Xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch DNA cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc khóa luận này, với lịng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp- Trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình tơi q trình thực khóa luận trƣờng, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Hà V n Huân TS i Th M i Hƣơng trực tiếp hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ tơi thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Đặ iệt, kh luận nhận đƣợc hỗ trợ từ Đề tài cấp Nhà nƣớc "Xây dựng sở liệu mã vạch DNA (DNA barcode) cho số loài lâm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngồi gỗ có giá tr kinh tế" PGS TS Hà V n Huân làm Chủ nhiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn hân thành đến thầy , gi đình, ạn bè - ngƣời động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Do q trình thực cịn có nhiều hạn chế mặt thời gian, kiến thức kinh nghiệm khơng tránh khỏi thiếu sót đ nh Tôi mong nhận đƣợc ý kiến đ ng g p thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp củ t i đƣợc hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2019 Sinh viên thực Nguyễn Thị Kiều Oanh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng qu n đối tƣợng nghiên ứu 1.1.1 Nguồn gố phân ố ủ h vàng 1.1.2 Đặ điểm sinh học 1.1.3 Giá tr sử dụng Tổng qu n N r od Giới thiệu N 1.2.2 C N mã vạ h r od đặ điểm ản ủ trình tự N r od Một số lo us đƣợ sử dụng phƣơng ph p N Ứng dụng ủ N r od thự vật r od thự vật 11 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2 Phƣơng ph p nghiên ứu 13 2 Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu 13 2.2.2 Dụng cụ, hóa chất sử dụng 13 2.2.3 Cách tiến hành 15 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 20 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 20 3 Phân t h kết 21 331 X đ nh phân tích trình tự DNA vùng gen nghiên cứu 21 3.3.2 So sánh khả n ng phân iệt củ đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA 32 ii CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH 34 Kết luận 34 4.2 Kiến ngh 34 TÀI LIỆU TH M KHẢO iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết Nghĩa tiếng Anh tắt Nghĩa tiếng Việt ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data Base pair Cặp bp CBOL Consortium for the Barcode of Consortium for the Barcode Life of Life Convention CITES on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora cpDNA CTAB s tế n quố loài nguy ấp ộ g n lụ lạp Chloroplast DNA Cetyl C ng ƣớ u n trimethylammonium Cetyl trimethylammonium bromide bromide Cytochrome b Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide Deoxyribonucleotid triphosphate triphosphate EBA Extraction Buffer A Đệm t h EBB Extraction Buffer B Đệm t h Cytb DNA (DNA) dNTP EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic Foward-Primer Mồi xu i IGS Intergenic Spacer vùng liên gen ITS Internal Transcribed Spacer kb Kilobase (1000 base) F-Primer v ng N gen 1000 ặp iv nằm giữ s mtDNA NAD(P)H NCBI N ty thể Mitochondrial DNA Nicotinamide adenine Nicotinamide dinucleotide phosphate National adenine dinucleotide phosphate Center for Biotechnology Information Trung tâm Quố gi Th ng tin C ng nghệ sinh họ ORF Open Reading Frame Khung đọ mở PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng huỗi polym r s PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone RFLP Restriction fragment length