TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Murdannia
1.1.1 Vị trí phân loại của chi Murdannia
Chi Murdannia được phân loại theo hệ thống APG IV, thuộc nhóm thực vật hạt kín (Angiosperm Phylogeny Group).
Thực vật hạt kín (Angiospermae)
Thực vật một lá mầm (Monocots)
1.1.2 Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Murdannia
Chi Murdannia, thuộc họ Commelinaceae, là một trong những chi lớn nhất với khoảng 60 loài phân bố rộng rãi trên toàn cầu, chủ yếu ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới ấm tại Châu Á, Châu Phi, Trung và Nam Mỹ Đặc biệt, Châu Á chiếm hơn 50% tổng số loài, trong khi Châu Phi có 11 loài và Ấn Độ có 29 loài Tại Việt Nam, chi Murdannia bao gồm 16 loài, trong đó có 7 loài được sử dụng làm thuốc như M bracteata, M divergens, M edulis, M medica và M nudiflora.
M simplex, M triquetra [7,8] Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở nước ta được thể hiện trong Bảng 1.1
Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam
Các tỉnh phía Bắc (Ninh Bình, Nam Định,…) đến Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng
Thừa Thiên - Huế, Khánh Hòa, Lâm Đồng, Đồng Nai
Bà Rịa - Vũng Tàu, TP Hồ Chí
Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Đồng Nai
Murdannia edulis (Stokes) Faden Lâm Đồng, Phú Yên, Ninh Thuận,
Bình Phước, TP Hồ Chí Minh
Bruckner Từ Lâm Đồng đến các tỉnh Nam Bộ
Hoàng Liên Sơn, Phú Yên, Khánh
Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Hòa Bình,
Hà Nội, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Trị, Thừa Thiên- Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, TP Hồ Chí Minh
Murdannia simplex (Vahl.) Brenan Khánh Hòa, Ninh Thuận, Lâm Đồng
Murdannia spectabilis (Kurz) Faden Từ Huế đến Đà Lạt, Đồng Nai
Murdannia spirata (L.) Bruckner Quảng Nam, Thừa Thiên - Huế
Thảo nguyên trên vùng cát: Huế, Đà Nẵng, Nha Trang, Biên Hòa, Vũng
Bruckner Ruộng, dựa lộ, bình nguyên
1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Murdannia
Chi Murdannia thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) là cây thân thảo có thể mọc đứng hoặc bò, với rễ thường phình ở giữa Lá cây mọc cách hoặc mọc vòng ở gốc Hoa của cây hình chùm xim, mọc ở ngọn hoặc nách lá, được bao bọc bởi các lá bắc có cuống rõ Mỗi lá bắc chứa từ 2 đến 5 xim hoa, hoa lưỡng tính với vòi nhụy lệch về một phía Cánh hoa có màu tím, xanh dương, hồng, vàng hoặc hơi trắng, hình tròn hoặc hình trứng Cấu trúc hoa gồm 3 nhị sinh sản đối diện với lá đài và 3 nhị lép đối diện với cánh hoa Quả của cây có hình trứng, hình nang hoặc hình cầu, mở thành 3 ô, mỗi ô chứa 1 hoặc 2 hạt với rốn hạt tròn.
Dưới đây là hình ảnh một số loài Murdannia tìm thấy ở Việt Nam
Hình 1.1 Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Murdannia ở Việt Nam
Các loài thuộc chi Murdannia có nhiều đặc điểm thực vật tương đồng Khi phân tích, nên chọn cây có đầy đủ các bộ phận, đặc biệt là hoa, vì đây là bộ phận ít bị ảnh hưởng bởi điều kiện tự nhiên và đặc trưng cho loài Hoa của chi Murdannia có sự đa dạng về màu sắc, hình dạng tràng hoa, và kích thước nhị, nhụy hoa.
Hình 1.2 Hoa của một số loài thuộc chi Murdannia
Tổng quan về loài Murdannia bracteata
- Tên khoa học: Murdannia bracteata J.K.Morton ex D.Y.Hong, họ Thài lài (Commelinaceae)
- Tên tiếng Việt: Trai lá hoa, Cỏ rươi lá bắc, Bao tử
1.2.1 Đặc điểm hình thái loài Murdannia bracteata
Cây thân thảo này là loại sống lâu năm với rễ sợi dài, đường kính từ 0,15 đến 0,4mm Thân cây hình trụ, có khía dọc, chia đốt dài từ 3 đến 10cm, màu xanh đậm và được phủ lông dày đặc màu trắng Lá cây đơn, mọc so le, với bẹ lá dài từ 0,7 đến 1,3 cm, màu xanh nhạt và gốc lá ôm lấy thân, mặt ngoài cũng phủ lông dày đặc màu trắng Phiến lá nguyên, hình dải dài, có hình mác hoặc hình elip thuôn, với gân lá chạy thẳng song song từ gốc và gân giữa rõ ràng.
