Xác định chỉ thị dna barcode và nhân giống in vitro loài lan phi điệp năm cánh trắng mắt nai (dendrobium anosmum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP ===***=== KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SINH VIÊN NĂM HỌC 2020 - 2021 Tên khóa luận: XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ DNA-BARCODE VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI LAN PHI ĐIỆP NĂM CÁNH TRẮNG MẮT NAI (Dendrobium anosmum) Giảng viên hướng dẫn: 1- TS.Bùi Thị Mai Hương 2- TS.Nguyễn Thị Hồng Gấm Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hà Phượng Loan Mã SV: 1753070726 Hà Nội, năm 2021 LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian học tập làm việc Viện Công nghệ sinh học Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam mang đến cho hào hứng hành trang giúp chuẩn bị tốt cho công việc tương lai Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi tham gia thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Viện Trong trình nghiên cứu tìm hiểu tơi định lựa chọn đề tài: “Xác định thị DNA - barcode nhân giống in vitro cho dòng lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai” làm khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Hồng Gấm TS Bùi Thị Mai Hương tạo điều kiện hết mức, sát trực tiếp hướng dẫn suốt để thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Công nghệ tế bào thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện q trình tơi thực đề tài Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2021 Sinh viên thực Nguyễn Thị Hà Phượng Loan MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH .8 ĐẶT VẤN ĐỀ .9 PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 11 1.1 Tổng quan chi Lan Hoàng thảo (Dendrobium) 11 1.2 Giới thiệu loài lan Phi điệp (Dendrobium anosmum Lindl.(1845)) 12 1.2.1 Mô tả 12 1.2.2 Phân bố 12 1.2.3 Các điều kiện để nuôi trồng Lan Phi Điệp 12 1.3 Tổng quan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 13 1.4 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium .14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 1.5 Tổng quan DNA barcode 17 1.5.1 Giới thiệu DNA-barcode 17 1.5.2 Một số locus sử dụng làm thị DNA-barcode thực vật 19 1.5.3 Những nghiên cứu ứng dụng DNA-barcode giám định loài .24 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 27 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 27 2.2 Đối tượng, phạm vi nội dung nghiên cứu 27 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2.2 Phạm vi nghiên cứu 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu xác định thị DNA - barcode (Phương pháp tách chiết DNA tổng số) 28 2.4.2 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống mẫu lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai kỹ thuật nuôi cấy mô 32 2.5 Phương pháp thu thập xử lí số liệu 36 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Kết xác định số đoạn DNA- barcode 38 3.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 38 3.1.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 38 3.1.3 Phân tích kết 39 3.1.3.1 Xác định phân tích trình tự DNA vùng gen nghiên cứu 39 3.1.3.2 So sánh khả phân biệt đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 49 3.2 Kết nhân giống mẫu lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai kỹ thuật nuôi cấy mô 49 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu mẫu lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai (5CT1) 49 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân thể chồi loài lan Phi Điệp cánh trắng mắt nai (5CT1) 53 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi loài lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai 55 3.2.