Phân t h đ hình trình tự polymorphism DNA RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate Reverse primer Mồi ngƣợ R-Primer TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA RN vận huyển UV Ti Untraviolet v ự tm DANH MỤC CÁC BẢNG Hình 1.1: Cây Bách Vàng Bảng 2.1 Thành phần đệm tách A (100ml) 14 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách B (100ml) 14 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) ngân hàng gen NCBI 22 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) ngân hàng gen NCBI 26 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) ngân hàng gen NCBI 30 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 DNA tổng mẫu Bách vàng 20 Hình Kết nhân g n matK, rbcL trnH-psbH 21 Hình 3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI 23 Hình Sự sai khác trình tự đoạn gen matK loài Cupressus vietnamensis Callitropsis nootkatensis (các v tr s i kh đƣợ i đỏ) 25 Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo NCBI 27 Hình Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) nghiên cứu với loài Callitropsis nootkatensis NCBI 28 Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 30 Hình Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) nghiên cứu với loài Callitropsis nootkatensis NCBI 32 vii ĐẶT VẤN ĐỀ h vàng Việt N m, Hoàng đàn vàng Việt N m, trắ Bách vàng hay Quản hoặ ây ché tên gọi đ phƣơng h d nh ph p kho họ : Callitropsis vietnamensis loài ây thân gỗ đƣợ ph t thời gi n gần họ Hoàng đàn (Cupressaceae , nguồn gố khu vự huyện Quản ạ, tỉnh Hà Giang thuộ miền ắ Việt N m Loài gỗ tốt, thơm, kh ng mối mọt Ngƣời dân đ phƣơng d ng gỗ Hoàng đàn vàng làm qu n tài Họ ho m i hƣơng ủ thứ gỗ giữ đƣợ x kh ng hỏng Vì vậy, ây lớn sống thể o độ thấp hầu nhƣ đốn hạ hồn tồn, hỉ ịn lại ây nhỏ, ong qu o, ây lớn đƣờng k nh khoảng 40 cm Trên trƣờng thự tế, hoàng đàn vàng r n n kết hạt nhƣng kh ng tìm thấy ây on t i sinh Nhƣ ho d kho nh v ng ảo vệ tốt, loài đứng trƣớ nguy tuyệt hủng Th o tiêu huẩn ủ IUCN trạng ủ lồi đƣợ xếp ấp CR Criti lly End ng r d – Cự kỳ nguy ấp Trong ng t kiểm nhiệm n y, phƣơng ph p hủ yếu đƣợ sử dụng dự hình th i họ qu n s t ằng mắt hoặ qu tiêu ản hiển vi Tuy nhiên, phƣơng ph p gặp trở ngại s u nguyên liệu thự vật qu xử lý hoặ hình th i gần giống nh u, gây kh kh n việ phân loại nghiên ứu nhân giống Hiện n y, việ ứng dụng g n mã vạ h, x đ nh barcode phƣơng ph p đ nh d nh, sử dụng đoạn nằm ộ g nom đoạn N N huẩn ngắn ủ sinh vật đ ng nghiên ứu để phụ vụ gi m đ nh loài, m ng lại hiệu o thời gi n ngắn, g p phần kh ng nhỏ vào đ nh d nh ảo tồn loại thự vật giới Phƣơng ph p x DNA barcode ũng đƣợ p dụng phổ iến loài thự đ nh gi tr kinh tế Từ lý trên, t i thự đề tài “Nghiên ứu x đ nh đoạn o đoạn DNA barcode cho loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis phụ vụ gi m đ nh loài” n ứ để phân loại, lự họn xây dựng liệu g n, quý g p phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, ảo tồn nguồn g n ủ quố gi CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Bách vàng Bách vàng đƣợ tìm thấy vào th ng 10 n m 1999, đ đƣợ m tả nhƣ hi d nh ph p kho họ Xanthocyparis vietnamensis, qu n hệ họ hàng gần với bách Nootka (Callitropsis nootkatensis), loài s uđ ũng đƣợ huyển s ng hi F rjon & Hiệp N T ngƣời kh , n m 2002 S u đ , Littl ngƣời kh n m 2004 chi ban đầu Callitropsis đƣợ lấy th o d nh ph p kho họ Nootk , họ lại huyển ây hỉ r tên ủ loài h h vàng hi Hiện hỉ ịn khoảng 100 cịn sống.