Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn cố định đạm
Tiến hành lấy mẫu đất trồng lúa tại một số tỉnh trung du miền núi phía Bắc Việt Nam. Mẫu đất đảm bảo tính đại diện của thổ nhưỡng.
Việc lấy mẫu đất tuân theo hướng dẫn của Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 7538 – 6:2010. Dùng thuổng nhọn khoét xuống tầng canh tác độ sâu đến 20 cm. Bất cứ lớp phủ thực vật, lớp rác đã phủ rêu, rễ cây, cành cây hoặc rác từ cây gỗ và các động vật sống trong đất có thể nhìn thấy đều phải nhặt bỏ. Mỗi mẫu đất lấy 100 gam, được gói cẩn thận trong các túi PE và chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4±2oC.
2.5.1.2. Phương pháp pha loãng dung dịch [13]
Cân 10g mẫu đất cho vào 90 ml nước cất vô trùng.
Chuẩn bị 6 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 6.
Ống 1: chứa 10 ml nước cất vô trùng, 6 ống còn lại chứa 9 ml nước cất vô trùng.
Dùng Micropipet hút 1ml dung dịch từ bình tam giác đã hòa 10g đất cho vào ống 1 lắc đều. Sau đó hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, lắc đều. Cứ tiếp tục đến ống 5. như vậy chúng ta tiến hành pha loãng dung dịch ở các nồng độ: 10-2,10-3, 10-4, 105, 10-6, 10-7
2.5.1.3. Môi trường phân lập Ashby Thành phần môi trường Ashby:
Manniton: 20 g.
K2HPO4: 0,2 g.
MgSO4.7H20: 0,2 g.
NaCl: 0,2 g.
K2SO4: 0,1 g.
CaCO3: 5,0 g.
Agar: 20 g.
Nước cất vừa đủ:1000 ml pH = 7
Môi trường Ashby lỏng thì không bổ sung agar.
Môi trường thạch Ashby được hấp khử trùng ở 1atm trong thời gian 15 phút. Sau đó, phân phối môi trường vào các đĩa petri.
Môi trường Ashby được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri vô trùng, mỗi đĩa 10-15 ml.
2.5.1.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn [13]
Chuẩn bị môi trường Ashby manniton thạch đĩa.
Thành phần môi trường bao gồm: Manniton 20 g; K2SO4 0,1 g; K2PO4 0,2g;
MgSO4.7H2O 0,2 g; NaCl 0,2 g; CaCO3 5 g; agar 15 g; nước cất 1000 ml; pH 7 – 7,2.
Môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C, trong thời gian 15 phút - Cấy mẫu
+Với mẫu đất đó xử lý: Mỗi độ pha loóng hỳt 100 àl dịch hũa loóng của mẫu cấy trải trên môi trường thạch đĩa.
+Với mẫu rễ đó xử lý: Mỗi độ pha loóng hỳt 100 àl dịch nghiền của mẫu cấy trải trên môi trường thạch đĩa.
- Nuôi và theo dõi sự phát triển của các chủng vi sinh vật
Các đĩa thạch sau khi cấy được chuyển vào tủ ấm với nhiệt độ ổn đinh 30oC để nuôi và định kỳ (8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 36 giờ....) theo dõi và quan sát sự phát triển của khuẩn lạc.
- Thuần giống
Tách riêng rẽ các khuẩn lạc phát triển từ đĩa thạch để cấy ria vào đĩa thành khác đã chuẩn bị sẵn, rồi đặt vào tủ ấm để theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc, nếu các khuẩn lạc mọc lên có hình thái, đặc điểm giống nhau, soi trên kính hiển vi hình thái tế bào nếu giống nhau thì cấy chuyển vào ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để đem đi bảo quản giống.
Bảo quản và giữ giống thí nghiệm
Sau khi thu đúng khuẩn lạc theo tài liệu mô tả, chọn các khuẩn lạc đơn, cấy dòng thuần từ 4 – 5 lần, sau đó cấy vào ống thạch nghiêng, đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC.