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng chất hòa sinh trưởng đến khả rễ tạo hoàn chỉnh lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai 58 3.2.5 Kết đưa trồng vườn ươm 61 SƠ ĐỒ HĨA QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG PHI ĐIỆP CÁNH TRẮNG MẮT NAI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ .63 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1 Kết luận 64 4.1.1 Đối với xây dựng sở liệu DNA mã vạch Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 64 4.1.2 Đối với nhân giống lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosmun) kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 64 4.2 Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ BIỂU 71 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu ADN Tên gọi Acid Deoxyribo nucleic Ghi BAP bp Benzyl amino purine-6 Base pair (cặp bazơ nitơ) Hóa chất Cs CTAB Cộng Cetyl trimethyl ammonium bromide CTTN ddNTP Cơng thức thí nghiệm Dideoxynucleotide triphosphate ĐC Đối chứng ĐHST EBA Điều hòa sinh trưởng Đệm tách A Hóa chất EBB Đệm tách B Hóa chất EDTA Axit ethylene diamine tetra acetic Hóa chất IAA Indol acetic Acid Hóa chất IBA Indole-3- butyric acid Hóa chất MS Murashige &Skoog, 1962 NAA Naphthyl acetic acid Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ sinh học Hoa Kỳ NCBI Sig Mức ý nghĩa (Significant) TB Trung bình 5CT1 Năm cánh trắng Mắt nai Hóa chất Hóa chất DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu loài 5CT1 .33 Bảng 2.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân thể chồi loài 5CT1 33 Bảng 2.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh thể chồi loài 5CT1 34 Bảng 2.4 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả rễ tạo hoàn chỉnh loài 5CT1 35 Bảng 3.1 So sánh hệ số tương đồng di truyền loài đoạn gen trnHpsbA loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun) .40 Bảng 3.2 So sánh hệ số tương đồng di truyền loài đoạn gen rbcL loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun) 43 Bảng 3.3 So sánh hệ số tương đồng di truyền loài đoạn gen ycf loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun) .46 Bảng 3.4 Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự ycf, trnH-psbA rbcL .49 Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả tạo mẫu loài 5CT1 .50 Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân thể chồi loài lan 5CT1 53 Bảng 3.7 Kết ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi loài lan 5CT1 .56 Bảng 3.8 Kết ảnh hưởng chất ĐHST đến khả rễ tạo hoàn chỉnh loài lan 5CT1 .59 Bảng 3.9 Kết đưa trồng vườn ươm 61 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hoa Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 14 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số mẫu Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 38 Hình 3.2 Kết PCR đoạn gen ycf, rbcL, trnH-psbA mẫu Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 39 Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA xử lý NCBI 41 Hình 3.4 Sự sai khác nucleotide trình tự đoạn gen trnH-psbA loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai với lồi Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác biểu thị không xuất dấu nối đối xứng) 42 Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn rbcL tạo phần mềm NCBI Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 44 Hình 3.6 Sự tương đồng trình tự đoạn gen rbcL loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai với trình tự lồi Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác biểu thị không xuất dấu nối đối xứng) 45 Hình 3.7 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn ycf tạo phần mềm NCBI Phi điệp năm cánh trắng mắt nai 47 Hình 3.8 Sự sai khác trình tự đoạn gen ycf loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai với trình tự lồi Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác biểu thị khơng xuất dấu nối đối xứng) 48 Hình 3.9 Phơi hạt lan Phi Điệp cánh trắng tái sinh môi trường nuôi cấy khởi đầu 52 Hình 3.10 Phơi hạt lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai tái sinh thành protocom 52 Hình 3.11 Thể chồi lan Phi Điệp cánh trắng mắt nai nuôi cấy công thức môi trường nhân thể chồi 54 Hình 3.12 Bình thể chồi tái sinh chồi 5CT1 sau tuần ni cấy 55 Hình 3.13 Cụm chồi lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai lúc cấy chuyển nuôi cấy công thức môi trường nhân nhanh chồi 57 Hình 3.14 Chồi lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai sau tuần môi trường nhân nhanh chồi 58 Hình 3.15 Ảnh lồi 5CT1 sau tuần nuôi