Nuôi cấy tế bào xạ đen (ehretia asperula zollinger et moritzi) in vitro để thu nhận sinh khối có khả năng tổng hợp acid rosmaring

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ MỸ TRÂM NUÔI CẤY TẾ BÀO XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) IN VITRO ĐỂ THU NHẬN SINH KHỐI CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ACID ROSMARINIC LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ MỸ TRÂM NUÔI CẤY TẾ BÀO XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) IN VITRO ĐỂ THU NHẬN SINH KHỐI CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ACID ROSMARINIC Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 62420201 Phản biện độc lập: PGS TS Nguyễn Vũ Phong Phản biện độc lập: PGS TS Trần Thanh Hương Phản biện: PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh Phản biện: PGS TS Trịnh Ngọc Nam Phản biện: PGS TS Lê Phi Nga NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên PGS TSKH Ngô Kế Sương LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tác giả Các kết nghiên cứu kết luận luận án trung thực không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án Phạm Thị Mỹ Trâm i TÓM TẮT Cây xạ đen (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) loại dược liệu quan trọng, chứa acid rosmarinic, thành phần hợp chất phenolic phân lập, có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn ức chế tế bào ung thư Nghiên cứu “Nuôi cấy tế bào xạ đen (Ehretia asperula Zollinger et Moritzi) in vitro để thu nhận sinh khối có khả tổng hợp acid rosmarinic” thực nhằm cung cấp thông tin cần thiết cho việc tạo sinh khối thực vật chứa acid rosmarinic điều kiện có kiểm sốt Mơ sẹo xốp hình thành từ in vitro tăng trưởng tốt môi trường Gamborg (B5) bổ sung glucose 30 g/L, 2,4-D 0,4 mg/L BA 0,1 mg/L, sử dụng làm nguyên liệu tạo huyền phù tế bào Sự tăng trưởng tốt tế bào huyền phù g mô sẹo xốp nuôi cấy 20 mL môi trường B5 lỏng bổ sung glucose 30 g/L, NAA 0,4 mg/L BA 0,1 mg/L, máy lắc tròn với tốc độ lắc 90 vòng/phút, điều kiện tối tuần Sinh khối hàm lượng acid rosmarinic cao nuôi cấy huyền phù tế bào tối với kích thước cụm tế bào không qua rây Hàm lượng acid rosmarinic từ huyền phù tế bào nuôi cấy môi trường bổ sung glucose 45 g/L cao gấp 1,2 lần so với sử dụng glucose 30 g/L Chitosan bổ sung vào môi trường nuôi cấy tác nhân cảm ứng sinh tổng hợp acid rosmarinic Chitosan 50 mg/L thúc đẩy huyền phù tế bào sản xuất acid rosmarinic sau 48 cảm ứng, cao gấp 1,17 lần so với nghiệm thức khơng bổ sung chitosan Ngồi ra, hoạt tính cao chiết xạ đen đánh giá với khả năng kháng oxy hóa ức chế tế bào phơi thận lành tính (HEK293) Khả năng kháng oxy hóa cao chiết xếp theo thứ tự: cao chiết từ in vitro > cao chiết từ mơ sẹo có nguồn gốc từ in vitro > cao chiết từ vườn > cao chiết từ sinh khối tế bào huyền phù Ở nồng độ 400 µg/mL, cao chiết xạ đen khơng có tác dụng gây độc dòng tế bào HEK293 ii SUMMARY Ehretia asperula Zollinger et Moritzi is an important pharmaceutical plant, containing rosmarinic acid, the main component of the phenolic group, with many valuable biological activities such as antibacterial, antiviral, antioxidant, anti-allergy, arthritis, asthma and anti-cancer The study "Rosmarinic acid production in Ehretia asperula Zollinger et Moritzi cell cultures" aimed to produce acid rosmarinic through culturing cell suspensions under controlled conditions Friable callus was successfully formed from leaves in vitro and on Gamborg (B5) medium supplemented with 30 g/L glucose, 0.4 mg/L 2,4-D, and 0.1 mg/L BA, as a material for cell suspension cultures The best cell suspension proliferation was achieved when g of friable callus was cultured in 20 mL of liquid B5 medium supplemented with 30 g/L glucose, 0.4 mg/L NAA, 0.1 mg/L BA and was rotated at 90 rpm on an orbital shaker under total darkness for weeks Cell aggregates are not sieved and are cultured in the dark for the highest biomass and rosmarinic acid content The content of rosmarinic acid in cell suspensions cultured in medium supplemented with 45 g/L glucose was 1.2 times higher than when 30 g/L glucose was used Chitosan was added to the culture medium as an elicitor for rosmarinic acid biosynthesis Chitosan 50 mg/L promoted the cell suspension to produce rosmarinic acid after 48 hours of treatment, 1.17 times higher than the treatment without chitosan In addition, the activity of Ehretia asperula Zollinger et Moritzi extract was also verified through its ability to inhibit oxidation and HEK293 cells The antioxidant capacity of the extracts was ranked as: extract from leaf in vitro > extract from callus derived from leaf in vitro > extract from leaf in the garden > extract from suspension cell biomass At concentrations below 400µg/mL, the extracts were not toxic to HEK293 cell iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cô PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên Thầy PGS.TSKH Ngô Kế Sương tận tình