Luận văn một số đặc điểm đột biến gen slc25a13 trên người bệnh bị thiếu hụt citrin tại bệnh viện nhi trung ương giai đoạn 2018 – 2022

Bệnh thiếu hụt Citrin

1.1.1 Khái niệm bệnh vàng da ứ mật do thiếu hụt Citrin

Trẻ sơ sinh bị vàng da có nồng độ bilirubin trong huyết thanh tăng cao, dẫn đến tình trạng ứ mật và giảm dòng chảy của mật Việc chẩn đoán và điều trị kịp thời tình trạng ứ mật ở trẻ sơ sinh là rất quan trọng để ngăn ngừa tổn thương không hồi phục cho các cơ quan khác và đạt kết quả tốt nhất khi can thiệp ngoại khoa Các triệu chứng lâm sàng phức tạp của trẻ sơ sinh bị vàng da cần được nhận diện sớm để hỗ trợ quá trình chẩn đoán trong thực hành lâm sàng.

Tần suất ứ mật sơ sinh là 1 trong 2500 trẻ, với nguyên nhân bao gồm ứ mật trong gan và ngoài gan, như tắc nghẽn hệ thống mật, nhiễm trùng sơ sinh, và các rối loạn di truyền Việc chẩn đoán kịp thời là rất quan trọng cho kết quả điều trị, vì có hơn 100 tình trạng liên quan đến ứ mật Trong đó, bệnh ứ mật bẩm sinh (BA) chiếm 25–45% các trường hợp, trong khi hội chứng Alagille và các bệnh di truyền khác chiếm từ 2–20% Ở trẻ sinh non, ứ mật có thể xảy ra ở 10–20% do các yếu tố như tuần hoàn ruột chưa trưởng thành và nhiễm trùng.

Bệnh vàng da ứ mật do thiếu hụt Citrin là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể 7q21.3, bao gồm hai thể lâm sàng: vàng da ứ mật khởi phát ở giai đoạn sơ sinh (NICCD) và vàng da ứ mật khởi phát ở người trưởng thành (CTLN2) Quá trình chuyển đổi từ NICCD sang CTLN2 có thể có giai đoạn trung gian dẫn đến suy hô hấp và rối loạn lipid máu (FTTDCD) Mặc dù thiếu hụt Citrin là một bệnh di truyền chuyển hóa hiếm gặp toàn cầu, nhưng tần số dị hợp tử ở khu vực Đông/Đông-Nam Á có thể lên đến 1/40 Bệnh này gây ra rối loạn trong các quá trình chuyển hóa, đặc biệt là chu trình ure.

SLC25A13 có thể gây ra triệu chứng suy gan cấp và tăng NH3 ở người lớn, kèm theo các vấn đề tâm thần và thần kinh bất thường Việc xác định nguyên nhân gây bệnh là ưu tiên hàng đầu để nâng cao hiệu quả điều trị Chẩn đoán phân tử bệnh ứ mật ở trẻ sơ sinh đã phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây, chủ yếu nhằm xác định các nguyên nhân di truyền của những bệnh lý và hội chứng di truyền như ứ mật tiến triển có tính chất gia đình, từ đó giúp bác sĩ xây dựng phác đồ điều trị hiệu quả nhất.

1.1.2 Dịch tễ học bệnh vàng da ứ mật do thiếu hụt Citrin

Thiếu hụt Citrin hay AGC (Aspartate/Glutamate carrier) là một bệnh di truyền chuyển hóa phổ biến ở trẻ em, đặc biệt ở khu vực Đông và Đông Nam Á, được coi là bệnh di truyền có tính sắc tộc Tình trạng này thường gặp ở các nước Đông Á, đặc biệt là Nhật Bản, trong khi tỷ lệ mắc bệnh ở châu Âu rất thấp Ước tính tỷ lệ mắc bệnh ở Hàn Quốc là 1/50.000, Trung Quốc là 1/17.000 và Nhật Bản là 1/19.000.

Tỷ lệ mắc bệnh ở Đông Á được ước đoán là 1/80.000 người, với tỷ lệ mang gen bệnh tại Trung Quốc là 1/65, Nhật Bản là 1/69 và Hàn Quốc là 1/112 Tần số dị hợp tử trong khu vực Đông Á có thể đạt tới 1/40 người Tỷ lệ mang gen tối thiểu là 1/90, trong khi tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử kép đối với các đột biến SLC25A13 đã biết là 1/33.000.

Thiếu hụt citrin được chia thành hai thể lâm sàng chính: citrullinemia loại II khởi phát ở người lớn (CTLN2-OMIM ID # 603471) và thể bệnh ứ mật trong gan ở trẻ nhỏ do thiếu citrin (NICCD-OMIM ID # 605814) Giữa hai giai đoạn này là thời kỳ thích nghi, thường xảy ra khi trẻ trên 1 tuổi Một số trường hợp vẫn có biểu hiện bệnh và được phân loại vào nhóm FTTDCD (rối loạn lipid máu không phát triển do thiếu citrin), viêm tụy, NASH và u gan FTTDCD thường xuất hiện từ 1 đến 3 tuổi, được xem là thể lâm sàng thứ ba của thiếu hụt citrin, do hai thể cổ điển có độ tuổi khởi phát khác nhau NICCD thường ảnh hưởng đến trẻ sơ sinh và giai đoạn đầu đời, trong khi citrullinemia loại II (CTLN2) có thể khởi phát đột ngột từ 20 đến 50 tuổi, thậm chí đến 80 tuổi.

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Thiếu hụt Citrin có thể ảnh hưởng đến trẻ ngay từ khi còn trong bụng mẹ, dẫn đến cân nặng sơ sinh thấp do ty thể của thai nhi không sản xuất đủ năng lượng Trẻ bị NICCD thường có tiền sử nhẹ cân và chậm phát triển Một biểu hiện đặc trưng của bệnh là vàng da ứ mật, cùng với các triệu chứng lâm sàng như ứ mật trong gan, gan to, gan nhiễm mỡ lan tỏa, rối loạn chức năng gan, giảm protein máu, và đông máu do gan suy giảm tổng hợp các yếu tố đông máu, cũng như thiếu máu tan máu và hạ đường huyết.

Trong giai đoạn giữa NICCD và CTLN2, bệnh nhân thường chỉ biểu hiện mệt mỏi với các xét nghiệm cận lâm sàng gần như bình thường, tuy nhiên một số trường hợp có thể gặp hạ đường huyết tái phát, suy giảm tăng trưởng, mệt mỏi, tăng lipid máu và viêm gan NICCD là thể bệnh phổ biến nhất, thường khởi phát sớm ở trẻ nhỏ, trong khi ở người lớn có thể không có biểu hiện rõ ràng do đã thích nghi Các triệu chứng lâm sàng của thiếu hụt Citrin có thể xuất hiện từ sơ sinh đến trưởng thành, bao gồm ứ mật, vàng da, phân có cồn, chậm phát triển, giảm protein huyết và khuôn mặt bầu bĩnh Tình trạng này thường xảy ra trong khoảng từ 6 đến 12 tháng tuổi Mặc dù NICCD không nghiêm trọng, nhưng một số bệnh nhân có thể tiến triển nặng và cần ghép gan, nếu không sẽ có nguy cơ tử vong Trước đây, người ta cho rằng hầu hết bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng đáng chú ý và cơ thể tự bù đắp cho sự thiếu hụt chuyển hóa.

Sau giai đoạn NICCD, hầu hết người bệnh có vẻ khỏe mạnh, ngoại trừ những người có chế độ ăn giàu protein và chất béo, nghèo carbohydrate Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng người thiếu hụt citrin có thể gặp phải các triệu chứng như chậm phát triển thể chất, mệt mỏi, sụt cân, tăng nồng độ canxi máu và citrullinemia trước khi tiến triển thành thể bệnh CTLN2 Hạ đường huyết thường gặp ở trẻ em thiếu hụt citrin do chế độ ăn thiếu carbohydrate, suy giảm quá trình tân tạo đường và giảm dự trữ glycogen ở gan Đặc biệt, một số trẻ sơ sinh không có triệu chứng lâm sàng nhưng sau này được chẩn đoán là thiếu hụt citrin Điều này cho thấy không phải tất cả người bệnh thiếu citrin đều có biểu hiện bệnh; một số trường hợp tiến triển sang kiểu hình trung gian FTTDCD ngay sau sinh, trong khi một số người khác không có triệu chứng cho đến khi trưởng thành.

Khoảng 50% bệnh nhân NICCD được phát hiện qua sàng lọc sơ sinh, trong khi khoảng 40% trẻ sơ sinh từ vài tháng tuổi có triệu chứng vàng da kéo dài Một số trường hợp được phát hiện muộn hơn với tình trạng chậm phát triển thể chất và rối loạn lipid máu (FTTDCC) Trong giai đoạn giữa NICCD và CTLN2, bệnh nhân thường không có triệu chứng nghiêm trọng ngoài cảm giác mệt mỏi Hầu hết những người thiếu Citrin có xu hướng ăn uống đặc biệt từ khoảng 1 tuổi, với chế độ ăn giàu protein, giàu chất béo và nghèo carbohydrate, điều này liên quan mật thiết đến cơ chế bệnh sinh của tình trạng thiếu Citrin.

CTLN2 ở tuổi trưởng thành (10 đến 80 tuổi) thường biểu hiện với các triệu chứng như tăng đường huyết, rối loạn ý thức và hành vi bất thường, thường xuất hiện đột ngột từ 20 đến 40 tuổi, có thể dẫn đến hôn mê và tử vong Tiên lượng bệnh không khả quan, nhưng ghép gan là một phương pháp điều trị hiệu quả Các triệu chứng thường xảy ra sau khi dùng thuốc, nhiễm trùng hoặc uống rượu Người bệnh thường có sở thích ăn đậu, lạc và chế độ ăn giàu protein như trứng, cá, thịt, trong khi không thích thực phẩm giàu carbohydrate Hầu hết người bệnh đều gầy, với hơn 90% có chỉ số khối cơ thể dưới 20, và khoảng 40% có chỉ số dưới 17 Các biến chứng chính của CTLN2 bao gồm viêm tụy, tăng lipid máu và u gan.

II hiếm gặp trên người không thuộc khu vực Đông Á nhưng vẫn nên được cân nhắc cẩn thận ở người lớn có biểu hiện bệnh não tăng huyết áp (25)

1.1.3.2 Đặc điểm cận lâm sàng

Ngay sau sinh, citrullin tăng nhanh, trong khi một số axit amin và glucose giảm Đến ngày thứ 5, phenylalanin, tyrosine, arginine và threonine có sự gia tăng đáng kể Sau 1 tháng tuổi, galactose và tổng số axit mật tăng rõ rệt, cho thấy tình trạng ứ mật trong gan ở trẻ sơ sinh, và ảnh hưởng của thiếu hụt citrin trở nên rõ ràng Khoảng 60% trường hợp NICCD được chẩn đoán qua các triệu chứng lâm sàng như ứ mật Nhiều trường hợp cũng cho thấy galactosemia, chảy máu nội tạng, nồng độ α-fetoprotein trong huyết thanh cao nhưng amoniac máu không tăng, cùng với sự gia tăng phosphatase kiềm và hạ đường huyết.

Các bất thường sinh hóa ở bệnh nhân NICCD thường cải thiện trong vòng một tháng và trở lại mức bình thường sau sáu tháng Thời gian điều trị dứt điểm chứng vàng da ứ mật tối thiểu là bốn tháng, trong khi chức năng gan cần khoảng mười tháng để phục hồi hoàn toàn Đặc biệt, sau 12 tháng, tất cả bệnh nhân NICCD đều có mức alpha-fetoprotein bình thường Đột biến gen SLC25A13 đã được xác định là nguyên nhân phân tử gây ra những bất thường này ở tất cả bệnh nhân.

Chuyển hóa của CTLN2 được đặc trưng bởi mức arginine huyết thanh cao hơn so với nhóm chứng, trong khi bệnh nhân CTLN1 lại có tình trạng thiếu arginine.

Đặc điểm di truyền bệnh thiếu hụt Citrin

Gen SLC25A13, nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q21.3), có kích thước khoảng 200 kb và di truyền theo cơ chế lặn trên nhiễm sắc thể thường Đột biến trên gen này là nguyên nhân gây ra bệnh NICCD và CTLN2.

Gen này có 18 exon với trình tự c.DNA dài 3135 nucleotide và khung đọc mở (ORF) gồm 2025 bp Sản phẩm protein của gen chứa 675 axit amin (aa) và có khối lượng phân tử 74 kDa Protein này tương đồng với protein aralar, được mã hóa bởi gen SLC25A12, thuộc họ protein vận chuyển xuyên màng phụ thuộc canxi.

Hiện nay, đã phát hiện khoảng 100 đột biến khác nhau trên gen SLC25A13, với sự đa dạng bao gồm đột biến thay thế, đột biến dịch khung, đột biến vô nghĩa và đột biến vùng cắt nối Thông tin chi tiết về các đột biến này có thể được tìm thấy trên trang web http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SLC25A13.

Hình 1.1 Cấu trúc gen SLC25A13 và sơ đồ tóm tắt và vị trí của 30 đột biến gen SLC25A13 [12]

Cấu trúc DNA bổ sung SLC25A13 (cDNA) và protein Citrin được dự đoán từ các đột biến mới Đặc điểm của các đột biến [I] - [XXXI] được trình bày trong Bảng 1.1, với các chữ cái màu đen và xám thể hiện các đột biến mới và đã biết Protein Citrin bao gồm 4 vùng EF, là vị trí liên kết ion canxi, cùng với 6 vùng xuyên màng từ 1-6.