[21] Cupressus vietnamensis Tình trạng bảo tồn Nguy ấp (IUCN 3.1)[1] Phân loại khoa học Giới (regnum) Ngành (divisio) Lớp (class) Bộ (ordo) Họ (familia) Chi (genus) Plantae Pinophyta Pinopsida Pinales Cupressaceae Cupressus Loài (species) C vietnamensis Danh pháp hai phần Cupressus vietnamensis (A.FARJON & T.H.NGUYÊN) SILBA, 2005.[21] ự vào kết húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đƣợ thể hình Cupressus vietnamensis(KX832629.1) Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn matK tạo NCBI  Nhận t Từ ây phân loại dự số liệu trình tự g n matK, t thấy: Lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) có quan hệ gần gũi với lồi Callitropsis nootkatensis có quan hệ xa với loài Cupressus torulosa S uđ húng t i so s nh cấp độ loài th o đoạn gen matK loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) với trình tự gen lồi Callitropsis nootkatensis cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KP099642.1, nhận đƣợc sai khác giữ đoạn g n đƣợc thể nhƣ s u: Score Expect Identities Gaps Strand 1459 bits(790) 0.0 796/799(99%) 0/799(0%) Plus/Plus Query CTTCTTTGCATTTATTACGATCGATTCTCCATGAATGTAGTTTTAGTCGAGAAAATTTGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 114642 CTTCTTTGCATTTATTACGATCGATTCTCCATGAATGTAGTTTTAGTCGAGAAAATTTGC 114701 Query 61 AGAAATCTCTGATTACACAGAGAGAAAATACGTTCTCCCTGTTCCTTTGGAATTCTTATG 120 23 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 114702 AGAAATCTCTGATTACACAGAGAGAAAATACGTTCTCCCTGTTCCTTTGGAATTCTTATG 114761 Query 121 TGTATGAATGCGAATCGTTTTTAATTCCTCTTATTAAACGATTTTTTAATTCACAATCAT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 114762 TGTATGAATGCGAATCGTTTTTAATTCCTCTTATTAAACGATTTTTTAATTCACAATCAT 114821 Query 181 TGTTATATGAATCTTTTCCGGATCGAACTCATTTTGAGAAAAAGATAAAAGATATTGTTA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 114822 TGTTATATGAATCTTTTCCGGATCGAACTCATTTTGAGAAAAAGATCAAAGATATTGTTA 114881 Query 241 TATTTCCTCCTCAAAAAATTTCAACAAAAAAGATCTGGTTGTTGAAGGATTCTTTCATCC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 114882 TATTTCCTCCTCAAAAAATTTCAACAAAAAAGATCTGGTTGTTGAAGGATTCTTTCATCC 114941 Query 301 ATTATGTGAGATATGGAGAAAGATCCCTTATAGCTCTAAAGGGTACGCATCTTCAAGTGA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 114942 ATTATGTGAGATATGGAGAAAGATCCCTTATAGCTCTAAAGGGTACGCATCTTCAAGTGA 115001 Query 361 AAAAATGTAGATATCATCTGTTTCATTTTTGGCAATACTATTTTCATCTTTGGTTTCAAC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 115002 AAAAATGTAGATATCATCTGTTTCATTTTTGGCAATACTATTTTCATCTTTGGTTTCAAC 115061 Query 421 CGTATAGGATATGCAGTCTTGAATTATCCAAGAtttctttttcttttttaggtttttttA 480 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 115062 CGTATAGGATATGGAGTCTTGAATTATCCAAGATTTCTTTTTCTTTTTTAGGTTTTTTTA 115121 Query 481 TGCATGTTAAAATGAGACCTCTCGTGGTTAGAGCCAAAATGCTAGATGATTTATTCATTA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 115122 TGCATGTTAAAATGAGACCTCTCGTGGTTAGAGCCAAAATGCTAGATGATTTATTCATTA 115181 Query 541 CCGATCTTATTACCAATGAATTAAACTCAACAGTTCCGATTAAATCAATTCTTTTTTCTT 600 ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| 24 Sbjct 115182 CCGATCTTATTACCAATGAATTAAACTCAACAGCTCCGATTAAATCAATTCTTTTTTCTT 115241 Query 601 TAGCTAAAGAAAAGTTTTGTGACATCTCAGGGTGGCCAATTAGTAAATTGTCTTGGACCA 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 115242 TAGCTAAAGAAAAGTTTTGTGACATCTCAGGGTGGCCAATTAGTAAATTGTCTTGGACCA 115301 Query 661 GTCTATCAGATGATGATATTCTCGATCGATTCGATCGAATTTGGATAAATCTTTTTCATT 