(Luận văn) nghiên cứu phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn methylobacterium sp từ lá dương xỉ (marattiaceae)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG lu ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU an n va p ie gh tn to w NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN d oa nl MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM ll u nf va an lu SP TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE) oi m z at nh z m co l gm @ Đà Nẵng – Năm 2018 an Lu n va ac th si ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG lu ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU an n va p ie gh tn to w NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN d oa nl MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM ll u nf va an lu SP TỪ LÁ DƯƠNG XỈ (MARATTIACEAE) oi m z at nh Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Cán hướng dẫn : TS PHẠM THỊ MỸ z m co l gm @ an Lu Đà Nẵng – Năm 2018 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng năm 2018 Tác giả luận văn lu an ĐẶNG THỊ MỸ TRIỀU n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô TS Phạm Thị Mỹ người trực tiếp truyền đạt kinh nghiệm quý báu động viên tơi suốt q trình thực khóa luận Xin cảm ơn thầy ThS Vũ Đức Hoàng nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em năm học lu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln giúp đỡ động an viên em suốt thời gian làm khóa luận va n Xin chân thành cảm ơn! to p ie gh tn Sinh viên thực d oa nl w Đặng Thị Mỹ Triều ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỤC LỤC lu an n va p ie gh tn to DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài .2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METHYLOBACTERIUM SP 1.1.1 Lịch sử phát phân loại VK Methylobacterium sp 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí 1.1.4 Phương pháp phân lập định danh 1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium .6 1.1.6 Một số ứng dụng chi Methylobacterium 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 10 1.2.1 Một số nghiên cứu giới .10 1.2.2 Một số nghiên cứu nước .12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu .15 2.1.3 Nội dung nghiên cứu .15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16 2.2.2 Phương pháp thu mẫu 17 2.2.3 Phương pháp phân lập 17 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào test sinh hóa chủng VK tuyển chọn 18 2.2.5 Phương pháp định danh chủng VK kỹ thuật sinh học phân tử 20 2.2.6 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng VK tuyển chọn 22 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si lu an n va p ie gh tn to 2.2.7 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng chủng VK tuyển chọn .23 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu .24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 25 3.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ MẪU LÁ DƯƠNG XỈ 25 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO VÀ CÁC TEST SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VK ĐƯỢC TUYỂN CHỌN .27 3.3 ĐỊNH DANH CHỦNG VK T6, T12 BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 32 3.3.1 Tách chiết khuếch đại gen 32 3.3.2 Giải trình tự đoạn gen 16S – rRNA định danh loài 33 3.4 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VK T6 VÀ T12 .36 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ methanol 36 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ 37 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH 38 3.5 NGHIÊN CỨU ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VK T6 VÀ T12 .38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide CMS: Môi trường MS bổ sung Caseine Hydrolase CFU: Colony Forming Unit IAA: Indole-3-acetic acid MMS: Methanol minerat salts NCBI National Center for Biotechnology Information PCR: Polymerase Chain Reaction PHB: Poly-β-hydroxybutyrate lu PPFM: Pinkpigmented facultatively methylotrophic an Phịng thí nghiệm VK: Vi khuẩn UV: Ultraviolet VSV: Vi sinh vật n va PTN p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC BẢNG BIỂU Kí hiệu bảng Tên bảng Trang Danh mục loài Methylobacterium sp 1.1 đặt tên (Lựa chọn dựa công bố tạp chí ngân hàng NCBI) Trình tự cặp mồi sử dụng để khuếch đại vùng 2.1 22 gen 16S rRNA 3.1 Hình thái khuẩn lạc 32 chủng VK phân lập 3.2 