Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh đến loài chủng vi khuẩn tuyển chọn
3.3.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý của chủng tuyển chọn
Để xác định đặc điểm sinh trưởng của chủng tuyển chọn trên môi trường cho trước (Ashby) cần thiết phải có 1 đường chuẩn – là mối quan hệ tuyến tính giữa mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy với độ hấp thụ tia UV với cùng bước sóng. Đường chuẩn và hàm số tuyến tính phụ thuộc giữa mật độ tế bào vi khuẩn với độ hấp thu tia UV của chủng MN26 trên môi trường Ashby được thể hiện tại hình 3.3.
Mật độ tê bào (CFU/ml)
Độ hấp thụ tia UV
0 0,0
32000 0,001 280000 0,003 2500000 0,012 29000000 0,063 280000000 0,408
Hình 3.3. Đường chuẩn tuyến tuyến giữa mật độ tế bào trong dung dịch và độ hấp thụ tia UV của chủng MN26
y = 1E-09x + 0.0063 R² = 0.9976
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
0 100000000 200000000 300000000
Mậtđộ tế báo (CFU/ml)
Độhấp thụ tia UV
Kết quả xây dựng đường chuẩn trên hình 3.3 cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính được xây dựng bởi đồ thị và hàm số phụ thuộc giữa mật độ tế bào trong môi trường Ashby với độ hấp thụ tia UV của chủng MN26 có độ tin cậy cao, với giá trị R2 = 0,9976.
Việc xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng MN26 được thực hiện theo thời gian nuôi trên môi trường Ashby. Cấy chuyển dịch nuôi vi khuẩn đã hoạt hóa sang các bình tam giác 100ml chứa môi trường lỏng Ashby. Mỗi bình tam giác được cấy chuyển 1 ml dịch huyền phù. Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút ở 30oC. Xác định mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy sau 1 ngày. 2 ngày. 3 ngày.
…8 ngày bằng phương pháp đo giá trị OD ở bước sóng 610 nm. Dựa vào hàm tương quan giữa độ hấp thụ tia UV và mật độ tế bào sẽ xác định được mật số tế bào tương ứng với mỗi giá trị OD tương ứng đo được theo các mốc thời gian.
Kết quả xây dựng đường cong tăng sinh cho chủng MN26 được thể hiện trên hình 3.4.
Thời gian nuôi (ngày)
Mật độ tế bào trong dịch nuôi (CFU/ml)
0 700000
1 11700000
2 39700000
3 125700000
4 268700000
5 390700000
6 411700000
7 407700000
8 394700000
Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của chủng MN26
Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, quá trình sinh trưởng của một quần thể vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn (Tiềm phát Logarit Cân bằng động Suy vong). Kết quả nghiên cứu xây dựng đường cong sinh trưởng cho chủng MN26 phù hợp với quy luật trên. Căn cứ vào đồ thị hình 4, có thể chia mốc thời gian
0 50000000 100000000 150000000 200000000 250000000 300000000 350000000 400000000 450000000
0 2 4 6 8 10
Thời gian nuôi (Ngày)
Mậtđộ tế báo (CFU/ml)
về động thái sinh trưởng chủng MN26 như sau: giai đoạn tiềm phát vào hai ngày đầu sau khi cấy, giai đoạn Logarit sau ngày thứ 2 đến ngày thứ 5, giai đoạn cân bằng động vào sau ngày thứ 5 đên ngày thứ 7, và giai đoạn suy vong sau ngày thứ 7 nuôi cấy. Căn cứ vào số liệu thực tế đo được về độ hấp thu tia UV kết hợp với đường chuẩn tuyền tính giữa mật độ tế bào và độ hấp thụ tia UV cho thấy sau 6 ngày nuôi cấy giá trị mật độ tế bào đạt tối đa ở mức 4,117x108 CFU/ml.
Như vậy so với thời điểm 0 giờ (ngay sau khi cấy) mật độ tế bào sau 6 ngày nuôi đã tăng lên khoảng 588 lần.
