khối sau ngày ni 4,257 x 108 CFU/ml + Về đặc điểm sinh hóa, MN26 có khả sinh loại enzyme, có khả đồng hóa nguồn carbon, có khả sinh Indole khơng có khả chuyển hóa nitrate thành nitrite + Về định danh, chủng MN26 coi ứng viên loài thuộc chi Flavobacterium, với danh pháp khoa học Flavobacterium sp MN26 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện ni cấy, thành phần mơi trường thay để hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ chủng Flavobacterium sp MN26 ứng dụng sản xuất nông nghiệp 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu tiếng việt Phạm Thị Ngọc Lan Trương Văn Lung (1999) Bước đầu nghiên cứu vi khuẩn Azotobacter đất vùng gò đồi tỉnh Thừa Thiên – Huế Đại Học Khoa Học –Đại Học Huế Nguyễn Thị Hồng Minh (2005) Nghiên cứu hiệu việc cố định tế bào vi khuẩn cố định đạm tự Azotobacter khuôn gel Chitosan Bạch Văn Tương (2006) Đánh giá biến động dinh dưỡng đất & vi sinh vật đất số hệ thống trồng Đăk Lăk Nguyễn Thị Phương Chi Phạm Thanh Hà Nguyễn Thị Thi Hồ Kim Anh Nguyễn Thi Quỳnh Mai (1999) Phối hợp chủng Vi Khuẩn cố định Nitơ Vi Khuẩn hoà tan Phốt phát để nâng cao hiệu chế phẩm phân Vi sinh Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn thị Mai Khanh (2010) Phân lập nhận diện số chủng vi khuẩn cố định ni tơ bắp Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Phương Oanh, Trần Bửu Minh, Nguyễn Thị Pha (2013) Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn đất vùng rễ lúa có khả cố định đạm tổng hợp IAA Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học, 26: 82 – 88 Nguyễn Thị Thu Hằng Đỗ Thị Thủy (2015) Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nito sinh tổng hợp IAA Trường Đại học Lâm Nghiệp Trần Thị Xuân Phương, Nguyễn Thị Như Ngọc Nguyễn Thị Thuận Lê Xuân Diễm Ngọc (2017) – Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nito sinh tổng hợp IAA đất trồng lúa tỉnh Thừa Thiên Huế (2017) Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1993) NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐẾN NHÂN GIỐNG CÂY XÁO TAM PHÂN KHÁNH HOÀ (Paramignya trimera (Oliver) Burkill) BẰNG GIÂM HOM VÀ CHIẾT CÀNH Trường đại học Huế 59 10 Trần Bảo Trâm cs (2017) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp IAA (Indole Acetic Acid) từ đất trồng sâm Việt Nam Quảng Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ Tập 33 Số 2S (2017) 219-226 11 Nguyễn Minh Chơn (2004) Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trường Đại học Cần Thơ 12 Nguyễn Đức Lượng (2014) Công nghệ vi sinh - Tập Vi sinh vật học công nghiệp NXB Đại học Quốc gia TP HCM 13 Phạm Thị Ngọc Lan (2012) Giáo trình Thực tập vi sinh vật học Nxb Đại học Huế 14 Nguyễn Anh Huy Nguyễn Hữu Hiệp (2018) Phân lập nhận diện dòng vi khuẩn chịu mặn có khả cố định đạm tổng hợp IAA từ đất sản xuất lúa – tơm Bạc Liệu, Sóc Trăng Kiên Giang Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ Tập 54, số 1B: – 12 15 Lê Như Kiểu, Lê Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Toàn, Lã Tuấn Anh, Đặng Thương Thảo (2012) Đánh giá hiệu phân hữu vi sinh đa chức đặc chủng cho cao su giai đoạn kiến thiết Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số (32): 60 – 65 16 Nguyễn Đình Thi (2012) Ảnh hưởng axit Indol axetic (IAA) đến sinh trường, phát triển suất lạc (Arachis hypogaea) Thừa Thiên Huế Tạp chí Khoa học, Địa học Huế Tập 75 A, số 6, 143-152 17 Ngô Thạch Quỳnh Huyên, Trần Thanh Hương, Bùi Trang Việt (2017).Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát triển chồi từ mô phân sinh chồi Cát Tường Eustomagrandiflorum (Raf.) Shinners Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng Nghệ: Chuyên san Khoa học tự nhiên, tập 1, số 6, 58 – 67 18 Chu Nguyên Thanh, Nguyễn Yến Nhi, Đào Ngọc Điệp, Trần Thị Hoài Bảo, Hoàng Thị Thanh Minh, Bùi Văn Lệ (2018) Đánh giá khả kích thích tăng trưởng thực vật hai chủng Pseudomonas phân lập từ vừng rễ bắp Tạp chí 60 Phát triển Khoa học Công Nghệ: Chuyên san Khoa học tự nhiên, tập 2, số 2, 38 – 46 19 Phạm Văn Toản (2003) Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, 127-131 20 Đỗ Kim Nhung, Vũ Thành Công (2011) Khảo sát khả sinh tổng hợp IAA cố định đạm vi khuẩn Gluconacetobacter