Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch dna (dna barcode) cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi suốt q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Văn Huân, TS Bùi Thị Mai Hƣơng tận tình giúp đỡ bảo tơi q trình hồn thành khóa luận Đặc biệt, Khóa luận nhận đƣợc hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc "Xây dựng sở liệu mã vạch DNA (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá trị kinh tế" PGS.TS Hà Văn Huân làm Chủ nhiệm Với kiến thức kỹ thầy cô truyền dạy khơng giúp tơi hồn thành khóa luận mà cịn tài sản q báu theo giúp tơi sau Cảm ơn anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học quan tâm giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Chân thành cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên hỗ trợ suốt thời gian qua Do q trình thực cịn có nhiều hạn chế mặt thời gian, kiến thức kinh nghiệm khơng tránh khỏi thiếu sót định Tơi mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp tơi đƣợc hồn thiện Xn Mai, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Lưu Thị Thu i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Keo Lai 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Giá trị sử dụng 1.2 Tổng quan DNA barcode ( DNA mã vạch) 1.2.1 Giới thiệu mã vạch DNA barcode 1.2.2 Một số DNA barcode sử dụng 1.2.3 ng dụng c a D barcode tr n thực v t 14 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 16 2.3.1.V t liệu nghiên cứu 16 2.3.2 Hóa chất 16 2.3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Tách chiết D t ng số 18 2.4.2 iểm tra ết tách chiết D t ng số 20 ii 2.4.3 Phương pháp nhân gen đích c a ỹ thu t PCR 20 2.4.3.1 Các bước tiến hành phản ứng PCR 20 2.4.4 Tinh sản phẩm PCR 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết tách chiết DAN tổng số 24 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 24 3.3 Phân tích kết 25 3.3.1 Xác định phân tích trình tự DNA vùng gen nghiên cứu 25 3.3.2 So sánh phân biệt c a đoạn trình tự 35 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 4.1 Kết luận 37 4.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Bp Base pair Cặp base CBOL Consortium for the Barcode Consortium for the of Life Barcode of Life CITES Convention on International Trade in Endangered Công ƣớc buôn bán Species of Wild Fauna and quốc tế loài nguy cấp Flora cpDNA Chloroplast DNA CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide Cytb Cytochrome b Cytochrome b 10 DNA (DNA) Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic 11 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate 12 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A 13 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B 14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 15 F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi 16 IGS Intergenic Spacer vùng liên gen gen lục lạp iv axit ethylenediamine tetraacetic 17 ITS Internal Transcribed Spacer vùng DNA nằm gen 18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 19 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể 20 NAD(P)H Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học 22 ORF Open Reading Frame Khung đọc mở 23 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase 24 PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone 25 RFLP Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA 26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 28 SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate 29 R-Primer Reverse primer Mồi ngƣợc 30 TAE Tris-Acetate-EDTA 31 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 31 UV Untraviolet Tia cực tím 21 v Tris-Acetate-EDTA DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học Keo Lai [24] Bảng 1.2 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 11 Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu Keo Lai sử dụng cho nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách A (100ml) 17 Bảng 2.3 