Nghiên cứu định danh trà hoa vàng (camellia sp ) ở hòa bình bằng chỉ thị hình thái và dna barcode

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH LOÀI TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA SP) Ở HỊA BÌNH BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ DNA BARCODE NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Vũ Quang Nam Th.S Cao Thị Việt Nga Sinh viên thực : Trần Văn Xuân Mã sinh viên : 1853160053 Lớp : 63 - CNSH Khóa học : 2018- 2022 Hà Nội, 2022 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi suốt q trình thực khóa luận trường, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Tài nguyên thực vật rừng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Cao Thị Việt Nga PGS.TS Vũ Quang Nam tận tình hưỡng dẫn bảo tơi q suốt hồn thành khóa luận đề tài “Nghiên cứu định danh lồi Trà hoa vàng (Camellia sp) Hịa Bình thị hình thái DNA barcode” Với kiến thức kỹ thầy cô truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn hành trang q giá giúp tơi sau Cảm ơn anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên hỗ trợ suốt thời gian qua Mặc dù cố gắng chắn khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót Vì vậy, tơi mong nhận ý kiến đánh giá, góp ý để tạo tiền đề vững cho công việc sau Xuân Mai, ngày 17 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Trần Văn Xuân i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Tổng quan Trà hoa vàng 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh học Camellia L 1.1.4 Giá trị sử dụng 1.1.5 Giới thiệu mã vạch DNA barcode 1.1.6 Một số đề tài nghiên cứu có liên quan đến lồi Trà hoa vàng trích dẫn đánh giá tổng quan 11 1.1.7 Một số DNA barcode sử dụng 13 1.1.8 Ứng dụng DNA barcode thực vật 17 CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.3.2 Hóa chất sử dụng 19 2.3.3 Thiết bị sử dụng 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Phương pháp mơ tả hình thái trà hoa vàng Camellia sp 21 2.4.2 Phương pháp Tách chiết DNA tổng số 21 2.4.3 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 23 ii 2.4.4 Tinh sản phẩm PCR 24 2.4.5 Phương pháp đọc trình tự 24 2.4.6 Xử lí số liệu 25 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Sử dụng thị hình thái để đinh danh loài Trà hoa vàng Camellia sp thu mẫu Lương Sơn, Hịa Bình 26 3.1.1 Định danh mẫu Trà hoa vàng Camellia sp Hịa Bình dựa thị hình thái 28 3.1.2 Kết tách chiết DNA tổng số 30 3.1.3 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kĩ thuật PCR 31 3.1.4 Phân tích kết 32 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Bp Base pair Cặp base CBOL Consortium for Barcode of Life CITES for on International Trade in Endangered Species of Công ước bn bán quốc tế lồi nguy cấp cpDNA Wild Fauna DNA and Flora Chloroplast CTAB Cetyl trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide Cytb Cytochrome b bromide Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate 10 DNA the Barcode of Life Convention the Consortium Bộ gen lục lạp (DNA) 11 dNTP 12 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A 13 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B 14 EDTA ethylenediamine Ethylenediaminetetraacetic Axit tetraacetic acid 15 F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi iv TT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 16 IGS Intergenic Spacer 17 ITS Internal Transcribed Spacer 18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 19 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể 20 NAD(P)H 21 NCBI Vùng liên gen Nicotinamide gen adenine Nicotinamide dinucleotide phosphate National Vùng DNA nằm Center adenine dinucleotide phosphate for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học 22 ORF Open Reading Frame 23 PCR Polymerase Chain Reaction 24 PVP Polyvinyl pyrrolidone 25 RFLP 26 Khung đọc mở Phản