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 115302 GTCTATCAGATGATGATATTCTCGATCGATTCGATCGAATTTGGATAAATCTTTTTCATT 115361 Query 721 ACTACAGTGGATCCATCAATCAAGATGGTTTATATCATATAAAGTATATACTTTTAATTT 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 115362 ACTACAGTGGATCCATCAATCAAGATGGTTTATATCATATAAAGTATATACTTTTAATTT Query 781 CATGTGCTAAAACTTTGGC 115421 799 ||||||||||||||||||| Sbjct 115422 CATGTGCTAAAACTTTGGC 115440 Hình 3.4 Sự sai khác trình tự đoạn gen matK loài Cupressus vietnamensis Callitropsis nootkatensis (các vị tr sai khác đƣợc bôi đỏ) Từ kết thu đƣợ , nhận thấy tỷ lệ tƣơng đồng giữ trình tự g n matK loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) nghiên ứu với trình tự đoạn g n m tK lồi Callitropsis nootkatensis NC I 99,62% Th y điểm s i kh : ằng C v tr số 227 Thay C ằng G v tr số 434 Thay T ằng C v tr số 574 3312 n đoạn g n rbcL Trình tự g n rbcL đƣợ phân t h s i kh k h thƣớ 599 p, đ kh ng giữ mẫu nghiên ứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn g n rbcL ủ mẫu 25 h vàng nhƣ s u: ATGTCACCAAAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTCGGATTCAAA GCGGGTGTTAAAGATTACAGATTAACTTATTATACTCCGGAATATCA GACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTCACTCCTCAAC CTGGAGTGCCCCCCGAAGAAGCGGGAGCAGCGGTAGCTGCCGAATC TTCCACTGGTACGTGGACCACTGTTTGGACCGATGGCCTTACCAGTCT TGATCGCTACAAGGGGCGATGCTATGATATTGAACCCGTTCCTGGAG AAGAAACTCAATTTATTGCCTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTG AAGAAGGCTCTGTGACTAACCTGTTTACTTCTATTGTAGGTAATGTAT TTGGATTCAAAGCTTTACGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATTC CTCCTGCTTATTCAAAAACTTTTCAAGGCCCACCACATGGTATTCAAG TAGAAAGAGATAAATTAAACAAATATGGTCGTCCTTTATTGGGATGT ACTATCAAACCAAAATTGGGTCTATCTGCCAAGAATTATGGTAGAGC GGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC Các trình tự s u đ đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng th o đoạn gen rbcL loài Hoàng đàn ằng cách sử dụng công cụ BLAST Một số lồi có trình tự g n tƣơng đồng dùng so sánh với lồi h vàng đƣợc trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) ngân hàng gen NCBI STT Tỷ lệ tƣơng Tên loài Mã số đồng Callitropsis nootkatensis 100.00% KP099642.1 Cupressus torulosa 99.83% NC_039563.1 Cupressus tonkinensis 99.83% NC_039562.1 Cupressus jiangeensis 99.83% MG596347.1 Cupressus chengiana 99.83% KY392754.1 Cupressus gigantea 99.83% KT315754.1 Cupressus sempervirens 99.83% FN689378.1 Cupressus duclouxiana 99.83% AY988242.1 26 ự vào kết húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đƣợ thể hình Cupressus vietnamensis (KX832629.1) Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo NCBI  Nhận t Từ ây phân loại dự số liệu trình tự g n rbcL, t thấy: Loài vàng (Cupressus vietnamensis) h qu n hệ gần gũi với loài Callitropsis nootkatensis S uđ húng t i so s nh cấp độ loài th o đoạn gen rbcL loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) với trình tự gen lồi Callitropsis nootkatensis cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KP099642.1, so sánh giữ đoạn g n đƣợc thể nhƣ s u: Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 1107 bits(599) 0.0 599/599(100%) 0/599(0%) Plus/Plus Query ATGTCACCAAAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTCGGATTCAAAGCGGGTGTTAAAGATTAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct ATGTCACCAAAAACAGAGACTAAAGCAAGTGTCGGATTCAAAGCGGGTGTTAAAGATTAC 27 60 Query 61 AGATTAACTTATTATACTCCGGAATATCAGACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 