Thành phần đệm tách B (100ml) 17 Bảng 2.4 Thành phần đệm TE (100ml) 17 Bảng 2.5 Trình tự thông tin cặp mồi đƣợc sử dụng 21 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ngân hàng gen NCBI 26 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ngân hàng gen NCBI 30 Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ngân hàng gen NCBI 33 Bảng 3.7 Bảng so sánh khả phân biệt Các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA 36 DANH MỤC HÌNH vi Hình 1.1 Hình thái Keo Lai Hình 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số mẫu Keo lai 24 Hình 3.2 Kết PCR gen matK, trnH-psbA, rbcL mẫu Keo Lai 25 Hình 3.4 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 27 Hình 3.3 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea (các vị trí sai khác đƣợc bơi đỏ) 29 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo NCBI 31 Hình 3.5 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea 32 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 34 Hình 3.7 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea (các vị trí sai khác đƣợc bơi đỏ) 35 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Keo Lai thuộc họ Đậu Tên khoa học Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid Keo Lai kết hợp Keo tràm (Acacia Auriculiormis) Keo Tai Tƣợng (Acacia Mangium) Giống keo lai tự nhiên đƣợc phát Messir Herbern Shim ghi nhận vào năm 1972 số Keo tai trƣợng trồng ven đƣờng Sook Telupid thuộc bang Sabah, Malaysia [23] Năm 1976, M.Tham kết luận thông qua việc thụ phấn chéo Keo tai tƣợng Keo tràm tạo Keo lai có sức sinh trƣởng nhanh giống bố mẹ Cây Keo lai có nguồn gốc Australia, đƣợc trồng phổ biến nƣớc Đông Nam Á Tuy nhiên, năm gần đây, giống Keo Lai đƣợc phát số tỉnh vùng Đơng Nam Bộ Ở Ba Vì (Hà Nội) số tỉnh khác Việt Nam Đồng thời, giống keo đƣợc Trung tâm nghiên cứu giống rừng thuộc Viện Khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam nghiên cứu khảo nghiệm thành công (Diễn đàn nongnghiepViet.info) Cây Keo Lai loài chủ lực trồng rừng kinh tế đa số ngƣời dân Công ty Lâm Nghiệp So với loài Keo khác nhƣ Keo tràm, Keo tai tƣợng Keo lai có đặc điểm hẳn sinh khối, tỷ trọng độ dồng sinh trƣởng Những gỗ thẳng, kích thƣớc lớn đƣợc sử dụng xây dựng, đóng đồ mộc mỹ nghệ, hàng hóa xuất Phải đến 80% gỗ Keo Lai dùng cho công nghiệp chế biến gỗ Phần lại “phụ phẩm” nhƣ cành nhánh, nhỏ cong, xấu đem bán cho nhà máy giấy Ngoài ra, Keo Lai đƣợc sử dụng để làm sàn gỗ, đóng sản xuất pallet gỗ với kích thƣớc, độ dài ngắn khác Trƣớc đây, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa thị hình thái đặc tính sinh lý sinh hóa bên nhờ vào bảng hƣớng dẫn định danh có sẵn Phƣơng pháp phân loại truyền thống nhiều trƣờng hợp cịn gặp nhiều khó khăn hạn chế, nhƣ: nhiều sinh vật có hình thái giống nhƣng thực tế lại khác hệ thống phân loại (hệ gen khác nhau), ngƣợc lại nhiều sinh vật có hình thái khác nhƣng lại gần hệ thống phân loại (hệ gen giống nhau) Mặt khác, phƣơng pháp phân loại dựa đặc điểm hình thái khó phân biệt đƣợc khác biệt biến dị dƣới loài Đặc biệt, mẫu vật có nguồn gốc sinh vật bị biến đổi hình thái, nhƣ: mẫu sinh vật chết, bị chôn vùi dƣới đất, công trình xây dựng, qua chế biến khơng thể xác định đƣợc thị hình thái Do đó, địi hỏi cần có phƣơng pháp định danh phân loại đại khắc phục đƣợc hạn chế Việc ứng dụng gen mã vạch, xác định đoạn DNA barcode phƣơng pháp định danh, sử dụng đoạn DNA chuẩn ngắn nằm genome sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phƣơng pháp xác định đoạn DNA barcode đƣợc áp dụng phổ biến cho lồi thực vật có giá trị kinh tế cao Từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho Loài Keo Lai (Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid) phục vụ giám định loài” để phân loại, lựa chọn xây dựng liệu gen quý góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý quốc gia CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Keo Lai 1.1.1 Phân loại khoa học Bảng 1.1 Phân loại khoa học Keo Lai [24] Giới (Regnum) Plantae Bộ (Ordo) Fabales Họ (Familia) Fabaceae Phân họ (Subfamilia) Mimosoideae Chi (Genus) Acacia Loài (Species) A.auriculiformis mangium 1.1.2 Phân bố Cây Keo Lai phân bố rộng khắp giới nƣớc năm gần đây, mọc chủ yếu khu vực đồi núi, vùng sƣờn dốc hay có gió hầu hết dạng đất, thích nghi tỉnh từ Quảng Bình trở vào Vùng đất thích nghi đất có độ pH từ 3-7, chủ yếu trồng loại đất ferali, tầng dày tối thiểu 75 cm, tối ƣu từ 4-50 cm, đất phù sa cổ, đất xám bạc màu, đất phèn lên luống không bị ngập nƣớc trồng đƣợc [25] Trong nƣớc, Keo lai thƣờng phân bố khu vực nhƣ: Tân Tạo, Trảng Bom, Sơng Mây, Cà Mau, Quảng Bình Ba Vì ( Hà Tây), Phú Thọ, Hịa Bình, Tuyên Quang, Thái Nguyên Trên giới thƣờng phân bố nƣớc: Australia, Papua New Guinea, Indonesia, Maylaysia, Philippines, Thailand TTATGTTAGATATCAAGGAAAATCCATTCTAGTTTCAAAGAATACGCCC TTTTTGATGAAAAAATGGAAATACTATCTTATCCATTTATGGCAATGTCA TTTTTTTGTTTGGTCTCAACCAGGAAAGATCCATATAAACCAATTATCCG AGCATTCATTTTACTTTTTGGGCTATTTTTCAAATGTGCGGCTAAATCCTT CAGTGGTACGGAGTCAAATGTTGGAAAAGTCATTTATAATGGAAAATCT TATGAAAAAGCTTGATACAATAATTCCAATTATTCCTCTAATTAGATCAT TGGCTAAAGCAAATTTTTGTAATGTATTAGGACATCCCATTAGTAAGCC GGTCTGGGCCGATTCATCCGATTTTGATATTATTGAGCGATTTTTGCAGA TATGCAGAGATCTCTCTCATTATTACAACGGATCCTCAAAAAAAAAGAG TTTGTATCGAATCAAATATATACTTCGGCTTTCTTGT Các trình tự sau đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ loài lồi có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen matK lồi Keo Lai cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Keo lai đƣợc trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Tỷ ệ tương đồng Acacia longhiphyllodinea LN885287.1 99% Acacia longhiphyllodinea LN885286.1 99% Acacia pachycarpa AF274153.1 99% Acacia websteri LN885327.1 99% Acacia lasiocalyx isolate 615LAS LN885284.1 99% Acacia sulcaticaulis isolate 570SUL LN885319.1 99% Acacia translucens AF523087.1 99% Acacia melanoxylon AF274222.1 99% Acacia puncticulata isolate 256PUN LN885300.1 99% 10 Acacia resinimarginea isolate 530RES LN885303.1 99% 26 Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể nhƣ hình 3.4 Hình 3.4 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI  Nh n t: Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự gen matK ta thấy loài Acacia auriculiformis mangium,Acacia hybrid có quan hệ gen gần với lồi Acacia translucens có quan hệ xa với lồi Acacia puncticulata Sau chúng tơi so sánh cấp độ lồi theo đoạn gen matK loài Acacia auriculiformis mangium,Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số LN885287.1, nhận đƣợc sai khác đoạn gen đƣợc thể nhƣ sau: Score Expect Identities 1725 bits(934) 0.0 Query Gaps Strand 936/937(99%) 0/937(0%) Plus/Plus TAATTTACGATCAATTCATTCAATATTTCCtttttttGAGGAAAAATTTCCATATTTAAA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3332 TAATTTACGATCAATTCATTCAATATTTCCTTTTTTTGAGGAAAAATTTCCATATTTAAA 3273 Query 61 TTATGTGTCAGATGTACAAATACCCTACCCTATACATCTGGAAATCTTGATTCAAACCCT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 27 Sbjct 3272 TTATGTGTCAGATGTACAAATACCCTACCCTATACATCTGGAAATCTTGATTCAAACCCT 3213 Query 121 TCGATACTGGGTGAAAGATGCCTCCTCCTTTCATTTATTAAGGCTCTTTCTTTATGAGTA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3212 TCGATACTGGGTGAAAGATGCCTCCTCCTTTCATTTATTAAGGCTCTTTCTTTATGAGTA 3153 Query 181 TTGTAATTGGAATAGTCTTATTACTCCaaaaaaaaGGATTTCTACTTTTTCAAAAAGTAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3152 TTGTAATTGGAATAGTCTTATTACTCCAAAAAAAAGGATTTCTACTTTTTCAAAAAGTAA 3093 Query 241 TCCAAGATTTTTCCTGTTCCTATATAATTTTTATGTATGTGAATACGAATCCATCTTTCT 300 Sbjct 3092 TCCAAGATTTTTCCTGTTCCTATATAATTTTTATGTATGTGAATACGAATCCATCTTTCT 3033 Query 301 TTTTCTCCGTAACAAATCTTCTTATTTACGATTAACATCTTCTGGAGTCTTTTTTGAACG 360 Sbjct 3032 TTTTCTCCGTAACAAATCTTCTTATTTACGATTAACATCTTCTGGAGTCTTTTTTGAACG 2973 Query 361 AATCTATTTCTATGCAAAAATAGAACATTTTGTAGAAGTCTTTGATAAGGATTTTCCGTC 420 Sbjct 2972 AATCTATTTCTATGCAAAAATAGAACATTTTGTAGAAGTCTTTGATAAGGATTTTCCGTC 2913 Query 421 