Khảo sát ảnh hưởng của cách cắt mẫu rễ bất định lên sự hình thành và tăng trưởng của rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro ... Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hìn
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - tế NGUYỄN THỊ NHẬT LINH Lu ận án tiế n sĩ Ki nh NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ - Năm 2017 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - nh tế NGUYỄN THỊ NHẬT LINH Lu ận án tiế n sĩ Ki NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) VÀ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN SỰ TÍCH LŨY SAPONIN Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62.42.01.12 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Dương Tấn Nhựt GS TS Nguyễn Hoàng Lộc HUẾ - Năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án: “Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) khảo sát ảnh hưởng số elicitor lên tích lũy saponin” cơng trình nghiên cứu tơi trợ giúp cộng hướng dẫn GS.TS Dương Tấn Nhựt GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc Luận án hỗ trợ kinh phí điều kiện trang thiết bị từ đề tài phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo giống trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, với hỗ trợ Trung tâm Sâm Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế Các số liệu luận án tế phần kết đề tài thực Viện Nghiên nh cứu Khoa học Tây Nguyên Tôi xin cam đoan kết số liệu luận Ki án hoàn toàn trung thực chưa công bố hình thức Tơi Đà Lạt, ngày 07 tháng 09 năm 2017 Tác giả Lu ận án tiế n sĩ xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Nhà trường lời cam đoan Nguyễn Thị Nhật Linh ii LỜI CẢM ƠN Trong biển kiến thức bao la, thực tìm thuyền lớn để theo đuổi đam mê nghiên cứu khoa học Với vai trò đầu tàu, Thầy, GS.TS Dương Tấn Nhựt chèo lái, hướng dẫn giúp đỡ biết hệ sinh viên tiến đến với ước mơ gặt hái thành công sống đường nghiên cứu khoa học phục vụ cho phát triển nước nhà Cảm ơn Thầy ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngừng giúp đỡ để tơi hồn thành luận án Để hồn thành luận án này, tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc gợi ý dẫn hướng cho nghiên cứu, nhắc nhở để tơi hồn thành tốt chương trình học luận án nh tế Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất q Thầy, Cơ Khoa Sinh học phịng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế tạo điều kiện giúp đỡ năm học vừa qua án tiế n sĩ Ki Xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo cô chú, anh chị Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Trung tâm Sâm Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh cho tơi hội thực nghiên cứu Đặc biệt, tơi xin cảm ơn anh, chị Phịng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống Cây trồng trực tiếp hướng dẫn thời gian qua Tôi xin cảm ơn anh Nam, anh Luận, anh Huy, chị Hiền, chị Phượng, Tùng Chiến tận tình giúp đỡ tơi người thân gia đình Lu ận Thời gian gặp ngắn ngủi bạn sinh viên, học viên thực tập Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên Trường Đại học Khoa học – Đại học Huế cho ấn tượng sâu sắc lịng nhiệt tình với cơng việc bạn tạo cho nhiều niềm phấn khởi để thực tốt luận án Tôi xin cảm ơn giúp đỡ bạn thời gian qua Để hồn thành tốt luận án này, tơi xin gửi lời cảm ơn đến anh Thức, anh Hiếu, Kim Cương, Văn Cương Tâm sát cánh bên không ngừng hỗ trợ giúp đỡ tơi mặc cho khó khăn cách trở Dù có khó khăn hay thất bại đơi lúc nản lịng, gia đình ln điểm tựa vững giúp vượt qua khó khăn thử thách đời Con xin cảm ơn Bố, Mẹ, người Thầy đầu tiên, dìu dắt vào đời, cho dù khó nhọc đến đâu ln tạo cho điều kiện tốt để không thua với bạn bè trang lứa Con xin cảm ơn nhà luôn ủng hộ, động viên đỡ đần cho con! Đà Lạt, ngày 09 tháng 07 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Nhật Linh iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ xiii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ SÂM NGỌC LINH 1.