định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên ngành kinh nghiệm thực tiễn quý báu Quý Thầy, Cô giúp đỡ động viên tơi suốt q trình thực luận án Xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa TP.HCM nhiệt tình dẫn, hỗ trợ phương tiện, dụng cụ thí nghiệm tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài Đồng thời, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, Viện Phát triển Ứng dụng, Trường Đại học Thủ Dầu Một giúp đỡ, tạo điều kiện tốt sở vật chất, phịng thí nghiệm tinh thần để tơi có thể hoàn thành tốt luận án Xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè em sinh viên nhiệt tình động viên, hỗ trợ tơi hồn thành luận án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người thầy vĩ đại chăm sóc, u thương, dạy dỗ dìu dắt vào đời Con xin cảm ơn người thân gia đình ln ủng hộ động viên suốt thời gian học tập thực đề tài Nghiên cứu sinh Phạm Thị Mỹ Trâm iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xiii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xvi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu luận án Ý nghĩa khoa học Ý nghĩa thực tiễn Tính luận án Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây xạ đen 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ đen 1.1.3 Hợp chất có hoạt tính sinh học xạ đen 1.2 Acid rosmarinic 1.2.1 Tính chất lý hóa acid rosmarinic 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp acid rosmarinic thực vật 1.2.3 Thực vật giàu acid rosmarinic v 1.2.4 Hoạt tính sinh học acid rosmarinic 1.3 Hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật in vitro 12 1.3.1 Nuôi cấy mô sẹo 13 1.3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào 13 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng lên trình ni cấy tế bào thực vật 14 1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng lên trình ni cấy mơ sẹo 14 1.4.1.1 Nguyên liệu thực vật 15 1.4.1.2 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật 15 1.4.1.3 Mơi trường khống 16 1.4.1.4 Nguồn carbon 17 1.4.1.5 Ánh sáng 18 1.4.1.6 pH môi trường 19 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên thu nhận hợp chất thứ cấp từ hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 19 1.4.2.1 Điều kiện môi trường .19 1.4.2.2 Dòng tế bào 20 1.4.2.3 Tiền chất hữu 20 1.4.2.4 Sự kích kháng 21 1.5 Thu nhận acid rosmarinic từ hệ thống tế bào thực vật in vitro 23 1.6 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô-tế bào xạ đen 28 1.6.1 Vi nhân giống xạ đen .28 1.6.2 Nuôi cấy tế bào xạ đen 30 1.7 Nhận xét chung 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu nghiên cứu 32 vi 2.1.1 Nguồn mẫu 32 2.1.2 Hoá chất 33 2.1.3 Địa điểm thời gian thực luận án .33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Vi nhân giống xạ đen .35 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên tạo mô sẹo xạ đen 35 2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên tạo mô sẹo từ xạ đen vườn .35 2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên tạo mô sẹo từ xạ đen in vitro .37 2.2.3 Xác định diện hợp chất phenolic hàm lượng acid rosmarinic mô sẹo xạ đen .39 2.2.4 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng loại mô sẹo đến chất lượng nguyên liệu tạo huyền phù tế bào 39 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên gia tăng sinh khối tích lũy acid rosmarinic huyền phù tế bào xạ đen .40 2.2.5.1 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên hình thành tăng sinh huyền phù tế bào 40 2.2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lên tích lũy acid rosmarinic huyền phù tế bào 41 2.2.6 Điều kiện hấp khử trùng nuôi cấy 43 2.2.6.1 Điều kiện hấp khử trùng 43 2.2.6.2 Điều kiện nuôi cấy .43 2.2.7 Các phương pháp phân tích 43 2.2.7.1 Chỉ tiêu theo dõi 43 2.2.7.2 Xác định khối lượng mô sẹo tươi 44 vii 2.2.7.3 Xác định tỉ lệ mẫu cấy hình thành mơ sẹo xốp số tăng trưởng .44 2.2.7.4 Xác định sinh khối huyền phù tế bào 44 2.2.7.5 Xác định diện hợp chất phenolic mô sẹo xạ đen .45 2.2.7.6 Chiết xuất định lượng acid rosmarinic 46 2.2.7.7 Khảo sát hoạt tính sinh học nguồn mẫu xạ đen 47 2.2.8 Xử lý số liệu 50 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Kết .51 3.1.1 Vi nhân giống xạ đen .51 3.1.2 Ảnh hưởng số yếu tố lên tạo mô sẹo xạ đen 52 3.1.2.1 Ảnh hưởng số yếu tố lên tạo mơ sẹo từ xạ đen ngồi vườn .52 3.1.2.2 Ảnh hưởng số yếu tố lên tạo mô sẹo từ xạ đen in vitro 59 3.1.3 Sự diện hợp chất phenolic hàm lượng acid rosmarinic mô sẹo xạ đen 65 3.1.3.1 Sự diện hợp chất phenolic 65 3.1.3.2 Hàm lượng acid rosmarinic .65 3.1.4 Ảnh hưởng loại mô sẹo đến chất lượng nguyên liệu tạo huyền phù tế bào 66 3.1.5 Ảnh hưởng số yếu tốt lên gia tăng sinh khối tích lũy acid rosmarinic huyền phù tế bào xạ đen .68 3.1.5.1 Ảnh hưởng số yếu tố lên hình thành tăng sinh huyền phù tế bào 68 3.1.5.2 Ảnh hưởng số yếu tố lên tích lũy acid rosmarinic huyền phù tế bào 72 3.1.6 Hoạt tính sinh học nguồn mẫu xạ đen .79 3.1.6.1 Hàm lượng acid rosmarinic hoạt tính kháng oxy hóa 79 viii