AGATTAACTTATTATACTCCGGAATATCAGACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTC 120 Query 121 CGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTGCCCCCCGAAGAAGCGGGAGCAGCGGTAGCTGCCGAA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 CGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTGCCCCCCGAAGAAGCGGGAGCAGCGGTAGCTGCCGAA 180 Query 181 TCTTCCACTGGTACGTGGACCACTGTTTGGACCGATGGCCTTACCAGTCTTGATCGCTAC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 TCTTCCACTGGTACGTGGACCACTGTTTGGACCGATGGCCTTACCAGTCTTGATCGCTAC 240 Query 241 AAGGGGCGATGCTATGATATTGAACCCGTTCCTGGAGAAGAAACTCAATTTATTGCCTAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 AAGGGGCGATGCTATGATATTGAACCCGTTCCTGGAGAAGAAACTCAATTTATTGCCTAT 300 Query 301 GTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGCTCTGTGACTAACCTGTTTACTTCTATT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 GTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGCTCTGTGACTAACCTGTTTACTTCTATT 360 Query 361 GTAGGTAATGTATTTGGATTCAAAGCTTTACGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 GTAGGTAATGTATTTGGATTCAAAGCTTTACGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATT 420 Query 421 CCTCCTGCTTATTCAAAAACTTTTCAAGGCCCACCACATGGTATTCAAGTAGAAAGAGAT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 CCTCCTGCTTATTCAAAAACTTTTCAAGGCCCACCACATGGTATTCAAGTAGAAAGAGAT 480 Query 481 AAATTAAACAAATATGGTCGTCCTTTATTGGGATGTACTATCAAACCAAAATTGGGTCTA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 AAATTAAACAAATATGGTCGTCCTTTATTGGGATGTACTATCAAACCAAAATTGGGTCTA Query 541 TCTGCCAAGAATTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC 540 599 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 541 TCTGCCAAGAATTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGATTTTAC Sự sai k ác tr 599 tự đoạ ge rbcL loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) g iê cứu với loài Callitropsis nootkatensis NCBI Từ kết thu đƣợ , nhận thấy tỷ lệ tƣơng đồng giữ trình tự g n rbcL lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) nghiên ứu với trình tự đoạn g n rbcL loài Callitropsis nootkatensis NC I 100% kh ng có điểm s i kh 28 3313 n đoạn g n trnH-psbA Trình tự g n trnH-psbA đƣợ phân t h kh ng s i kh k h thƣớ 582 p, đ giữ mẫu nghiên ứu, kết tƣơng đồng 100% Kết giải trình tự đoạn g n trnH-psb ủ mẫu h vàng nhƣ s u: CGCGCGTGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGGAACCACTTGG CTACGTCCGCCCCAAACTAATTGGCAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCA TTTCAAGAATGAATGGTTCTAAGCCCCGAAAACCAACTAATAATGAA ACTATTATTATTATTGAGTTTAGTTATTAATTTGTTGCACTTGCAATG CAACTCTCACACAAGTTAGTGACATTGACATTTTTTTTTTTATATAAA TAGTTTTGTTTTGGGTATTCAAAAAAAGATCTGAGCCAATACTCGAT ACTAATTAATAATTAGTATTATGTATCCATGGCTGAATGGTAAAAGC ACCCAACTCATAATTGGGAAGTCGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATGC ACAGTAAATAGTTATTGTGCTCTGTTCGCAATAACTAGAACTTTTAAG AAAAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAAATTGGTACTGCTTTCTTTT TAGGATTGAAATACACTAACAATCCATCTTGAATAATTAGCCGTTTA TAGAATTAGCTTCAACAGCAGCTAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCA TTACGTTCGTGCATAAC Các trình tự s u đ đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NC I để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng th o đoạn gen trnH-psbA loài Hoàng đàn ằng cách sử dụng công cụ BLAST Một số lồi có trình tự g n tƣơng đồng dùng so sánh với loài bảng 3.3 29 h vàng đƣợc trình