Nhật Bản là quốc gia tiên phong trong nghiên cứu bệnh thiếu hụt citrin, với việc tách dòng và xác định chức năng gen SLC25A13 vào năm 1999 Đột biến của gen này đã được phát hiện ở những bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt Citrin, trong đó có mười một đột biến phổ biến được công bố, đánh dấu lần đầu tiên phát hiện trên gen SLC25A13 Các đột biến này, được ký hiệu bằng chữ số La mã từ I đến XXXI, đều ảnh hưởng đến chức năng protein do gen mã hóa, nhưng hầu hết các nghiên cứu không tìm thấy mối liên hệ rõ ràng giữa kiểu gen và kiểu hình Một số đột biến dẫn đến protein SLC25A13 bị cắt ngắn hoặc mất vòng lặp giữa các vùng xuyên màng do thiếu hoặc rất ít sản phẩm dịch mã Mặc dù ảnh hưởng của các đột biến đến biểu hiện bệnh chưa được chứng minh, một số ý kiến cho rằng citrullinemia loại II khởi phát ở người lớn có thể liên quan đến sự mất hoàn toàn Citrin.

Bảng 1.1 Đột biến được phát hiện trên người bệnh bị thiếu hụt Citrin

Tên viết tắt (Vị trí) Sự thay đổi

Sự thay đổi axit amin

II IVS11+1G>A (Int11) c.1019_1177del p.340_392del III 1638ins23 (ex16) c.1628_1660dup p.A554fs(570*)

XIV IVS6+1G>C c.IVS6(1789)ins p.A206fs(212*)

XV g.Ex15dup (IVS14_15) c.1453_1591dup p.M532fs(560*)

Tên viết tắt (Vị trí) Sự thay đổi

Sự thay đổi axit amin

XIX IVS16ins3kb RNA bất thường p.A584fs(585*)

XXII Ex1-1G>A không xác định

XXIII 1146delA (Ex11) c.1146delA p.R383fs(407*)

XXVI IVS13+2T>G không xác định

XXX 1374/5delG (Ex14) c.1374 or 1375delG p.A459fs(507*)

1.2.2 1.2.2 Chức năng protein Citrin và cơ chế bệnh sinh

Protein Citrin, với 675 amino acid và trọng lượng phân tử khoảng 74 kD, là một chất mang của phức hợp aspartate-glutamate trong màng trong ty thể Được mã hóa bởi gen SLC25A13, Citrin chủ yếu biểu hiện ở gan và đóng vai trò quan trọng trong quá trình đường phân tại đây Ngoài gan, Citrin còn xuất hiện ở thận, tim và các tế bào nhỏ khác Vai trò của Citrin trong việc vận chuyển aspartate từ chất nền ty thể đến tế bào rất quan trọng cho các con đường trao đổi chất, bao gồm tổng hợp protein, nucleotide và urê, cũng như tân tạo đường từ lactate và chuyển vị các chất tương đương khử như một phần của con thoi malate-aspartate NADH từ tế bào vào ty thể Citrin cũng có vai trò điều chỉnh năng lượng tế bào.

Gen SLC25A13 mã hóa Citrin và gen SLC25A12 mã hóa Aralar có độ tương đồng cao và đều tham gia vào chức năng vận chuyển aspartate - glutamate trên màng ty thể Cả hai gen này đều vận chuyển proton và Glu từ không gian liên màng của chất nền nội màng ty thể và Asp từ chất nền ty thể đến không gian nội màng của ty thể, và được kích hoạt bởi canxi AGC1 (Aralar) chủ yếu được biểu hiện ở não, cơ xương, tim và thận, trong khi AGC2 (Citrin) chủ yếu nằm ở gan, thận và tim AGC1 liên quan đến các bệnh về não/cơ xương, trong khi Citrin liên quan đến bệnh gan, và thiếu aralar gây ra thiểu năng não, ngừng phát triển, giảm trương lực cơ và động kinh.

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa của chu trình urê và con thoi malate-aspartate

AGC refers to the compound glutamate aspartate, while Arg stands for arginine and ASA indicates argininosuccinate Asp denotes aspartate, and AST represents aspartate aminotransferase Citrulline, CP is carbamyl phosphate, and Glu signifies glutamate α-KG refers to α-ketoglutarate, Mal represents malate, and MDH stands for malate dehydrogenase OAA is oxaloacetate, OMC indicates a carrier of α-ketoglutarate/malate, ORC refers to a carrier of nithine, Orn is ornithine, and Pyr denotes pyruvate.

Citrin đóng vai trò quan trọng trong gan, và sự thiếu hụt của nó có thể gây ra rối loạn tổng hợp urê cũng như ảnh hưởng đến chức năng vận chuyển NADH của aspartate Điều này dẫn đến các bất thường về trao đổi chất, bao gồm: 1) giảm cung cấp aspartate từ ty thể đến tế bào chất, làm giảm hoạt động của argininosuccinate synthetase, dẫn đến tăng nồng độ citrulline và amoniac; 2) ức chế cung cấp NADH cho ty thể, ảnh hưởng đến quá trình hình thành ATP và sản xuất năng lượng trong chuỗi hô hấp; 3) ức chế gluconeogenesis từ lactate và glycerol do sự xáo trộn cân bằng NADH/NAD+; 4) tích tụ acetyl CoA trong tế bào chất thúc đẩy tổng hợp axit béo; và 5) giảm điều hòa của thụ thể α kích hoạt peroxisome tăng sinh (PPARα), ảnh hưởng đến quá trình oxy hóa axit béo và gây ra sự sinh mỡ của gan Thiếu Citrin biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng và thay đổi bệnh lý phức tạp.

Sự thiếu hụt Citrin ngăn chặn các con thoi aspartate-malate, dẫn đến tăng tỷ lệ NADH, làm khó khăn cho quá trình oxy hóa nicotinamide adenine dinucleotide (NADH/NAD +) Tình trạng này ức chế quá trình đường phân và tạo rượu, giải thích lý do tại sao bệnh nhân CTLN2 không thích carbohydrate, không thể uống rượu, và thường gặp triệu chứng tâm thần khi tiêu thụ rượu Tỷ lệ NADH/NAD cao cũng ức chế quá trình tân tạo đường từ các cơ chất như lactate, glycerol và sorbitol, cùng với khó khăn trong chuyển hóa alanin thành urê và glucose, có thể dẫn đến hạ đường huyết ở bệnh nhân NICCD Mặc dù bệnh nhân NICCD bị galactosemia, đôi khi gây đục thủy tinh thể, nhưng không phát hiện bất thường về các enzym chuyển hóa galactose.

Tình hình nghiên cứu về đột biến gen SLC25A13 và bệnh thiếu hụt Citrin trên thế giới và tại Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu đột biến gen SLC25A13 trên thế giới

Nghiên cứu về đột biến gen bắt đầu từ năm 1999 khi một giáo sư Nhật Bản phát hiện ra gen gây bệnh thiếu hụt Citrin Tác giả Kobayashi đã nghiên cứu 118 gia đình ở Nhật Bản và phát hiện đột biến gen SLC25A13, mã hóa chất vận chuyển ty thể, với ba đột biến dị hợp tử Đây là nghiên cứu sinh học phân tử đầu tiên liên quan đến bệnh thiếu hụt Citrin, mở ra hướng đi cho hàng loạt nghiên cứu khác về đột biến gen.

Đột biến gen SLC25A13 đã được nghiên cứu, với các đột biến 851_854del (đột biến I) và IVS11+1G>A (đột biến II) được phát hiện ở trẻ sơ sinh Năm đột biến đầu tiên được đánh số từ I đến V bằng chữ số La Mã, và sau đó, các đột biến IV và VI cũng đã được xác định Tác giả Tamamori và cộng sự đã báo cáo 5 trường hợp trẻ sơ sinh bị ứ mật trong gan do thiếu Citrin và tiến hành phân tích các đột biến gen liên quan.

SLC25A13 cho thấy các biến thể di truyền liên quan đến bệnh lý, bao gồm dị hợp tử kép đột biến c.851_854del/IVS11+1G>A và IVS11+1G>A/p.E601*, cùng với đồng hợp tử đột biến p.S225* Những bệnh nhân này có mức alpha-fetoprotein cao, thường gặp ở bệnh nhân CTLN2 khởi phát ở tuổi trưởng thành Trong số 5 trường hợp, một bệnh nhân đã trải qua rối loạn chức năng gan nghiêm trọng nhưng hồi phục tốt sau ghép gan lúc 10 tháng tuổi Do đó, trẻ em bị thiếu hụt Citrin cần được theo dõi cẩn thận, đặc biệt trong giai đoạn sơ sinh, và có thể cần ghép gan nếu chức năng gan bị ảnh hưởng nặng.

Đột biến c.851_854del là dạng phổ biến nhất gây thiếu hụt Citrin ở Nhật Bản và Trung Quốc, chiếm hơn 50% trường hợp ở Trung Quốc và 30% ở Nhật Bản và Hàn Quốc Ngoài ra, có 68 đột biến gây bệnh khác được xác định, bao gồm 50 đột biến điểm, trong đó 12 đột biến nằm trong vùng điều hòa và 36 đột biến trong vùng mang ti thể Đặc biệt, đột biến splice site là phổ biến nhất ở Đông Á, với tỷ lệ 48% ở Nhật Bản và 33% ở Hàn Quốc Các biến thể như IVS11+1G>A, IVS13+1G>A và c.1452+1G>A không tạo ra codon dừng sớm nhưng có thể dẫn đến protein bị dịch khung.

Các gen có đột biến vô nghĩa ít phổ biến hơn, chiếm khoảng 4% ở Trung Quốc, với các đột biến phổ biến nhất là c.1399C>T (1,5%), p.Q259* (1%), p.R319* (1%) và p.R184* (0,5%) Tại Nhật Bản và Hàn Quốc, tỷ lệ đột biến p.S225* cao hơn đáng kể, lần lượt đạt 6% và 9% trong tổng số bệnh nhân Các đột biến ở vị trí nối, xóa, chèn và đột biến vô nghĩa có thể dẫn đến sự phân rã mRNA, tạo ra axit amin vô nghĩa và làm mất hoàn toàn chức năng của gen.

Đột biến sai nghĩa là loại đột biến làm thay đổi axit amin thành một axit amin khác, chiếm 20% tổng số người bệnh ở dân số Trung Quốc Các đột biến phổ biến nhất bao gồm p.E252K, p.G393S, c.1231G>A và p.A541D Đến nay, đã xác định được 44 đột biến sai nghĩa, trong đó 70% (30 đột biến) nằm trong vùng mang (carrier domain) và 30% (14 đột biến) nằm trong vùng điều khiển, ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển hoặc điều hòa canxi Đặc biệt, không có biến thể sai nghĩa nào được phát hiện trong chuỗi xoắn lưỡng cực ở đầu C, mặc dù nó được coi là quan trọng cho việc điều khiển gen.

Trong một nghiên cứu về bệnh nhân có alen bị đột biến, 53% bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử, trong khi 47% có đột biến đồng hợp tử Đặc biệt, 42% trong số những người mang đột biến gen đồng hợp tử có đột biến c.851_854del Sự kết hợp của các alen khác nhau ở những bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức năng của citrin, vì nó liên quan đến việc hình thành dimer.

Bệnh thiếu hụt Citrin và đột biến gen SLC25A13 có tính chất sắc tộc, với tỷ lệ phát hiện và tần suất khác nhau giữa các quốc gia Các đột biến c.851_854del và c.1638_1660dup phổ biến ở các nước châu Á, đặc biệt là Nhật Bản, Việt Nam và Trung Quốc Đột biến IVS11+1G>A xuất hiện ở Nhật Bản và Hàn Quốc, trong khi p.S225* chỉ được phát hiện ở Nhật Bản và IVS6+5G>A ở Trung Quốc Tỷ lệ phát hiện đột biến gen SLC25A13 cao nhất ở Hàn Quốc và Đài Loan, với c.851_854del, c.1638_1660dup và IVS lần lượt chiếm 17%, 33% và 33% Sàng lọc 12 đột biến ở Hàn Quốc cho thấy IVS11+1G>A và các đột biến khác như IVS16ins3kb, c.851_854del và c.1177+1G>A cũng có tỷ lệ phát hiện đáng kể.

IV (15) Một nghiên cứu Nhật Bản nhận thấy rằng tần số đột biến IV khác nhau trong NICCD người bệnh và nhóm chứng (12)

Nghiên cứu của Yasuda và cộng sự về citrullinemia loại II khởi phát ở người lớn tại Nhật Bản đã phát hiện hai đột biến mới trên gen SLC25A13, cho thấy tần số mang đột biến gen này cao Trong nghiên cứu, 7 đột biến đã được sàng lọc, bao gồm 5 đột biến đã biết từ I đến V và 2 đột biến mới được xác định là VI và VII, trên 103 bệnh nhân CTLN2 được chẩn đoán qua các xét nghiệm sinh hóa và enzym Kết quả cho thấy 102 bệnh nhân mang ít nhất một trong bảy đột biến, trong đó 93 bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử Tác giả kết luận rằng citrullinemia loại II khởi phát ở người lớn là do sự mất hoàn toàn Citrin.

Nhóm đột biến phổ biến ở Thổ Nhĩ Kỳ bao gồm c.851_854del, IVS16ins, và c.1638_1660dup với tỷ lệ lần lượt là 42,41%, 16,46% và 6,33% Nghiên cứu trên nhóm bệnh nhân thiếu hụt Citrin tại Trung Quốc đã xác định 53 kiểu gen, trong đó chỉ có c.851_854del/c.851_854del và c.851_854del/c.1399C>T có sự phân bố địa lý khác nhau Tỷ lệ dị hợp tử đột biến SLC25A13 ở dân số phía bắc cao hơn so với phía nam Tại Đông Nam Á, nghiên cứu về bệnh thiếu hụt Citrin chỉ được công bố tại Thái Lan, và hiện chưa có tài liệu từ các quốc gia khác.

1.3.2 Tình hình nghiên cứu đột biến gen SLC25A13 tại Việt Nam

Người bệnh thể NICCD của Việt Nam được đề cập trong nghiên cứu năm 2002

Hai ca NICCD đầu tiên được phát hiện có đột biến c.851_854del là những người Việt Nam, hiện đang sinh sống tại Australia và Hoa Kỳ.

