Luận văn một số đặc điểm đột biến gen slc25a13 trên người bệnh bị thiếu hụt citrin tại bệnh viện nhi trung ương giai đoạn 2018 – 2022

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO, BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN SLC25A13 TRÊN NGƯỜI BỆNH BỊ THIẾU HỤT CITRIN TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG GIAI ĐOẠN 2018-2022 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 HÀ NỘI, 2022 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO, BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN SLC25A13 TRÊN NGƯỜI BỆNH BỊ THIẾU HỤT CITRIN TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG GIAI ĐOẠN 2018-2022 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BS NGÔ DIỄM NGỌC HÀ NỘI, 2022 ii LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu thực hỗ trợ, giúp đỡ nhiều người Tôi xin trân trọng cảm ơn luôn ghi nhớ! Lời cảm ơn sâu sắc tơi xin gửi đến tồn người bệnh bị bệnh thiếu hụt Citrin gia đình họ Nếu khơng có hợp tác nhiệt tình họ, tơi khơng thể hồn thành nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn TS BS Ngô Diễm Ngọc, khoa Di truyền sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương hướng dẫn trình nghiên cứu Tơi gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Nguyễn Thị Anh Vân, trường Đại học Y tế công cộng hỗ trợ suốt trình hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương anh, chị đồng nghiệp, đặc biệt TS.BS Nguyễn Phạm Anh Hoa, Trưởng Khoa Gan-Mật tạo điều kiện, giúp đỡ trình nghiên cứu Tơi thực xúc động tự hào hỗ trợ nhiệt tình, động viên, chia sẻ đồng nghiệp Khoa Di truyền Sinh học phân tử, nơi công tác, để tơi hồn thành nhiệm vụ nghiên cứu tôi! Tôi vô cảm ơn chia sẻ, giúp đỡ động viên bố mẹ gia đình tơi Chồng tơi người thân yêu bên cạnh tôi, động viên yêu thương vô bờ bến! Họ động lực để luôn cố gắng không ngừng Tôi nguyện cố gắng để làm điều có ý nghĩa với gia đình, với sống với bệnh nhân Nguyễn Thị Mai Hương iii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Bệnh thiếu hụt Citrin 1.2 Đặc điểm di truyền bệnh thiếu hụt Citrin 1.3 Tình hình nghiên cứu đột biến gen SLC25A13 bệnh thiếu hụt Citrin giới Việt Nam 14 1.4 Giới thiệu địa điểm nghiên cứu 21 Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Thời gian thu thập số liệu địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Thiết kế nghiên cứu 23 2.4 Cỡ mẫu 24 2.5 Phương pháp chọn mẫu 25 2.6 Phương pháp thu thập số liệu 25 2.7 Biến số nghiên cứu 25 2.8 Các khái niệm, quy trình kỹ thuật sử dụng 26 2.9 Phương pháp phân tích số liệu 30 2.10 Đạo đức nghiên cứu 31 2.11 Hạn chế nghiên cứu, sai số biện pháp khắc phục sai số 31 Chương 3: Kết nghiên cứu 32 3.1 Xác định đột biến gen SLC25A13 32 3.2 Tỷ lệ kiểu gen đột biến gen SLC25A13 41 Chương 4: Bàn luận 50 4.1 Đột biến gen SLC25A13 người bệnh thiếu hụt citrin 50 4.2 Tỷ lệ kiểu gen đột biến gen SLC25A13 55 iv KẾT LUẬN 62 KHUYẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 74 8.1 Phụ lục 1: Kết xét nghiệm di truyền người bệnh nghiên cứu 74 8.2 Phụ lục 2: Phiếu thông tin người bệnh 83 8.3 Phụ lục 3: Kết tách DNA tổng số người bệnh bị thiếu hụt Citrin 85 8.4 Phụ lục 4: Sản phẩm PCR 18 exon gen SLC25A13 90 8.5 Phụ lục 5: Bảng mã hóa viết tắt axit amin 91 8.6 Phụ lục 6: Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 92 8.7 Phụ lục 7: Kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 94 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AGC (Aspartate/Glutamate carrier): Chất vận chuyển Aspartat Glutamat Bp (Base pair): Cặp bazơ c.DNA (Complementary DNA): DNA bổ sung CTLN2 (Adult-onset type II citrullinemia): Vàng da ứ mật khởi phát người trưởng thành ddNTP (Dideoxynucleotide triphosphate): nucleotide tự đánh dấu huỳnh quang DNA (Desoxyribonucleic acid): phân tử mang thông tin di truyền dNTP (Deoxynucleotide triphosphate): Nucleotide gồm Adenine, Guanine, Cytozine, Thymine EtBr (Ethidium bromide): hóa chất nhuộm DNA FTTDCD (Failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency): Không phát triển rối loạn lipid máu thiếu citrin GS: Glutamine synthetase Kb (kilo base): đơn vị đo kích thước DNA kDa (kilo Dalton): đơn vị đo khối lượng protein NADH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen): Năng lượng khử NADH NICCD (Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency): Vàng da ứ mật khởi phát giai đoạn sơ sinh NASH (Nonalcoholic steatohepatitis): Viêm gan nhiễm mỡ không rượu NGS (Next generation sequencing): Giải trình tự hệ MCT (Medium chain triglyceride): Chất béo chuỗi trung tính MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification): Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa vào phản ứng nối MS (Mass Spectrometry): Kỹ thuật để đo tỉ lệ khối/điện tích ion mRNA (message ribonucleic axit): RNA thông tin PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng trùng hợp chuỗi RFLP (Restriction fragement length polymophism): Đa hình đoạn cắt giới hạn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đột biến phát người bệnh bị thiếu hụt Citrin 11 Bảng 2.1 Các biến số nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi kiểm tra lại đột biến 27 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi phản ứng PCR/PCR-RFLP 27 Bảng 2.4 Trình tự 18 cặp mồi dùng giải trình tự gen 27 Bảng 2.8 Kích thước sản phẩm cắt enzyme đột biến sàng lọc kỹ thuật PCR/PCR-RFLP 29 Bảng 3.1 Phân bố người bệnh theo giới độ tuổi phát bệnh trung bình 32 Bảng 3.2 Tóm tắt kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng chẩn đoán bệnh thiếu hụt Citrin 32 Bảng 3.3 Tỷ lệ loại kiểu gen nghiên cứu 41 Bảng 3.4 Các loại kiểu gen người bệnh 41 Bảng 3.5 Kết xác định tỷ lệ loại đột biến gen SLC25A13 43 Bảng 3.6 Các loại đột biến nghiên cứu 42 Bảng 3.7 Sự phân bố đột biến gen SLC25A13 43 Bảng 3.8 Phân loại đột biến gen SLC25A13 44 Bảng 3.9 Xét nghiệm sinh hóa người bệnh mã số WBCT170102 47 Bảng 3.10 Xét nghiệm sinh hóa người bệnh mã số WBCTS210304 48 Bảng 3.11 Sàng lọc axit amin người bệnh mã số WBCTS210304 49 Bảng 2.5 Thành phần pha hóa chất PCR 96 Bảng 2.6 Thành phần pha hóa chất cắt enzyme 97 Bảng 2.7 Thành phần pha hóa chất PCR sợi đơn 98 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc gen SLC25A13 sơ đồ tóm tắt vị trí 30 đột biến gen SLC25A13 [12] 10 Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa chu trình urê thoi malate-aspartate 13 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 24 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme đột biến I 33 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đột biến III 34 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme đột biến X 35 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đột biến XIX 35 Hình 3.5 Hình ảnh trình tự gen có đột biến p.M1T 36 Hình 3.6 Hình ảnh trình tự gen có đột biến p.L45F 37 Hình 3.7 Hình ảnh trình tự gen có đột biến IVS11+1G>A 37 Hình 3.8 Hình ảnh trình tự gen có đột biến I 38 Hình 3.9 Hình ảnh trình tự gen có đột biến p.V411M 38 Hình 3.10 Hình ảnh trình tự gen có đột biến p.R588Q 39 Hình 3.11 Hình ảnh trình tự gen có đột biến p.R467* 39 Hình 3.12 Hình ảnh trình tự gen bị đột biến [c.1956C>A;c.1962 delT] 40 Hình 3.13 Hình ảnh trình tự gen bị đột biến [c.1956C>A; c.1962 delT] 40 Hình 3.14 Phả hệ, hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme đột biến I trình tự đoạn gen bị đột biến [ c.1956C>A; c.1962 