ứng chuỗi polymerase Polyvinyl pyrrolidone Restriction fragment length Phân tích đa hình trình tự polymorphism DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 28 SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate 29 R-Primer Reverse primer Mồi ngược 30 TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA 31 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 31 UV Untraviolet Tia cực tím v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 – Phân loại khoa học Trà hoa vàng – chưa gắn nguồn Bảng 1.2 Danh mục lồi Camellia L có hoa vàng Việt Nam Bảng 2.1 - Thành phần đệm tách A (100ml) 19 Bảng 2.2 - Thành phần đệm tách B (100ml) 20 Bảng 2.3 - Thành phần đệm TE (100ml) 20 Bảng 2.4 - Trình tự thơng tin cặp mồi sử dụng 23 Bảng 2.5 - Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng 3.1 Đặc điểm thực vật học, sinh thái học số loài 26 Trà hoa vàng 26 Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng Camellia sp loài Trà khác 33 Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền Camellia sp với đoạn trình tự trnH-pbsA 35 Bảng 3.4 Tỷ lệ tương đồng Camellia sp loài Trà khác 36 Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền Camellia sp với đoạn trình tự rbcL 37 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ sinh thái rừng nhiệt đới đa dạng phong phú, xét khía cạnh kinh tế có nhiều lồi khơng cho gỗ lại có giá trị kinh tế lớn lơn gỗ nhiều lần Việc nghiên cứu tận dụng nguồn tài nguyên thực vật gỗ rừng hướng đắn, có nhiều triển vọng Vừa đáp ứng mục tiêu kinh tế, vừa thúc đẩy trì ổn định hệ sinh thái vừa bảo tồn tính đa dạng sinh học Chi Chè (Camellia L.) thuộc họ Chè (Theaceae) từ lâu thân thuộc với người dân nhiều nước giới có nhiều tác dụng chữa bệnh dùng phổ biến để làm đồ uống, thực phẩm chức Đã có nhiều nghiên cứu nước giới chi Camellia, kết cho thấy phần lớn loài chi chứa thành phần chủ yếu flavonoid, triterpenoid số hợp chất polyphenolic khác; có nhiều hoạt tính q giá, đáng ý hoạt tính chống oxi hóa (Qin et al., 2008; Huang et al 2009; He et al., 2015; Wei et al., 2015) Trong chi Camellia, Trà hoa vàng (gold camellia) coi loại quý Trên giới có khoảng 40 lồi, phân bố chủ yếu miền Nam Trung Quốc miền Bắc Việt Nam Ở Việt Nam, ước tính có khoảng 30 loài Trà hoa vàng, phân bố rộng khắp nước (Le & Luong, 2016) Mặc dù nghiên cứu chi Camellia có từ sớm có nhiều công bố chi này, riêng Trà hoa vàng, chưa có nhiều nghiên cứu, thành phần hóa học hoạt tính sinh học Đa phần nghiên cứu Trà hoa vàng tập trung vào đặc tính thực vật làm cảnh chúng Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Trà hoa vàng bắt đầu có từ năm 2011 trở lại đây, chủ yếu tác giả Trung Quốc Trà hoa vàng gọi “Siêu trà Camellia” sản phẩm thực phẩm chức từ loài xem sản phẩm có giá trị cao có lợi cho sức khỏe Trong thời gian gần đây, việc khai thác giống Trà hoa vàng mọc tự nhiên để bán thị trường diễn phổ biến, đáng báo động, khiến cho loài dược liệu quý có nguy bị tuyệt chủng Từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu định danh loài Trà hoa vàng (Camellia sp) Hịa Bình thị hình thái kỹ thuật DNA barcode” để phát triển giống, xây dựng liệu gen góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý quốc gia CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Tổng quan Trà hoa vàng 1.1.1 Phân loại khoa học Bảng 1.1 – Phân loại khoa học Trà hoa vàng – chưa gắn nguồn Giới (Regnum) Plantae Bộ (Ordo) Theales Họ (Familia) Theaceae Chi (Genus) Camellia Loài (Species) Camellia tonkinensis 1.1.2 Phân bố ❖ Trên giới Chi Camellia L có khoảng 280 lồi, phân bố chủ yếu nhiệt đới nhiệt đới, có nguồn gốc khu vực miền đông miền nam châu Á, từ phía đơng dãy Himalaya tới Nhật Bản Indonesia - Châu Á: Ấn độ, Bangladesh, Đài Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka, Trung Quốc, Việt Nam - Châu Phi: Burundi, Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda - Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Ecuador, Peru - Châu Đại Dương: Australia, New-Zeland - Châu Âu: Thổ Nhĩ Kỳ, Liên xơ (cũ) Ở Trung Quốc, lồi Camellia quan tâm bảo tồn phát triển từ sớm Đến có nhiều trung tâm bảo tồn nghiên cứu phát triển Trà, có Trà hoa vàng Vườn ngân hàng gen Camellia Nam Ninh nơi lưu giữ sưu tập lớn Trà hoa vàng (Camellia chrysantha.M Sealy) giới Lưu giữ 20 loài Camellia 15 thứ trà hoa vàng (Camellia chrysantha) nhằm bảo tồn, nghiên cứu, lai tạo giống nghiên cứu trồng trọt Có 3,000 cá thể lưu giữ, từ tạo 7,000 dịng lai từ bố mẹ Trà hoa vàng (Camellia chrysantha M.Sealy) lồi khác chi Camellia L… Có lồi sưu tập thu từ Việt Nam, gồm: C Cuống dài cỡ cm, mập, lông sớm rụng; phiến mỏng, mặt xanh đậm, bóng, khơng lơng, mặt xanh nhạt, có lơng tơ gắn gân (quan sát kính hiển vi soi nổi), dạng xoan rộng, cỡ 15-23 x 5-7,5 cm; chóp nhọn đến có đi, dài tới cm; gốc trịn đến tù; mép cưa nơng, thưa, cưa cách cỡ 3-5 mm; hệ gân dạng lơng chim, 8-11 gân bên gân chính, vấn hợp nhau, cách mép cỡ 0,5-0,6 mm Nụ hoa trước nở hình cầu, cỡ 2,5-3 x 2-2,5 cm Hoa mầu vàng; đài hoa 5, gần nhau, hình trịn gần trịn, dai, cứng, phủ lớp lơng tơ dày mặt ngồi, mặt khơng lơng, mép mỏng; tràng hoa 9-12, màu vàng nhạt, dạng lòng máng, cỡ 1,5-2 x 1,3-1,8 cm; nhị nhiều nhị, dính tới 2/3 chiều dài nhị, tạo lớp màng phía ngồi; nhuỵ gồm nỗn, bầu hợp, vịi nhuỵ rời Quả đóng, cỡ 1,7 x 2,5-3 cm, ô Hạt 1/mỗi ô Mùa hoa: tháng 3-4, mùa quả: tháng 5-10 (Hình 1.2) Hình 3.1 Tiêu chuẩn Trà hoa vàng ba (Camellia tonkinensis) (Số hiệu mẫu Balansa 3860 – P!.P01903515) 29 Hình 3.2 Trà hoa vàng ba (Camellia tonkinensis) thu từ Hồ Bình A Cành mang hoa; B Bộ nhuỵ với nỗn, vịi nhuỵ rời; C Các phần rời hoa; D Vỏ (Ảnh: Vũ Quang Nam) 3.1.2 Kết tách chiết DNA tổng số Các mẫu Trà hoa vàng sau thu thập tiến hành tách chiết DNA tổng số Kết thu tách chiết thành công DNA tổng số 02/02 mẫu Trà hoa vàng Kết tách chiết điện di gel agarose 1% thể hình 3.3 30 Hình 3.3 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu Trà hoa vàng Trên ảnh điện di, mẫu DNA sau tách chiết có băng vạch sáng rõ, DNA thu bị đứt gãy Do ta thấy phương pháp tách chiết DNA phù hợp với mẫu Trà hoa vàng nghiên cứu Từ kết tách chiết DNA tổng số ta có chất lượng DNA mẫu Trà Hoa Vàng đạt tiêu chuẩn thực phản ứng PCR sau 3.1.3 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kĩ thuật PCR DNA tổng số tách chiết bước sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen rbcL, TrnH-psbA, kỹ thuật PCR với cặp mồi tương ứng đặc hiệu Kết PCR thu hình 3.4 31 Hình 3.4 - Kết PCR gen TrnH-psbA, rbcL, mẫu Trà hoa vàng Kết điện di cho thấy băng sáng rõ nét, không xuất băng phụ Đoạn gen đoạn gen rbcL có kích thước khoảng 750bp, đoạn gen TrnH-psbA có kích thước khoảng 480bp Điều cho thấy mồi sử dụng đặc hiệu nhiệt độ bắt mồi tối ưu Các mẫu tinh đem xác định trình tự nucleotitde 3.1.4 Phân tích kết ❖ Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA Camellia sp thu thập Lương Sơn, Hịa Bình Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen trnH-psbA nhân có kích thước 480bp Kết giải trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu Trà hoa vàng sau xử lý thu sau: TTCACAATCCCCTGCCTTAATCCCCTTGGGTACATCCGCCCCC TTACTCCCCTATTTAAATTATAAAATAAAGAATTAAAATTCAACCA TTCATGATTATTTTTTTTTTTTTTTATTTTTGAGATACAAATAGTAA GCAAAAATTAAAAATTTTATTTTTTATTTTAAATGGAAAATAACAA 32 TTTCACAAAGGTATATAAATTATAAATTAATACATAACAAAAAGA CGATACTCAAAGATGAACCAACCCATAACCCATAAAAATACTTTT CTTTTTACCCATACGAATCTTTTTCTTGTAACGAAAAAAGGATATG TAAAAAAAAAAAAAGTAAAGGAACAATAATGCCTTCCTGATAAAA CAAGAAATTGGTTATTGTTCCTTTACTTTTAAAAACGAGTATACAC TAAAACCAAAGTCTTATCCATTTGTAAATGGAGCTTCAATAGCAGC TAGGTCTAAAGGAAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAA Sau trình tự sử dụng