Nghiên cứu năm 2008 của Tabata và cộng sự đã phát hiện 4 bệnh nhân NICCD mang đột biến đồng hợp tử Đến năm 2009, nghiên cứu đầu tiên về 9 ca bệnh thiếu hụt Citrin tại Việt Nam cho thấy có 3 ca với đột biến đồng hợp tử c.851_854del, 1 ca dị hợp tử kép c.615+5G>A và IVS16ins, cùng 1 ca dị hợp tử với đột biến c.851_854del Năm 2013, nghiên cứu trên 324 bệnh nhân nghi ngờ thiếu hụt Citrin phát hiện 36 trường hợp có đột biến trên 2 alen, trong đó đột biến c.851_854del chiếm ưu thế Tuy nhiên, hai nghiên cứu này chỉ tập trung vào việc sàng lọc 4 đột biến trên gen SLC25A13, dẫn đến việc một số bệnh nhân có thể bị bỏ sót và không được điều trị kịp thời.

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Phạm Anh Hoa về lâm sàng và cận lâm sàng của NICCD ở trẻ em Việt Nam cho thấy các đặc điểm này không khác biệt nhiều so với các công bố quốc tế Tỷ lệ bệnh nhân có diễn biến tốt sau điều trị đạt 82%, trong khi nhóm có tiên lượng xấu chỉ chiếm 5,3%, với các triệu chứng như xơ gan, chậm phát triển thể chất, và tăng áp lực tĩnh mạch cửa Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng đối với y khoa và nhi khoa, cung cấp thêm hiểu biết về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của trẻ mắc NICCD, từ đó nâng cao kinh nghiệm trong chẩn đoán và điều trị bệnh thiếu hụt Citrin.

1.3.3 Kỹ thuật phát hiện đột biến gen và ý nghĩa của chẩn đoán phân tử bệnh thiếu hụt Citrin

Bệnh nhân mang đột biến gen SLC25A13 có biểu hiện lâm sàng đa dạng, từ không có triệu chứng trong giai đoạn sơ sinh cho đến rối loạn chức năng gan.

Chẩn đoán bệnh thiếu hụt Citrin là cần thiết ngay cả khi kết quả sàng lọc sơ sinh bình thường Sự hiện diện của u mạch máu gan ở bệnh nhân đã mở rộng phạm vi lâm sàng và định hướng chẩn đoán Biểu hiện vàng da ứ mật ở trẻ sơ sinh giai đoạn muộn cho thấy bệnh thiếu hụt Citrin có thể liên quan đến nhiều kiểu hình lâm sàng khác nhau, không nhất thiết xuất hiện trong một khung thời gian cụ thể Hạ đường huyết và sở thích đặc biệt với thực phẩm giàu protein cũng có thể là dấu hiệu để bác sĩ lâm sàng nghi ngờ về tình trạng thiếu Citrin, ngay cả khi không có triệu chứng khác.

Giới thiệu về địa điểm nghiên cứu

Bệnh viện Nhi Trung ương, bắt nguồn từ khoa Nhi của bệnh viện Bạch Mai, đã trải qua 52 năm phát triển với đội ngũ bác sĩ và nhân viên không ngừng nỗ lực chăm sóc sức khỏe trẻ em Việt Nam Để đáp ứng nhu cầu chẩn đoán và điều trị bệnh lý bẩm sinh, Khoa Di truyền và sinh học phân tử đã được thành lập, với sự hỗ trợ đào tạo từ các chuyên gia quốc tế Việc chẩn đoán các bệnh lý di truyền ở trẻ em, bao gồm bất thường nhiễm sắc thể và các bệnh lý di truyền đơn gen, đã nâng cao hiệu quả lâm sàng và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

Khoa Di truyền phân tử đã đóng góp quan trọng vào sự phát triển của bệnh viện nhờ hệ thống máy móc hiện đại và đồng bộ Hiện tại, khoa được trang bị nhiều thiết bị tiên tiến như hệ thống phân tích nhiễm sắc thể, hệ thống giải trình tự gen Sanger (ABI, Hoa Kỳ), hệ thống aCGH (Illumina) và máy PCR (Eppendorf, Hoa Kỳ), cùng với các thiết bị điện di và phụ trợ được bảo trì định kỳ Đặc biệt, khoa đã đạt chứng chỉ ISO 15189 từ năm 2014 và duy trì chất lượng ổn định trong nhiều năm, khẳng định hệ thống chất lượng cao và đáng tin cậy của mình.

Khoa Di truyền và sinh học phân tử là đơn vị hàng đầu trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh lý di truyền ở trẻ em, bao gồm bệnh cơ, thiếu máu huyết tán, rối loạn chuyển hóa di truyền và các bệnh miễn dịch di truyền Đây cũng là đơn vị duy nhất tại Việt Nam thực hiện các xét nghiệm di truyền cho nhiều bệnh lý bẩm sinh như Teo cơ tủy, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, Bệnh Wilson, và bệnh thiếu hụt Citrin, cùng với nhiều bệnh lý di truyền hiếm gặp khác Nhờ vào sự chuyên sâu này, Khoa đã góp phần quan trọng trong việc điều trị và nâng cao chất lượng sống cho người bệnh.

Khoa Di truyền và Sinh học phân tử hiện là đơn vị xét nghiệm tham chiếu cho nhiều cơ sở y tế trong cả nước, chuyên xét nghiệm các bệnh di truyền và bất thường nhiễm sắc thể Với việc triển khai thành công nhiều kỹ thuật cao và chuyên sâu, khoa đã nâng cao vị thế của mình cũng như Bệnh viện Nhi Trung ương Đặc biệt, bệnh viện là đơn vị duy nhất tại Việt Nam tiếp nhận khám, chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân mắc thiếu hụt citrin, từ đó tạo ra nguồn mẫu nghiên cứu phong phú để thực hiện các nghiên cứu về đặc điểm đột biến và kiểu gen của bệnh nhân này.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Trẻ em từ 0-1 tuổi đã được chẩn đoán mắc bệnh thiếu hụt Citrin tại Khoa Gan-Mật, Bệnh viện Nhi Trung ương Để xác định tính di truyền của đột biến chưa được công bố, mẫu máu của cả bố và mẹ sẽ được thu thập để tiến hành nghiên cứu.

Người bệnh mắc bệnh thiếu hụt Citrin thường có các triệu chứng như vàng da kéo dài, giảm protein huyết, tăng bilirubin và NH3, hạ đường huyết, cùng với sự gia tăng nhiều loại axit amin như Threonine, Citrulline, Methionine, Tyrosine, Phenylalanine, Lysine và Arginine.

Nghiên cứu chọn mẫu có chủ đích như sau:

- Giai đoạn hồi cứu: Chọn hết người bệnh đã có 2 đột biến gen SLC25A13

- Giai đoạn tiến cứu: Chọn người bệnh dựa trên chẩn đoán bệnh thiếu hụt Citrin của bác sĩ lâm sàng để phát hiện đột biến

- Người bệnh không có phiếu thông tin người bệnh hoặc thông tin về đột biến gen trong bệnh án

- Người bệnh chỉ có đột biến dị hợp tử hoặc không có đột biến gen SLC25A13.

Thời gian thu thập số liệu và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử của Bệnh viện Nhi Trung ương, địa chỉ 18/879 La Thành, Đống Đa, Hà Nội, trong khoảng thời gian từ tháng 05 đến tháng 07 năm 2022.

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu về đột biến gen SLC25A13 ở bệnh nhân thiếu hụt Citrin đã được thực hiện để xác định các dạng đột biến đồng hợp tử và dị hợp tử kép Nghiên cứu chia thành hai giai đoạn: từ tháng 11/2021 đến tháng 4/2022, tiến hành nghiên cứu hồi cứu và mô tả cắt ngang thông qua phiếu thông tin và bệnh án; từ tháng 5/2022 đến tháng 7/2022, thực hiện nghiên cứu tiến cứu và mô tả cắt ngang.

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Cỡ mẫu

Giai đoạn hồi cứu từ tháng 11/2021 đến tháng 04/2022 đã được thực hiện với 113 bệnh nhân thông qua hồ sơ bệnh án và phiếu thông tin Nghiên cứu tập trung vào việc thu thập tên đột biến và kiểu gen của những người bệnh mắc hội chứng thiếu hụt Citrin.

Giai đoạn tiến cứu từ tháng 05/2022 đến tháng 07/2022 đã phát hiện 9 bệnh nhân mang đột biến gen SLC25A13, gây ra bệnh thiếu hụt Citrin tử Nghiên cứu này tập trung vào việc thu thập thông tin về tên đột biến và kiểu gen của các bệnh nhân bị thiếu hụt Citrin.

Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu có chủ đích để nghiên cứu những bệnh nhân bị thiếu hụt Citrin, bao gồm những người có 2 đột biến gen dị hợp tử hoặc 1 đột biến đồng hợp tử Những bệnh nhân này đến từ các gia đình khác nhau.

Phương pháp thu thập số liệu

Thông tin về đột biến gen SLC25A13 của người bệnh được lưu trữ trong hồ sơ bệnh án hoặc phiếu thông tin cá nhân Nghiên cứu sẽ ghi nhận các thông tin liên quan đến đột biến gen, bao gồm tên đột biến, loại đột biến và kiểu gen của bệnh nhân.

Biến số nghiên cứu

Bảng 2.1 Các biến số trong nghiên cứu

STT Tên biến Loại biến Định nghĩa của biến

1 Kiểu gen Biến phân loại Mô tả tình trạng mang đột biến trên

2 alen của người bệnh Đồng hợp tử

Dị hợp tử kép Không có đột biến

2 Đột biến Biến phân loại Là những thay đổi xẩy ra trên gen và đã được chứng minh là gây bệnh

Nhiều tên khác nhau tương ứng với tên khác nhau được viết theo đúng qui ước quốc tế

3 Biến thể Biến phân loại Là những thay đổi xẩy ra trên gen và chưa được chứng minh ảnh hưởng

Nhiều tên khác nhau tương ứng với tên khác nhau được viết theo đúng qui ước quốc tế

STT Tên biến Loại biến Định nghĩa của biến

Giá trị của biến của chúng đến biểu hiện bệnh

Biến phân loại mô tả các loại đột biến gen, bao gồm đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung, đột biến thay thế và đột biến vùng cắt, nối Đột biến vô nghĩa xảy ra khi một nucleotide được thay đổi, dẫn đến việc tạo ra một mã dừng sớm Đột biến dịch khung xảy ra khi có sự thay đổi trong số lượng nucleotide, làm thay đổi toàn bộ chuỗi amino acid Đột biến thay thế là khi một nucleotide trong chuỗi gen được thay thế bằng một nucleotide khác mà không làm thay đổi khung đọc Cuối cùng, đột biến vùng cắt, nối ảnh hưởng đến cách mà gen được cắt và nối, có thể dẫn đến sản phẩm protein bất thường.

5 Vùng gen Biến phân loại Là các vị trí trên gen

6 Tỷ lệ đột biến Biến phân loại Tỷ lệ % tương ứng của các đột biến

7 Tuổi Biến định lượng (biến liên tục)

Tuổi của người bệnh tính đến thời điểm tiến hành nghiên cứu được tính bằng cách lấy năm thực hiện nghiên cứu trừ đi năm sinh

Nhiều giá trị khác nhau

Là giới tính thật theo giấy khai sinh

Các khái niệm, quy trình kỹ thuật sử dụng

2.8.1 Điều kiện bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm để phát hiện đột biến gen SLC25A13 trong nghiên cứu là 2 ml máu ngoại vi, được lấy vô trùng vào ống chống đông EDTA và bảo quản ở nhiệt độ từ -20ºC đến 4ºC Mẫu này cần được vận chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 72 giờ để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

2.8.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất, thiết bị và vật liệu tiêu hao được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Phụ lục 6 Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại gen SLC25A13 bao gồm 22 cặp mồi, mỗi cặp gồm một mồi xuôi và một mồi ngược (25, 26, 30) như thể hiện trong Bảng 2.2, 2.3 và 2.4 Đặc biệt, mười tám cặp mồi giải trình tự gen đã được Trung tâm Y tế Asan tại Hàn Quốc cung cấp.

Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi kiểm tra lại đột biến mới

Tên mồi Trình tự mồi Kích thước sản phẩm PCR

Bảng 2.3 Trình tự 4 cặp mồi của phản ứng PCR/PCR-RFLP

Tên mồi Trình tự mồi Kích thước sản phẩm

Bảng 2.4 Trình tự 18 cặp mồi dùng trong giải trình tự gen

Tên mồi Trình tự mồi Kích thước sản phẩm PCR

Tên mồi Trình tự mồi Kích thước sản phẩm PCR

2.8.3 Kỹ thuật sinh học phân tử được dùng để phát hiện đột biến gen SLC25A13

Kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong Phục lục 7

- Mẫu DNA đạt tiờu chuẩn khi nồng độ DNA tổng số >10 ng/àl và độ tinh sạch

Trong quy trình PCR, mẫu trắng không chứa DNA được sử dụng để đảm bảo rằng hóa chất không bị ảnh hưởng bởi DNA ngoại nhiễm, và sản phẩm PCR của mẫu này không hiển thị băng trên hình ảnh điện di Đồng thời, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương cũng được tiến hành song song; hình ảnh điện di của mẫu chứng âm sẽ cho thấy sản phẩm tương ứng với đoạn DNA không bị đột biến, trong khi mẫu chứng dương phải có các đoạn DNA có kích thước tương ứng với kết quả của loại đột biến đã biết.

- Kết quả điện di phải rõ ràng, tín hiệu không bị nhiễu, các băng sản phẩm PCR sáng và đúng kích thước lý thuyết

- Trình tự gen thu được đúng với kích thước lý thuyết, tín hiệu rõ ràng

2.8.3.2 Đánh giá kết quả xét nghiệm

Kết quả từ kỹ thuật PCR/PCR-RFLP cho phép so sánh sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân với mẫu chứng, từ đó đưa ra những kết luận rõ ràng (Bảng 2.5).