Tổng hợp đặc tính sinh hóa chủng VK 25,26 31 lu (T6, T12) an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Trang 2.1 Lá dương xỉ 15 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16 2.3 Phương pháp test Gram (–)/(+) nhanh với KOH 18 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng khuếch đại PCR 22 3.1 Hình thái khuẩn lạc 34 chủng VK phân lập từ mẫu dương xỉ 25 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng VK có sắc tố hồng 27 3.3 Tế bào kính hiển vi 15 chủng VK (T1, T2, T4, T5, T6, T7, T8, T10, T12, T13, T16, T18, T25, T27, T31) 29 3.4 Thử nghiệm catalase chủng VK T6, T12 30 3.5 Test Urease chủng VK T6, T12 31 3.6 Sinh khối chủng VK T6, T12 32 3.7 Sản phẩm PCR chủng VK T6, T12 33 Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng VK T6 34 an Tên hình ảnh p lu Số hiệu n va ie gh tn to 3.8 Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng VK T12 Ảnh hưởng nồng độ methanol lên sinh trưởng 36 chủng VK T6 T12 an lu 3.10 35 d oa nl w 3.9 37 ll u nf 38 oi m 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng VK T6 T12 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng VK T6 T12 Đường cong sinh trưởng chủng VK T6 T12 sau 120h nuôi cấy va 3.11 z at nh 3.13 39 z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Chi Methylobacterium bao gồm nhiều lồi vi khuẩn (VK) có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) Chúng cư ngụ chủ yếu vùng lá, tìm thấy đất nước Chúng sử dụng methanol từ thực vật làm nguồn carbon chủ yếu đồng thời sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật (auxin, cytokinin, salicylic acid), vitamine (B12) enzyme (urease, ACC deaminase) để tác động ngược trở lại thực vật, nhóm VK có ích nên chúng sử dụng để tăng suất lúa [35], kích thích lu sinh trưởng mía, bơng vải hay gia tăng tính kháng bệnh đậu phộng [9], [23], an [36] va n Bên cạnh đó, Methylobacterium sp có khả sử dụng đa dạng hợp chất tn to hữu khác nhau, từ chất không độc chất độc sinh vật hay ie gh chất gây ô nhiễm môi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane, p trinitrotoluent, Hg, Ni, Cd ) chúng có nhiều tiềm để ứng dụng xử nl w lý ô nhiễm môi trường [46] M radiotolerans, M extorquens, M fujisawaense cịn oa có khả kháng mạnh với chất phóng xạ, chúng tồn liều chiếu xạ d 20kGy Vì thế, nhóm VK sử dụng làm vi sinh vật thị cho khả vô lu va an trùng vật dụng dùng ngành công nghiệp thực phẩm, y tế xử lý vô u nf trùng công nghệ chiếu xạ [45] ll Do sử dụng hợp chất carbon làm nguồn lượng nên VK m oi Methylobacterium sp VK kiểu mẫu đầy tiềm việc sử dụng z at nh nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất sản phẩm có giá trị chẳng hạn như: βcarotene, vitamine B12, Q10, amino acid…[23], [46] Ngày nay, nhiều cơng trình z @ tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu l gm protein ngoại lai tế bào vi khuẩn Methylobacterium sp., hai cơng trình bật hướng nghiên cứu biểu bacteriocin tinh thể độc tố m co diệt sâu [23] an Lu Đặc biệt, hướng tiếp cận nhiều nhà khoa học giới quan tâm hướng sử dụng protein đơn bào từ vi sinh vật làm nguồn n va ac th si 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục [2] Bùi Văn Lệ, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Vũ Hồng Liên (1999), Giáo trình thực tập sinh hóa, ngành cơng nghệ sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM, 67tr [3] Lê Duy Linh, Trần Thị Hường,Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng (2001), Thực tập vi sinh sở, NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh lu [4] - Nguyễn Hồng Lộc (2007), Giáo trình Nhập mơn cơng nghệ sinh học, NXB Đại an Học Huế va n [5] Nguyễn Đức Lượng (2002), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2, Thí nghiệm vi tn to sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr – 67, 260 -291, 445 ie gh [6] Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, Biện Anh Tuấn (2006), Khảo sát hệ VK p Methylobacterium sp lúa ( Oryza sativa L.) Việt Nam Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, ISSN 2566-5320, 3:34-50 w oa nl [7] Kiều Phương Nam, Trần Minh Tuấn, Đỗ Thị Duy Thiện, Biện Anh Tuấn , Bùi d Văn Lệ (2010) , Định danh chủng VK phân lập vùng Đông Nam Bộ lu va an kĩ thuật rDNA 16S xác định quan hệ di truyền chúng chi Methylobacterium Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, ISSN 0866- ll u