cấy môi trường rễ R3 61 Hình 3.16 Ảnh lồi 5CT1 rễ hồn chỉnh 61 Hình 3.17 Cây lan loài Phi Điệp cánh trắng mắt nai sau trồng vào giá thể 62 ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa lan từ lâu sử dụng làm loài cảnh quý giá, đẹp màu sắc mà hình dáng, từ đường nét cánh hoa tao nhã đến hình dạng thân, cành dun dáng, có lồi hoa sánh nổi, số lồi cịn có hương thơm quyến rũ, tao Vì vậy, từ lâu ông cha ta coi hoa lan biểu tượng khiết, cao quí vương giả (Nguyễn Quỳnh Trang et al.,2013) [7] Chi lan hoàng thảo (Dendrobium) chi quan trọng họ Phong lan (Orchidaceae), Theo A Takhajan (1966), giới chi Hồng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 lồi, chủ yếu phân bố Đơng Nam Á đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia Ở Việt Nam có 107 lồi, phân bố vùng núi từ Bắc vào Nam số đảo ven biển Chúng có ý nghĩa dược liệu sức khỏe người như: tác dụng loại bỏ chất độc hại tích lũy mô, tăng cường khả miễn dịch thể, giảm lượng đường máu kéo dài tuổi thọ Lan Phi Điệp loài thực vật thuộc chi Lan Hồng Thảo nhiều người u thích Ngồi tên Lan Phi Điệp cịn gọi Lưỡng điểm hạc, Lan giả hạc, hay Lan giả hạc tím Ngồi dịng lan phi điệp thơng thường, lan phi điệp đột biến giới chơi lan săn lùng khắp nước sẵn sàng chi hàng trăm triệu, chí tỷ đồng để sở hữu giỏ lan độc đáo, đặc sắc Tất dòng Lan phi điệp đột biến thường có giá cao theo người khác biệt, mà người muốn sở hữu thứ độc vơ nhị, khắp nước có loại hoa Những lan đột biến gen, lạ hình dáng, độc đáo mặt hoa, hấp dẫn người chơi lan như: năm cánh trắng mắt nai, năm cánh trắng Trường Sa, năm cánh trắng Phú Thọ, năm cánh trắng HO, năm cánh trắng Củ Chi,…[9,10] Tuy nhiên, tự nhiên nội nhũ hạt lan thường bị tiêu giảm hạt muốn nảy mầm phải có xuất nấm cộng sinh Rhiroctonia nên khả tự nảy mầm thấp Bên cạnh đó, nhân giống hoa lan đường sinh dưỡng thường chậm, hệ số nhân giống thấp ảnh hưởng lớn tới mẹ Để giải vấn đề này, người ta áp dụng nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro tạo hàng loạt mang đặc tính tốt, ổn định mặt di truyền, có hệ số nhân cao, nhân nhanh hàng loạt,… nhằm đưa giải pháp tốt để giảm mức độ khan nguồn lan giống thời gian ngắn với giá hợp lý Việc xác định xác lồi lan quan trọng việc xác định giống trồng, lựa chọn cha mẹ để nhân giống bảo tồn nguồn gen Chúng trở thành cơng cụ mới, phục vụ có hiệu cho công tác giám định, phân loại, đánh giá quan hệ di truyền phát loài Gần đây, phân loại loài thuộc chi Dendrobium mối quan tâm lớn nhà thực vật học coi thách thức phức tạp họ lan Một phân tích phân tử nhiều đặc điểm hình thái Dendrobium dường đồng Mã vạch DNA (DNA barcode) kỹ thuật sử dụng đoạn DNA ngắn để chuẩn hóa phân biệt lồi - Một phương pháp nhanh chóng để xác định xác lồi lan, góp phần cho việc bảo tồn nguồn gen lồi có giá trị nước ta Ở Việt Nam, phương pháp tương đối mẻ Song có số đề tài khoa học tiến hành xác định DNA barcode thực vật thu dược kết đánh giá cao (Vũ Đình Duy, 2019) [16] Từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định thị DNA - barcode nhân giống in vitro cho dòng lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai” nhằm góp phần bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật làm sở cho việc nhân nhanh dòng lan năm cánh trắng mắt nai, cung cấp nguồn lan giống chất lượng cao để phát triển dịng lan Phi điệp có hoa đẹp nước 10 100 Cây to khỏe, xanh đậm, rễ bám giá thể tốt xuất rễ Cây lan in vitro mà có kết hợp vỏ thơng rêu rừng cho tỷ lệ sống sót đạt 100% mức sống cao Cây lan có vươn cao đỉnh sinh trưởng, non mọc lên, màu xanh đậm, có sức sống tốt Tuy nhiên, rễ in vitro nên phát sinh yếu tốc độ sinh trưởng chậm Mới đưa mơi trường bên ngồi chưa kịp thích ứng, hay bị tác nhân có hại bên ngồi xâm nhiễm gây tổn thương làm hại cho lan Vì cần có biện pháp chăm sóc tốt cho in vitro đưa bên ngồi Hình 3.17 Cây lan lồi Phi Điệp cánh trắng mắt nai sau trồng vào giá thể 62 SƠ ĐỒ HĨA QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG PHI ĐIỆP CÁNH TRẮNG MẮT NAI BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Trên sở kết thu tơi đưa quy trình nhân giống in vitro lan Phi điệp cánh trắng mắt