CACCCTATGGTTCTTCAAGGACCCTTTCATTCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCCAT 480 Sbjct 2912 CACCCTATGGTTCTTCAAGGACCCTTTCATTCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCCAT 2853 Query 481 TCTAGTTTCAAAGAATACGCCCTTTTTGATGAAAAAATGGAAATACTATCTTATCCATTT 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2852 TCTAGCTTCAAAGAATACGCCCTTTTTGATGAAAAAATGGAAATACTATCTTATCCATTT 2793 Query 541 ATGGCAATGTCAtttttttGTTTGGTCTCAACCAGGAAAGATCCATATAAACCAATTATC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2792 ATGGCAATGTCATTTTTTTGTTTGGTCTCAACCAGGAAAGATCCATATAAACCAATTATC 2733 Query 601 CGAGCATTCATTTTACTTTTTGGGCTATTTTTCAAATGTGCGGCTAAATCCTTCAGTGGT 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2732 CGAGCATTCATTTTACTTTTTGGGCTATTTTTCAAATGTGCGGCTAAATCCTTCAGTGGT 2673 Query 661 ACGGAGTCAAATGTTGGAAAAGTCATTTATAATGGAAAATCTTATGAAAAAGCTTGATAC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2672 ACGGAGTCAAATGTTGGAAAAGTCATTTATAATGGAAAATCTTATGAAAAAGCTTGATAC 2613 Query 721 AATAATTCCAATTATTCCTCTAATTAGATCATTGGCTAAAGCAAATTTTTGTAATGTATT 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2612 AATAATTCCAATTATTCCTCTAATTAGATCATTGGCTAAAGCAAATTTTTGTAATGTATT 2553 Query 781 AGGACATCCCATTAGTAAGCCGGTCTGGGCCGATTCATCCGATTTTGATATTATTGAGCG 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 28 Sbjct 2552 AGGACATCCCATTAGTAAGCCGGTCTGGGCCGATTCATCCGATTTTGATATTATTGAGCG 2493 Query 841 ATTTTTGCAGATATGCAGAGATCTCTCTCATTATTACAACGGATCCTCaaaaaaaaaGAG 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2492 ATTTTTGCAGATATGCAGAGATCTCTCTCATTATTACAACGGATCCTCAAAAAAAAAGAG Query 901 TTTGTATCGAATCAAATATATACTTCGGCTTTCTTGT 2433 937 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2432 TTTGTATCGAATCAAATATATACTTCGGCTTTCTTGT 2396 Hình 3.3 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea (các vị trí sai khác bôi đỏ) Từ kết thu đƣợc, nhận thấy tỷ lệ tƣơng đồng trình tự gen matK lồi Keo lai Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự đoạn gen matK loài Acacia longhiphyllodinea NCBI 99% có 01 điểm sai khác: - Thay T C vị trí số 3.3.1.2 Trình tự DNA gen rbcL Sản phẩm PCR sau tinh đƣợc đem giải trình tự Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen rbcL đƣợc nhân có kích thƣớc 599 bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen rbcL mẫu Keo Lai nhƣ sau: ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTG TTAAAGATTATAAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGA TAGTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCG CCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACAT GGACAACTGTGTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGG ACGATGCTACCACATCGAGTCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATT GCTTATGTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAA CATGTTTACTTCGATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCG CTCTACGTCTGGAAGATTTGCGAATCCCTCCTTCTTATTCTAAAACTTTC CAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAG TACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTAT CCGCGAAGAATTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACT TGATTTTAC 29 Các trình tự sau đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen rbcL lồi Keo Lai cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Keo lai đƣợc trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen rbcL tương đồng với lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ngân hàng gen NCBI Tỷ ệ STT Mã số Tên loài tương đồng Acacia scirpifolia LN885312.1 100% Acacia scalene LN885311.1 100% Acacia longiphyllodinea LN885287.1 100% Acacia lasiocalyx LN885284.1 100% Acacia andrewsii LN885245.1 100% Acacia umbraculiformis LN885325.1 99% Acacia stanleyi LN885317.1 99% Acacia restiacea LN885308.1 99% Acacia puncticulata LN885300.1 99% 10 Acacia woodmaniorum LN885328.1 99% Kết xây dựng đƣợc phát sinh chủng loại đƣợc thể nhƣ hình sau: 30 Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự gen rbcL ta thấy loài Acacia auriculiformis mangium , Acacia hybrid có quan hệ gen gần với lồi Acacia andrewsii, Acacia stanleyi có quan hệ xa với loài Acacia restiacea, Acacia woodmaniorum Từ tƣơng đồng trình tự, nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Keo Lai Do lấy trình tự mẫu đại diện cho lồi để phân tích kết So sánh khác biệt cấp độ loài theo đoạn gen rbcL loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số N885287.1 Sự sai khác trình tự đoạn gen đƣợc thể nhƣ hình 3.5: 31 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1107 bits(599) 0.0 599/599(100%) 0/599(0%) Plus/Minus Query ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60148 ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTAT 60207 Query 61 AAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATAGTGATATCTTGGCAGCATTC 120 Sbjct 60208 AAATTGACTTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATAGTGATATCTTGGCAGCATTC 60267 Query 121 CGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAA 180 Sbjct 60268 CGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCAGGTGCCGCGGTAGCTGCTGAA 60327 Query 181 TCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAC 240 Sbjct 60328 TCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTAC 60387 Query 241 AAAGGACGATGCTACCACATCGAGTCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60388 AAAGGACGATGCTACCACATCGAGTCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTAT 60447 Query 301 GTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCGATT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60448 GTAGCTTATCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCGATT 60507 Query 361 GTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAAGATTTGCGAATC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60508 GTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAGGCCCTGCGCGCTCTACGTCTGGAAGATTTGCGAATC 60567 Query 421 CCTCCTTCTTATTCTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGAT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60568 CCTCCTTCTTATTCTAAAACTTTCCAAGGTCCGCCTCACGGCATCCAAGTTGAGAGAGAT 60627 Query 481 AAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60628 AAATTGAACAAGTACGGCCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTA Query 541 TCCGCGAAGAATTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC 60687 599 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 60688 TCCGCGAAGAATTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC 60746 Hình 3.5 Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen loài Acacia longhiphyllodinea 32 Từ kết thu đƣợc, nhận thấy khơng có điểm sai khác trình tự gen rbcL lồi Keo Lai nghiên cứu với trình tự đoạn gen rbcL loài Acacia longhiphyllodinea Tỷ lệ tƣơng đồng 100% 3.3.1.3 Trình tự đoạn gen trnH-psbA Kết xác định trình tự nucleotide cho thấy, đoạn gen trnH-psbA đƣợc nhân có kích thƣớc 431 bp, khơng có sai khác mẫu nghiên cứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu Keo Lai nhƣ sau: CCCTATACTATCTAAAAATTACAGAGATTTCCATTTGTATTCTTTCTTTTT TTTTTTCATTATTTTGAAGTTTTTACTCGTCTTCTAAGATACAATAGACTA GAATTAAAACATTCATTTCTCTTTTTTTTTTTTCATTTCAAAAGATAAAG AAAGATTGCTGAGAAAAACGTATAAAATAAATTAGTAAAAAAGAAACA AAAAGTATGAAACTCCAATATTTTTCTTAAAACAACGGTAAAGAATGTT GAAGTAAATACAAAATTGATGTATGAAACTACTAAAAAGTAAAGGTAA AAAGTAAAGGAGCAATATTAACCCTCTTGATAGAACAATAAATTAATTA TTGCTCCTTTACGTTCAAAAACTCGTATACATTAAGACCAAGATTTTATC CGTTTATAGCTGGAGCCTCAACCGCAGC Các trình tự sau đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen trnH-psbA loài Keo Lai cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Keo lai đƣợc trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ngân hàng gen NCBI STT 10 Mã số Tên loài Acacia auriculiformis Acacia spirorbis subsp Acacia resinosa isolate 612RES Acacia longiphyllodinea Acacia effusifolia isolate 030EFF Acacia effusifolia isolate 006EFF Acacia websteri Acacia lasiocalyx Acacia distans isolate JM1865 Acacia scleroclada 33 GU135330.2 KC284620.1 LN885306.1 LN885287.1 LN885263.1 LN885262.1 LN885327.1 LN885283.1 KC284227.1 