Bảng 2.5 Kích thước sản phẩm cắt enzyme của các đột biến được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR/PCR-RFLP

Tên đột biến Kích thước các băng trên hình ảnh điện di (bp)

Không bị đột biến Dị hợp tử Đồng hợp tử Đột biến I 174, 118 292, 174, 18 288 Đột biến III 123 123, 146 146 Đột biến X 225 bp, 119, 72 225, 180, 119, 72, 45 180, 119, 72, 45 Đột biến IVS16ins 385 385, 3500 3500

2.8.3.3 Nhận định kết quả giải trình tự gen

Các nucleotide được đánh dấu huỳnh quang sẽ tương ứng với các đỉnh màu sắc khác nhau sau khi thực hiện giải trình tự Cụ thể, nucleotide A sẽ có màu xanh lá cây, tạo nên sự phân biệt rõ ràng trong quá trình phân tích.

Trong nghiên cứu di truyền, nucleotide T được biểu thị bằng màu đỏ, G bằng màu đen, và C bằng màu xanh da trời Đột biến đồng hợp tử xảy ra khi có sự thay thế nucleotide tại cùng một vị trí trên cả hai bản sao của gen, chỉ có thể phát hiện khi so sánh với trình tự chuẩn Ngược lại, đột biến dị hợp tử sẽ tạo ra hai đỉnh tín hiệu khác nhau tại vị trí đột biến do trình tự đã thay đổi Đối với đột biến thêm hoặc mất nucleotide, nếu là đồng hợp tử, cả hai bản sao sẽ mất nucleotide giống nhau, và chỉ có thể nhận biết khi so sánh với trình tự gen chuẩn Trong trạng thái dị hợp tử, chỉ một bản sao bị đột biến, dẫn đến sự xáo trộn nucleotide và tạo ra các đỉnh tín hiệu chồng lên nhau tại vị trí đột biến Sự xuất hiện của một hoặc hai đỉnh tại cùng một vị trí cho thấy sự khác biệt hoặc tương đồng giữa nucleotide trên bản sao bình thường và bản sao bị đột biến.

2.8.3.4 Cách viết tên đột biến

Mutations are named according to international nomenclature standards, specifically following the guidelines set by the Human Genome Variation Society (HGVS) These mutations are then compared with publicly available genetic mutation data in the Human Gene Mutation Database (HGMD) to ensure accuracy and consistency Additionally, they are verified against the data systems of ongoing research projects.

2.8.3.5 Cách nhận định kiểu gen

Kiểu gen của người bệnh sẽ được biểu thị bằng các đột biến được tìm thấy trên

Bệnh nhân có thể mang hai alen của gen, ví dụ như trường hợp đột biến đồng hợp tử c.851_854del được ký hiệu là c.851_854del/c.851_854del Kiểu gen của bệnh nhân có ba dạng: đột biến đồng hợp tử, đột biến dị hợp tử kép và đột biến dị hợp tử, với các nhận định cụ thể cho từng dạng.

Đột biến đồng hợp tử xảy ra khi người bệnh mang 2 đột biến dị hợp tử giống nhau tại cùng một vị trí trên 2 alen khác nhau của gen SLC25A13 Điều này có thể ảnh hưởng đến chức năng của gen và gây ra các vấn đề sức khỏe liên quan.

- Đột biến dị hợp tử kép: Nếu 2 đột biến dị hợp tử xảy ra tại 2 vị trí khác nhau

- Kiểu gen dị hợp tử: Nếu người bệnh có duy nhất một đột biến dị hợp tử.

Phương pháp phân tích số liệu

2.9.1.1 Phân tích tỷ lệ đột biến gen

Số liệu các loại đột biến trong nghiên cứu được thu thập và phân tích bằng chương trình excel

2.9.1.2 Phân tích đột biến mới bằng các chương trình chuyên dụng

Để thu thập và xử lý số liệu giải trình tự gen, các trình tự gen được thu thập bằng phần mềm Sequencing analysis v3.1 và phân tích trên phần mềm Chromas/Chromas Pro Những trình tự gen này sẽ được so sánh với trình tự chuẩn đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank) Cụ thể, trình tự tham khảo của gen SLC25A13 trên ngân hàng gen quốc tế là NG_012247.1.

Phương pháp thiết kế trình tự mồi sử dụng chương trình Primer3 để tạo ra các trình tự mồi hiệu quả Trình tự gen tham khảo được áp dụng trong nghiên cứu này là NG_012247.1, nhằm khuyếch đại đoạn gen từ vị trí 49810 đến 49952.

Phương pháp dự đoán ảnh hưởng của các đột biến mới liên quan đến việc xác định các biến thể chưa được báo cáo trên bệnh nhân thiếu hụt Citrin Những biến thể này sẽ được phân tích để dự đoán ảnh hưởng đến sản phẩm protein thông qua các chương trình tin sinh như MutationTaster, Provean và Polyphen-2, nhằm xác định xem chúng là đột biến hay đa hình (phân tích in silico).

2.9.1.3 Cách gọi tên, phân loại những thay thế nucleotide trên gen

Phân loại các biến thể theo hướng dẫn của Hội di truyền Hoa kỳ (https://varsome.com/about/resources/acmg-implementation/).

Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu được thông qua hội đồng đạo đức của trường Đại học Y tế công cộng, mã số: 150/2022/YTCC-HD3 ngày 19/05/2022

Kết quả nghiên cứu sẽ được bảo mật và chỉ được thông báo cho bác sĩ điều trị cùng với bệnh nhân hoặc người giám hộ của họ Tất cả bệnh nhân, cũng như cha mẹ hoặc người giám hộ, cần ký vào phiếu thông tin bệnh nhân.

Hạn chế của nghiên cứu, sai số và biện pháp khắc phục sai số

- Hạn chế: 109 người bệnh thiếu hụt Citrin chưa được giải trình tự trực tiếp Sanger cho 18 exon của gen SLC25A13 do chi phí cao

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Xác định các đột biến gen SLC25A13

3.1.1 Đặc điểm chung của người bệnh trong nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào nhóm CD thuần tập lớn nhất tại Việt Nam, bao gồm 76 nam và 46 nữ từ 122 gia đình ở miền Bắc, với tỷ lệ giới tính khoảng 1,7:1 Tuổi khởi phát trung bình của bệnh nhân là 3,05 tháng, với độ lệch chuẩn là 1,61.

Bảng 3.1 Phân bố người bệnh theo giới và độ tuổi phát bệnh trung bình

Giới Số người bệnh Độ tuổi phát bệnh trung bình (tháng)

Để chẩn đoán bệnh thiếu hụt Citrin, máu ngoại vi của bệnh nhân sẽ được tách DNA tổng số và kiểm tra chất lượng Kết quả cho thấy DNA tổng số của bệnh nhân đạt yêu cầu để thực hiện các phản ứng PCR tiếp theo.

3.1.2 Mô tả các đột biến gen SLC25A13 được phát hiện trong nghiên cứu

Trong tổng số 122 người bệnh bị thiếu hụt Citrin, 99 người bệnh có kiểu gen đồng hợp tử và 23 người bệnh có kiểu gen dị hợp tử hợp kép (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Tóm tắt kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong chẩn đoán bệnh thiếu hụt Citrin

Số người bệnh Kỹ thuật chẩn đoán được sử dụng

PCR/PCR-RFLP Giải trình tự gen

3.1.3.2 Đột biến gen SLC25A13 được sàng lọc bằng phản ứng PCR và PCR-

Qua phân tích kết quả, 121 người bệnh có đột biến số c.851_854del (Hình 3.1) trong đó 97 người đồng hợp tử và 21 người bệnh dị hợp tử

Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme của đột biến c.851_854del

M: Thang DNA chuẩn 100 bp, 1 Mẫu chứng không có đột biến; 2 Mẫu chứng người bệnh đột biến dị hợp tử; 3: Mẫu chứng người bệnh đột biến đồng hợp tử; 4 và 8: Người bệnh bị đột biến đồng hợp tử; 5: Người bệnh không có đột biến I; 6-7: Người bệnh bị đột biến dị hợp tử; BC: Mẫu trắng không chứa DNA (Blank control)

Sản phẩm PCR ở người không có đột biến c.851_854del có kích thước 292 bp, trong khi người có đột biến này có sản phẩm PCR kích thước 288 bp do mất đoạn 4 bp Khi sử dụng enzyme cắt giới hạn, sản phẩm PCR của người không có đột biến sẽ được cắt thành hai đoạn 118 bp và 174 bp Ngược lại, ở người có đột biến, trình tự gen không còn điểm cắt nhận diện, do đó không bị cắt Cụ thể, bệnh nhân đồng hợp tử đột biến c.851_854del sẽ cho kết quả điện di với kích thước 288 bp, trong khi bệnh nhân dị hợp tử sẽ có ba băng khác nhau, với băng cao nhất 288 bp thể hiện trình tự bị đột biến và hai băng còn lại có kích thước 174 bp và 118 bp từ trình tự không bị đột biến.

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có hai bệnh nhân thiếu hụt citrin mang đột biến c.1638_1660dup Cả hai bệnh nhân này đều có kiểu gen dị hợp tử kép, bao gồm đột biến c.1638_1660dup và c.851_854del.

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đột biến c.1638_1660dup

M: Thang DNA chuẩn 100 bp, 1 Mẫu chứng không có đột biến; 2 Mẫu chứng người bệnh đột biến dị hợp tử; 3-7: Mẫu người bệnh không có đột biến; BC: Mẫu trắng không chứa DNA (Blank control) Đột biến c.1638_1660dup là đột biến thêm đoạn 23 bp trên exon 16 Với cặp mồi đã được thiết kế cho đột biến c.1638_1660dup, sản phẩm PCR sau điện di của người không bị đột biến là 123 bp trong người bị đột biến sẽ là 146 bp Như vậy, kết quả điện di của người bị đột biến dị hợp tử đột biến c.1638_1660dup sẽ có 2 băng, kích thước lần lượt là 123 bp và 146 bp (Hình 3.2) Đột biến c.615+5G>A được phát hiện trên 3 người bệnh thiếu hụt citrin có kiểu gen dị hợp tử kép giữa đột biến c.615+5G>A và đột biến c.851_854del Đột biến c.615+5G>A là đột biến điểm, đột biến này làm thay đổi nucleotid A thành G ở vị trí

Vị trí 615 trên cDNA của gen SLC25A13 nằm trong intron 6, nơi xảy ra đột biến tạo thêm điểm cắt cho enzyme TasI Kết quả là, sản phẩm PCR ở người không có đột biến sẽ được cắt thành 6 đoạn với kích thước 12, 18, 21, 72, 119, và 225 bp Ngược lại, ở người có đột biến, đoạn gen 225 bp sẽ được cắt thành 2 đoạn nhỏ 180 bp và 45 bp Hình ảnh điện di trên thạch agarose 3% chỉ hiển thị 5 băng lớn gồm 45, 72, 119, và 180 bp.

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme của đột biến IVS6+5G>A

(M: Thang DNA chuẩn 100 bp, 1 Mẫu chứng không có đột biến; 2 Mẫu chứng người bệnh đột biến dị hợp tử; 3-6: Mẫu người bệnh không có đột biến; BC: Mẫu

Nghiên cứu phân tích kết quả PCR đã phát hiện 7 bệnh nhân thiếu hụt citrin với đột biến IVS16ins Trong số đó, có 2 bệnh nhân mang kiểu gen đồng hợp tử và 5 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép giữa đột biến IVS16ins và đột biến c.851_854del.

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đột biến IVS16ins

1: Thang DNA chuẩn 1 kb, 2 Mẫu chứng không có đột biến; 3: Mẫu chứng người bệnh đột biến dị hợp tử; 4: Mẫu chứng người bệnh đột biến đồng hợp tử; 5-6: Mẫu người bệnh không có đột biến; 7: Mẫu trắng không chứa DNA (Blank control) Đột biến IVS16ins là một đột biến thêm đoạn trên vùng intron 16 Người không có đột biến này, sản phẩm PCR được tổng hợp từ cặp mồi đã được thiết kế sẵn cho đột biến IVS16ins có kích thước là 343bp, người có đột biến IVS16ins sản phẩm PCR sẽ khoảng 3029 bp (Hình 3.4)

3.1.3.2 Các đột biến được được phát hiện bằng giải trình tự gen trực tiếp Sanger

Phương pháp giải trình tự gen trực tiếp Sanger đã phát hiện thêm 8 đột biến, trong đó có 6 đột biến đã được công bố gồm: c.2T>C, c.135G>C, IVS11+1G>A, c.1399C>T, c.1231G>A, và c.1763G>A Ngoài ra, còn có 2 đột biến mới trên gen SLC25A13.

Đột biến c.2T>C là một dạng đột biến thay thế axit amin, trong đó nucleotide T tại vị trí số 2 của trình tự c.DNA gen SLC25A13 được thay thế bằng C Sự thay đổi này dẫn đến việc mã mở đầu ATG chuyển thành ACG, làm cho axit amin mở đầu Methyonine chuyển thành Threonine Đột biến này đã được phát hiện ở 3 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp kép c.851_854del/c.2T>C.

Đột biến c.135G>C là một đột biến sai nghĩa được phát hiện ở một bệnh nhân duy nhất mang kiểu gen dị hợp tử kép c.851_854del/c.135G>C Đột biến này làm nucleotide G tại vị trí 135 trên c.DNA của gen SLC25A13 chuyển thành C, dẫn đến sự thay đổi mã bộ ba từ TTG thành TTC, gây ra sự chuyển đổi axit amin Leucine thành Phenylalanine tại vị trí 45 trong trình tự polypeptide của gen.

Đột biến IVS11+1G>A (Hình 3.7) là một trong ba đột biến vùng intron được phát hiện trong nghiên cứu, xuất hiện ở ba bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép Đột biến này gây ra sự chuyển đổi nucleotide G thành A tại vị trí 1177 trên c.DNA của gen, cụ thể là ở vùng intron 11, cách vị trí này một nucleotide.