sp Azospirillum sp phân lập từ mía Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, tr 161-167 21 Lai Chí Quốc, Nguyễn Thị Dơn, Cao Ngọc Điệp (2012) Tuyển chọn nhận diện vi khuẩn cố định đạm (có khả hịa tan lân kali) phân lập từ vật liệu phong hóa vùng núi đá hoa cương núi Cấm, tỉnh An Giang Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 24a, 60 – 69 22 Nguyễn Đình San (2015) Phân lập số chủng vi khuẩn lan có khả cố định đạm để cung cấp nguyên liệu cho sản xuất phân bón sinh học Tạp chí KH-CN Nghệ An Số 2/2015, 16 – 21 23 Trần Ánh Nguyệt, Trần Minh Trí, Hà Thành Đạt, Trần Thu Thảo, Hồ Viết Thế (2017) Kỷ yếu kỷ niệm 35 năm thành lập Trường ĐH Cơng nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh (1982 – 2017), 38 – 47 24 Nguyễn Thị Minh, Đỗ Minh Thu (2017) Nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi sinh vật nội sinh từ vùng sinh thái đất mặn huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định Tạp chí Khoa học Nông Nghiệp 15 (8): 1022 – 1032 *Tài liệu tiếng anh 25 Ahmad F., Ahmad I., Khan MS (2008): Screening of free-living Rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities Microbiol Res.;163(2):173–181 26 Vera Lucia D Baldani and Johanna Dobereiner (1979) “Host-plant specificity in the infection of cereals with Azospirillum spp” Soil Biol Biochem Vol 26 pp 433- 439 61 27 Abdel Wahap A M and P F Wareing (1980) Nitrogenase activity associated with the rhizosphere of inoculation of seedlings with Azotobacter New Phytol 84 711-721 28 Nikaido H (1999) Mircobial Biotechnology California University Berkeley USA 29 Puneet K.;and Sohal R.P (1998) Effect of innoculation of Azotobacter and PSN on fertilizer economy plant growth and yield of winter maize Nitrogen fixation with non legumes Kluwer Academic Publisher p 271-273 30 El-komy (2005) Coimmobilization of Azospirillum lipoferum and Bacillus megaterium for successful phosphorous and nitrogen nutrition of wheat plants Food Technol Biotechnol 43(1) 19-27 31 Stephan, M.P., Rao A.V (1979) Physiological studies with Azospirillum spp in Associative N2-Fixation Volume I, eds P.B Vose & A.P Ruschel (Boca Raton, FL: CRC Press, 1979) 7-14 32 Vlassak, K and Reynders, R (1979) Agronomic aspects of biological dinitrogen fixation by Azoxpirillum spp in Associative N2 Fixation Volume I, eds P B Vose & A P Ruschel (Boca Raton, FL: CRC Press, 1979) 93-102 33 Steenhoudt O., Vanderleyden J (2000) Azospirillum, a free-living nitrogen- fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects FEMS Microbiol Rev 24:487-506 34 Kahindi J.H.P., Woomer P., George T., de Souza Moreira F.M., Karanja N.K., Giller K.E (1997) Agricultural intensification, soil biodiversity and ecosystem function in the tropics: the role of nitrogen-fixing bacteria Appl Soil Ecol 6:5576 35 Peoples, M.B., and E.T Craswell 1992 Biological nitrogen fixation: investments, expectations and actual contributions to agriculture Plant Soil 141:13-39 36 Orr H.C., James A., Leifert C., Cooper J.M., Cummings S.P (2011) Diversity and activity of free-living nitrogen-fixing bacteria and total bacteria in organic and conventionally managed soils Appl Environ Microbiol 77:911-919 62 37 Fattah, Q.A (2005) Plant Resources for Human Development." Third International Botanical Conference 2005 Bangladesh Botanical Society, Dhaka, Bangladesh 38 Roper M.M and Gupta V.V.S.R (2016) Enhancing Non-symbiotic N2 Fixation in Agriculture The Open Agriculture Journal 10: 7-27 39 Dahal B., NandaKafle G., Perkins L., Brözel V.S (2017) Diversity of free- Living nitrogen fixing Streptomyces in soils of the badlands of South Dakota Microbiol Res 195:31-39 40 Rilling J I., Acuña J J., Sadowsky M J Jorquera M A (2018) Putative Nitrogen-Fixing Bacteria Associated With the Rhizosphere and Root Endosphere of Wheat Plants Grown in an Andisol From Southern Chile Front Microbiol 2018; 9: 2710 41 Ospina-Betancourth C., Acharya K., Allen B., Entwistle J., Head I.M., Sanabria J., Curtis T.P (2020) Enrichment of Nitrogen-Fixing Bacteria in a NitrogenDeficient Wastewater Treatment System Environ Sci Technol 54:3539-3548 42 Mahmud K., Makaju S., Ibrahim