LN885313.1 Tỷ ệ tương đồng 99% 99% 97% 93% 97% 97% 96% 94% 96% 92% Kết xây dựng phát sinh chủng loại đƣợc thể nhƣ hình sau: Hình 3.6 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI Từ phát sinh chủng loại dựa số liệu trình tự gen trnH-psbA ta thấy lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid có quan hệ gen gần với lồi Acacia auriculiformis, có quan hệ xa với lồi Acacia scleroclada Sau chúng tơi so sánh cấp độ loài theo đoạn gen trnH-psbA loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số LN885287.1, nhận đƣợc sai khác đoạn gen đƣợc thể nhƣ sau: 34 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 612 bits(290) 4e-171 402/431(93%) 26/431(6%) Plus/Plus Query CCCTATACTATCTAAAAATTACAGAGATTTCCATTTGTATTCTTTCtttttttttttCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 60 |||||||||||| Sbjct 131 CCCTATACTATCTAAAAATTACAGAGATTTCCATTTGTATTCTTTC TTTTTTTTTCAT 188 Query 61 TATTTTGAAGTTTTTACTCGTCTTCTAAGATACAATAGACTAGAATTAAAACATTCATTT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| Sbjct 189 TATTTTGAAGTTTTTACTCGTCTTCTAAGATACAATAGACTAAAATTAAAACATTCATTT 248 Query 121 CTCttttttttttttCATTTCaaaagataaagaaagattgctgagaaaaacgtataaaat 180 ||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 249 CTC TTTTTTTTTTCATTTCAAAAGATAAAGAAAGATTGCTGAGAAAAACGTATAAAAT 306 Query 181 aaattagtaaaaaagaaacaaaaagtatgaaaCTCCAATATTTT -TCTTAAAAC 233 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||| Sbjct 307 AAATTAGTAAAAAAGAA AAAAAGTATGAAACTCCAATATTTTTTTCTTATCTTAAAAC 364 Query 234 AACGGTAAAGAATGTTGAAGTAAATACAAAATTGATGTATGAAACTACTAAAAAGTAAAG 293 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 365 AACGGTAAAGAATGTTGAAGTAAATACAAAATTGATGTATGAAACTAC 412 Query 294 GTAAAAAGTAAAGGAGCAATATTAACCCTCTTGATAGAACAATAAATTAATTATTGCTCC 353 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 413 Query 354 -TAAAAAGTAAAGGAGCAATATTAACCCTCTTGATAGAACAATAAATTAATTATTGCTCC 471 TTTACGTTCAAAAACTCGTATACATTAAGACCAAGATTTTATCCGTTTATAGCTGGAGCC 413 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 472 Query 414 TTTACGTTCAAAAACTCGTATACATTAAGACCAAGATTTTATCCATTTATAGCTGGAGCC TCAACCGCAGC 531 424 |||||| |||| Sbjct 532 TCAACCACAGC 542 Hình 3.7 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea (các vị trí sai khác bơi đỏ) Từ hình 3.7 nhận thấy tỷ lệ tƣơng đồng 93% Có 29 điểm sai khác lồi đƣợc bơi đỏ nhƣ hình 3.7 3.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn trình tự 3.3.2.1 Các đoạn trình tự mat , rbcL, trnH-psbA Dựa vào kết so sánh trình tự đoạn gen matK, rbcL trnHpsbA Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với trình tự gen 35 lồi Acacia longhiphyllodinea cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số LN885287.1, ta lập đƣợc bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA nhƣ bảng 3.4 Bảng 3.7 Bảng so sánh khả phân biệt Các đoạn trình tự matK, rbcL, trnH-psbA Tên đoạn gen matK rbcL trnH-psbA 29 Kích thước trình tự 937 599 431 Tỷ ệ sai khác 0,1% 0% 6,7% Số điểm sai khác Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL trnHpsbA loài Keo Lai (Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ) với trình tự gen lồi Acacia longhiphyllodinea cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số LN885287.1 : trình tự đoạn gen matK có điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL khơng có điểm sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA có 29 điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự trnH-psbA cao (6,7%) khả phân biệt loài gen trnH-psbA tốt tỉ lệ sai khác trình tự rbcL thấp (0%) đồng nghĩa với khả phân biệt loài gen Tỉ lệ sai khác trình tự matK (0,1%) thấp tƣơng tự nhƣ gen rbcL nên khả phân biệt loài gen matK thấp Nhƣ vậy, đoạn trnH-psbA có khả phân biệt cao so với đoạn matK rbcL so sánh loài Acacia auriculiformis mangiu ,Acacia hybrid với loài Acacia longhiphyllodinea Kết hợp với phân loại hình thái cho thấy lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid có quan hệ gần với loài Keo tràm (Acacia auriculiformis) Nhƣ cho thấy kết phân tử thu đƣợc phân tích đoạn gen trnH-psbA phù hợp với kết hình thái Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA để xác định xác loài cần định danh 36 CHƯƠNG 4.1 ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ ết lu n Đã tách chiết đƣợc DNA tổng số 03/03 mẫu Keo Lai (Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid ) Đã nhân thành công gen matK, rbcL trnH-psbA kỹ thuật PCR từ DNA tổng số mẫu thu đƣợc Đã xác định đƣợc trình tự đoạn gen matK, rbcL trnH-psbA Keo Lai Đã xây dựng đƣợc phát sinh chủng loại dòng Keo Lai mã số BV10 với dòng Keo Lai khác ngân hàng gen quốc tế Đoạn trnH-psbA có khả phân biệt cao so với đoạn matK, rbcL so sánh loài Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid với lồi Acacia longhiphyllodinea Kết phân tích đoạn gen trnH-psbA phù hợp với kết hình thái cho thấy lồi Acacia auriculiformis mangium, Acacia hybrid có quan hệ gần với loài Keo tràm (Acacia auriculiformis) Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác loài cần định danh 4.2 iến n hị Đƣa trình tự gen matK, rbcL, trnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau  Tiếp tục thu thập mẫu Keo Lai vùng địa lý khác để đánh giá toàn diện tính đa dạng di truyền lồi  Nghiên cứu ứng dụng mã vạch DNA để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam Sử dụng gen matK, rbcL trnH-psbA vào việc giám định loài Keo Lai Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể Nhân mã vạch DNA khác đối tƣợng Keo Lai 37 TÀI LIỆU TH M HẢO TIẾNG VIỆT Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nông nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 – 124 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191 -198 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thu t gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thu t di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lƣợng (2002), Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh TIẾNG ANH Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 CBOL, Plant Working Group (2009), DNA barcode for land plants PNAS, pp 106 Chen S.Y.H Han J Liu C Song J Et Al (2010), “Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PloS ONE 5: e8613 10 Gao T.Y.H Song j Liu C Zhu Y Et Al (2010), “Identification of ITS2”, Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 116 - 121 11 Hebert P.D.N , C.A Ball S L , Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp 313 - 321 12 Kress, J.W.Wurdack, K.J ,Zimmer, E A ,Weigt, L A & Janzen, D.H (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Molecular Econogy, Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 8369 - 8374 13 Mark Y S H.P.D.N (2008), “Barcode of life”, Scientific American, pp 82 - 88 14 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 15 Storchova H., M S Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 16 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 17 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, (Hydrocotyle Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 18 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 19 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 20 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of singlecopy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 14071420 21 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 22 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 WEBSITE 23 https://123doc.org/document/2669112-nghien-cuu-lap-bieu-the-tich-caydung-cho-rung-trong-keo-lai-acacia-hybrids-tai-huyen-thuan-chau-tinhson-la.htm 24 https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_Keo 25 https://123doc.org/document/4351815-ky-thuat-trong-keo-lai.htm 26 https://nongthonmoihatinh.vn/index.php/vi/news/Nhieu-nguoi-cung-quantam/Tham-canh-tot-rung-cay-keo-lai-nha-nong-thu-nhap-cao-gap-doi82738/ 27 https://123doc.org//document/2725612-phan-tich-trinh-tu-its-va-matkcay-ho-gung-zingiberaceae.htm