bày Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Tỷ lệ tƣơng đồng Mã số Callitropsis nootkatensis 99.48% KP099642.1 Cupressus sempervirens 98.79% FN689387.1 Cupressus jiangeensis 96.44% MG596347.1 Cupressus chengiana 96.44% KY392754.1 Cupressus gigantea 96.10% KT315754.1 Cupressus tonkinensis 94.84% NC_039562.1 Cupressus torulosa 92.23% NC_039563.1 Cupressus duclouxiana 95.00% JN044318.2 ự vào kết húng t i xây dựng ây ph t sinh hủng loại đƣợ thể hình Cupressus vietnamensis (KP099645.1) Hình Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA tạo NCBI 30  Nhận t Từ ây phân loại dự số liệu trình tự g n trnH-psb , t thấy: Loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) có quan hệ gần gũi với lồi Callitropsis nootkatensis S uđ húng t i so s nh cấp độ loài th o đoạn gen trnH-psbA loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) với trình tự gen lồi Callitropsis nootkatensis công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI với mã số KP099642.1, nhận đƣợc sai khác giữ đoạn g n đƣợc thể nhƣ s u: Score Expect Identities Gaps Strand 1057 bits(572) 0.0 579/582(99%) 2/582(0%) Plus/Minus Query CGCGCGTGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGGAACCACTTGGCTACGTCCGCCCCAAAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117826 CGCGCGTGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGGAACCACTTGGCTACGTCCGCCCCAAAC 117767 Query 61 TAATTGGCAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCATTTCAAGAATGAATGGTTCTAAGCCCCGA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117766 TAATTGGCAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCATTTCAAGAATGAATGGTTCTAAGCCCCGA 117707 Query 121 AAACCAACTAATAATGAAACTATTATTATTA-TTGAGTTTAGTTATTAATTTGTTGCACT 179 ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117706 AAACCAACTAATAATGAAACTATTATTATTAGTTGAGTTTAGTTATTAATTTGTTGCACT 117647 Query 180 TGCAATGCAACTCTCACACAAGTTAGTGACATTGACAtttttttttttATATAAATAGTT 239 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 117646 TGCAATGCAACTCTCACACAAGTTAGTGACATTGACATTTTTTTTTTT-TATAAATAGTT 117588 Query 240 TTGTTTTGGGTATTCaaaaaaaGATCTGAGCCAATACTCGATACTAATTAATAATTAGTA 299 ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117587 TTGTTTTGGGTATTCAAAAAAAGATCTGAACCAATACTCGATACTAATTAATAATTAGTA 117528 Query 300 TTATGTATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAGTCGCGGGTTC 359 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117527 TTATGTATCCATGGCTGAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAGTCGCGGGTTC 117468 Query 360 AATTCCTGCTGGATGCACAGTAAATAGTTATTGTGCTCTGTTCGCAATAACTAGAACTTT 419 31 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117467 AATTCCTGCTGGATGCACAGTAAATAGTTATTGTGCTCTGTTCGCAATAACTAGAACTTT 117408 Query 420 TAAGAAAAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAAATTGGTACTGCTTTCTTTTTAGGATTGA 479 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117407 TAAGAAAAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAAATTGGTACTGCTTTCTTTTTAGGATTGA 117348 Query 480 AATACACTAACAATCCATCTTGAATAATTAGCCGTTTATAGAATTAGCTTCAACAGCAGC 539 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117347 AATACACTAACAATCCATCTTGAATAATTAGCCGTTTATAGAATTAGCTTCAACAGCAGC Query 540 TAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCATTACGTTCGTGCATAAC 117288 581 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 117287 TAGATCCAGAGGGAAGTTGTGAGCATTACGTTCGTGCATAAC 117246 Hình 3.8 Sự sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) nghiên cứu với loài Callitropsis nootkatensis NCBI Từ kết thu đƣợ , nhận thấy tỷ lệ tƣơng đồng giữ trình tự g n trnH-psbA lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) nghiên ứu với trình tự đoạn g n trnH-psbA loài Callitropsis nootkatensis NC I 99,48% điểm s i kh : Từ - ằng G v tr số 152 Từ ằng - v tr số 227 Th y G ằng S v tr số 270 ánh kh phân biệt đ ạn t nh t ự vào kết so s nh trình tự at bc t n -psbA đoạn g n matK, rbcL trnH-psbA ủ Bách vàng (Cupressus vietnamensis) với trình tự g n ủ lồi Callitropsis nootkatensis, t lập đƣợ ảng so s nh khả n ng phân iệt ủ đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psb nhƣ ảng Bảng 3.4 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA  Tên đoạn g n Số điểm s i kh K h thƣớ trình tự Tỷ lệ s i kh Nhận xét: matK rbcL trnH-psbA 3 799 599 582 0.37% 0% 0.51% 32 Kết phân tích cho thấy so sánh trình tự matK, rbcL trnH-psbA lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) với lồi Callitropsis nootkatensis: trình tự đoạn gen matK có điểm sai khác, trình tự đoạn gen rbcL khơng có điểm sai khác trình tự đoạn gen trnH-psbA có điểm sai khác Tỉ lệ sai khác trình tự trnH-psbA cao (0.51% đ khả n ng phân iệt loài gen trnH-psbA ũng tốt tỉ lệ sai khác trình tự rbcL thấp (0% đồng nghĩ với khả n ng phân iệt loài gen Tỉ lệ sai khác trình tự matK (0.37%) thấp trnH-psbA (0.51% kh ng đ ng kể (0,14% o rbcL nên đoạn gen matK cho kết tƣơng qu n độ xác không nhỏ Kết tƣơng qu n loài mà gen matK th hoàn toàn phù hợp với phân loại lồi trƣớ đ dựa vào hình thái Mặc dù vậy, cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự matK, rbcL trnH-psbA để x đ nh xác lồi cần đ nh danh Kết phân tích th cho thấy loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) gần gũi với loài Callitropsis nootkatensis Kết hồn tồn phù hợp với phân loại hình th i trƣớ đ ngƣời kh , n m 2002) 33 Farjon & Hiệp N.T CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH Kết luận Đã t h hiết đƣợc DNA tổng số mẫu Bách vàng Đã nhân ản thành công đoạn gen matK, rbcL trnH-psbA kỹ thuật PCR từ DNA tổng số mẫu thu đƣợc Đã x đ nh đƣợc trình tự nu l otid đoạn gen matK, rbcL trnH- psbA Bách vàng Đã xây dựng đƣợ loài Bách vàng kh ây ph t sinh hủng loại ủ loài Bách vàng với ngân hàng g n quố tế Đoạn trnH-psbA có khả n ng phân iệt o so với đoạn matK, rbcL so sánh loài loài Bách vàng (Cupressus vietnamensis) loài Callitropsis nootkatensis Kết phân t h đoạn g n matK, rbcL trnHpsbA phù hợp với kết hình thái cho thấy lồi lồi Bách vàng (Cupressus vietnamensis) gần gũi với loài Callitropsis nootkatensis 4.2 Kiến nghị • C ng ố trình tự gen matK, rbcL trnH-psbA lên Ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau • Tiếp tụ x đ nh đoạn N r od kh đối tƣợng Bách vàng • Tiếp tục thu thập mẫu Bách vàng v ng đ lý kh nh u để đ nh giá toàn diện t nh đ dạng di truyền lồi • Nghiên ứu ứng dụng mã vạ h N để xây dựng sở liệu DNA barcode cho lồi thực vật Việt Nam • Sử dụng gen matK, rbcL trnH-psbAvào việ gi m đ nh loài Bách vàng Việt N m, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi kh dấu hiệu x để tìm đ nh lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 34 TÀI LIỆU TH M KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi 2004 , Kỹ uậ d uyền ứng d ng, NX Đại họ Quố Gi Hà Nội PGS TS Khuất Hữu Th nh 2006 , Kỹ uậ g n nguyên ý ứng d ng, NX Kho họ kỹ thuật Hà Nội Hồ Huỳnh Th