để so sánh với lồi Trà khác cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI Tỷ lệ tương đồng mẫu Trà hoa vàng thu mẫu Hòa Bình (Camellia sp.) lồi Trà khác (được thể bảng 3.2) Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng Camellia sp loài Trà khác TT Tên loài Mã số Tỷ lệ tương đồng (%) Camellia tonkinensis KX098581.1 96.57 Camellia petelotii KJ806276.1 95.97 Camellia chrysantha MZ618349.1 95.97 Camellia chuongtsoensis MT663341.1 95.97 Camellia vietnamensis MN078085.1 95.77 Sau chúng tơi sử dụng phương pháp Maximum Likelihood để xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ lồi Trà (như hình 3.5) 33 Hình 3.5 - Cây phân loại đoạn gen trnH-psbA tạo (ML) Camellia sp Bằng phần mềm Mega X nhận khoảng cách di truyền (pdistance) loài Trà vàng Camellia sp với loài Trà khác (được thể bảng 3.3) 34 Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền Camellia sp với đoạn trình tự trnHpbsA Camellia tonkinensis Camellia sp Camellia vietnamensis Camellia petelotii Camellia chuongtsoensis Camellia chrysanthoides Camellia tonkinensis Camellia sp 0,0354 Camellia vietnamensis 0,0061 0,0419 Camellia petelotii 0,0061 0,0376 0,0041 Camellia chuongtsoensis 0,0061 0,0418 0,0041 0,0041 Camellia chrysanthoides 0,0061 0,0418 0,0041 0,0041 0,0000 Căn vào phát sinh chủng loại thị trnH-pbsA khoảng cách di truyền loài ta thấy loài Trà thu thập Hịa Bình có quan hệ gần với loài Trà vàng (Camellia tonkinensis) với khoảng cách di truyền 0.0354, hệ số bootstrap 100% có quan hệ xa với loài Trà (Camellia vietnamensis) với khoảng cách di truyền 0.0419, hệ số bootstrap 100% ❖ Trình tự ADN đoạn gen rbcL Camellia sp thu thập Hịa Bình Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen rbcL nhân có kích thước 718bp Kết giải trình tự đoạn gen rbcL mẫu Trà hoa vàng sau xử lý thu sau: ACAGAAACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAA AGATTACAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGAT ACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCGCAACCTGGAGTTC CACCTGAAGAAGCAGGGGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCTACTG GTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACTTACTAGCCTTGATCG TTACAAAGGGCGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGAGAAGA AAGTCAATTTATTGCTTATGTAGCGTATCCTTTAGACCTTTTTGAAG AAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTT GGGTTCAAAGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAAGATCTGCGAATCC CTACTGCGTATGTTAAAACTTTCCAAGGACCGCCTCATGGCATCCA AGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTGTTGGG ATGTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTACGGA AGAGCAGTTTATGAATGTCTCCGCGGTGGACTTGATTTTAC 35 Sau trình tự sử dụng để so sánh với lồi Trà khác cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI Tỷ lệ tương đồng Camellia sp thu thập Lương Sơn, Hịa Bình loài Trà khác (được thể bảng 3.1) Bảng 3.4 Tỷ lệ tương đồng Camellia sp loài Trà khác TT Tên loài Mã số Tỷ lệ tương đồng (%) Camellia tonkinensis KX078450.1 99.83 Camellia petelotii KJ806276.1 99.83 Camellia chrysanthoides MZ618349.1 99.83 Camellia chuongtsoensis Camellia vietnamensis MT663341.1 MN078085.1 99.83 99.83 Sau sử dụng phương pháp Maximum Likelihood để xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ lồi Trà hình 08 Hình 3.6 Cây phân loại đoạn gen rbcL tạo (ML) Camellia sp 36 Bằng phần mềm Mega X chúng tơi nhận khoảng cách di truyền (pdistance) lồi Trà thu thập Lương Sơn, Hịa Bình với loài Trà khác Việt Nam (được thể bảng 3.5) Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền Camellia sp với đoạn trình tự rbcL Camellia.sp Camellia tonkinensis Camellia vietnamensis Camellia petelotii Camellia chuongtsoensis Camellia chrysanthoides Camellia.sp Camellia tonkinensis 0,0017 Camellia vietnamensis 0,0017 0,0000 Camellia petelotii 0,0017 0,0000 0,0000 Camellia