nai sau: Quả lan 5CT1 Công thức khử trùng: KT3 (1 phút cồn 700, phút HgCl2) - Môi trường nuôi cấy khởi đầu: MS + 20 g/l sucrose + 5g/l agar + dịch chiết 200 g/l khoai tây + 0,2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Nhân thể chồi lan 5CT1 - Môi trường nhân nhanh thể chồi NTC4: MS + 20g/l đường + 7g/l agar + dịch chiết khoai chuối 150g/l + 0,3 NAA mg/l + 0,5 BAP mg/l + 0,3 mg/l Kinetin Nhân nhanh thể chồi lan 5CT1 - Môi trường nhân nhanh chồi NNTC3: MS + 20g/l đường + 7g/l agar + dịch chiết chuối 150g/l + 0,2mg/l NAA + 0,6mg/l BAP + 0,4mg/l Kinetin - Môi trường rễ R3: MS + 20g/l đường + 7g/l agar + dịch chiết chuối 150g/l + 0,4mg/l NAA + 0,2mg/l IBA Cây lan 5CT1 hoàn chỉnh - Giá thể (Vỏ thông : rêu rừng = : 2) Cây lan 5CT1 vườn ươm 63 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.1.1 Đối với xây dựng sở liệu DNA barcode Phi điệp năm cánh trắng mắt nai Đã tách chiết DNA tổng số loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosmun) Đã nhân thành công gen ycf, trnH-psbA rbcL kỹ thuật PCR từ DNA tổng số mẫu thu Đã xác định trình tự đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL Đã xây dựng phát sinh chủng loại Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosmun) với dòng Phi điệp khác ngân hàng gen quốc tế Đoạn ycf có khả phân biệt cao so với đoạn trnH-psbA rbcL so sánh loài Dendrobium anosmun với lồi khác Kết phân tích đoạn gen ycf phù hợp với kết hình thái cho thấy lồi Dendrobium anosmun có quan hệ gần với lồi Dendrobium tosaense Mặc dù cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định xác lồi cần định danh 4.1.2 Đối với nhân giống lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosmun) kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ❖ Công thức khử trùng: KT3 (1 phút cồn 700 , phút HgCl2); ❖ Môi trường nuôi cấy khởi đầu: MS + 20 g/l đường sucrose + 5g/l agar + dịch chiết 200 g/l khoai tây + 0,2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA ❖ Môi trường nhân chồi NTC4: MS + 20g/l đường + 7g/l agar + dịch chiết khoai chuối 150g/l + 0,3 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin ❖ Môi trường nhân nhanh chồi NNTC3: MS + 20g/l đường + 7g/l agar + dịch chiết chuối 150g/l + 0,2mg/l NAA + 0,6mg/l BAP + 0,4mg/l Kinetin ❖ Môi trường rễ R3: MS + 20g/l đường + 7g/l agar + dịch chiết chuối 150g/l + 0,4mg/l NAA + 0,2mg/l IBA 64 ❖ Giá thể cây: Vỏ thông : rêu rừng = : 4.2 Kiến nghị 1) Sử dụng đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL vào việc giám định dòng lan Dendrobium anosmum Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 2) Áp dụng quy trình nhân giống lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai kỹ thuật nuôi cấy mô vào sản xuất 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bùi Thị Mai Hương, Trần Phương Thảo (2020), “Nghiên cứu xác định đoạn DNA-Barcode cho loài áo cộc (liriodendron chinense) phục vụ giám định loài”, khoa CNSH-ĐH Lâm nghiệp Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), “Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến q trình ni cấy phát sinh tế bào soma phơi vơ tính lan (Dendrobium, Phalaenopsis, Cybidium)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, tr 503 - 508 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nhà xuất Hà Nội Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu (2012), “Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật”, khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Ngô Quang Vũ (2002), Những số hấp dẫn thị trường lan cắt cành giới”, Tr.10, tạp chí Hoa cảnh Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013), “Nhân giống in vitro Lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum)”, tạp trí khoa học cơng nghệ lâm nghiệp số (kỳ I),Tr.16-21 Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị Bích Phượng (2010), “Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân giống in vitro Hoàng lan thân gãy (Dendrobium aduncum)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3): 361 - 367 Nguyễn Thị Hồng Huế (2016), Đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Phi điệp từ hạt”, Trường đại học sư