y ƣơng 2005 , S n ọ p n ử, NX Gi o ụ – Hà Nội, trang 191-198 Nguyễn Đứ Lƣợng 2002 , Công ng ệ g n NX Đại họ Quố Gi TP Hồ Chí Minh Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Th ng 2008 , “Cơ d uyền ọ p n ế bào”, NX Đại họ Quố Gi Hà Nội Võ V n Chi 2004 , Từ điển thực vật thông dụng, tập NXB Khoa học kỹ thuật TÀI LIỆU TIẾNG ANH Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W 2003 , “Non oding pl stid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylog ny of s l ngiosp rms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 Kress W J., Erickson D L 2008 , “ N r od s: G n s, g nomi s, nd ioinform ti s”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 Hollings worth Pm, G S Littl p 2011 , “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PloS ONE, 65 10 Miwa H, O.I Matsui a, Hascgawa M, Akiyama H, Et, Al 2009 ,”Adaptive evolution of rbcL in Conocephalum (Hepaticae, bryophytes)”, G n , 441, pp 169 – 175 11 Ol S nd Gitt P 2009 , “How m ny lo i s it t k to ro us?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 N r od 12 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E , Sm ll R L 2007 ,” Comp rison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylog n ti studi s in ngiosp rms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 13 Stor hov H , M S Olson 2007 , “Th psbA-trnH non oding r gion in r hit ture of the chloroplast ngiosp rms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 14 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christi n , nd Esk W 2007 ,” Pow r nd limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA r oding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 15 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M , Culh m , Ch s M W 2000 , “ phylog n ti n lysis of L liin (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers ITS of ri osom l N ”, Lindleyana (15), pp.96114 16 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., uist rm t C H , Smuld rs 2009 , “ N r oding dis rimin t s the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-inv siv r l tiv s”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091 17 Vij y n K nd Tsou C H 2010 , “ N r oding in pl nts: t xonomy in n w p rsp tiv ”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 18 W ng W , Wu Y , Y n Y , Erm kov M , K rst tt r R r oding of th L mn , 2010 “ N f mily of qu ti mono ots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 19 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010 “ uth nti tion of T xillus hin nsis using N r oding t hniqu ”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 20 Y o H , Song J , Liu C , Luo K , H n J 2010 , “Us of ITS2 r gion s th univ rs l N r od for pl nts pp.13102 WEBSITE 21 https://vi.wikipedia.org/wiki/Bach_vang nd nim ls”, PLoS ONE (5), ... lại có vảy mọc từ gốc cành từ đỉnh ành nhƣ loài hoàng đàn l vảy dẹt [21] 1.1.3 Giá trị sử dụng Bách vàng cho gỗ thẳng, có vân gỗ đẹp, ch u mối mọt Gỗ thƣờng sử dụng làm đồ thủ công mỹ nghệ đồ gỗ. .. di truyền loài • Nghiên ứu ứng dụng mã vạ h N để xây dựng sở liệu DNA barcode cho loài thực vật Việt Nam • Sử dụng gen matK, rbcL trnH-psbAvào việ gi m đ nh loài Bách vàng Việt N m, đồng thời... gen quốc tế NC I để tìm khác biệt cấp độ loài lồi có trình tự tƣơng đồng th o đoạn gen matK lồi Bách vàng cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự g n tƣơng đồng dùng so sánh với loài h