Hình 1.3 Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng của Murdannia bracteata
Chú thích: 1 Toàn cây; 2 Rễ cây; 3 Thân cây;
4 Hình thái lá; 5 Bẹ lá; 6 Mép lá
Cụm hoa mọc ở nách lá hoặc ở ngọn, mỗi hoa có một lá bắc hình bầu dục riêng biệt Hoa lưỡng tính với cuống dài, hình trụ, màu xanh và nhẵn Đài hoa gồm 3 phần rời, hình lòng thuyền, màu xanh nhạt và có lông ngắn thưa ở mặt ngoài Tràng hoa cũng có 3 phần rời, mang màu tím Nhị hoa gồm 6 cái, sắp xếp thành 2 vòng: 3 nhị vòng ngoài bất thụ với chỉ nhị hình sợi màu tím và 3 nhị hữu thụ.
Chỉ nhị có 9 kích thước khác nhau, với đặc điểm là nhị mập, lông dài màu tím tập trung ở chân chỉ nhị Bao phấn hình bầu dục, màu trắng, có 2 ô Bầu nhụy hình elip thuôn, màu xanh, gồm 3 lá noãn liền nhau tạo thành 3 ô Vòi nhụy dài 0,6 cm, màu tím nhạt Thời gian ra hoa từ tháng 5 đến tháng 11.
Hình 1.4 Đặc điểm cơ quan sinh sản của Murdannia bracteata
Cụm hoa bao gồm nhiều phần quan trọng: từ hoa nguyên vẹn nhìn từ trên xuống (2a) và từ dưới lên (2b), đến lá bắc (3) và đài (4) Tràng (5) đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc hoa, trong khi nhị được chia thành nhị bất thụ (6a) và nhị hữu thụ (6b) Bầu (7) và bầu cắt ngang (8) cũng là những thành phần không thể thiếu trong việc hình thành và phát triển của hoa.
1.2.2 Đặc điểm phân bố loài Murdannia bracteata
Cây Trai lá hoa phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc và một số quốc gia Đông Nam Á, bao gồm Malaysia và Việt Nam Tại Việt Nam, loài cây này được tìm thấy từ các tỉnh phía Bắc cho đến Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, thường mọc ở những nơi đất ẩm như ven đường, bờ kênh rạch, ven rừng, và trên nương rẫy.
1.2.3 Thành phần hóa học của loài Murdannia bracteata
Năm 2006, Wang Guei Jane cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc 4 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết methanol toàn cây
Năm 2009, bằng xét nghiệm Folin-Ciocalteu, Yam Mun Fei và cộng sự xác định được tổng hàm lượng phenolic của M bracteata là khoảng 10% [12]
Năm 2014, Ooi Kheng Leong cùng các cộng sự đã phân lập một số hợp chất từ dịch chiết hexan của M bracteata bằng phương pháp GC-MS và UPLC
15 hợp chất bay hơi được phát hiện bằng phương pháp GC-MS bao gồm:
(8) 2,2-dimethyl-3-(3,7,16,20-tetramethyl-heneicosa-3,7,11,15,19- pentaenyl)-oxiran
(19) 9,19-cyclo-25,26-epoxyergostan-3-ol, 4,4,14-trimethyl-, acetat
Các hợp chất không bay hơi là 2 dẫn xuất của apigenin (20) và acid caffeic (21) được xác định bằng UPLC [13]
Năm 2016, thông qua phổ IR, Ch’ng Yung Sing và cộng sự đã cho thấy
M bracteata có chứa hàm lượng lớn các hợp chất saccharid [14]
Năm 2019, Shyur Lie Fen và các cộng sự đã phát hiện ra 7 hợp chất monogalatosyldiacylglycerol trong phân đoạn dịch chiết giàu galactolipid của M bracteata, trong đó thành phần chính là 1,2-di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol (dLGG) chiếm 78,9% Các gốc acyl còn lại cấu tạo nên 6 galactolipid khác.