delT] 45 Hình 3.15 Phả hệ, điện di agarose đột biến c.851_854del trình tự gen có đột biến p.Y24_72Ifs*10 46 viii TÓM TẮT NGHIÊN CỨU Thiếu hụt Citrin bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gặp giới đột biến gen SLC25A13 Bệnh gồm thể lâm sàng NICCD CTLN2, có độ tuổi khởi phát khác Xét nghiệm di truyền nhằm phát đột biến gen để chẩn đoán xác định sở để điều trị cho người bệnh sở để sàng lọc cho thành viên gia đình chẩn đốn trước sịnh Vậy, đột biến gen SLC25A13 người Việt Nam có khác biệt so với công bố y văn? Đột biến phổ biến kiểu gen phổ biến? Nghiên cứu thực để làm rõ nội dung Nghiên cứu thực 122 người bệnh từ 122 gia đình có độ tuổi từ 0-1 tuổi Khoa Di truyền sinh học phân tử, bệnh viện Nhi Trung ương Nghiên cứu thực hồi cứu, mô tả cắt ngang từ tháng 01/2018-04/2018 tiến cứu, mô tả cắt ngang từ 05/2022-07/2002 Số liệu đột biến gen thu thập phiếu thông tin người bệnh phát kỹ thuật PCR/PCR-RFLP giải trình tự gen trực tiếp Trong tổng số 122 người bệnh, 99 người có kiểu gen đồng hợp tử 23 người có kiểu gen dị hợp tử kép Kết nghiên cứu xác định kiểu gen, kiểu gen đồng hợp tử đột biến c851_854del phổ biến Tổng số 12 đột biến gen SLC25A13 khác tìm thấy nghiên cứu gồm đột biến [c.1956C>A;c.1962del] c.70-63_132del 10 đột biến công bố (p.R284Rfs*3, IVS11+1G>A, p.A554fs*570, IVS6+5G>A, p.A584fs*585, c.2T>C, c.135G>C, c.1231G>A, c.1399C>T, c.1763G>A) Như vậy, đột biến gen SLC25A13 xảy toàn gen Đột biến c.851_854del đột biến phổ biến nhất, IVS16ins đột biến phổ biến thứ hai người bệnh thiếu hụt Citrin Việt Nam Kiểu gen đồng hợp tử đột biến c.851_854del phổ biến người bệnh thiếu hụt Citrin Việt Nam Phát đột biến gen SLC25A13 tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán xác định bệnh Thiếu hụt Citrin, đồng thời cịn sở để tư vấn di truyền, tư vấn di truyền trước sinh trước hôn nhân cho người mang gen bệnh ĐẶT VẤN ĐỀ Thiếu hụt citrin bệnh di truyền chuyển hóa gây bệnh vàng da, ứ mật gan trẻ sơ sinh (NICCD) Gen khiếm khuyết bệnh nhân thiếu hụt citrin SLC25A13, nằm nhiễm sắc thể 7q21.3, mô tả lần người bệnh mắc bệnh citrullinemia loại II người lớn (1) Gen mã hóa citrin, chất mang aspartate (Asp)-glutamate (Glu) màng ty thể, tham gia vào trình tạo gluconeogenesis, đường phân hiếu khí chuyển động aspartate từ ty thể đến tế bào chất, thành phần thoi malate-aspartate NADH Nó mơ tả lần người Nhật Bản người Đông Á coi bệnh liên quan đến sắc tộc (2) Người bệnh NICCD có xác định Israel, Cộng hòa Séc, Vương quốc Anh Hoa Kỳ, nhiên đột biến quần thể khác với đột biến phổ biến châu Á Đột biến gen SLC25A13 đa dạng, gồm nhiều loại đột biến xảy toàn gen Cho đến nay, khoảng 100 đột biến khác phát gen SLC25A13 Tại Việt Nam, số nghiên cứu thiếu hụt Citrin mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh Nghiên cứu đột biến gen SLC25A13 cịn hạn chế nghiên cứu sàng lọc bốn đột biến xác định gen SLC25A13 mà chưa thể tầm soát hết tồn bất thường xảy gen (14,15) Ngồi ra, đột biến gen SLC25A13 có đặc trưng chủng tộc (1) nên dựa liệu công bố giới để làm sở để phát đột biến gen người Việt Nam hiệu khơng cao Thêm nữa, phát đột biến gen SLC25A13 khơng có ý nghĩa quan trọng chẩn đoán xác định bệnh thiếu hụt Citrin mà mang lại liệu quan trọng đột biến gen người bệnh mắc thiếu hụt Citrin Từ đó, nghiên cứu xác định đột biến thường gặp vùng gen thường xảy đột biến, giúp cho việc chẩn đoán nhanh người bệnh điều trị kịp thời Vì bệnh thiếu hụt Citrin khởi phát sớm, lâm sàng khơng điển hình nên đơi việc chẩn đốn bệnh gặp khó khăn bị bỏ sót khiến người bệnh đối mặt với nguy nhiều biến chứng nguy hiểm ảnh hưởng lâu dài đến chất lượng sống Dù vậy, đa số người bệnh tự thích nghi với bệnh độ tuổi từ đến 12