nf 7020, 3:44-49 oi m [8] Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, Đỗ Thị Duy Thiện, Lê Thị Thùy Dương, Trần z at nh Thị Trinh (2010), Sinh tổng hợp giberelin (gibbrellin) VK Methylobacterium sp Tạp chí nơng thơn phát triển nơng thơn, ISSN 0866-7020, 5:51-54 z [9] Kiều Phương Nam, Bùi Văn Lệ, Đỗ Thị Duy Thiện, Hồ Lê Trung Hiếu (2010), @ l gm Khả ứng dụng VK Methylobacterium sp việc gia tăng tỉ lệ nảy mầm hạt giống trồng, Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, tập 13, số m co T3-2010, tr.49-57 an Lu [10] Kiều Phương Nam, Nguyễn Tấn Trung, Trần Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Việt, Trần Thị Thúy, Bùi Văn Lệ (2010), Nghiên cứu điều kiện lên men thúc đẩy n va ac th si 42 tích lũy PHB chủng Methylobacterium radiotolerans H2T, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1551-1556 [11] - Phạm Thị Kim Ngọc (2014), Ứng dụng phương pháp vi sinh, hóa sinh giải trình tự vùng gen 16S – rRNA để định danh VK Lactic có khả sinh Protease q trình lên men mắm mực, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, số 6S: 703-708 [12] Lê Xuân Phương (2008), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [13] TCVN 8551:2010 - Tiêu chuẩn Việt Nam trồng – phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu lu an [14] Lê Lý Thùy Trâm, Kiều Nam Phương, Bùi Văn Lệ (2006), Thu nhận poly-β va hydroxybutyrate- loại nhựa sinh học dễ phân hủy từ VK methylobacterium n gh tn to sp phân lập Việt Nam, Tạp chí KH CN Đại học Đà Nẵng, số 1(13), Tr 47-52 p ie [15] Khuất Bửu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa w học kỹ thuật oa nl TÀI LIỆU TIẾNG ANH d [16] Ackermann J.U., muller s., Losche A., Bley T., Babel W.(1995), an lu “Methylobacterium rhodesianum cells tend to double the DNA content under pp 9-20 ll u nf va growth limitations and accumulate PHB” Journal of Biotechnology, Vol.39, oi m [17] Araujo w L., Maccheroni w Jr., Aguilar-Vildoso c L, Barroso p A V., z at nh Saridakis H o., Azevedo J L (2001), “Variability and interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks”, z Canadian Journal of Microbiology, Vol 47, pp 229-236 @ gm [18] Araujo w L., Marcon J., Maccheroni w Jr., Van Elsas J D., Van Vuurde J w l L., Azevedo J L (2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and m co their interaction with Xyllella fastidiosa in citrus plants”, Applied and an Lu Enviromental Microbiology, Vol 68, No 10, pp 4906-4914 n va ac th si 43 [19] Bergey D.H.; Noel R.K.; John G.H (1989), Bergey’s manual of sytematic bacteriology, Publisher: Baltimore, MD: Williams & Wilins [20] Bousfied, I J Green, P N (1985), “Eclassification of Bacteria of the Genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the Genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson) Emend Green and Bousfield 1983”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 35, pp 209 [21] Doronina N V., Trotsenko Y A., Kuzentsov B B., Tourova T p., SalkinojaSalonen M s (2002b), “Methylobacterium suomiense spp nov and Methylobacterium lusitanum spp nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary lu an Microbiology, Vol 52, pp 773-776 va [22] Feinberg L.A, Burr G, Tlusty M, Rhyne A, Szczebak JT, Bourque B, Bowen n protein as an alternative protein source in aquaculture feed”, eCollection 2017, pp 7710- 7717 p ie gh tn to JL, Marx CJ (2017), “Multidisciplinary approach to validating a single-cell w [23] Green P N (1992) “The Genus Methylobacterium”, In Balows A., Troper H oa nl G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K H (ed.) The Prokaryote, 2nd ed., d Springer-Verlag, Berlin, pp 2342-2345 an lu [24] Gallego V., Garcisa T M.Ventosa A (2005a), “Methylobacterium hispanicum u nf va spp and Methylobacterium aquaticum spp nov., isolated from drinking water”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp ll oi m 281-287 z at nh [25] Gawel N J., Jarret R L (1991), “A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea”, Plant Molecular Biology Reporter 9, pp.262-266 z [26] Holland M A., Polacco J C (1994) “PPFMs and other coveư contaminants: is @ gm there more to plant physiology than just plant?”, Plant Physiology, Vol 45, pp l 197-209 “Phenotypic and genetic diversity of chrorine-resistant an Lu K (1995), m co [27] Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K