Hình 3.8 Hình ảnh trình tự gen có đột biến I Đột biến I, có tên theo danh pháp quốc tế là c.851_854del là một đột biến mất

Đột biến 4 nucleotide GTAT tại exon 9 của gen SLC25A13 đã được phát hiện ở 120 bệnh nhân, dẫn đến mất 4 nucleotide từ vị trí 851 đến 854 trên c.DNA Sự thay đổi này làm thay đổi khung đọc mở của gen, khiến sản phẩm protein bị rút ngắn Mặc dù axit amin Arginine tại vị trí 284 không bị ảnh hưởng, mã bộ ba CGT đã chuyển thành CGA, tạo ra mã kết thúc sớm cách vị trí axit amin bị thay đổi 3 axit amin Đột biến c.851_854del xuất hiện ở 97 bệnh nhân với kiểu gen đồng hợp tử và 23 bệnh nhân với kiểu gen dị hợp tử kép kết hợp với một đột biến khác.

Đột biến c.1231G>A là một đột biến sai nghĩa xảy ra trên exon 13, được phát hiện ở bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử kép c.1231G>A/c.1763G>A Cả hai đột biến này chỉ được phát hiện trên một bệnh nhân duy nhất, và nguyên nhân của đột biến này là do sự thay đổi nucleotide.

G ở vị trí 1231 thành nucleotide A trên c.DNA của gen SLC25A13 dẫn đến axit amin Valine bị thay đổi thành Methyonine ở vị trí 411 trên chuỗi polypeptide của gen

SLC25A13 (Hình 3.9) Tương tự, đột biến c.1763G>A là đột biến sai nghĩa trên exon

17, do nucleotide G chuyển thành A ở vị trí 1763 khiến cho axit amin Arginine ở vị trí 588 trên trình tự polypeptide thành axit amin Glutamine (Hình 3.10)

Hình 3.10 Hình ảnh trình tự gen có đột biến c.1763G>A

Tỷ lệ kiểu gen và các đột biến gen SLC25A13

Kết quả nghiên cứu cho thấy, 99 người bệnh có kiểu gen đồng hợp tử và 23 người bệnh có kiểu gen dị hợp tử kép (Bảng 3.3)

Bảng 3.3 Tỷ lệ các loại kiểu gen trong nghiên cứu Kiểu gen (alen/alen) Số người bệnh Tỷ lệ (%, n2) Đồng hợp tử 99 81.15

Chú thích: n: tổng số người bệnh nghiên cứu

Bảng 3.4 Các loại kiểu gen của người bệnh

Kiểu gen Vị trí Số người bệnh

Tỷ lệ (%, n2) c.851_854del/c.851_854del Ex9/Ex9 97 79,51 c.851_854del/c.1638_1660dup Ex9/Ex16 2 1,64 c.851_854del/c.615+5G>A Ex9/Int6 3 2,46 c.851_854del/IVS16ins Ex9/Int16 5 4,10

IVS16ins/IVS16ins Int16/Int16 2 1,64 c.851_854del/c.2T>C Ex9/Ex1 3 2,46 c.851_854del/c.135G>C Ex9/Ex3 1 0,82 c.851_854del/IVS11+1G>A Ex9/Int11 3 2,46 c.851_854del/c.1399C>T Ex9/Ex14 3 2,46 c.851_854del/[c.1956C>A;c.1962del] Ex9/ Ex 18 1 0,82 c.851_854del/c.70-63_132del Ex9/Ex3 1 0,82 c.1231G>A/c.1763G>A Ex13/Ex17 1 0,82

Chú thích: n (tổng số người bệnh nghiên cứu); Ex (Exon); Int (Intron)

Trong nghiên cứu với 99 bệnh nhân, 97 người mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến c.851_854del, trong khi 2 người có kiểu gen đồng hợp tử đột biến IVS16ins Ngoài ra, có 23 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép, trong đó 22 người có kiểu gen dị hợp tử kép giữa đột biến I và các đột biến khác như c.1638_1660dup, c.615+5G>A, IVS16ins, c.2T>C, c.135G>C, c.1399C>T, c.70-63_132del, [c.1956C>A;c.1962 del], IVS11+1G>A Đặc biệt, 1 trong số 23 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép c.1231G>A/c.1763G>A được phát hiện thông qua giải trình tự gen.

Nghiên cứu đã xác định nhiều kiểu gen khác nhau ở bệnh nhân, bao gồm 2 người với kiểu gen c.851_854del/c.1638_1660dup, 3 người với c.851_854del/c.615+5G>A, 5 người với c.851_854del/IVS16ins, và 12 người có kiểu gen dị hợp tử kép với một đột biến I và một đột biến khác được phát hiện qua giải trình tự gen Đặc biệt, một bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép c.1231G>A/c.1763G>A.

Trong nghiên cứu, phần lớn các đột biến được xác định là dị đồng hợp tử c.851_854del hoặc dị hợp tử kép với đột biến c.851_854del, chiếm tỷ lệ 13/23 Ngoài ra, có một trường hợp bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử kép với hai đột biến sai nghĩa là c.1231G>A và c.1763G>A.

3.2.2 Tỷ lệ các loại đột biến gen SLC25A13

Phân tích kết quả cho thấy có sự hiện diện của nhiều loại đột biến gen SLC25A13 ở người bệnh, bao gồm 2 đột biến vùng cắt nối, 2 đột biến vô nghĩa, 4 đột biến sai nghĩa và 4 đột biến lệch khung hình (Bảng 3.6).

Bảng 3.5 Các loại đột biến trong nghiên cứu

Số thứ tự Loại đột biến Số lượng đột biến

4 Đột biến vùng cắt nối 2

Tổng cộng, 12 đột biến gen khác nhau được phát hiện ở người bệnh thiếu hụt Citrin trong nghiên cứu bao gồm 10 đột biến đã được công bố: c.851_854del,

IVS11+1G>A, c.1638_1660dup, IVS6+5G>A, IVS16ins, c.2T>C, c.135G>C, c.1231G>A, c.1399C>T, c.1763G>A và 2 đột biến mới: [c.1956C>A;c.1962 del], c.70-63_132del (Bảng 3.5)

Đột biến gen SLC25A13 phổ biến nhất là c.851_854del, tiếp theo là đột biến IVS16ins Các đột biến khác có tần suất phát hiện thấp, chỉ dao động từ 1% đến 3%.

Bảng 3.6 Kết quả xác định tỷ lệ các loại đột biến gen SLC25A13

Viết tắt Tên đột biến (c.DNA, axit amin) Vị trí trên gen

Số alen bị đột biến

II c c.1176+1G>A (IVS11+1G>A) intron 11 3 1,23 III c.1638_1660dup (p.A554fs*570) exon 16 2 0,82

XIX IVS16ins (p.A584fs*585) intron 16 8 3,28 Đột biến khác c.2T>C (p.M1T) exon 1 3 1,23 c.135G>C (p.L45F) exon 3 1 0,41 c.1231G>A (p.V411M) exon 13 1 0,41 c.1399C>T (p.R467*) exon 14 3 1,23 c.1763G>A (p.R588Q) (XXIX) exon 17 1 0,41

[c.1956C>A;c.1962 del] p.[Asn652Lys;F654Lfs*45] exon 18

Chú thích: n (tổng số người bệnh nghiên cứu); chữ in đậm: đột biến mới

Bảng 3.7 Sự phân bố các đột biến trên gen SLC25A13

Vị trí trên gen Số lượng đột biến Tỷ lệ (%, n2)

Đột biến trong gen SLC25A13 đã được phát hiện ở cả exon và intron, bao gồm 9 exon (exon 1, exon 3, exon 9, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18) và 3 intron (intron 6, intron 11, intron 16).

Chín đột biến xảy ra trên exon bao gồm c.851_854del, c.1638_1660dup, c.2T>C, c.135G>C, c.1399C>T, c.70-63_132del, [c.1956C>A;c.1962del], c.1231G>A, và c.1763G>A Ngoài ra, có 3 đột biến trên intron là IVS6+5G>A, IVS11+1G>A và IVS16ins Trong số các đột biến này, c.70-63_132del và [c.1956C>A;c.1962del] là hai đột biến mới được công bố lần đầu tiên, trong khi 10 đột biến còn lại đã được ghi nhận trong tài liệu y học.

Bảng 3.8 Phân loại đột biến trên gen SLC25A13 Loại đột biến Số lượng đột biến Tỷ lệ (%, n2) Đã công bố 10 83,33

3.2.3 Đột biến mới trên gen SLC25A13

 Phân tích phả hệ của hai người bệnh có đột biến sai nghĩa mới kết hợp với đột biến lệch khung

Nghiên cứu đã phát hiện hai đột biến mới, p.[N652K;F654Lfs*45] và p.Y24_72Ifs*10 Đột biến p.[N652K;F654Lfs*45] xuất hiện ở một trẻ 1,5 tháng tuổi với kiểu gen dị hợp tử kép (c.851_854del/[c.1956C>A;c.1962del]) Trong khi đó, đột biến p.Y24_72Ifs*10 được phát hiện ở trẻ 27 ngày tuổi cũng có kiểu gen dị hợp tử kép (c.851_854del/c.70-63_132del) Cả hai đột biến này đã được xác nhận trên máu ngoại vi của cha mẹ bệnh nhân.

Bệnh nhân nữ 1,5 tháng (WBCT170102) mang kiểu gen dị hợp tử hợp kép với hai đột biến c.851_854del và [c.1956C>A;c.1962del] Đột biến c.851_854del di truyền từ bố, làm thay đổi khung đọc mở và tạo mã kết thúc sớm, dẫn đến protein bị ngắn Phân tích toàn bộ 18 exon của gen DNA bằng giải trình tự Sanger cho thấy bệnh nhân có thêm một đột biến dị hợp tử [c.1956C>A;c.1962del] ở exon 18 Kết quả sàng lọc cho thấy chị gái bệnh nhân mang gen đột biến c.851_854del, trong khi bố có đột biến c.851_854del và mẹ có đột biến [c.1956C>A;c.1962del].

Hình 3.14 Phả hệ, hình ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme đột biến I và trình tự đoạn gen bị đột biến c.[1956C>A;1962 delT]

Bài viết trình bày về phả hệ của bệnh nhân mã số WBCT170102, nữ giới mang gen bệnh, cùng với các thành viên trong gia đình như nam giới mang gen bệnh và ca chỉ điểm Hình ảnh điện di cho thấy đột biến 851_854del, với các mẫu chứng khác nhau từ không có đột biến đến đồng hợp tử Đặc biệt, đột biến p.[N652K;F654Lfs*45] bao gồm một đột biến sai nghĩa và một đột biến mất nucleotide T, dẫn đến mã kết thúc cách 45 axit amin Trình tự gen của người bệnh và các thành viên trong gia đình được so sánh, với người mẹ không có đột biến và người bố là dị hợp tử.

Sản phẩm PCR của cặp mồi mới được thiết kế thêm có kích thước lý thuyết là

Phân tích hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi mới cho thấy bệnh nhân và mẹ bệnh nhân có hai băng sản phẩm khoảng 539 bp và 344 bp Kết quả giải trình tự gen trực tiếp chỉ ra một đột biến mất đoạn từ intron 2 vào tận exon 3, với đoạn intron bị mất tính từ đầu 5’ của gen SLC25A13 cách nucleotide đầu tiên của exon 3 là 63 nucleotide.

Để xác định chắc chắn rằng đột biến 132 nucleotide của exon 3 là nguyên nhân gây bệnh, nghiên cứu đã thu thập và đối chiếu kết quả xét nghiệm sinh hóa của người bệnh (Bảng 3.9 và 3.10).

Hình 3.15 Phả hệ, điện di agarose của đột biến c.851_854del và trình tự gen có đột biến mới c.70-63_132del

Bài viết trình bày về bệnh nhân WBCT210304, một nữ giới mang gen bệnh và có cha mẹ cũng mang gen bệnh Hình ảnh điện di cho thấy sự hiện diện của đột biến c.851_854del, với các mẫu chứng khác nhau: mẫu chứng bình thường, đồng hợp tử, và dị hợp tử Đặc biệt, hình ảnh điện di của đột biến c.70-63_132del (p.Y24_72Ifs*10) sử dụng cặp mồi bổ sung cho exon 3 và intron liền kề, cho thấy sự khác biệt giữa người bệnh, mẹ và bố Đột biến c.70-63_132del là một biến thể phức tạp, dẫn đến việc mất một đoạn intron trước exon 3 và một phần trình tự gen của exon 3, làm mất 43 aa từ vị trí 24 đến 67 của polypeptit SLC25A13 Các trình tự gen của người bệnh, mẹ và bố được so sánh để xác định sự hiện diện của đột biến.

Bảng 3.9 Xét nghiệm sinh hóa của người bệnh mã số WBCT170102

Tên xét nghiệm Chỉ số bình thường 1,27 m 2,9 m 5,63 m 7,73 m 11 m 13 m

Ghi chú: m: month; T bilirubin: bilirubin toàn phần; D bilirubin: bilirubin trực tiếp; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; GGT, gamma glutamyl transferase; NH3, ammonia; AFP: Alpha fetoprotein; ALP: Alkaline Phosphatase

Bé trai 27 ngày tuổi (WBCT210304) là bệnh nhân thứ hai trong nghiên cứu, là con đầu lòng trong gia đình Bé có hai đột biến dị hợp tử kép: c.851_854del và c.70-63_132del Phân tích DNA của bố mẹ cho thấy đột biến c.851_854del di truyền từ bố, trong khi đột biến c.70-63_132del di truyền từ mẹ.

Bảng 3.10 Xét nghiệm sinh hóa của người bệnh mã số WBCTS210304

Tên xét nghiệm Chỉ số bình thường 0,9 m 2,4 m 4,5 m 9,5 m 15,3 m

AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; GGT, gamma glutamyl transferase; NH3, ammonia; AFP: Alpha fetoprotein; ALP: Alkaline Phosphatase m: month

Người bệnh mã số WBCTS210304 đã trải qua quá trình sàng lọc axit amin để đánh giá sự thay đổi của các axit amin, trong khi người bệnh WBCT170102 lại không thực hiện phân tích axit amin tại thời điểm đó.