Sau 3-5 ngày khi vi sinh vật đã mọc tốt, đem các ống giống đi bảo quản trong tủ lạnh ở 4-60C. Sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần. Để bảo quản giống được lâu từ 6 tháng đến 2 năm có thể giữ giống trong paraffin lỏng vô trùng hay giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô
2.5.1.6. Phương pháp chuẩn bị giống thí nghiệm [13]
Trước khi tiến hành mỗi thí nghiệm chuẩn bị 2 ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường Ashby lỏng, dùng que cấy lấy vi khuẩn. từ các ống giống, hòa tan vào 2 ống
nghiệm. Lắc đều 2 ống nghiệm bằng tay, hoặc lắc trên máy lắc ủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong tủ ấm.
Sau 24 giờ, dùng giống từ 2 ống nghiệm này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo trong nội dung nghiên cứu.
2.5.2. Phương Pháp đánh giá khả năng cố định nitơ và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn
2.5.2.1. Đánh giá khả năng cố định nitơ của vi khuẩn
Nghiên cứu xác định nhanh amoni trong nước sử dụng phương pháp Nessler [13]
Nguyên tắc của phương pháp:
Khi thuốc thử Nessler (K2HgI4) trong môi trường kiềm được thêm vào một dung dịch muối amoni loãng, thì amoni sẽ nhanh chóng phản ứng với thuốc thử, tạo phức có màu vàng đến nâu sẫm phụ thuộc vào nồng độ amoni có trong mẫu. Màu tạo ra giữa thuốc thử Nessler và amoni có cực đại hấp thụ quang ở bước sóng 420 - 500 nm tùy thuộc vào nồng độ amoni trong mẫu. Đây là phương pháp khá nhạy, có thể xác định được lượng amoni (tính theo N) từ 0,02 mg/l đến 5,00 mg/l. Các yếu tố ảnh hưởng có thể loại trừ bằng cách kết tủa với kẽm hydroxit hoặc chưng cất trước khi nessler hóa.
Thuốc thử Nessler được sử dụng để xác định amoni trong dung dịch amoni rất loãng và trong nước tự nhiên. Phương pháp cũng được ứng dụng để xác định nitrat và nitrit bằng cách khử chúng trong môi trường kiềm có hợp kim Devarda làm xúc tác tới amoniac; thu các nitrat và nitrit đã bị khử về dạng NH3 bằng cách chưng cất. Quy trình này được ứng dụng với nồng độ amoni <0,1 mg/l.
Hoá chất, thuốc thử và cách pha chế Nước cất không amoni
Nước cất không amoni có thể chuẩn bị bằng cách: cho nước đã cất qua cột trao đổi ion chứa nhựa trao đổi ion hỗn hợp Amberlite MB-1. Hoặc có thể sử dụng thẳng nước cất 2 lần vừa mới sản xuất.
Sau đó, nước đã loại amoni được dự trữ trong bình thủy tinh trung tính có nút đậy kín khí. Sử dụng nước cất không amoni cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.
Dung dịch amoni (N-NH4+) chuẩn
- Dung dịch gốc chứa 0,1 g N-NH4/L: cân 0,3819 g NH4Cl tinh khiết hoá học (đã sấy khô ở 105oC trong 2h) cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất không amoni đến vạch mức. Dung dịch này có nồng độ N-NH4+ = 1g/L.
- Các dung dịch chuẩn có nồng độ amoni thấp hơn được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc trước khi sử dụng bằng nước cất không amoni.
Dung dịch Segnet 30%: cân 50 g KNaC6H4O6 hoà tan sau đó định mức tới 100 ml bằng nước cất không amoni.