R., Missaoui A (2020) Current Progress in Nitrogen Fixing Plants and Microbiome Research Plants 9, 97 43 Ryu M.H., Zhang J., Toth T., Khokhani D., Geddes B.A., Mus F., Garcia- Costas A., Peters J.W., Poole P.S., Ané J.M., Voigt C.A (2020) Control of nitrogen fixation in bacteria that associate with cereals Nature Microbiology 5:314–330 44 Steenhoudt O., Vanderleyden J (2000) Azospirillum, a free-living nitrogen- fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects FEMS Microbiol Rev 24:487-506 45 Clark, A.G, 1974, Indol acetic production by Agrobacterium and Rhizobium species, 11(1974), 29-35 46 Ahmad F., Ahmad I., Khan MS (2008): Screening of free-living Rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities Microbiol Res.;163(2):173–181 47 Liu W.H., Chen F.F., Wang C.E., Fu H.H., Fang X.Q., Ye J.R., Shi J.Y (2019) Indole-3-Acetic Acid in Burkholderia pyrrocinia JK-SH007: Enzymatic 63 Identification of the Indole-3-Acetamide Synthesis Pathway Front Microbiol 10:2559 48 Myo E.M., Ge B., Ma J., Cui H., Liu B., Shi L., Jiang M., Zhang K (2019) Indole-3-acetic acid production by Streptomyces fradiae NKZ-259 and its formulation to enhance plant growth BMC Microbiology 19:155 49 Rodrigues A.A Forzani M.V., de Souza Soares R., Sibov S.T., Daniel J., Vieira G (2016) Isolation and selection of plant growth-promoting bacteria associated with sugarcane Pesq Agropec Trop, 46: 149-158 50 Giassi V., Kiritani C., Kupper K.C (2016) Bacteria as growth-promoting agents for citrus rootstocks Microbiological Research, 190: 46-54 51 Anjali Chauhan, Guleria S., Balgir P.P., Walia A., Mahajan R., Mehta P., and Shirkot C.K (2017) Tricalcium phosphate solubilization and nitrogen fixation by newly isolated Aneurinibacillus aneurinilyticus CKMV1 from rhizosphere of Valeriana jatamansi and its growth promotional effect Braz J Microbiol, 48: 294304 52 Li H.B., Singh R.K., Singh P., Song Q.Q., Xing Y.X., Yang L.T., Li Y.R (2017) Genetic Diversity of Nitrogen-Fixing and Plant Growth Promoting Pseudomonas Species Isolated from Sugarcane Rhizosphere Front Microbiol, 8:1268 PHỤ LỤC Một số hình ảnh kết trình nghiên cứu Hình ảnh khuẩn lạc chủng MN26 Hình ảnh tế bào chủng MN26 Kết thử nghiệm loại hydrocacbon chủng MN26 Hình ảnh thử nghiệm khả sinh enzyme chủng MN26 Khả sinh Indole chủng MN26 Thử nghiệm phản ứng Methyl đỏ Kết so sánh trình tự Gen 16SRNA NCBI Trinh tự Gen 16SRNA CTCAGGATGAACGCTAGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGG GGTAGAATTCTTCGGAATTTGAGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGC GTATGCAATCTGCCTTCCACAGAGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGA TTAATACCTCATAGCATCATGACCCGGCATCGGGATATGATTAAAG TCACAACGGTGGAAGATGAGCATGCGTCCCATTAGCTAGTTGGTAA GGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGGGTAGGGGTCCTGAGAGGG AGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCAAGCCTGAACCAG CCATGCCGCGTGCAGGATGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTT GTACGGGAAGAAACACTCCGACGTGTCGGAGCTTGACGGTACCGTA AGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGATCCAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAG GCGGTCTTGTAAGTCAGTGGTGAAAGCCCATCGCTCAACGGTGGAA CGGCCATTGATACTGCAGGACTTGAATTACTGGGAAGTAACTAGAA TATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGAGATTACATGGAATACCAA TTGCGAAGGCAGGTTACTACCAGTGGATTGACGCTGATGGACGAAA GCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGATGGATACTAGCTGTTGGTGGCAACATCAGTGGCTAAGCGAA AGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT TAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGCAGAC TGACCGATTTGGAAACAGATCTTTCGCAAGACAGTTTACAAGGTGC TGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCT ATAACGAGCGCAACCCCTGTTGTTAGTTGCCAGCGAGTCAAGTCGG GAACTCTAACAAGACTGCCAGTGCAAACTGTGAGGAAGGTGGGGA TGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGCTACACACGTGC TACAATGGCCGGTACAGAGAGCAGCCACCTCGCGAGGGGGAGCGA ATCTATAAAGCCGGTCACAGTTCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACT CCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAGCCATGATCCGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGA AGCTGGGGGTGCCTGAAGTCGGTGACCGCAAGGAGCTGCCTAGGGT AAAACTGGTAACTAGGGCTA