chuongtsoensis 0,0017 0,0000 0,0000 0,0000 Camellia chrysanthoides 0,0017 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Căn vào phát sinh chủng loại thị đoạn gen rbcL khoảng cách di truyền loài ta thấy loài Trà (Camellia tonkinensis, Camellia petelotii, Camellia chrysanthoides, Camellia chuongtsoensis, Camellia vietnamensis) nằm nhánh có tương đồng 100%, lồi Trà thu thập Lương Sơn, Hịa Bình phân thành nhánh khác có thay đổi nucleotide vị trí số so lồi trà Tuy nhiên thị khơng có phân biệt loài cao tương đồng 100% trình tự nucleotide lồi Trà Camellia sp ACAGAAACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTAT 60 ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Camellia tonkinensis ACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTACAAATTGACTTAT 60 Như vậy, từ kết gen thành công đoạn gen rbcL, trnH-pbsA từ ADN tổng số loài Trà hoa vàng thu từ Lương Sơn, Hồ Bình kỹ thuật PCR; kết xác định trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN cho thấy đoạn rbcL có kích thước 750bp, đoạn TrnH-psbA có 480bp; đoạn ADN rbcL không phù hợp làm đoạn mã vạch để nhận biết loài Trà hoa vàng thu từ Lương Sơn Hồ Bình; đoạn TrnH-psbA làm mã vạch có khả phân 37 biệt, theo mẫu vật thu từ Hồ Bình có quan hệ gần với loài Trà hoa vàng (Camellia tonkinensis) phân bố khu vực VQG Ba Vì hay cịn gọi Trà hoa vàng (Camellia tonkinensis) Từ đó, nhận định rằng, loài Trà hoa vàng thu mẫu Lương Sơn, Hồ Bình lồi Trà hoa vàng (Camellia tonkinensis) có phân bố Ba Vì 38 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã định danh lồi Trà hoa vàng Camellia sp thu Hịa Bình hình thái Đã nhân gen thành công đoạn gen rbcL, trnH-pbsA từ ADN tổng số lồi Trà hoa vàng thu từ Hồ Bình kỹ thuật PCR Kết xác định trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN cho thấy đoạn rbcL có kích thước 750bp, đoạn TrnH-psbA có 480bp Đoạn ADN rbcL không phù hợp làm đoạn mã vạch để nhận biết loài Trà hoa vàng thu từ Hồ Bình Đoạn TrnH-psbA làm mã vạch có khả phân biệt, theo mẫu vật thu từ Hồ Bình có quan hệ gần với lồi Trà hoa vàng Ba Vì (Camellia tonkinensis) Cuối sau trình so sánh thị hình thái DNA barcode kết luận mẫu nghiên cứu Trà hoa vàng thu Lương Sơn, Hịa Bình lồi Trà hoa vàng Ba Vì (Camellia tonkinensis) 4.2 Kiến nghị Đưa trình tự gen rbcL, TrnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau Tiếp tục thu thập mẫu Trà hoa vàng vùng địa lý khác để đánh giá toàn diện tính đa dạng di truyền lồi Nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam Sử dụng gen rbcL TrnH-psbA vào việc giám định loài Trà hoa vàng Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể Nhân mã vạch DNA khác đối tượng Trà hoa vàng 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Bae K and Byun J Screening of leaves of higher plants for antibacterial action Kor J Pharmacogn 1987; 8:1 Chen, J H.; Wu, S R.; He, Y Z.; Lin, W Y.; Luo, J H.; Fu, J Y The wholesome function and trace elements of leaves in artificial asexual propagation of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama (golden camellia) Weiliang Yuansu Yu Jiankang Yanjiu 1993, 10, 51-52 Chen S.Y.H Han J Liu C Song J Et Al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS ONE 5: e8613 Gao T.Y.H Song j Liu C Zhu Y Et Al (2010), “Identification of ITS2”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 116 – 121 Han Y, Chagne D, Gasic K, Rikkerink EH, Beever JE, Gardiner SE and Korban SS BAC-end sequence-based SNPs and Bin mapping for rapid integration of physical and genetic maps in apple Genomics 2009; 93:282-8 Hebert P.D.N C.A Ball S L , Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp 313 – 321 Kress, J.W.Wurdack K.J ,Zimmer, E A ,Weigt, L A & Janzen, D.H (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Molecular Econogy, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 