Thuốc thử Nessler
- Nessler A: hòa tan một lượng cân chính xác 7,0 g KI và 10,0 g HgI2 trong khoảng 50 ml nước cất không amoni, rồi định mức thành 100 ml.
- Nessler B: cân chính xác 16g NaOH sau đó hoà tan và định mức thành 50 ml bằng nước cất không amoni.
Thuốc thử Nessler gồm 100ml Nessler A với 50ml Nessler B; trộn hai thể tích với nhau, lắc đều, để lắng một ngày trong chỗ tối, sau đó lọc lấy phần nước trong bằng giấy lọc hoặc gạn lấy dung dịch khỏi phần cặn lắng. Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu nâu có nút nhám và nên để trong bóng tối.
Phương pháp tiêu chuẩn (theo APHA, tái bản lần thứ 18, 1992)
Đường chuẩn cho xác định ion amoni được xây dựng như sau: chuẩn bị 1 loạt ống Nessler (hoặc bình định mức) 50 ml thêm lần lượt 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 7,0; 8,0;
9,0 và 10,0 ml dung dịch NH4Cl tiêu chuẩn (nồng độ 50 mg NH3/L). Thêm 1 ml dung dịch Segnet, lắc đều; thêm tiếp 2 ml dung dịch thuốc thử Nessler vào mỗi ống và điền nước đến 50 ml, lắc đều. Để yên 10 phút rồi so màu trên máy trắc quang ở bước sóng 420 nm.
Tiến hành xác định amoni trong các mẫu thực tế như sau: cho vào bình nón (dung tích 250 ml) 100 ml dung dịch mẫu nghiên cứu, thêm 1 ml ZnSO4 10%, lắc đều. Điều chỉnh pH đến 10,5 bằng dung dịch NaOH 6N. Để lắng vài phút rồi lọc lấy phần dung dịch. Tiếp đó lấy vào bình định mức 50 ml một lượng dung dịch đã lọc có hàm lượng NH4+ trong khoảng từ 0,02 - 5,00 mg NH3 - N/L (nếu hàm lượng cao hơn thì có thể pha loãng để có dung dịch nồng độ phù hợp). Loại bỏ các ion cản trở bằng cách thêm 1 ml dung dịch EDTA vào và khuấy đều dung dịch hay dùng 1 ml dung dịch Segnet
để che các ion ảnh hưởng đến phép phân tích và thuốc thử Nessler. Thêm 2 ml dung dịch thuốc thử Nessler vào mẫu, lắc đều. Để yên 10 phút rồi so màu ở bước sóng 400- 425 nm (nếu dùng cuvet có bề dày 1cm thì có thể phân tích được amoni theo nitơ đến 0,4-5,0 mg/L). Nếu nồng độ nitơ amoni đến 10 mg/L có thể xác định bằng phương pháp này đo ở bước sóng 525 nm.
Do màu của dung dịch dịch chuyển từ vàng sang nâu đỏ; cho nên phương pháp Nessler được khuyến cáo sử dụng hai vùng bước sóng để đo độ hấp thụ quang để nâng cao độ chính xác (400 - 425 nm cho khoảng nồng độ 0,2 - 5 mg/L và 450 - 500 nm cho khoảng nồng độ 5 - 10 mg/L).
2.5.2.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn (TCVN 10784:2015) Để xác định hàm lượng IAA sinh ra bởi các chủng vi khuẩn thu thập được tiến hành dựng đường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA.
Thực hiện nuôi cấy các chủng cố định đạm cao trên môi trường thuận lợi nhất chọn ra từ thí nghiệm trên. Chuẩn bị môi trường lỏng trong các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm khoảng 10ml dịch môi trường, hấp khử trùng, để nguội. Tiến hành cấy các chủng được tuyển chọn vào các ống nghiệm chứa môi trường đã khử trùng. Nuôi ở nhiệt độ 37oC, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút. Sau 4 ngày thu dịch nuôi cấy và ly tâm 5500 vòng/phút lấy dịch trong để đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA.