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển tế 1.2 Đặc điểm hình thái sinh trưởng nh 1.3 Đặc điểm phân bố Ki 1.4 Đặc điểm đa dạng di truyền sĩ 1.5 Tác dụng dược lý n SƠ LƯỢC VỀ CÁC HỢP CHẤT SAPONIN tiế 2.1 Cấu trúc saponin có sâm Ngọc Linh án 2.2 Các tính chất hóa lý saponin sâm Ngọc Linh 10 2.3 Vai trò saponin 11 Lu ận 2.4 Con đường tổng hợp triterpene saponin 11 NUÔI CẤY IN VITRO SINH KHỐI RỄ BẤT ĐỊNH VÀ RỄ THỨ CẤP 13 3.1 Khái niệm rễ bất định 13 3.2 Khái niệm rễ thứ cấp 13 3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy rễ thứ cấp rễ bất định 14 3.3.1 Loại mẫu cấy 14 3.3.2 Vị trí phát sinh 15 3.3.3 Vai trò điều hòa auxin 17 3.3.4 Tương tác auxin cytokinin 19 3.3.5 Nhiệt độ 20 3.3.6 Ánh sáng 20 3.3.7 Giá thể nuôi cấy 20 iv 3.3.8 Các hệ thống nuôi cấy 21 3.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ loài sâm 22 3.4.1 Một số nghiên cứu giới 22 3.4.2 Một số nghiên cứu nước rễ bất định sâm Ngọc Linh 24 ELICITOR VÀ SỰ KÍCH KHÁNG TRONG NI CẤY IN VITRO 25 4.1 Khái niệm 25 4.2 Phân loại 25 4.3 Cơ chế tác động elicitor 27 1.1 Cách xử lý tác động elicitor 31 4.4.1 Nồng độ elicitor 31 tế 4.4.2 Thời gian tiếp xúc với elicitor 31 nh 4.4.3 Thời kỳ nuôi cấy 31 Ki 4.4.4 Thành phần dinh dưỡng 32 sĩ 1.2 Một số elicitor phổ biến nuôi cấy nhân sâm 32 n 4.5.1 Chitosan 32 tiế 4.5.2 Dịch chiết nấm men 33 án 4.5.3 Elicitor có nguồn gốc từ chất điều hòa sinh trưởng thực vật 33 1.3 Ứng dụng elicitor ni lồi nhân sâm in vitro 35 Lu ận CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 39 1.1 Nguồn mẫu 39 1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 39 1.3 Địa điểm thời gian thực luận án 40 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 40 2.1 Tối ưu cách chọn mẫu môi trường nuôi cấy rễ thứ cấp từ nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro 40 2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng cách cắt mẫu rễ bất định lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 40 2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng auxin lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 41 v 2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng việc kết hợp auxin cytokinin lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất định in vitro 42 2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 42 2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ NH4+/NO3- mơi trường MS lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất định in vitro 42 2.1.6 Khảo sát ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 43 tế 2.1.7 Khảo sát ảnh hưởng giá thể nuôi cấy lên hình thành tăng nh trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 43 Ki 2.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ bất định sâm Ngọc Linh để tăng cường hình sĩ thành rễ thứ cấp tích lũy saponin nuôi cấy in vitro 44 n 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ni cấy lên tăng sinh tích lũy tiế saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 44 án 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 44 Lu ận 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 44 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng giai đoạn nuôi cấy tối sáng lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 45 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thể tích ni cấy lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 45 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng hệ thống ni cấy lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 46 2.3 Tối ưu khả tích lũy saponin rễ thứ cấp hình thành từ rễ bất định sâm Ngọc Linh nhờ tác động elicitor 48 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng chitosan lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 48 vi 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 48 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng abscisic acid lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 49 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng salicylic acid lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 