Vị trí của 2 gốc acyl trong các hợp chất 24, 25, 26, 27, 28 chưa được xác định (R1, R2 có thể hoán vị cho nhau) [15] Cùng trong năm đó, nghiên cứu của
Lê Phương Thảo đã phân lập được 2 hợp chất từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của lá cây M bracteata bằng phương pháp sắc ký cột: Apigenin (29) và Quercetin (30) [9]
Năm 2021, Đỗ Thị Thanh Hương đã tiến hành nghiên cứu và phân lập thành công ba hợp chất từ dịch chiết ethyl acetat của lá cây M bracteata Các hợp chất này được tách biệt bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng, bao gồm Acid 2-hydroxyl-3-phenylpropanoic, Acid 3-amino butanoic, và Acid (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-dihydrophaseic.
1.2.4 Tác dụng sinh học của Murdannia bracteata
1.2.4.1 Tác dụng kháng Helicobacter pylori
Năm 2005, Wang Yuan Chuen và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng kháng Helicobacter pylori của dịch chiết ethanol 95% từ 50 loài thảo dược Đài Loan, trong đó dịch chiết từ M bracteata cho thấy khả năng ức chế 8/10 chủng thử nghiệm, thể hiện hoạt tính kháng Hp trung bình.
1.2.4.2 Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan
Nghiên cứu của Mun Fei Yam và cộng sự (2010) chỉ ra rằng dịch chiết ethanol từ lá của loài này có khả năng chống oxy hóa hiệu quả, thể hiện qua hoạt tính thu dọn gốc DPPH, ức chế lipid peroxidase và có tác dụng tương đương với chế phẩm trolox.
Nghiên cứu in vitro cho thấy ME có khả năng ức chế hình thành gốc tự do DPPH với EC50 = 2,82 ± 0,009 mg/mL Khi chuột được cho uống ME với liều 500mg/kg hoặc 1000mg/kg trước khi gây nhiễm độc gan bằng CCl4, tình trạng hoại tử mô gan giảm đáng kể Ngoài ra, hoạt độ men gan (AST và ALT) và nồng độ malondialdehyd (MDA) trong huyết tương cũng bị ức chế rõ rệt ME còn có khả năng ức chế peroxid hóa lipid trong mô gan với EC50 = 1,785 mg/mL ± 0,01 mg/mL Tác dụng bảo vệ gan của ME có thể được giải thích nhờ vào 10% hàm lượng các hợp chất phenol, đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan.
1.2.4.3 Tác dụng điều trị tổn thương gan
Năm 2019, nghiên cứu của Shyur Lie Fen và cộng sự đã chỉ ra rằng phân đoạn chiết giàu galactolipid (GLE) từ M bracteata và dLGG có tác dụng điều trị tổn thương gan Cụ thể, GLE và dLGG làm giảm đáng kể sự tăng hoạt độ AST và ALT huyết thanh ở chuột bị tổn thương gan do LPS và D-galactosamin.
LPS/D-GalN có hiệu quả trong việc điều trị tổn thương gan và viêm gan cấp Nghiên cứu cho thấy dLGG có khả năng bảo vệ gan khi được sử dụng với liều 1 hoặc 10 mg/kg trước khi tiêm LPS/D-GalN cho chuột.
1.2.4.4 Tác dụng gây độc tế bào ung thư gan và ức chế α-glucosidase
Năm 2012, Ooi Kheng Leong và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng điều trị ung thư gan và tiểu đường của M bracteata trong y học cổ truyền Malaysia Họ đã phơi khô, xay và chiết xuất dược liệu bằng các dung môi hexan, chloroform và methanol, sau đó kiểm tra độc tính của từng dịch chiết trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 và hoạt tính ức chế α-glucosidase.
Dịch chiết hexan (HE) cho thấy tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 với EC50 = 37,17± 1,00 μg/mL Thành phần chính của HE, α-tocopherol (10), đã thể hiện khả năng gây độc tế bào đối với nhiều loại ung thư như u thần kinh đệm, ung thư biểu mô tuyến thực quản và ung thư buồng trứng α-tocopherol (10) cũng tăng cường quá trình apoptosis thông qua việc làm tăng biểu hiện caspase 3.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng (20) có khả năng kích hoạt quá trình apoptosis bằng cách kích hoạt các caspase 3, 7, 9 và 10 trong tế bào HepG2, đồng thời giải phóng các chất trung gian hóa học như TNF-α và IFN-γ [22].