Nguyên tắc
a. Nguyên tắc định tính
Vi sinh vật dùng để xác định khả năng sinh tổng hợp axit 3-indol-axetic (IAA) là vi sinh vật thuần.
IAA được sinh tổng hợp trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật tiết ra môi trường bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc. Khi có mặt của thuốc thử Salkowski, dưới tác dụng của tia UV, sẽ xuất hiện vòng màu đỏ bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạc.
b. Nguyên tắc định lượng
Lượng IAA trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski.
Thuốc thử, dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy
Hóa chất sử dụng để pha các chất chuẩn đạt loại tinh khiết hóa học, hóa chất sử dụng để phân tích đạt loại tinh khiết phân tích.
a. Nước cất, đáp ứng các yêu cầu nước loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).
b. Thuốc thử Salkowski Thành phần:
Bảng 2.3. Thành phần thuốc thử Salkowski
Sắt (III) clorua (FeCI3) 0,5 M 15 ml
Axit sunfuric (H2SO4) 98% 300 ml
Nước cất 500 ml
Cách chuẩn bị:
Đổ từ từ 300 ml dung dịch axit sunfuric 98% vào 500 ml nước cất (không đổ ngược lại). Sau đó dùng pipet hút 15 ml dung dịch sắt (III) clorua 0,5 M bổ sung vào dung dịch trên. Bảo quản trong chai có màu sẫm và đặt trong tối.
Dung dịch chuẩn IAA
a. Dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock)
Sử dụng axit 3-indol-axetic (IAA) có độ tinh khiết ≥99%, độ ẩm <0,1%.
Cân 10 mg IAA, cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều. Dung dịch thu được là dung dịch chuẩn gốc IAA gốc (IAA stock), cú nồng độ 1000 àg/ml.
b. Dung dịch chuẩn làm việc IAA
Chuẩn bị 10 bình định mức dung tích 10 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Dùng pipet lần lượt hỳt dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock), cú nồng độ 1000 àg/ml vào các bình định mức theo thể tích ghi trong bảng 2.4. Thêm nước cất đến vạch định mức, trộn đều.
Bảng 2.4. Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc IAA
STT
Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc IAA
(àg/ml)
Thể tích dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock) 1000 àg/ml (ml) cho vào mỗi bỡnh
định mức dung tích 10 ml
1 00,0 0,0
2 10,0 0,1
3 20,0 0,2
4 30,0 0,3
5 40,0 0,4
6 50,0 0,5
7 60,0 0,6
8 70,0 0,7
9 80,0 0,8
10 90,0 0,9
c. Thang chuẩn IAA
Chuẩn bị 10 bình định mức dung tích 10 ml, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc IAA có các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 pg/ml cho vào các bình định mức. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn đến vạch định mức, trộn đều.
Chú thích: Tùy theo hàm lượng IAA do vi sinh vật tổng hợp được, có thể pha dung dịch chuẩn làm việc và thang chuẩn có nồng độ IAA thấp hơn hoặc cao hơn.
d. Đường chuẩn IAA
Đo thang chuẩn IAA trên máy quang phổ, ở bước sóng 530 nm, hiệu chỉnh máy sao cho đường chuẩn có dạng y=ax + b (với R2 lớn hơn 0,95);
Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biểu diễn tương quan giữa số đo trên máy và nồng độ dung dịch chuẩn IAA.
e. Mẫu thử
Dùng một pipet vô trùng lấy 1 ml dung dịch mẫu ban đầu cho vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường dịch thể Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn. Nuôi lắc ở tốc độ 150 r/min, trong tối hoàn toàn, thời gian từ 3 ngày đến 5 ngày, nhiệt độ từ 28 °C đến 30
°C; đảm bảo mật độ tế bào vi sinh vật không nhỏ hơn 108 CFU/ml (dung dịch mẫu thử). Mỗi mẫu được cấy lặp lại không ít hơn 2 lần;
Ly tâm không ít hơn 3 ml dung dịch mẫu thử bằng máy ly tâm với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min. Lấy 2 ml phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn đến vạch định mức, trộn đều;
Giữ yên trong thời gian 25 min. Xác định hàm lượng IAA trong mẫu thử bằng máy quang phổ ở bước sóng 530 nm.