49 2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng jasmonic acid lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 50 2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng kết hợp elicitor ngoại sinh elicitor nội sinh lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh in vitro 50 tế 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng thời gian xử lý elicitor lên tăng sinh tích nh lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 51 Ki 2.4 Phương pháp xác định số tăng trưởng, tỷ lệ chất khô, tỷ lệ hình thành sĩ tăng sinh mẫu cấy 52 n 2.5 Môi trường nuôi cấy 52 tiế 2.6 Điều kiện nuôi cấy 52 án PHƯƠNG PHÁP SINH HĨA ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN 52 3.1 Phương pháp định tính sắc ký lớp mỏng 52 Lu ận 3.2 Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao 53 3.3 Phương pháp xác định suất tổng hợp saponin 55 PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT TẾ BÀO HỌC 55 PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 55 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 TỐI ƯU NUÔI CẤY RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH TỪ NHỮNG MẪU RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO 56 1.1 Tối ưu cách chọn mẫu môi trường nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh 56 1.1.1 Ảnh hưởng cách cắt mẫu rễ bất định lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 56 1.1.2 Ảnh hưởng auxin lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 59 vii 1.1.3 Ảnh hưởng việc kết hợp auxin với cytokinin lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 62 1.1.4 Ảnh hưởng môi trường khống lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 65 1.1.5 Ảnh hưởng tỷ lệ NH4+/NO3- môi trường MS lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 66 1.1.6 Ảnh hưởng loại đường carbohydrate lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 68 1.1.7 Ảnh hưởng giá thể ni cấy lên hình thành tăng trưởng rễ tế thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 70 nh 1.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy rễ thứ cấp từ rễ bất định sâm Ngọc Linh in vitro 71 Ki 1.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm sĩ Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 71 n 1.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh tiế từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 72 án 1.2.3 Ảnh hưởng pH môi trường lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 73 Lu ận 1.2.4 Ảnh hưởng giai đoạn nuôi cấy tối sáng lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 75 1.2.5 Ảnh hưởng thể tích mơi trường nuôi cấy lên tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 76 1.2.6 Ảnh hưởng hệ thống ni cấy lên hình thành tăng trưởng rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 78 TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY SAPONIN CỦA RỄ THỨ CẤP SÂM NGỌC LINH NUÔI CẤY TỪ RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO 80 2.1 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy lên tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy rễ bất định in vitro 80 2.1.1 Ảnh hưởng giai đoạn ni cấy lên tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất đinh in vitro 80 viii 2.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 81 2.1.3 Ảnh hưởng pH lên tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 82 2.1.4 Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy lên tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 83 2.2 Ảnh hưởng số elicitor lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 85 2.2.1 Ảnh hưởng chitosan lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 85 tế 2.2.2 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin nh rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 86 Ki 2.2.3 Ảnh hưởng abscisic acid lên tăng sinh tích lũy saponin rễ sĩ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 88 n 2.2.4 Ảnh hưởng salicylic acid lên tăng sinh tích lũy saponin rễ tiế thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 89 án 2.2.5 Ảnh hưởng jasmonic acid lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 91 Lu ận 2.2.6 So sánh tác động elicitor đơn lẻ lên sư tổng hợp saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh nuôi cấy từ rễ bất định in vitro 92 2.2.7 Ảnh hưởng việc kết hợp đồng thời salicylic acid dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh in vitro 95 2.2.8 Ảnh hưởng thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh in vitro 98 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 101 TỐI ƯU HĨA NI CẤY TẠO RỄ THỨ CẤP TỪ RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO SÂM NGỌC LINH 101 1.1 Ảnh hưởng cách chọn mẫu rễ bất định in vitro để tạo rễ thứ cấp 101 1.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 102 156 Lu ận án tiế n sĩ Ki nh tế 1.13 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung elicitor lên tăng sinh tích lũy saponin rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh in vitro 157 n sĩ Ki nh tế Kết sắc ký lớp mỏng định tính saponin tác động đơn lẻ elicitor nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh Lu ận án tiế Kết phân tích HPLC định lượng saponin tác động đơn lẻ elicitor nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh Mẫu 0: Đối chứng Mẫu 1: Ảnh hưởng 50 mg/L chitosan Mẫu 2: Ảnh hưởng 100 mg/L chitosan 158 tiế Lu ận án Mẫu 4: Ảnh hưởng 200 mg/L chitosan n sĩ Ki nh tế Mẫu 3: Ảnh hưởng 150 mg/L chitosan Mẫu 5: Ảnh hưởng 50 mg/L dịch chiết nấm men Mẫu 6: Ảnh hưởng 100 mg/L dịch chiết nấm men 159 tiế n sĩ Ki nh tế Mẫu 7: Ảnh hưởng 150 mg/L dịch chiết nấm men Lu ận án Mẫu 08: Ảnh hưởng 200 mg/L dịch chiết nấm men Mẫu 9: Ảnh hưởng 50 mg/L abscicic acid Mẫu 10: Ảnh hưởng 100 mg/L abscicic acid 160 Lu ận án tiế n sĩ Ki nh tế Mẫu 11: Ảnh hưởng 150 mg/L abscicic acid Mẫu 12: Ảnh hưởng 200 mg/L abscicic acid 161 Mẫu 13: Ảnh hưởng 50 mg/L salicylic acid Lu ận án Mẫu 15: Ảnh hưởng 150 mg/L salicylic acid tiế n sĩ Ki nh tế Mẫu 14: Ảnh hưởng 100 mg/L salicylic acid Mẫu 16: Ảnh hưởng 200 mg/L salicylic acid 162 Mẫu 17: Ảnh hưởng 50 mg/L jasmonic acid sĩ Ki nh tế Mẫu 18: Ảnh hưởng 100 mg/L jasmonic acid Lu ận án tiế n Mẫu 19: Ảnh hưởng 150 mg/L jasmonic acid Mẫu 20: Ảnh hưởng 200 mg/L jasmonic acid 163 Kết sắc ký lớp mỏng định tính saponin tác động kết hợp thời gian xử lý nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh Sắc ký đồ mẫu khảo sát cho vết có giá trị Rf màu sắc tương đồng với vết chuẩn M-R2, G-Rb1, G-Rg1 Ki 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Mẫu13: 100 mg/L YE+100 µg/L SA Mẫu14: 100 mg/L YE+150 µg/L SA Mẫu15: 100 mg/L YE+200 µg/L SA Mẫu16: 150 mg/L YE+25 µg/L SA Mẫu17: 150 mg/L YE+50 µg/L SA Mẫu18: 150 mg/L YE+100 µg/L SA Mẫu19: 150 mg/L YE+150 µg/L SA Mẫu20: 150 mg/L YE+200 µg/L SA Sâm chuẩn Chuẩn M-R2 Chuẩn G-Rb1 Chuẩn G-Rg1 sĩ án tiế Mẫu 01: 25 mg/L YE+25 µg/L SA Mẫu 02: 25 mg/L YE+50 µg/L SA Mẫu 03: 25 mg/L YE+100 µg/L SA Mẫu 04: 25 mg/L YE+150 µg/L SA Mẫu 05: 25 mg/L YE+200 µg/L SA Mẫu 06: 50 mg/L YE+25 µg/L SA Mẫu07: 50 mg/L YE+50 µg/L SA Mẫu 08: 50 mg/L YE+100 µg/L SA Mẫu09: 50 mg/L YE+150 µg/L SA Mẫu10: 50 mg/L YE+200µg/L SA Mẫu 11: 100 mg/L YE+25 µg/L SA Mẫu12: 100 mg/L YE+50 µg/L SA 2 7 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Lu ận 10 11 12 n nh tế n- butanol : acid acetic: nước (7:1:2) Mẫu 21: 200 mg/L YE+25 µg/L SA Mẫu 22: 200 mg/L YE+50 µg/L SA Mẫu 23: 200 mg/L YE+100 µg/L SA Mẫu 24: 200 mg/L YE+150 µg/L SA Mẫu 25: 200 mg/L YE+200 µg/L SA Mẫu 26: Thêm 150 mg/L YE sau 10 ngày nuôi cấy Sâm chuẩn 10 11 12 13 14 Chuẩn M-R2 Chuẩn G-Rb1 10 Chuẩn G-Rg1 11 Mẫu 27: Thêm 150 mg/L YE sau 20 ngày nuôi cấy 12 Mẫu 28: Thêm 150 mg/L YE sau 30 ngày nuôi cấy 13 Mẫu 29: Thêm 150 mg/L YE sau 40 ngày nuôi cấy 14 Mẫu 30: Thêm 150 mg/L YE giai đoạn đầu nuôi cấy 164 Kết định lượng saponin tác động kết hợp thời gian xử lý nuôi cấy RTC sâm Ngọc Linh SẮC KÝ ĐỒ MẪU SÂM MẪU 1: mAU 203nm,4nm (1.00) 2500 /113000 2000 /1334983 /200515 