A., Fukuyama M., Tabuchi n va ac th si 44 Methylobacterium strains isolated from various environment”, Applied and Enviromental Microbiobiology, Vol 61, No 6, pp 2099-2107 [28] Homschuh M., Grotha R., Kutschera u (2002), “Epiphytic bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica: effects of Methylobacterium strains on protonema development”, Plant biol (Stuttg) Vol.4, pp 682-687 [29] Kang Y s., Kim J.7 Shin H D., Nam Y D., Bae J w., Jeon c o., Park w (2007), “Methylobacterium platani spp nov., isolated from a leaf of the tree Platanus orientalis”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 57, pp 2849-2853 [30] Koenig R L., Morris R O., Polacco J C (2002) “tRNA is the source of low- lu an level trans-zeatin production in Methylobacterium sp”, Journal of bacteriology, va Vol 184, No 7, pp 1832-1842 n Hydroxybutyrate biosynthesis and growth on Cl and C2 compounds in the methylotrop Methylobacterium extorquens AMi”, Journal of Bacteriology, Vol p ie gh tn to [31] Korotkova N., Lidstrom M E (2001), “Connection between Poly- w 183, No 3, pp 1038-1046 persicinum spp nov., d oa nl [32] Kato Y., Asahara M., Goto K., Kasai H., Yokota A (2008), “Methylobacterium Methylobacterium komagatae spp nov., lu an Methylobacterium brachiatum spp nov., Methylobacterium tardum spp nov u nf va and Methylobacterium gregans spp nov., isolated from freshwater”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 58, ll oi m pp 1134-1141 z at nh [33] Listrom M E., Crowth G J (2008) “Formate as the main branch point formethylotrophic metabolism in Methylobacterium extorquens AM1.”, Journal z of Bacteriology, Vol 184, No 7, pp 1832-1842 @ gm [34] Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung H., Yang J., l Sundaram S, SA T (2004) “Growth promotion and induction of systemic an Lu Bot Bull Acad Sin., Vol 45, pp 315-324 m co resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza satva L.) by Methylobacterỉum sp.” n va ac th si 45 [35] Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa, (2002), “ A new insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics ang growth promotion of cotton (Gossypium hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum ofticinarum L.)” Environmental and Experimental Maliti [36] C M (2000) “Physiological and biochemical effects of Methylobacterium sp Strains and foliar-applied methanol on growth and development of rice Oryza satival L”, Ph.D thesis, the city University of New York, USA [37] Mercan N., Aslime B., Yuksekdag Z.N., Beyatli Y (2002), “Production of PolyB-Hydroxybutyrate (PHB) by Some Rhizobium Bacteria” Turk Biol 26pp.215- lu an 219 n va [38] Mly M., Chen H (2004), “Effect of intensive insulin therapy on beta-cell diabetes: a multicentre randomised parallel-group trial”.MPMI Vol 12, No 9, pp 829-832 p ie gh tn to function and glycaemic control in patients with newly diagnosed type w [39] Omer Z S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B (2004a) “Indole-3-acetic oa nl acid production by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria”, Plant d Growth Regulation, Vol 43, pp 93-96 an lu [40] Omer Z S., Tombolini R., Gerhardson B (2004b) “Plant colonization by pink- u nf va pigmented facultative methylotrophic bacteria (PPFMS)”, FEMS Microbiology Ecology, Vol 47, pp 319-326 ll oi m [41] Patt T E., Cole G C., Hanson R S (1976), “Methylobacterium, a New Genus z at nh of Facultatively Methylotrophic Bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 26, pp 226- 229 z [42] Penalvera c G N., Morin D., Canteta F., Saurel o., Alain M., Vorholt J A @ gm (2006), “Methylobacterium extorquens AMi produces a novel type of acyl- l homoserine lactone with a double unsaturated side chain under methylotrophic m co growth conditions” FEBS Letters, Vol 580, pp 561-567 an Lu [43] Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., Arnheim N., (1985), "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and n va ac th si 46 restriction site analysis for diagnosis anemia" Science 230 (4732): pp.1350–1354 of sickle cell [44] Stepnowski p., Blotevogel K H., Jastor B (2004), “Extraction of carotenoid produced during methanol waste International biodegradation”, Biodeterioration & Biodegradation, Vol 53, pp 127 - 132 [45] Van Aken B., Peres C M., Doty S