f. Mẫu trắng
Ly tâm không ít hơn 3 ml môi trường dịch thể Luria Bertani đã chuẩn bị sẵn bằng máy ly tâm với tốc độ 6000 r/min, trong thời gian 10 min;
Lấy 2 ml phần dung dịch trên bề mặt (phần nước trong) cho vào bình định mức dung tích 10 ml. Thêm thuốc thử Salkowski đã chuẩn bị sẵn đến vạch định mức, trộn đều;
Giữ yên trong thời gian 25 min. Xác định hàm lượng IAA trong mẫu trắng bằng máy quang phổ ở bước sóng 530 nm.
Chú thích: Tiến hành đo dung dịch mẫu thử và mẫu trắng đồng nhất với điều kiện đo dung dịch chuẩn. Sau khi đo khoảng 10 mẫu phải kiểm tra lại thang chuẩn. Nếu sai lệch phải hiệu chỉnh máy, lặp lại đường chuẩn và đo lại mẫu.
g. Tính và biểu thị kết quả
Hàm lượng IAA do vi sinh vật sinh tổng hợp được tính theo công thức:
M = a - ao Trong đó:
M Hàm lượng IAA do vi sinh vật sinh tổng hợp, tính bằng microgam/mililít (àg/ml);
a Hàm lượng IAA sinh tổng hợp được trong 1 ml mẫu thử, tính bằng microgam/mililớt (àg/ml);
ao Hàm lượng IAA sinh tổng hợp được trong 1 ml mẫu trắng, tính bằng microgam/mililớt (àg/ml).
2.5.3. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hoạt hóa và nhân sinh khối các chủng tuyển chọn trên môi trường Ashby lỏng, nuôi lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ khác nhau (28oC - 42oC (bước nhảy 2oC)) trong 7 ngày. Xác định mật độ tế bào ở các thời điểm nuôi cấy sau 1, 2, 3, ... ngày bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 610 nm từ đó xác định được nhiệt độ phù hợp cho sự sinh trưởng của các chủng tuyển chọn. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.5.4. Đánh giá ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hoạt hóa và nhân sinh khối các chủng tuyển chọn trên môi trường Ashby lỏng, nuôi lắc 150 vòng/phút ở mức nhiệt độ phù hợp đã khảo sát ở phương pháp 3.4.4, pH được thiết kế ở các mức nhau dao động từ pH 4 đến pH 9 (bước nhảy 0,5) trong 7 ngày.
Xác định mật độ tế bào ở các thời điểm nuôi cấy sau 1, 2, 3...ngày bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 610 nm từ đó xác định được pH phù hợp cho sự sinh trưởng của các chủng tuyển chọn. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.5.5. Phương pháp giải trình tự 16S RNA
Định danh phân tử và xây dựng sơ đồ phả hệ: DNA tổng số của chủng tuyển chọn được tách chiết theo phương pháp của Sambrook & Russell (2001). Trình tự gen 16SrRNA được khuếch đại sử dụng cặp mồi 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG và 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT (Lane, 1991) và được đọc trình tự thông qua hệ thống Applied Biosystems 3730 xl DNA analyzer sử dụng Big Dye terminator cycle sequencing kit v.3.1 (Macrogen, Hàn Quốc). Sử dụng dữ liệu công bố trên EzTaxon để nhận diện chủng phân lập (Chun & cs., 2007). Đồng thời, vị trí phân loại của chủng phân lập được xây dựng bằng phần mềm MEGA 7 (Kumar & cs., 2016).