phạm Hà Nội 17 10 Nguyễn Thị Lý Anh (2/1990), Đề tài: “Nhân giống trồng in vitro”, Khoa CNSH-ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội 11 Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009), “Nhân giống lan Dendrobium 66 anosmum, Dendrobium mini phương pháp nuôi cấy mô, nghiên cứu loại giá thể trồng lan Dendrobium thích hợp cho hiệu cao”, đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Đại học An Giang 12 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2011), “Nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum (Lan Hồng Thảo Long nhãn)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, trường Đại học Nông nghiệp, tập 10, số 2, tr 263 - 271 13 Nguyễn Thu Hường (2016), Luận văn ThS: “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium asomum Lindl.) 14 Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) - lồi lan rừng có nguy tuyệt chủng”, Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 64, tr 127 - 136 15 Tháng 8/2010, Maridass cộng tiến hành nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu thân rễ Nghiên cứu đăng Tạp chí Cơng nghệ sinh học quốc tế (2010) 16 Vũ Đình Duy (2019), “Sử dụng trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS- rRNA) để xác định loài lan thuộc chi Lan Hồng thảo (Dendrobium)”, tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới số 18, Tr.3-12 17 Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013) “Nhân giống in vitro loài lan địa Dendrobium nobile Lindl.” Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 7: 917-925 18 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 19 Adams P.B., Systematics of Dendrobiinae (Orchidaceae), with special reference to Australian taxa, Botanical Journal of the Linnean Society, 2011,166:105-126 and species identification of Dendrobium (Orchidaceae) in China, Biochemical Genetics, 2014, 52:127-136 20 Bijaya P., Deepa T (24, May 2012), “In vitro mass propagation of 67 an epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl through shoot tip culture” African Journal of Biotechnology Vol 11 (42), pp 9970 - 9974 21 Casiraghi M, Labra M, Ferri E, Galimberti A, and Mattia D.F (2010) DNA barcoding: theoretical aspects DNA practical applications Brief Bioinform, 11(4):440-453 22 Chinese Pharmmacopoeia Editorial Committee (CPEC) Pharmmacopoeia of the People’s Republic of China In Theoretical and Applied Genetics, CPEC,Beijing, China, 2010 23 Ding G., Li X., Ding X., Qian L., Genetic diversity across natural populations of Dendrobium officinale, the endangered medicinal herb endemic to China,revealed by ISSR and RAPD markers, Genetika, 2009, 45:375-382 24 Fazekas A.J, Burgess K.S, Kesanakurti P.R, Graham S.W, Newmaster S.G, Husband B.C, Percy D.M, Hajibabaei M, Barrett S.C (2008) Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well.PLoS One, (7): e2802 25 Feng S.G., Lu J.J., Gao L., Liu J.J., Wang H.Z., Molecular phylogeny analysis 26 Hebert, P.D., Cywinska A., and Ball S.L (2003) Biological identifications through DNA barcodes.Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512): 313-321 27 Hollingsworth, P.M (2011) Refining the DNA barcode for DNA plants Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49):1945119452 28 Jin W., Yao S., Cultivation and appreciation of noble spring Orchid cultivars;Guangdong Science and Technology Press: Guangzhou, China, 2006 29 Knudson, L (1922), Nonsymbiotic germination of orchid seeds, Botanical Gazette, 73, p 1- 25 30 Lee H-L, Yi D-K, Kim J-S, Kim K-J (2007) Development of plant DNA barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast 68 genome The Second International Barcode of Life Conference Academia Sinica, Taipei, Taiwan September 18–20, 2007 31 Leonid Averyanov, Anna L Averyanova., Updated checklist of the Orchids of 32 Logacheva, M., Penin A., Samigullin T., Vallejo-Roman C., DNA Antonov A (2007) Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome sequences: in search of a “lucky gene” Biochemistry (Moscow), 72 (12): 13241330 33 Maridass M., Mahesh R., Raju G.A., Muthuchelian K (2010) “In vitro propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture” International Journal of Biological Technology, 1(2), 50 - 54 34 Moudi M., Go R., Yien C.Y.S., Saleh M.N., A review on molecular systematic of the genus Dendrobium Sw, Acta Biologica Malaysiana, 2013, 2(2):71-78 35 Sana A., Touqeer A., Ishfaq A H., Mehwish Y “In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma white” African Journal of Biotechnology Vol 10(16), pp 3097 - 3103, 18 April, 2011 36 Supinrach, S Supinrach, I (2010), Study of medias on growth seedling Cattleya and Phalaenopsis, Proceedings of the 49th Kasetsart University Annual Conference, Kasetsart University, 1, p 264- 271 37 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 38 Trung K.H., Khanh T.D., Ham L.H., Duong T.D., Khoa N.T., Molecularphylogeny of the endangered Vietnamese Paphiopedilum species based on theinternal transcribed spacer of the nuclear ribosomal DNA, Advanced Studiesin Biology, 2013, 5:337-346 39 Tsi Z.H., Chen S.C., Luo Y.B., Zhu G.H., Orchidaceae (3) In flora 69 republicae popularis sinicae, Science Press: Beijing, China, 1999 40 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 Vietnam Vietnam National University Publishing House, Hanoi, 2003 Bulpitt C.J., Li Y., Bulpitt P.F., The use of orchids in Chinese medicine,Journal of the Royal Society of Medicine, 2007, 100(12):558-563 41 Wang H.Z., Feng S.G., Lu, J.J., Shi, N.N., Liu J.J., Phylogenetic study and molecular identification of 31 Dendrobium species using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers Scientia Horticulturae, 2009, 122:440-447 42 Xiang X.G., Schuiteman A., Li D.Z., Huang W.C., Chung S.W., Li J.W., Zhou H.L., Jin W.T., Lai Y.J., Li Z.Y., Jin X.H , Molecular systematics of Dendrobium (Orchidaceae, Dendrobieae) from mainland Asia based on plastid and nuclear sequences, Molecular Phylogenetics and Evolution, 2013, 69:950-960 WEBSITE 43 http://www.barcodinglife.org/ 44 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 45 https://www.bluenanta.com/detail/hybrid/ 70 PHỤ BIỂU Phụ biểu 1: Kiểm tra hệ số nhân thể chồi in vitro nồng độ NAA, BAP Kinetin khác Test of Homogeneity of Variances congthucthinghiem Levene Statistic df1 46,962 df2 Sig 128 ,000 ANOVA congthucthinghiem Sum of Squares df Mean Square Between Groups 129,810 Within Groups 140,190 128 Total 270,000 134 F 21,635 19,754 Sig ,000 1,095 Phụ biểu 2: Kiểm tra hệ số nhân nhanh thể chồi in vitro nồng độ NAA, BAP Kinetin khác 71 Test of Homogeneity of Variances congthucthinghiem Levene Statistic df1 68,599 df2 Sig 128 ,000 ANOVA congthucthinghiem Sum of Squares df Mean Square Between Groups 124,375 Within Groups 145,625 128 Total 270,000 134 F 20,729 18,220 Sig ,000 1,138 Phụ biểu 3: Kiểm tra chiều dài rễ hoàn chỉnh loài 5CT1 Test of Homogeneity of Variances congthucthinghiem Levene Statistic 2,888a df1 df2 72 133 Sig ,004 ANOVA congthucthinghiem Sum of Squares df Mean Square F Between Groups 74,625 10 7,463 Within Groups 124,681 133 ,937 Total 199,306 143 7,960 Sig ,000 Phụ biểu 4: Kiểm tra tỷ lệ chồi rễ loài 5CT1 Test of Homogeneity of Variances congthucthinghiem Levene Statistic df1 29,264 df2 102 Sig ,000 ANOVA congthucthinghiem Sum of Squares df 73 Mean Square F Sig Between Groups 20,463 4,093 Within Groups 114,537 102 1,123 Total 135,000 107 3,645 ,004 Phụ biểu 5: Số rễ trung bình loài 5CT1 Test of Homogeneity of Variances congthucthinghiem Levene Statistic df1 9,788 df2 Sig 103 ,000 ANOVA congthucthinghiem Sum of Squares df Mean Square Between Groups 18,355 4,589 Within Groups 116,645 103 1,132 Total 135,000 107 F 4,052 Sig ,004 Phụ biểu 6: Thành phần môi trường MS sử dụng nghiên cứu 74 Ký hiệu môi trường Đa lượng Thành phần Khối lượng (mg/l) NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KNO3 1900 K2SO4 KH2PO4 170 CaCl2.2H2O 332,2 Ca(NO3)2.4H2O FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 MnSO4.7H2O 16,9 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 Na2MoO4.2H2O 0,25 Myo- inositol 100 Glycine Nicotinic acid 0,5 MS I MS II Vi lượng MS III MS IV Vitamin MS V 75 Pyridoxxin HCl 0,5 Thiamin HCl 0,1 76