Đột biến gen SLC25A13 của người bệnh thiếu hụt citrin

Thiếu hụt citrin là một bệnh di truyền phổ biến ở khu vực Đông và Đông Nam Á, đặc biệt tại Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc và Việt Nam Nghiên cứu này là lần đầu tiên phân tích đột biến gen SLC25A13 trong một nhóm thuần tập lớn nhất ở Việt Nam, khác với các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào số lượng bệnh nhân hạn chế hoặc chỉ mô tả các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng Người bệnh CD thể NICCD tại Việt Nam đã được ghi nhận từ năm 2002.

Hai trường hợp NICCD đầu tiên ở Úc và Hoa Kỳ là người Việt Nam có đột biến I Nghiên cứu của tác giả Saheki cho thấy tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm ưu thế trong CTLN2 với 72 nam so với 31 nữ, trong khi NICCD không có sự khác biệt giới tính (20 nam và 32 nữ) Tuy nhiên, tỷ lệ nam/nữ trong nghiên cứu là 2/1, và nghiên cứu chưa giải thích được lý do cho sự khác biệt này.

Phân tích đột biến gen SLC25A13 là rất quan trọng do sự đa dạng trong triệu chứng lâm sàng của bệnh Hiện tại, đã có hơn 100 đột biến được xác định liên quan đến gen này, gây ra những thách thức trong việc chẩn đoán chính xác.

SLC25A13 đã được xác định với phổ đột biến không đồng nhất, chủ yếu ở các bệnh nhân từ Đông Á Tại Nhật Bản, sáu đột biến phổ biến I, II, III, IV, V, và XIX chiếm 91% tổng số đột biến, và cùng với năm đột biến khác trên exon 17, chúng chiếm 95% tỷ lệ đột biến Đột biến I (c.851_854del), II (IVS11-1G>A), và III (c.1638_1660dup) lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1999, trong khi đột biến XIX (IVS16ins) được phát hiện vào năm 2008 Bốn đột biến này cũng đã được tìm thấy ở các quốc gia Đông Á như Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam.

Các đột biến phổ biến nhất ở bệnh nhân thể NICCD tại Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan bao gồm các đột biến I, II, III, X và XIX Đặc biệt, đột biến I, XIX chiếm ưu thế ở Hàn Quốc, trong khi đột biến II phổ biến ở Nhật Bản nhưng hiếm gặp ở Đài Loan Tại Đài Loan, đột biến I, X và III có tần suất cao trong nhóm trẻ bị NICCD Bên cạnh đó, bốn đột biến I, III, X và XIX cũng xuất hiện với tần suất cao ở người Trung Quốc, với tỷ lệ phát hiện dao động từ 84,47% đến 87% Do đó, việc lựa chọn sàng lọc bốn đột biến đã biết có tỷ lệ phát hiện cao ở Nhật Bản trước khi thực hiện giải trình tự toàn bộ gen SLC25A13 cho bệnh nhân thiếu hụt Citrin là một bước đi hợp lý.

(12,13) Sàng lọc bốn đột biến bao gồm c.851_854del, c.1638_1660dup, IVS6+5G>A và IVS16ins hiệu quả trong chẩn đoán trẻ bị vàng da ứ mật do thiếu hụt

Chẩn đoán trước sinh và xét nghiệm CD là cần thiết cho các gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh, đặc biệt là khi có bốn đột biến quan trọng cần được thực hiện để chẩn đoán phân tử cho những người bị thiếu hụt citrin.

Giải trình tự trực tiếp 18 exon của gen SLC25A13 và các vùng lân cận đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán hiệu quả hơn nhờ phân tích đột biến toàn bộ gen Tỷ lệ đột biến được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger dao động từ 2,21% đến 12,5%, chứng minh hiệu quả của phương pháp này Qua giải trình tự gen, đã phát hiện thêm 8 đột biến, trong đó bốn đột biến c.851_854del, c.1638_1660dup, IVS6+5G>A và IVS16ins chiếm 83,19% tổng số alen SLC25A13 bị đột biến, tạo thành nhóm đột biến tần số cao trong nhóm CD Trung Quốc Kỹ thuật giải trình tự cũng phát hiện 22 đột biến khác với tỷ lệ 14,11%, trong khi tỷ lệ đột biến không xác định chỉ là 2,7% Tại Nam Trung Quốc, 4 đột biến tần số cao chiếm 87,9% tổng số alen đột biến, trong khi miền Bắc chỉ đạt 63,6%, cho thấy sự khác biệt phân bố đột biến giữa hai khu vực có ý nghĩa thống kê Giải trình tự gen là kỹ thuật bổ sung cần thiết để chẩn đoán bệnh thiếu hụt Citrin và làm đa dạng dữ liệu đột biến gen SLC25A13.

Tuy đột biến dịch khung có tỷ lệ phát hiện cao nhất, nhưng đột biến sai nghĩa lại là loại đột biến chiếm ưu thế nhất trên gen SLC25A13 ở người Trung Quốc, với 59,67% Ngược lại, tỷ lệ phát hiện các đột biến sai nghĩa rất nhỏ so với đột biến thêm hoặc mất đoạn, trong khi đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn nhỏ chiếm tới 93,85% Nghiên cứu đã ghi nhận 114 đột biến gen SLC25A13 trên toàn thế giới, bao gồm 69 đột biến sai nghĩa và vô nghĩa So với nghiên cứu trên 116 bệnh nhân thiếu hụt Citrin ở Trung Quốc, số đột biến phát hiện trong nghiên cứu này là rất nhỏ, với 27 đột biến khác nhau, trong đó có 15 đột biến mới Đột biến gen SLC25A13 được tìm thấy trên cả vùng exon và intron, ảnh hưởng đến chức năng của protein Các đột biến vị trí nối, chèn, xóa và vô nghĩa có thể dẫn đến mất chức năng vận chuyển do cấu trúc protein bị thay đổi Sự hiện diện của các đột biến này vẫn chưa được làm rõ về ảnh hưởng đến chức năng của protomer và dimer trong trường hợp dị hợp tử kép.

Mười trong số 12 đột biến đã được công bố trên y văn, trong đó sáu đột biến phổ biến ở Đông Á (I, II, III, V, X và XIX) thường được sàng lọc đầu tiên trong nhiều nghiên cứu Các đột biến còn lại cũng đã được xác nhận là gây bệnh thiếu hụt citrin Hai đột biến mới được phát hiện là đột biến mất nucleotide, có khả năng làm thay đổi khung đọc gen và tạo ra protein bất thường hoặc không chức năng Mặc dù chưa có nghiên cứu sâu về chức năng gen, nhưng qua biểu hiện lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng, có thể xác định hai đột biến này là nguyên nhân gây bệnh thiếu hụt citrin Để khẳng định chắc chắn về các đột biến mới, cần tiến hành phân tích chuyên sâu về cấu trúc và chức năng của citrin.

Có sự khác biệt về loại đột biến giữa CTLN2 và NICCD, với đột biến đồng hợp tử c.851_854del/c.851_854del và IVS11-1G>A/IVS11-1G>A thường gặp ở bệnh nhân CTLN2 nhưng hiếm gặp ở NICCD Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy rằng nhận xét này không hoàn toàn chính xác, vì đột biến c.851_854del/c.851_854del rất phổ biến ở nhóm bệnh NICCD, chiếm đến 79,5% trong nghiên cứu, trong khi không có bệnh nhân nào có đột biến đồng hợp tử II/II Hạn chế của nghiên cứu là chưa xác định được tỷ lệ giữa bệnh nhân nam và nữ có kiểu gen đồng hợp tử đột biến c.851_854del/c.851_854del.

Nghiên cứu về tỷ lệ kiểu gen cho thấy tính đồng nhất cao về alen đột biến gen SLC25A13, với kiểu gen đồng hợp tử c.851_854del/c.851_854del có tần suất cao nhất (79,5%) Tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử này vượt trội so với các nghiên cứu quốc tế, nơi tỷ lệ này chỉ đạt khoảng 47% ở nhiều quốc gia như Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc và Hồng Kông Một nghiên cứu tại miền nam Trung Quốc ghi nhận tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử đột biến là 49% Đáng chú ý, tỷ lệ kiểu gen có sự khác biệt giữa các khu vực trong cùng một quốc gia, với miền nam Trung Quốc có tỷ lệ cao hơn miền bắc Kiểu gen đồng hợp tử IVS16ins là kiểu gen thứ hai được phát hiện, với tần suất thấp hơn, chỉ đạt 8,7% ở miền bắc và 1,6% ở miền nam Trung Quốc Các kiểu gen khác trong nghiên cứu có tỷ lệ thấp, càng khẳng định sự ưu thế của kiểu gen đồng hợp tử đột biến c.851_854del và sự phổ biến của đột biến này trong quần thể người Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt với nghiên cứu của tác giả Chen và một số tài liệu quốc tế, khi tỷ lệ kiểu gen đồng hợp tử cao hơn, trong khi kiểu gen dị hợp tử kép chiếm đa số (66) theo Chen Kiểu gen dị hợp tử kép, bao gồm hai đột biến khác nhau từ bố và mẹ, có tỷ lệ thấp hơn so với kiểu gen đồng hợp tử và không đồng nhất với một số kết luận toàn cầu Nghiên cứu của Tavoulari cho thấy tỷ lệ kiểu gen dị hợp tử kép lên tới 53% (37), với sự phổ biến của kiểu gen kết hợp c.851_854del và một đột biến khác (c.851_854del/-) Ngược lại, nghiên cứu tương đồng với tác giả Lin (2016) cho thấy tỷ lệ kiểu gen c.851_854del/IVS16ins, c.851_854del/c.615+5G>A và c.851_854del/c.1638_1660dup lần lượt là 10.61%, 7.76% và 6.94% Đặc biệt, kiểu gen c.851_854del/c.851_854del và c.851_854del/c.1399C>T có sự phân bố địa lý khác biệt, với tỷ lệ c.851_854del/c.851_854del ở phía nam cao hơn nhiều so với phía bắc Trung Quốc.

Tỷ lệ đồng hợp tử của đột biến gen SLC25A13 ở miền Bắc là 17,39% (4/23), trong khi ở biên giới là 34,28% (12/35) và cao nhất ở miền Nam với 52,94% (99/187) Điều này cho thấy quần thể phía Bắc có mức độ không đồng nhất về alen mang đột biến gen SLC25A13 cao hơn so với quần thể phía Nam Đột biến này phổ biến ở các quần thể người có tổ tiên từ Đông Á, trong khi thông tin về đột biến từ các khu vực khác trên thế giới còn hạn chế Một số đột biến mới được phát hiện ở bệnh nhân gốc Tunisia, Pakistan và Bắc Âu đã củng cố quan điểm rằng đây là một bệnh di truyền mang tính sắc tộc Trường hợp NICCD đầu tiên ở người Bulgari có đột biến dị hợp tử kép p.R361*/p.A25E đã được ghi nhận, cùng với hai trường hợp NICCD và CTLN2 được phát hiện ở Thổ Nhĩ Kỳ.

Tỷ lệ kiểu gen và các đột biến gen SLC25A13

Trong nghiên cứu về đột biến gen SLC25A13, đột biến c.851_854del là loại phổ biến nhất, chiếm 494/538 alen bị đột biến Đây cũng là đột biến gen SLC25A13 duy nhất được phát hiện ở bệnh nhân thể NICCD tại Việt Nam, theo một nghiên cứu công bố ở Nhật Bản Đột biến này làm thay đổi khung đọc mở, dẫn đến việc tạo ra mã kết thúc sớm sau 3 axit amin so với vị trí axit amin bị đột biến, làm cho protein bị cắt ngắn hơn so với bình thường.

284 axit amin Đây là đột biến có tỷ lệ gặp cao nhất ở Châu Á (15,18,35,59,41) Đột biến c.851_854del và c.1638_1660dup là 2 đột biến phổ biến nhất ở Trung Quốc

Đột biến c.851_854del trên gen SLC25A13 là biến thể phổ biến nhất ở bệnh nhân thiếu citrin tại miền Nam Trung Quốc, chiếm 68% trong tổng số các dạng đột biến, và có xu hướng giảm dần từ nam lên bắc Sự khác biệt về tần suất đột biến giữa các khu vực có thể liên quan đến di cư cổ đại Nghiên cứu cho thấy đột biến này có nguồn gốc từ Nam Trung Quốc, đặc biệt là các khu vực Quảng Tây và Yunan, do hiệu ứng người sáng lập Ngoài ra, đột biến c.851_854del cũng là một trong hai đột biến phổ biến nhất ở Hàn Quốc và Nhật Bản Tại Nhật Bản và Hàn Quốc, tần suất alen bị đột biến c.851_854del, c.1638_1660dup và p.S255* lần lượt là 17%, 33% và 33% Đột biến c.1176+1G>A, mặc dù không phổ biến trong nghiên cứu, nhưng cũng là một trong hai đột biến chính ở Nhật Bản và Hàn Quốc, và chưa được phát hiện ở người Trung Quốc hoặc Đài Loan.

Đột biến c.851_854del và tần số đột biến IVS11-1G>A có sự khác biệt về phân bố địa lý tại Trung Quốc Tuy nhiên, nghiên cứu hiện tại chưa phân loại các đột biến và kiểu gen của bệnh nhân thiếu hụt citrin theo vùng miền ở Việt Nam Đột biến c.1638_1660dup là một trong hai đột biến phổ biến nhất ở miền nam Trung Quốc và Đài Loan, đồng thời cũng là một trong hai đột biến phổ biến thứ hai ở trẻ sơ sinh bị ứ mật tại Đài Loan Đột biến này dẫn đến sự thay đổi axit amin Alanine thành Glycine tại vị trí 554 trên chuỗi polypeptide, tạo ra mã kết thúc sớm cho 17 axit amin Mặc dù c.1638_1660dup được phát hiện ở một số ít trường hợp tại Trung Quốc, nhưng tần số của các đột biến khác vẫn cần được nghiên cứu thêm.

SLC25A13 có sự phân bố địa lý khác nhau, nhưng không có sự khác biệt đáng kể về sự phân bố của các đột biến c.615+5G>A và c.1638_1660dup giữa các khu vực khác nhau của Trung Quốc.