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Cây Trai lá hoa, với tên khoa học Murdannia bracteata, được thu hái tại huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định vào tháng 11 năm 2021 Mẫu thực vật này đã được giám định bởi ThS Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
(Phiếu giám định số: UMP-082021) Mẫu lá được thu hái, phơi sấy và bảo quản trong túi nilon kín
2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị
Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm và cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, pha đảo RP-18 (Merck) cỡ hạt 0,03 – 0,05 mm
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm, pha thường silica gel 60 F254 (Merck), độ dày 0,2 mm; pha đảo silica gel 60 RP-18 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm; hoạt hóa ở 110 o C trong 1h
- Sắc ký cột: Sử dụng các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Trường Đại học
Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Dụng cụ thí nghiệm như cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong và ống nghiệm là những thiết bị quan trọng trong Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền cùng với Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm thuộc Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, các thiết bị quan trọng bao gồm cân phân tích, máy cô quay chân không, tủ sấy, tủ hút và đèn soi UV được sử dụng để hỗ trợ nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực dược phẩm.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất
Lá cây Trai lá hoa sau khi rửa sạch và làm khô sẽ được cắt nhỏ và ngâm chiết bằng dung môi EtOH 80% ở nhiệt độ phòng, thực hiện 3 lần với mỗi lần 10 L Quá trình chiết xuất sử dụng thiết bị siêu âm ở 40 độ C trong 30 phút Sau đó, dịch chiết EtOH được lọc qua giấy lọc, gộp lại và cất dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao chiết tổng ethanol.
Phân tán cao chiết tổng được thực hiện thông qua quá trình cất và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc Sau khi cất, các phân đoạn n-hexan và EtOAc được loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm để thu được các cắn tương ứng Cuối cùng, phần dịch nước còn lại được cô cạn để thu được phân đoạn nước.
Tiến hành xử lý và phân lập hợp chất từ cắn EtOAc thông qua phương pháp sắc ký cột Các phân đoạn thu được trong quá trình phân lập được theo dõi và kiểm tra bằng kỹ thuật TLC.
Sắc ký cột sử dụng silicagel với kích cỡ hạt từ 0,063-0,200 mm và 0,040-0,063 mm của Merck, kết hợp với các loại cột sắc ký đa dạng Để đạt hiệu quả tối ưu, nên lựa chọn các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
+ Sắc ký bản mỏng: thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được qua 2 bước chính
Bước đầu tiên trong quy trình nghiên cứu là đo nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực và thực hiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) để thiết lập bộ dữ liệu cho các chất phân lập được.
+ Bước 2: So sánh bộ dữ liệu của các chất phân lập được với dữ liệu của các chất đã công bố
KẾT QUẢ
Kết quả chiết xuất, phân lập một số hợp chất
Dược liệu phần trên mặt đất của M bracteata được xay nhỏ 5 kg và chiết với EtOH 80% qua ba lần, mỗi lần kéo dài 3 giờ, với tỷ lệ dung môi/dược liệu lần lượt là 10:1, 8:1 và 6:1 (l/kg) Sau khi lọc và gộp dịch chiết, dung môi được cất thu hồi dưới áp suất giảm, thu được 450,1 g cao EtOH 80% (MBT).
Phân tán 440 g cao tổng với 1,5 lít nước và chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan và EtOAc, mỗi dung môi được sử dụng ba lần với tỷ lệ 1:1 (v/v) Sau khi gộp dịch chiết, tiến hành cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao n-hexan (MBH) 85,6 g, cao EtOAc (MBE) 158,3 g và cắn nước (MBW) 193,1 g.
Quy trình chiết xuất phân đoạn được thể hiện qua sơ đồ dưới đây (Hình
Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ M bracteata
Chiết với EtOH 80% (tỉ lệ dung môi/dược liệu: 10:1 - 8:1 - 6:1, l/kg)
Lọc, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
Phân tán 440 g cao vào 1,5l nước
Chiết phân đoạn bằng n-hexan
3.1.2 Phân lập các hợp chất
Khảo sát phân đoạn ethyl acetat phân tách bằng sắc ký cột silica với hệ dung môi gradient n-hexan - EtOAc - MeOH (50:1:0,1 - 5:1:0,1 -1:1:0,1, v/v/v) và 100% MeOH thu được 7 phân đoạn ký hiệu (D1 - D7)
Phân đoạn D1 được tách bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan - aceton (tỉ lệ 30:1 - 10:1, v/v), thu được phân đoạn D1.1 Sau đó, phân đoạn D1.1 được kết tủa bằng aceton và lọc rửa nhiều lần, cho ra hợp chất MB01 với khối lượng 35 mg và hợp chất MB03 với khối lượng 25 mg.