1500 1000 500 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 MẪU 2: /473454 tế mAU 190nm,4nm (1.00) sĩ 500 Ki /456283 /3449515 1000 nh 1500 27.5 30.0 MẪU 35.0 án mAU 190nm,4nm (1.00) 32.5 37.5 Lu ận 2000 37.5 /3188067 tiế 25.0 n 1000 /193206 /3144099 1500 500 25.0 : MẪU 27.5 30.0 32.5 35.0 mAU 190nm,4nm (1.00) 2500 /786311 2000 1000 /533021 /1789854 1500 500 -500 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0min 165 MẪU /548718 mAU 2000 190nm,4nm (1.00) /963184 /437406 1500 1000 500 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 MẪU mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 tế /729429 /1593083 1000 /121275 1500 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 Ki MẪU nh 500 sĩ mAU 190nm,4nm (1.00) 1250 n /458293 1000 tiế 750 250 án /577202 /609274 500 -250 25.0 MẪU Lu ận 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 mAU 190nm,4nm (1.00) /823754 1750 1500 /583054 1000 750 /414354 1250 500 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 MẪU mAU 190nm,4nm (1.00) /323139 1000 /341574 /1770621 500 -500 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 166 MẪU 10 /2866479 mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 1500 500 /461249 /1901111 1000 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 MẪU 11 mAU 190nm,4nm (1.00) /1989446 2000 1500 tế 500 /314937 /1729069 1000 20.0 25.0 nh 30.0 35.0 40.0 Ki MẪU 12 mAU 190nm,4nm (1.00) tiế n 1500 /2429549 sĩ 2000 án 500 /310760 /2234533 1000 20.0 MẪU 13 Lu ận 25.0 30.0 35.0 40.0 2000 /4317089 mAU 190nm,4nm (1.00) /765099 1000 500 /244860 1500 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 MẪU 14 /571426 mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 1000 /318392 /1692094 1500 500 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 167 MẪU 15 /1439004 mAU 2500 190nm,4nm (1.00) 2000 /1327598 /188901 1500 1000 500 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 MẪU 16 /2774790 mAU 190nm,4nm (1.00) tế 1500 Ki sĩ /285747 /792038 500 nh 1000 25.0 tiế n -500 30.0 35.0 MÂU 17 /835335 1000 500 /1661295 45.0 /240608 Lu ận 1500 án mAU 190nm,4nm (1.00) 40.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 MẪU 18 /2465329 mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 1000 /400046 /876907 1500 500 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 168 MẪU 19 /1834751 mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 1500 /644938 /365045 1000 500 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 MẪU 20 /464541 mAU 1500 190nm,4nm (1.00) sĩ Ki /397513 /962050 500 nh tế 1000 27.5 30.0 1000 37.5 500 40.0 /1504098 /1119155 Lu ận 1500 35.0 án mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 32.5 /298385 25.0 MẪU 21 tiế n -500 -500 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 MẪU 22 /2468416 mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 1000 /496765 /1661916 1500 500 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 169 MẪU 23 mAU 2500 190nm,4nm (1.00) /2710762 2000 1500 500 /346974 /753259 1000 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 MẪU 24 /1536798 mAU 190nm4nm (1.00) 2250 Ki 1250 nh /5399881 1500 /4484725 1750 tế 2000 1000 sĩ 750 30.0 35.0 40.0 Lu ận 1500 1000 /612587 500 22.5 25.0 27.5 /237138 án mAU 2000 190nm,4nm (1.00) 45.0min /3028150 tiế n 25.0 MẪU 25 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 MẪU 26 /939995 mAU 190nm,4nm (1.00) 2000 1000 /351252 /2576412 1500 500 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 : 170 MẪU 27 mAU 203nm,4nm (1.00) 3000 2500 /135042 2000 1000 500 /93864 /496633 1500 25.0 30.0 35.0 40.0 MẪU 28 /1708923 mAU 190nm,4nm (1.00) tế 1500 nh 500 Ki /630324 /269672 1000 sĩ 25.0 30.0 35.0 MẪU 29 mAU 190nm,4nm (1.00) /391901 /255532 Lu ận 1500 500 /938118 án 2000 1000 40.0 tiế 20.0 n -500 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 MẪU 30 /1261723 mAU 190nm4nm (1.00) /1445225 1500 1000 /1768012 2000 500 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0