3.3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng MN26
Hoạt hóa và nhân sinh khối các chủng đã sàng lọc trên môi trường Ashby lỏng. nuôi lắc 150 vòng/phút ở các mức nhiệt độ khác nhau (28oC - 42oC (bước nhảy 2oC)) trong 6 nuôi cấy. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 610 nm. từ đó xác định được nhiệt độ phù hợp cho sự sinh trưởng của chủng. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến chủng MN26 vi khuẩn được thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của các chủng MN26 với đối chứng là MN106
Ký hiệu chủng
Mật độ tế bào (x 108 CFU/ml) sau 6 ngày nuôi tại nhiệt độ khảo sát tương ứng
26oC 28oC 30oC 32oC 34oC 36oC 38oC 40oC 42oC MN26 3,656 4,121 3,907 3,757 3,087 2,367 0,607 0,07 - MN106 2,891 3,684 3,658 3,642 3,012 2,151 0,445 - - Kết quả bảng 5 cho thấy, nhiệt độ nuôi có ảnh hưởng khá rõ rệt đến sự sinh trưởng của chủng MN26. Dải nhiệt độ thích hợp cho chủng MN26 phát triển từ 28 – 32oC. Khi nuôi ở nhiệt độ từ 34oC trở lên thì khả năng tích lũy sinh khối của chủng đều có xu hướng giảm. Và ở nhiệt độ 42oC không thấy có sự phát triển của chủng. Trong dải nhiệt độ thích hợp (28-32oC) có thể chọn ra điểm
nhiệt độ tối thích cho nuôi chủng MN26 là 28oC, tại nhiệt độ này sinh khối chủng có khả năng tích lũy đến 4,121 x 108 CFU/ml. Như vậy với chủng MN26 nhiệt độ nuôi thích hợp được chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo là 28oC.
3.3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của các chủng MN26
Hoạt hóa và nhân sinh khối 12 chủng đã qua sàng lọc trong môi trường Ashby lỏng, nuôi lắc 150 vòng/phút ở mức nhiệt độ thích hợp 28oC, pH được thiết kế ở các mức dao động từ pH 4 đến pH 9 (bước nhảy 0.5). pH của môi trường được điều chỉnh bằng dung dịch đệm Na2HPO4 và KH2PO4 (Lê Như Kiểu và cs. 2012) [21], nuôi trong 6 ngày. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 610nm, từ đó xác định được pH phù hợp cho sự sinh trưởng của từng chủng, chi tiết được thể hiện trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng đã sàng lọc pH của môi
trường Mật độ tế bào x 108 (CFU/ml) của các chủng
MN26 sau 6 ngày nuôi
Mật độ tế bào x 108 (CFU/ml) của các
chủng đối chứng MN106 sau 6 ngày nuôi
4,0 - -
4,5 0,047 0,042
5,0 0,887 0,725
5,5 2,587 1,889
6,0 3,987 3,126
6,5 4,257 3,665
7,0 3,907 3,667
7,5 3,497 3,256
8,0 0,957 1,132
8,5 0,167 0,115
9,0 0,007
Kết quả bảng 3.6 cho thấy: Trong dải khảo sát từ 4,0 đến 9,0 pH có ảnh
hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của các chủng sàng lọc. Với mức pH cao nhất (9,0) và thấp nhất (4,0), chủng MN26 sinh trưởng yếu hoặc không sinh trưởng.
Trong khoảng từ 6,0 đến 7,0 vi khuẩn phát triển tốt khi nuôi với cùng môi trường và điều kiện nhiệt độ thích hợp. Trong đó, tại pH = 6,5 chủng MN26 cho tỷ lệ tích lũy sinh khối nhiều nhất, đạt 4,257 x 108 CFU/ml. Như vậy điều kiện nhiệt độ và pH môi trường ban đầu để nuôi cấy thích hợp cho chủng MN26 lần lượt là 28oC và 6,5.