Phân đoạn D3 được phân lập bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexan - aceton (5:1 - 1:1, v/v), từ đó thu được phân đoạn D3.3 Hợp chất MB10 (16 mg) đã được chiết xuất từ phân đoạn D3.3 thông qua sắc ký cột silica gel sử dụng hệ dung môi DCM - MeOH (10:1, v/v).
Hình 3.2 Sơ đồ phân lập 3 chất từ phân đoạn ethyl acetat
Hệ dung môi n-hexan - EtOAc - MeOH (50:1:0,1 - 5:1:0,1 -1:1:0,1, v/v/v) và 100% MeOH
Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
3.2.1 Hợp chất MB01: Nonadecan-1-ol
Hợp chất MB01 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng, khó tan trong các dung môi thông thường như chloroform, ethyl acetat, methanol và aceton
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất MB01
Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất MB01 cho tín hiệu của 2 proton ở vùng trường thấp đặc trưng cho một nhóm hydroxymethylen tại δ H 4,03 (2H, dd, J = 7,2;13,8 Hz, H-1), tín hiệu của 17 nhóm methylen no mạch hở tại δ H 1,1 - 2,8, tín hiệu triplet ở vùng trường cao đặc trưng cho nhóm methyl đầu mạch tại δ 0,84 (3H, t, J = 13,8 Hz, H-19) Phổ khối ESI-MS của hợp chất MB01 cho tín hiệu tại m/z 285,3 [M+H] + phù hợp với một công thức phân tử C19H40O Từ những dữ liệu phổ trên kết hợp với phân tích phổ ESI-
MS có thể xác định MB01 là một ancol no mạch thẳng là nonadecan-1-ol
Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất MB01 3.2.2 Hợp chất MB03: β-sitosterol
Hợp chất MB03 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, tan tốt trong chloroform, không hấp thụ UV 254 và 365 nm, hiện màu với thuốc thử
H2SO4 10% trong EtOH 96% sau khi hơ nóng
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của hợp chất MB03 và chất tham khảo
Vị trí δ H Sa,b (mult., Hz) δ H a,b (mult., Hz)
29 0,84 (3H, t, 7,4) 0,85 (3H, t, 7,2) a) đo trong CDCl 3 , b) 600 MHz, S) của β-sitosterol [25]
Phổ 1 H-NMR của MB03 xuất hiện tín hiệu của proton olefinic ở δ H 5,35 (1H, m, H-6), một nhóm hydroxymethin tại H 3,52 (1H, m, H-3), 6 nhóm methyl trong đó có 2 nhóm methyl dưới dạng tín hiệu singlet tại H 0,68 (3H, s, H-18) và 1,01 (3H, s, H-19), 3 nhóm methyl dưới dạng doublet tại H 0,92 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-21); 0,81 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-26) và 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-27) và 1 nhóm methyl dưới dạng triplet tại H 0,85 (3H, t, J = 7,2
Hz, H-29) gợi ý cấu trúc sterol của MB03 [25] So sánh dữ liệu phổ của MB03 và hợp chất đã công bố [25], có thể kết luận MB03 là β -sitosterol (Hình 3.4)
Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất MB03
3.3.3 Hợp chất MB10: Acid betulinic
Hợp chất MB10 dạng tinh thể hình kim màu trắng Mp 316-318 o C; không hấp thụ UV 254 và 365 nm, hiện màu tím sau khi phun thuốc thử H2SO4
10% trong EtOH 96% sau khi hơ nóng
Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của hợp chất MB10 và chất tham khảo [26]
Vị trí δ C Ba,b δ C a,b δ H Ba,c (mult., Hz) δ H a,c (mult., Hz)
30 19,4 19,4 1,79 (3H, s) 1,69 (3H, s) a) Đo trong CDCl 3 , b) 125 MHz, c) 500 MHz, B) của acid betulinic đo trong CDCl 3 [26]
Phổ 1 H-NMR của MB10 cho tín hiệu cộng hưởng của một proton của nhóm hydroxymethin ở H 3,18 (1H, dd, J = 5,0; 11,0 Hz, H-3); tín hiệu proton vinylic của nhóm methylen đầu mạch tại H 4,61 (1H, s, H-29), 4,74 (1H, brd, H-29), sáu tín hiệu proton methyl ở H 0,99 (3H, s, H-23), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,94 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,69 (3H, s, H-30) và rất nhiều tín hiệu nằm trong vùng trường cao (0,68 - 2,80 ppm) Các tín hiệu proton trên gợi ý, MB10 là một triterpenoid khung lupan Phổ 13 C-NMR và