Tỷ lệ phát hiện đột biến c.615+5G>A xếp thứ 3 trong nghiên cứu nhưng thấp hơn so với c.851_854del, với tỷ lệ tương tự ở Nhật Bản (0,5%) và thấp hơn nhiều ở Đài Loan (16,7%) Đây là đột biến phổ biến thứ hai ở miền nam Trung Quốc, nhưng chỉ có 2 bệnh nhân được phát hiện Nghiên cứu chỉ ra rằng có sự khác biệt về tần suất đột biến theo khu vực ở Trung Quốc Đột biến IVS16ins đứng thứ 2 trong tỷ lệ phát hiện và phổ biến nhất ở Hàn Quốc (33%) Tần suất đột biến c.851_854del giảm từ nam lên bắc, trong khi IVS16ins có xu hướng ngược lại, cho thấy sự biến đổi di truyền liên tục giữa các quần thể Đột biến c.2T>C hiếm gặp ở người Việt Nam nhưng phổ biến ở Thái Lan (1/85) Nghiên cứu cho thấy đột biến này có thể gây mất chức năng protein citrin Đột biến c.135G>C là hiếm gặp và chỉ được phát hiện trên một bệnh nhân duy nhất Đột biến c.1231G>A được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2011 và là một trong những đột biến phổ biến nhất.

Đột biến c.1399C>T là đột biến vô nghĩa duy nhất trong nghiên cứu và lần đầu tiên được phát hiện trên một bệnh nhân NICCD ở Việt Nam, làm thay đổi axit amin Arginine ở vị trí 467 thành mã kết thúc Đáng chú ý, bên cạnh bốn đột biến phổ biến khác, c.1399C>T tương đối phổ biến ở biên giới Trung Quốc, trong khi các đột biến IVS11+1G>A và p.R455L lại phổ biến hơn ở miền bắc Trung Quốc Hiện tượng này có thể liên quan đến sự khác biệt trong các quần thể và tỷ lệ di cư thấp giữa các khu vực ở Trung Quốc đại lục Ngoài ra, đột biến c.1763G>A trên exon 17 đã được công bố lần đầu tiên vào năm 2008 và được phát hiện ở bệnh nhân NICCD người Pakistan tại Anh.

Vùng gen 17 tại Nhật Bản có tỷ lệ đột biến cao, đạt 15,31%, trong đó đột biến trên exon 17 chiếm 3,7% tổng số 95,1% đột biến được phát hiện trong nghiên cứu sàng lọc 11 đột biến đã biết Tuy nhiên, vị trí này chỉ ghi nhận một đột biến duy nhất, c.1763G>A, và nó chỉ được phát hiện ở một bệnh nhân, cho thấy tỷ lệ phát hiện của đột biến này là rất thấp trong nghiên cứu.

Nghiên cứu này lần đầu tiên công bố hai đột biến mới trên gen SLC25A13, bao gồm [c.1956C>A; c.1962 del] và c.70-63_132del, được phát hiện bằng giải trình tự Sanger và chưa được báo cáo trước đây Để xác minh tác động của đột biến c.70-63_132del đến protein và quá trình nối mRNA, cần thực hiện phân tích trình tự DNA của gen SLC25A13, mặc dù nghiên cứu này chưa được thực hiện Các công cụ tin sinh học đã hỗ trợ xác định khả năng gây bệnh của các đột biến mới, tạo nền tảng cho các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo Hai đột biến này không có trong cơ sở dữ liệu 1000 bộ gen, gnomeAD và ExAC Lý thuyết cho thấy chúng có thể thay đổi khung đọc mở của gen, dẫn đến mã kết thúc sớm và sản phẩm protein bất thường, tương tự như hậu quả của đột biến c.851_854del, một đột biến gen SLC25A13 gây bệnh đã được biết đến Chẩn đoán NICCD đã được thực hiện cho hai bệnh nhân, với đột biến [c.1956C>A; c.1962 del] ở bệnh nhân nữ và c.70-63_132del ở bệnh nhân nam, cả hai đều bị vàng da kéo dài trong thời kỳ sơ sinh, nhưng chỉ có bệnh nhân nam được phân tích.

Kết quả xét nghiệm sinh hóa lần đầu của hai bệnh nhân cho thấy giảm protein toàn phần, albumin, và tăng bilirubin, bilirubin trực tiếp, gamma glutamyl transferase, và phosphatase kiềm, chỉ ra tổn thương gan tương tự Bilirubin toàn phần và liên hợp đều tăng, trong khi alpha fetoprotein huyết thanh tăng nhẹ và gamma glutamyl transferase cao hơn 10-20 lần so với mức bình thường Nồng độ transaminase và alpha fetoprotein của bệnh nhân WBCTS210304 tăng nhẹ, với AST thường cao hơn ALT Glucose của bệnh nhân WBCT170102 tăng nhẹ lúc 3 tháng nhưng trở lại bình thường sau hai tháng, trong khi lactate giảm ở cả hai bệnh nhân Xét nghiệm amoniac trong máu cho thấy không có tăng huyết áp (>110 μmol/L) và không triệu chứng Các xét nghiệm sinh hóa khác đều nằm trong hoặc gần phạm vi bình thường Các đột biến mới cần nghiên cứu thêm in vivo và in vitro để xác nhận khả năng gây bệnh, đồng thời làm phong phú thêm dữ liệu đột biến SLC25A13 trong ngân hàng đột biến gen toàn cầu, cung cấp bằng chứng hỗ trợ cho thực hành lâm sàng và tư vấn di truyền trong tương lai.

Kết quả phân tích axit amin của người bệnh mã số WBCTS210304 cho thấy nồng độ citrulline tăng đáng kể Arginine, tyrosine, lysine và ornithine cũng cao hơn

Nghiên cứu cho thấy nồng độ axit amin ở bệnh nhân mắc bệnh CD giai đoạn sơ sinh có sự gia tăng đáng kể, đặc biệt là citrulline, điều này hỗ trợ cho việc sàng lọc sơ sinh bằng công nghệ MS-MS Các axit amin như Met, Tyr, Ala, và His cũng có mặt với nồng độ cao, liên quan đến vàng da và rối loạn chức năng gan Đột biến gen SLC25A13 được xác định là nguyên nhân chính gây ứ mật ở trẻ sơ sinh, với biểu hiện lâm sàng như vàng da kéo dài và khuôn mặt bầu bĩnh Việc xét nghiệm di truyền là cần thiết để khẳng định chẩn đoán và hỗ trợ điều trị, giúp ngăn ngừa tình trạng phù não do truyền glycerol ở bệnh nhân thiếu citrin Chẩn đoán sớm tình trạng thiếu citrin có thể mang lại lợi ích cho bệnh nhân và gia đình.

Một hạn chế trong nghiên cứu là việc giải trình tự trực tiếp có thể bỏ sót đột biến trong các đoạn mồi và khó xác định các biến đổi lớn Điều này có thể lý giải tại sao đột biến thứ hai không được phát hiện ở ba bệnh nhân thiếu citrin trong nghiên cứu của tác giả Fu và cộng sự Hơn nữa, nghiên cứu chưa thực hiện khảo sát sâu hơn về hai đột biến mới trên gen SLC25A13 ở mức độ in vivo và in vitro để khẳng định ảnh hưởng của chúng đối với quá trình dịch mã bất thường và tính chất gây bệnh Một hạn chế khác là nghiên cứu chưa được thực hiện trên nhóm bệnh nhân thiếu hụt citrin ở miền Nam Việt Nam Do đột biến gen SLC25A13 có tính chất đặc trưng quần thể, việc thu thập mẫu trên diện rộng hơn sẽ giúp phản ánh chính xác sự đa dạng đột biến gen này ở người Việt Nam và nhận xét về sự khác biệt sắc tộc của đột biến.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng điều trị CD có hiệu quả cao, đặc biệt ở trẻ sơ sinh dưới 1 tuổi Việc áp dụng sàng lọc sơ sinh mở rộng, sàng lọc di truyền và tư vấn di truyền là rất quan trọng Chậm trễ trong chẩn đoán có thể làm giảm hiệu quả điều trị và ảnh hưởng xấu đến tiên lượng bệnh.

NICCD là một rối loạn chuyển hóa phức tạp, thường khó phân biệt với các bệnh gan khác Một trong những đặc điểm nổi bật của NICCD là tình trạng tăng axit amin trong máu.

Thiếu hụt citrin có thể được phát hiện khi nồng độ citrulline tăng cao trong sàng lọc sơ sinh, điều này gợi ý cho các bác sĩ lâm sàng cân nhắc đến bệnh thiếu hụt Citrin ở trẻ em có triệu chứng vàng da và ứ mật Phân tích khối phổ (MS) có giá trị trong việc xác định tình trạng thiếu hụt citrin, hỗ trợ tiên lượng và điều trị bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xác định đột biến gen SLC25A13 là yếu tố quan trọng trong chẩn đoán chính xác trẻ bị thiếu hụt Citrin.

1 Đột biến gen SLC25A13 trên người bệnh thiếu hụt Citrin ở Việt Nam khá đa dạng, gồm nhiều loại đột biến và đột biến xảy ra rải rác trên toàn bộ gen Nghiên cứu đã phát hiện được 12 đột biến gen SLC25A13 Các đột biến này xảy ra trên exon 1, exon 3, exon 9, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18 và 3 intron đó là intron

6, intron 11, intron 16 Đặc biệt, nghiên cứu đã phát hiện 2 đột biến mới trên gen

SLC25A13 đó là [c.1956C>A;c.1962 del] và c.70-63_132del

Phụ lục 1: Kết quả xét nghiệm di truyền của người bệnh trong nghiên cứu 74

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

22 WBCT180801 Lê Thị Yến Nh 180367987 1 2

23 WBCTS180805 Bùi Lê An Ng 180313148 1 1 p.R467*

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

44 WBCT190403 Trần ĐÌnh Uyên Nh 190138154 1 2

45 WBCTS190405 Phạm Anh Th 187882141 1 1 IVS11+1G>A

46 WBCT190406 Nguyễn Ngô Bảo Ch 190019698 1 2

51 WBCT190901 Nguyễn Ngọc Lâm Ph 190348732 1 1 1

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

59 WBCT191106 Nguyễn Thị Nhật Th 190521921 1 2

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

73 WBCT200402 Nguyễn Thị Lệ Tr 202165781 1 1 1

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

97 WBCT210307 Ngô Đắc Đăng Kh 210157196 1 2

98 WBCTS210401 Trần Phan Đăng Kh 210104061 1 1 p.M1T

110 WBCT211003 Nguyễn Phan Khánh Ng 210259830 1 2

Mã bệnh nhân Họ và tên Mã số bệnh viện

Kiểu gen số alen bị đột biến Đột biến khác

Dị hợp kép Đồng hợp tử Đột biến

I Đột biến III Đột biến

116 220035CT Đào Thị Quỳnh Ch 220001234 1 2

Phụ lục 3: Kết quả tách DNA tổng số của người bệnh bị thiếu hụt Citrin

STT Mã số người bệnh

Kết quả tách DNA tổng số

Lượng DNA (àg/àl) Độ tinh sạch

Phụ lục 6: Hóa chất và thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

- Hóa chất tách DNA từ máu ngoại vi: QiaAmp DNA blood mini kit (250 phản ứng/ kit (QIAGEN, Đức); 100% Ethanol (Merck, Đức)

Hóa chất sử dụng cho PCR bao gồm 2X colorless master mix từ Promega (Hoa Kỳ) và 21 cặp mồi, trong đó có mồi xuôi và mồi ngược của gen SLC25A13 (25, 26, 30) được trình bày trong Bảng 2.2, 2.3 và 2.4 Ngoài ra, nước khử ion từ Invitrogen (Hoa Kỳ) cũng được sử dụng trong quá trình này.

- Enzyme cắt: Tail I, Tas I (Thermo Fissher, Hoa Kỳ)

The electrophoresis setup includes agarose from Invitrogen (USA) and a 10X TBE solution (Invitrogen, USA), which should be diluted to 1X before use The buffer composition consists of 0.89 M Tris, 0.89 M boric acid, and 0.02 M EDTA Additionally, the 10X Blue Juice™ loading dye (Invitrogen, USA) is utilized along with ethidium bromide (EtBr) from Invitrogen (USA) for DNA visualization For molecular weight markers, a 100 bp DNA ladder at 1 µg/µl and a 1 kb plus ladder at 0.5 µg/µl, both from Invitrogen (USA), are incorporated.

- Hóa chất tinh sạch: Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Qiagen-purification Kit, Đức)

- Hóa chất tinh sạch DNA sợi đơn: BigDye XTerminator™ Purification Kit (Thermo Fisher, Hoa Kỳ)

- Hóa chất giải trình tự gen: BigDye v3.1; BigDye v3.1 Termination reaction kit; POP -7 polymer; Running buffer 10X của hãng Applied Biosystems, Hoa Kỳ

Tủ an toàn sinh học bậc 2; Tủ âm sâu (-20°C, -80°C, 4°C); Bể ổn nhiệt 56°C;

The article highlights essential laboratory equipment, including the Samsung microwave from South Korea, Mettler Toledo's 10-g analytical balance from Switzerland, and the ABI GeneAmp PCR System 9700 from the United States It also features the Nanodrop DNA concentration meter, Eppendorf 5415C centrifuge from Germany, and the GelDoc gel imaging system from BioRad, USA Additionally, the PowerPac 300 horizontal electrophoresis system, sterilization autoclave, and ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer from Applied Biosystems, USA, are mentioned, along with various Eppendorf pipettes from Germany.

Cỏc loại đầu cụn cú lọc (1000 àl, 200 àl, 100àl, 10àl), ống Eppendorf

(Corning, Hoa Kỳ) được vô trùng tuyệt đối bằng hấp ướt ở 120 o C trong 20 phút, và sấy khô trước khi sử dụng.

Phụ lục 7: Kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng trong nghiên cứu

 Kỹ thuật tách DNA tổng số

Quy trình tách DNA tổng số từ máu ngoại vi được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, dựa vào sự hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm và 280nm để định lượng nồng độ nucleic acid trong mẫu Sử dụng kit thương mại Qiagen, quy trình này đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc tách chiết DNA.