L., Yoon J M., Schnoor J L (2004a), “Methylobacterium populi sp nov., a novel aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 60, No 1, pp 308-317 [46] Van Aken B., Yoon J M., and Schnoor J L (2004b) “Biodegradation of notro- lu an substituted explosives 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5- n va triazine, and octahydro-1,3,4,5-tetranitro-1,3,4-tetrazocine by a deltoids_nigra DN34)” Applied and Environmental Microbiology, Vol 70, No 1, pp 508-517 p ie gh tn to phytossymbiotic Methylobacterium sp Associated with poplar tissues (Populus w [47] Verhoef R., De Waard p., Schols H A., Siika-aho M., Voragen A G J (2003), oa nl “Methylobacterium spp isolated from a finnis paper machine produces highly d pyruvated galactan exopolysaccharide”, Carbohydrate Research, Vol 338, pp an lu 1851-1859 u nf va [48] Weon H Y., Kim B Y., Joa J H., Son J A., Song M H., Kwon s w., Go s J., Yoon s H (2008), “Methylobacterium iners spp nov and Methylobacterium ll oi m aerolatum spp nov., isolated from air samples in Korea”, International Journal z at nh of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 58, pp 93-96 [49] Zhang L L., Chen J M., Fang F (2008), “Biodegradation of methyl t-butyl ether z by aerobic granules under a cosubstrate condition”, Appl Microbiol m co l gm @ Biotechnol, Vol 78, pp 543-550 an Lu n va ac th si 47 WEBSITE [50] https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ( 20/4/2018) [51] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi (20/2/2018) lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC  Thành phần môi trường CMS lu an n va p ie gh tn to 1900 mg/l 1650 mg/l 440 mg/l 170 mg/l 370 mg/l 27,85 mg/l 37,25 mg/l 0,025 mg/l 0,025 mg/l 6,2 mg/l 0,83 mg/l 22,3 mg/l 0,25 mg/l 8,6 mg/l 1mg/l 30g/l 1mg/l 100mg/l 2g/l 2g/l d oa nl w KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O KH2PO4 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O H3BO3 HI2 MnSO4 Na2MoO4.2H2O ZnSO4.7H2O Glycine Sucrose Vitamin B1 Meso inositol Cao thịt Casein hydrolyase pH va an lu u nf  Thành phần môi trường MRS ll oi m z at nh z gm @ 10g 8g 4g 20g 1ml 2g 5g 2g 0,2g 10g 1000ml 6,2±0,2 m co l an Lu Peptone Bột Lab-Lemco Bột chiết nấm men Glucose Sorbitan mono-oleate K2HPO4 Sodium acetate 3H2O Triammonium citrate MgSO4.7H2O Agar Nước cất pH cuối (25ºC) n va ac th si  Thành phần môi trường MMS lu K2HPO4 1,20 g KH2PO4 0,62 g CaCl2.6H2O 0,05 g MgSO4.7H2O 0,2 g NaCl 0,1 g FeCl3.6H2O 1,0 mg (NH4)2SO4 0,5 µg CuSO4.5H2O 5,0 µg MnSO4.5H2O 10,0 µg Na2MoO4.2H2O 10,0 µg H3BO3 10,0 µg ZnSO4.7H2O 70,0 µg CoCl2.6H2O 5,0 µg Nước cất vừa đủ 1000ml pH 7,0 Agar 20g [a] Methanol 10 ml [a] : bổ sung sau hấp 121oC 15 phút an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC  Kết giải trình tự chủng vi khuẩn T6 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si  Kết giải trình tự chủng T12 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ METHANOL ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG T6 VÀ T8 (Đơn vị: 106 CFU/ml) Chủng VK % Methanol 0.5 lu 12 3.76 3.27 5.9 6.42 1.5 4.75 5.37 3.8 4.49 2.5 2.98 3.59 1.89 3.07 3.5 1.42 2.45 0.79 1.8 4.5 0.51 0.77 0.19 0.33 an T6 n va p ie gh tn to nl w KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN d oa KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG T6 VÀ T8 an lu (Đơn vị: 106 CFU/ml) oi T6 T12 3.85 4.68 5.12 6.38 6.31 7.18 3.89 5.12 2.05 3.96 45 1.29 50 0.83 35 z 40 z at nh 30 m 25 ll 20 u nf va Chủng VK Nhiệt độ gm @ 3.09 1.33 m co l an Lu n va ac th si KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG T6 VÀ T8 (Đơn vị: 106 CFU/ml) Chủng VK T6 T12 0.68 4.5 1.3 2.27 2.1 3.67 5.5 3.3 4.6 4.6 6.33 6.5 6.67 7.08 5.46 6.41 7.5 4.33 5.87 3.37 4.73 8.5 2.41 3.3 1.12 2.3 9.5 0.83 1.1 10 0.3 0.49 pH lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG HAI CHỦNG T6 VÀ T12 (Đơn vị: 106 CFU/ml) Chủng VK T6 T12 0.3 0.38 0.42 0.72 1.28 1.79 2.1 2.35 2.76 3.51 4.16 4.36 4.75 5.46 5.89 6.31 6.29 6.24 6.23 6.2 6.17 5.9 5.73 4.33 4.1 3.9 2.75 2.26 1.46 0.4 0.52 0.58 0.61 0.89 1.5 1.9 2.6 3.2 3.9 4.6 5.8 7.3 7.29 7.3 7.26 7.18 6.88 6.72 6.57 6.32 6.03 5.73 5.46 5.09 4.78 4.31 4.06 3.97 3.41 Số lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100 104 108 112 116 120 an Lu n va ac th si lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si