DEPT xuất hiện các tín hiệu của carbon olefin methin lai hóa sp 2 đầu mạch ở
Các tín hiệu tại C 150,4 (C-20) và 109,7 (C-29) cho thấy sự hiện diện của một triterpen khung lupan, cùng với carbon methin tại C 79,0 (C-3) và 6 tín hiệu của carbon methyl Tín hiệu đặc trưng của nhóm carbon carbonyl ở C 179,5 (C-28) chỉ ra sự carbonyl hóa một nhóm methyl của khung lupan Phổ DEPT cũng xác định có 10 nhóm methylen, 5 nhóm methin và 5 carbon bậc 4 Dựa trên các dữ liệu này và tài liệu tham khảo [26], cấu trúc của hợp chất MB10 được xác định là acid betulinic.
Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất MB10
BÀN LUẬN
Hợp chất MB01: Nonadecan-1-ol
Nonadecan-1-ol là một sản phẩn tự nhiên được tìm thấy ở Crataegus monogyna, Euphorbia piscatoria và các sinh vật khác
Năm 2009, Alessandro Masolo và các cộng sự đã nghiên cứu dấu hiệu sinh dục trong tuyến tiết quanh hậu môn của loài Hystrix cristata Kết quả phân tích GC-MS cho thấy nonadecan-1-ol xuất hiện thường xuyên hơn ở giống đực so với giống cái.
Năm 2018, Southmendranath Chatterjee và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất lá Solena amplexicaulis (Lam.) Gandhi đối với vi khuẩn Salmonella gallinarum Kết quả cho thấy nonadecan-1-ol có khả năng ức chế mạnh mẽ nhất trong số 6 hợp chất được thử nghiệm với vi khuẩn này.
Hợp chất MB03: β-sitosterol
Phytosterol là hợp chất có hoạt tính sinh học trong màng tế bào thực vật, có cấu trúc hóa học tương tự cholesterol từ động vật có vú Chúng phổ biến trong quả hạch, hạt, đậu và dầu ô liu Trong số các phytosterol, β-sitosterol là loại phổ biến nhất trong thực vật và đã được nhiều nghiên cứu in-vitro và in-vivo chứng minh có nhiều tác dụng sinh học khác nhau.
Vào năm 1999, T J Wilt và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng của β-sitosterol trong việc điều trị triệu chứng của tăng sản tuyến tiền liệt lành tính Kết quả nghiên cứu cho thấy β-sitosterol có khả năng cải thiện các triệu chứng liên quan đến đường tiết niệu.
Năm 2019, Qian Yang và các cộng sự đã phát hiện rằng β-sitosterol có khả năng giảm sự phát triển phình động mạch nội sọ thông qua cơ chế ức chế trung gian TNF-α.
Năm 2021, Nicolas Panayotis và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng giảm lo âu của β-sitosterol trên chuột, cho thấy rằng β-sitosterol có hoạt tính giảm lo âu rõ rệt trong số năm loại phytosterol Việc tiêm β-sitosterol đã kích hoạt c-Fos ở vỏ não trước trán và nếp răng, giúp giảm căng thẳng và sợ hãi.
Kết hợp β-sitosterol với fluoxetin có thể tăng cường tác dụng giảm lo âu Nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy β-sitosterol có hiệu quả trong việc giảm lo âu, cả khi sử dụng độc lập và khi kết hợp với các thuốc chống trầm cảm liều thấp.
Năm 2022, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Huyền và cộng sự chỉ ra rằng β-sitosterol trong chiết xuất từ Clinacanthus nutans Lindau có khả năng tăng cường hoạt động tạo xương thông qua việc tái điều hòa các gen và protein liên quan đến sự biệt hóa Đồng thời, nghiên cứu của Ru Wang và các cộng sự trong cùng năm cũng chứng minh rằng β-sitosterol có tác dụng ức chế viêm trong hen suyễn do ovalbumin gây ra.