- Cho 20 àL Protease Qiagen vào mỗi ống ly tõm 1,5 mL, sau đú cho tiếp 200 àL mẫu máu toàn phần của người bệnh vào trong ống

- Thờm 200 àL dung dịch đệm AL, trộn đều hỗn hợp bằng mỏy lắc trong 15 giõy

- Ủ hỗn hợp trong máy ổn nhiệt ở nhiệt độ 56ºC trong 10 phút

- Ly tâm nhẹ hỗn hợp để tránh dung dịch đọng trên thành ống và nắp ống

- Thờm 200 àL cồn Ethanol (96-100%), trộn đều và ly tõm nhẹ

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp trên vào cột lọc QIAamp, tránh để hỗn hợp dính vào thành ống và nắp ống

- Ly tâm cột lọc ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi và chuyển cột lọc sang ống 2 ml sạch

- Thờm 500 àL dung dịch đệm AW1, ly tõm ống với tốc độ 8000 vũng/phỳt trong

1 phút Sau đó bỏ dịch nổi, chuyển cột lọc sang ống 2 ml sạch khác

- Thờm 500 àL dung dịch đệm AW2, ly tõm ống với tốc độ 13000 vũng/phỳt trong 3 phút Loại bỏ dịch nổi, chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 mLvô trùng

- Thờm 200 àL dung dịch AE vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phũng trong 1 phỳt, sau đó ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA tổng số

- DNA tổng số sau khi tách được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano drop

DNA tổng số được kiểm tra trên thạch agarose 1% trong vòng 40 phút trước khi được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Sau đó, DNA tổng số có thể được sử dụng cho các kỹ thuật tiếp theo hoặc được bảo quản ở nhiệt độ -20 độ C.

Các axit nucleic, với cấu trúc là các đại phân tử tích điện âm đồng đều, sẽ di chuyển về cực dương khi chịu tác dụng của điện trường không đổi Sau quá trình điện di, các đoạn DNA được nhuộm bằng Ethidium với nồng độ 0,5 μl/ml và được phát hiện dưới tia cực tím tại bước sóng thích hợp trên máy soi gel Để ước lượng kích thước các đoạn nucleotit trên gel, cần sử dụng một thang chuẩn (marker).

Để chuẩn bị thạch ngang agarose 1% hoặc 3%, trước tiên, bạn cần pha chế dung dịch đệm TBE 1X từ dung dịch TBE 10X Tiếp theo, cân 1g agarose cho 100ml dung dịch đệm TBE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên trong 1 phút Đun nóng dung dịch thạch bằng lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Sau đó, làm nguội gel đến khoảng 50-70°C dưới vòi nước hoặc ở nhiệt độ phòng Thêm 5µL ethdium vào 100ml dung dịch agarose, lắc nhẹ để ethdium tan đều mà không tạo bọt Lắp lược vào các khay đổ thạch và đổ dung dịch agarose vào khuôn đã cài sẵn lược, để dung dịch trải đều khắp khay Cuối cùng, để bản thạch nguội ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút và từ từ nhấc lược ra khỏi khuôn, tránh làm sứt hoặc thủng các giếng trên bản thạch.

Để tiến hành điện di trên thạch agarose, trước tiên, nhẹ nhàng đặt bản thạch vào buồng điện di và đổ đệm TBE 1X sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2-5 mm Tiếp theo, nạp DNA mẫu và marker vào các giếng bằng cách sử dụng pipet để hút một thể tích loading dye và trộn đều với 9 thể tích mẫu, sau đó nhỏ mẫu vào từng giếng, tránh tình trạng mẫu bị trào, tạo bọt khí hoặc đâm thủng giếng Sau khi đậy nắp buồng điện di và cắm điện cực, tiến hành điện di trong khoảng 30-50 phút với điện thế 100V Cuối cùng, theo dõi sự di chuyển của vệt màu trên bảng thạch và tắt máy điện di khi kết thúc, sau đó chuyển bản thạch sang máy chụp ảnh điện di.

DNA tổng số của bệnh nhân được sử dụng làm khuôn để khuếch đại các vùng gen quan tâm bằng cách sử dụng các cặp mồi đặc hiệu Phương pháp PCR áp dụng enzyme DNA Polymerase để khuếch đại các vùng gen có đột biến đã biết, trong một phản ứng có chứa dNTPs, buffer và mồi đặc hiệu Nghiên cứu sử dụng master mix, một dạng hóa chất đã bao gồm enzyme DNA polymerase, dNTPs và buffer, do đó mỗi phản ứng PCR chỉ cần bổ sung thêm mồi đặc hiệu vào ống PCR Hóa chất được chuẩn bị theo bảng hướng dẫn cụ thể.

Bảng 8.1 Thành phần pha hóa chất PCR

Húa chất Thể tớch (àl) dH2O 9,5

- Chu trình nhiệt của PCR/PCR-RFLP: o Đột biến I, III, X: 95 o C - 5 phút, [95 o C - 1 phút, 60 o C – 1 phút, 72 o C –

10 phút] x 37 chu kỳ, 72 o C -4 phút, giữ lạnh ở 20 o C o Đột biến XIX: 95 o C - 5 phút, [95 o C – 20 giây, 60 o C – 30 giây, 68 o C –

20 phút] x 35 chu kỳ, 72 o C -4 phút, giữ lạnh ở 20 o C

- Chu trình nhiệt của PCR cho 18 exon dùng để giải trình tự gen: o Exon 1: 95 o C - 5 giây, [95 o C - 30 giây, 62 o C – 1 phút, 72 o C – 2 phút] x

32 chu kỳ, 72 o C -15 phút, giữ lạnh ở 20 o C o Exon 6, 10: 95 o C - 5 giây, [95 o C - 30 giây, 54 o C – 1 phút, 72 o C – 2 phút] x 32 chu kỳ, 72 o C -15 phút, giữ lạnh ở 20 o C o Các exon còn lại: 95 o C - 5 giây, [95 o C - 30 giây, 57 o C – 1 phút, 72 o C –

2 phút] x 32 chu kỳ, 72 o C -15 phút, giữ lạnh ở 20 o C

- Chu trình nhiệt của PCR cho cặp mồi mới thiết kế thêm cho đột biến mới: o Exon 1: 95 o C - 5 giây, [95 o C - 30 giây, 58 o C – 1 phút, 72 o C – 30 giây] x 35 chu kỳ, 72 o C - 4 phút, giữ lạnh ở 20 o C

Sản phẩm PCR nên được bảo quản trong khoảng nhiệt độ 4-20°C để phục vụ cho các bước tiếp theo Đối với sản phẩm PCR của đột biến III và XIX, chúng được điện di trên thạch agarose 3% và 1%, sau đó chụp ảnh bản thạch điện để phân tích kết quả cho bệnh nhân.

PCR cho 2 đột biến đã biết bao gồm đột biến c.851_854del, X được thực hiện tương tự mục 2.8.3.3 Sản phẩm PCR của 2 đột biến này tiếp tục được cắt enzyme

Tail và Tas I (Bảng 2.6) ở điều kiện thích hợp

Phản ứng cắt enzyme được ủ ở nhiệt độ 65 o C từ 5 đến 10 giờ Sản phẩm cắt enzyme của đột biến c.851_854del, X được điện di trên thạch agarose 3%

Bảng 8.2 Thành phần pha hóa chất cắt enzyme

Húa chất Thể tớch (àl) dH2O 12,7

 Tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit chuyên dụng của hãng Qiagen (Đức) Sản phẩm PCR được giữ lại trên màng lọc, trong khi các trình tự mồi thừa và dNTPs thừa được phân hủy và loại bỏ qua màng lọc Quá trình này đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của sản phẩm PCR.

- Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di agarose trước khi tinh sạch

- Thờm 100 àl dung dịch Binding buffer B2 vào ống chứa 25 àl sản phẩm PCR (bổ sung theo thể tích 4/1 (4 thể tích đệm và 1 thể tích mẫu), trộn đều

- Chuyển toàn bộ dung dịch vào cột lọc Pure Link Spin Column đã được để sẵn trong tuýp, ly tâm 13.000 vòng trong 1 phút, loại bỏ dịch

- Thờm 650 àl dung dịch Wash buffer (W1) vào cột lọc và ly tõm 13.000 vũng trong 1 phút, bỏ dịch nổi và tiếp tục ly tâm 13.000 vòng trong 3 phút

Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1.5ml đã được vô trùng, sau đó bổ sung 50 µl đệm EB (Elution buffer) vào giữa cột lọc Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 2 phút.

- Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%

- Sản phẩm PCR tinh sạch được bảo quản ở - 4°C trong trường hợp dùng ngay hoặc lưu trữ ở -20°C

 Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger

Giải trình tự trực tiếp trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer machine (Applied Biosystem, Hoa Kỳ) được thực hiện như sau:

PCR mồi đơn là phương pháp sử dụng mồi xuôi hoặc mồi ngược để tổng hợp DNA sợi đơn Quy trình này sử dụng ddNTPs được đánh dấu huỳnh quang làm thành phần chính Các thành phần phản ứng được pha trộn theo tỷ lệ quy định trong Bảng 2.7.

Bảng 8.3 Thành phần pha hóa chất PCR sợi đơn

Húa chất Thể tớch (àl) dH2O 5,7

10 àM mồi ngược/ mồi ngược 1

Sản phẩm PCR tinh sạch 1

- Chu trình nhiệt cho PCR sợi đơn: 96 o C – 1 phút, [96 o C - 10 giây, 50 o C – 5 giây, 60 o C – 4 phút] x 25 chu kỳ, giữ lạnh ở 4 o C

Để tinh sạch sản phẩm PCR mồi đơn, sử dụng kít tinh sạch BigDyeX Terminator Chuẩn bị hóa chất bằng cách trộn dung dịch SAM Solution và BigDye Xterminator theo tỷ lệ 4.5:1 (v/v) trong vòng 24 giờ trước khi sử dụng Sau đó, bổ sung 55 µl dung dịch đã chuẩn bị vào từng ống 0.2 µl PCR sợi đơn Trộn đều dung dịch trong ống PCR trong 30 phút, rồi ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 3 phút để hoàn tất quá trình tinh sạch.

- Nhỏ mẫu vào plate đựng mẫu 96 giếng Hỳt 20 àl sản phẩm tinh sạch PCR mồi đơn và nhỏ lần lượt vào các giếng trên plate chứa mẫu 96 giếng

- Thiết lập thư mục giải trình tự: đánh số tên các mẫu chạy tương ứng trên plate

96 giếng và lựa chọn chương trình giải trình tự thích hợp

Để thực hiện quy trình giải trình tự gen, đầu tiên, cần đặt khay chứa mẫu vào đúng vị trí trên máy giải trình tự tự động Sau đó, tiến hành điện di mao quản trên máy ABI3500 để thu thập dữ liệu cần thiết.

BIÊN BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA

CÁC GÓP Ý ĐỀ CƯƠNG/LUẬN VĂN/LUẬN ÁN/CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Mai Hương

Tên đề tài: Một số đặc điểm đột biến gen SLC25A13 trên người bệnh bị thiếu hụt Citrin tại bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn 2018 – 2022

( Liệt kê các nội dung góp ý theo thứ tự các phần của đề cương/luận văn/luận án/chuyên đề)

Phần giải trình của học viên

(Nêu rõ đã chỉnh sửa như thế nào, ở phần nào, trang bao nhiêu Nếu không chỉnh sửa,giải thích lý do vì sao không chỉnh sửa)

1 Định hướng chuyên ngành của luận văn/luận án

2 Tên đề tài luận văn/luận án/chuyên đề

- Viết lại theo format của trường

- Cách dùng tên đột biến không đồng nhất

- Cần đề cập biến thể mới trong phần tóm tắt

- Học viên đã sửa lại tóm tắt nghiên cứu theo hướng dẫn của trường (Trang viii)

- Học viên đã sửa thống nhất cách gọi tên đột biến ở mức độ cDNA cho tất các đột biến

- Học viên đã bổ sung biến thể mới vào tóm tắt nghiên cứu

- Xem thay đổi điều chỉnh nội dung mục tiêu 1 và

- Học viên đã sửa lại 2 mục tiêu nghiên cứu theo góp ý của phản biện 1 Mục tiêu 1 là “Xác định đột biến….” thu gọn làm 1 mục tiêu

6 Khung lý thuyết/cây vấn đề

7 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Bổ sung khuyến cáo của

Hội di truyền Hoa kì

- Hạn chế sử dụng dấu gạch ngang đầu dòng, viết thành đoạn văn

- Xem xét và trình bày lại theo thiết kế nghiên cứu

- Chuyển bớt nội dung thiết bị, kỹ thuật sang phụ lục

- Sửa lại sơ đồ nghiên cứu

- Đối chiếu thời gian nghiên cứu với quyết định của Hội đồng đạo đức

- Hiệu chỉnh lại biến số nghiên cứu

- Hạn chế của nghiên cứu cần sửa lại

Học viên xin lỗi vì sự nhầm lẫn trong bản giải trình phản biện kín, đã nhầm mục 2.9.1.3 thành mục 2.9.1.2 Trong luận văn, học viên đã bổ sung tiêu chuẩn nhận định biến thể của Hộ di truyền Hoa Kỳ tại mục 2.9.1.3 (Trang 29).

Học viên đã tiến hành chỉnh sửa toàn bộ luận văn, đặc biệt chú trọng đến phần Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Họ đã loại bỏ các dấu gạch ngang đầu dòng và chuyển đổi chúng thành các đoạn văn mạch lạc hơn.

Học viên đã trình bày chi tiết thiết kế nghiên cứu và phương pháp chọn mẫu, bao gồm hai giai đoạn: tiến cứu và hồi cứu Trong mỗi giai đoạn, học viên làm rõ về kích thước mẫu và phương pháp thu thập dữ liệu nghiên cứu (Trang 21-22).

- Học viên đã chuyển nội dung có phần trang thiết bị và phương pháp kỹ thuật sang phụ lục 6,7