8369 – 8374 Kress, W J., & Erickson, D L., “DNA barcodes: gens, genomics, and bioinformatics”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(8), pp 2761-2762, 2008 Peng, X., Yu, D., Feng, B.M., Tang, L., Wang, Y.Q & Sgi,L Y (2011) Chemical constituents from the flowers of Camellia chrysantha Guihaia, 31(4), 550-553 10 Li Bin, Lin Furong, Lu Chang, Cai Qifei, Zheng Yongqi, Liu Ru, “Propagation method for soft cuttings of Liriodendron”, 770-774, 2018 40 11 Lin In Et Al (2013), "Chemical constituents and anticancer activity of yellow Camellias against MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells", Agric Food Chern, pp 61, 9638-9644 12 Mark Y S H.P.D.N (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp 82 – 88 13 Moon MK, Oh HM, Kwon BM, Baek NI, Kim SH, Kim JS and Kim DK Farnesyl protein transferase and tumor cell growth inhibitory activities of lipiferolide isolated from Liriodendron tulipifera Arch Pharm Res 2007; 30:299-302 14 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 15 Rivers M.C (2015) Camellia tonkinensis The IUCN Red List of Threatened Species 015e.T191442A1982634 16 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, loMolecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 17 Williams RS and Feist WC Durability of yellow-poplar and sweetgum and service life of finishes after long-term exposure Forest Products J 2004; 54:96-101 18 Wei J.B., Li X., Song H., Liang Y.H., Pan Y.Z., Ruan J.X., Qin X., Chen Y.X., Nong C.L & Su Z.H (2015) Characterization and determination of antioxidant components in the leaves of Camellia chrysantha (Hu) Tuyama based on composition-activity relationship approach Journal of Food and Drug Analysis, 23:40-48 41 19 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 20 Bùi Thị Mai Hương (2022) Xác định đoạn mã vạch AND số mẫu Trà hoa vàng Quảng Ninh phục vụ giám định lồi phân tích đa dạng di truyền Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn 2022, số tr.90-98 21 Đặng Văn Bích (2021) Hàm lượng số hợp chất có hoạt tính sinh học nụ hoa Trà Hoa vàng (Camellia chrysanthoides) thu thập Quảng Ninh Nông nghiệp & Phát triển Nơng thơn 2021, số 3-4 tr.46-54 22 Đinh Hồng Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 23 Hà Văn Huân (2015), “Mã vạch DNA (DNA barcode): Nguyên lý ứng dụng”, Ngân hàng liệu DNA Việt Nam đăng ngày 13 tháng 12 năm 2015 24 Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 – 124 25 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191 -198 26 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 27 Ngô Thị Thảo (2016) Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dung sinh học trà hoa vàng thu hái huyện Ba Chẽ, Tỉnh Quảng Ninh, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học - Công nghệ tuổi trẻ trường Đại học, Cao đẳng Y – Dược Việt Nam lần thứ XVIII, 610 – 614 42 28 Ngô Thị Minh Duyên, Ngô Quang Hưng, Lê Sỹ Doanh, Ngô Quý Công, Nguyễn Văn Khương, Đánh giá tình hình sinh trưởng khả tái sinh Trà hoa vàng số tỉnh phía bắc, Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam 29 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh 30 Nguyễn Thơng (2015), “Phân tích trình tự ITS matK họ gừng Zingiberaceae” 31.Nguyễn Văn Việt Nguyễn Thị Huyền, Trần Việt Hà (2019) Thử nghiệm ba vùng DNA tiềm (matK, rbcL ITS2) cho nhận dạng loài trà hoa vàng Bắc Giang (Camellia euphlebia) Quảng Ninh (Camellia chrysantha) Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp 2019, số tr.18-24 32 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nxb khoa học kỹ thuật, pp 33 Trần Ninh (2010) Các loài trà Vườn quốc gia Tam Đảo, Vườn quốc gia Tam Đảo, huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 34 Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN-8126:2009 (Ban hành ngày 21/12/2009) 43