Nghiên cứu thực nghiệm về β-sitosterol đã chỉ ra rằng hợp chất này có tiềm năng lớn trong việc sử dụng làm chất bổ sung để phòng ngừa và điều trị bệnh.
Hợp chất MB10: Acid betulinic
Các liệu pháp mới cần thiết để gây chết tế bào khối u, trong đó thực vật đóng vai trò quan trọng như nguồn cung cấp hợp chất chống ung thư Triterpenoid, đặc biệt là acid betulinic, là một hợp chất tự nhiên có triển vọng cao, được chiết xuất từ các loài thực vật như Birch (Betula sp.) và Psidium guajava Linn., với nhiều đặc tính sinh học, bao gồm khả năng chống ung thư mạnh mẽ.
Nghiên cứu in-vitro và in-vivo đã chỉ ra rằng acid betulinic có tác dụng mạnh mẽ đối với nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm cả những tế bào từ khối u kháng trị liệu và khó chữa Đồng thời, acid betulinic cũng được phát hiện là tương đối không độc hại đối với các tế bào khỏe mạnh.
Năm 2021, So Young Kim và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống tăng sinh của acid betulinic trên các dòng tế bào ung thư bàng quang (T-24, UMUC-3 và 5637) và xác định cơ chế tác dụng Kết quả cho thấy acid betulinic gây ra cái chết tế bào trong các tế bào ung thư bàng quang, đi kèm với quá trình chết theo chương trình, hoại tử và ngừng chu kỳ tế bào, đồng thời làm giảm biểu hiện của các chất điều chỉnh chu kỳ tế bào.
Acid betulinic (BA) đã chứng minh khả năng ngăn chặn sự gia tăng của các tế bào ung thư bàng quang ở người thông qua việc kích hoạt quá trình chết theo chương trình, hoại tử và ngừng chu kỳ tế bào Nghiên cứu cho thấy BA làm tăng sự biểu hiện của protein Bax và PARP đã phân cắt, đồng thời kích hoạt các caspase 3, 8 và 9 Đáng chú ý, BA không ảnh hưởng đến mức độ của các gốc oxy hóa hoạt động có nguồn gốc từ oxy (ROS), cho thấy rằng quá trình chết theo chương trình do BA gây ra không phụ thuộc vào ROS Bên cạnh đó, BA còn ngăn chặn khả năng di căn và giảm biểu hiện của các tế bào T24 và 5637 ở ốc sên, khẳng định vai trò quan trọng của nó trong việc ức chế sự phát triển của ung thư bàng quang.
Acid betulinic không chỉ thúc đẩy quá trình chết theo chương trình mà còn ức chế sự di căn của nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u thần kinh ngoại bì, ung thư biểu mô thận và ung thư đường mật.
Với việc các tác nhân tác động trực tiếp lên ty thể có thể dẫn đến chết tế bào khi hóa trị liệu không hiệu quả, ngày càng nhiều nghiên cứu tập trung vào việc phát triển các hợp chất mới cho điều trị ung thư Trong bối cảnh này, các tác nhân nhắm vào ty thể, như acid betulinic, nổi bật như một phương pháp tiềm năng để thay thế một số thuốc hiện có trong điều trị ung thư ở người.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm, đề tài khóa luận đã thu được một số kết quả như sau:
Đã tiến hành chiết xuất và phân lập thành công 3 hợp chất từ cây Trai lá hoa Quá trình này được thực hiện thông qua phương pháp ngâm chiết với dung môi EtOH 80% kết hợp với kỹ thuật sắc ký cột, nhằm chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của lá cây.
Cấu trúc của ba hợp chất phân lập từ lá cây Trai lá hoa đã được xác định thông qua các phương pháp như đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, cùng với việc so sánh dữ liệu với các hợp chất liên quan Ba hợp chất này bao gồm nonadecan-1-ol (MB01), β-sitosterol (MB03) và acid betulinic (MB10), đánh dấu lần đầu tiên chúng được phân lập từ nguồn gốc này.
- Tiếp tục nghiên cứu, chiết xuất và phân lập thêm các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của lá cây Trai lá hoa
- Đánh giá tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, giảm đau của phân đoạn dịch chiết từ cây Trai lá hoa.