Ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật để hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin uống phòng bệnh dịch tả ở quy mô bán công nghiệp

Bộ Y TẾ f My VIÊN VỆ SINH DICH TẾ HỌC CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CẤP NHÀ NƯỚC KV.01 / ĐỀ TÀI KV.0103 ỨNG DỤNG TIẾN BỘ KHOA HOG KY THUAT BE HOA THIỆN DŨNG NGHỆ SÂN XUẤT VẤPXIN UONG PHONG G aU! MO BAN CONG NGHIEP Chủ nhiệm: GS.T§ Đăng Đức Trạc h Phó chủ nhiệm : PGS P†S Đặng Đúc Ph ú Viễn Vệ Sinh Dịch Tễ Học Viên Vắcxin Chế phẩm Sinh học Trung tâm Quốc gia Kiểm định Vacxia Sở Y Tế Thừa Thiên - Huế, Viên Vi Sinh Miễn Dịch học, tr ưởng Đại học GoteEorr Wien Suc Krée Gude Gia (N.LH.), Bethesda, Md HANOL- 1955 a CHU NHIEM BE TAI KY - 01-03 GS TS PANG BUC TRACH PHO CHU NHIEM PGS PTS DANG BUC PHU Chủ nhiệm đề mục; KI- OL - 03-01 PTS Hoang thu Thuy? 'KI- 01 - 03 -03 BS Nguyên Phi Quy? KI-O1 - 03 -02 KI-ÔI - 03- 04 KI- 01 - 03 - 05 KI- 01 - 03 - 06 KI-O1 - 03-07 KI- 01 - 03 - 08 KI- 01-03 09 KI- 01-03-10 KL- 01-03-11 KI - 01-03-12 Cộng tác viên chính: KI- 01-03-13 TS Phang Day Cam“? KS Phan Va Dig Hing” B8 Dỗ Gia Cảnh PGS Nguyễn thị Ke” BS Chế quang Tuân"?! DS Hồ thị Ánh? BS Lê văn Bế) BS Doãn thị Tạm?) BS Nguyén dinh Son GS Tan Holmgren" US John Clemens? Vũ Bình”), Vũ thị Nương”, Nguyễn văn C: ‘am, Neuyén tha Thuy”, Dang Dice Phút”, Nguyễn Lan Phương”), Nguyễn đình Hồn, 2°, Phan thi Tuyet?), He Hong Nhang”, Hoàng thị Hồng), Nguyén qué Aah™ Ngayén Son", Hoang thi Phiếm9, Nguyễn thái HoX®, Ann -Marie Svennerholn®, MR Rao “Thư kỹ đề tài : PGS.TS Đặng Đức Phú (1) Viện Vệ sinh Dịch tế nọc {2) Viện vacxin chế phẩm sinh học Nha trangĐà lạt (3) Trưng tàm Qvốc gia kiểm định vacxin (4) Sở Y tế thừa Thiên - Huế (3) Vign Vi sinh Miễn dich hoc, Trường đại học Œoteborg, Thuy Điền {6) Viện sức khoẻ Quốc gia (N.1.I1), Bethesda, Vid, MỤC Lục | BAT VAN DE I, TONG QUAN Ill, GÁC NỘI DỰNG NGHIÊN CỨU Phần thứ nhất: Bổ xung kháng nguyên cần thiết Phan thứ hai: Sản xuất vắc xin tả qui mô bán công nghiệp Phần thứ ba: Thí nghiệm thực địa iV BAN LUAN CHUNG V, KẾT LUẬN CHUNG Vị TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 48 I ĐẶT VẤN ĐỀ Đề tài "Nghiên cứu sản xuất vắc xin uống phòng bệnh tẢ” 64 B - 07 - 03 - 01 (1880) có kết sau (3, 11, 12): 1, Một vắcxin chất, toàn tế bão, gồm Vibrio cholerae typ sinh học cổ điển typ sinh học EI Tor, bất hoạt bới nhiệt formalin, chế tạo Sản phẩm đạt yêu cầu Trung Tâm Quốc Gia Kiểm Định Vắcxin, ì Vắcxín thí nghiệm người tinh nguyện tơ an tồn, với liều uống 100 tỉ vi khuẩn x lần Theo dõi đáo ứng miễn dịch người tình nguyện, thấy có hiệu giá ig đặc hiệu cao, đặc biệt sIgA Vắcxin sản xuất qui mở phịng thí nghiệm, sân phẩm sản xuất thử đạt 200.000 liều Giá thành ước tính liều 0,5 kg gạo Nếu sản xuất kiểm định qui mơ lớn hơn, giá thành thấp 4, Những vấn đề cân tiếp tục nghiên cứu: «_ Quy trình hợp lý cần để sản xuất vắcxin quy mô lớn + Cải tiến để tăng hiệu lực gây miễn dịch vắcxin Đề tài KY 01.03 (1992 - 1995) “Ứng dụng tiến khoa học kỹ thuật để hoàn thiện cơng nghệ sản xuất vắcxin uống phịng tả qui mô bán công nghiệp” nhắm mục địch: Bổ xung số kháng nguyên cần thiết để tăng hiệu lực vắcxin Nâng mức sân xuất tử qui mơ phịng thí nghiệm lên cui md bán sơng nghiệp, với thiết bị có Thí nghiệm thực địa, nhận xót sơ hiệu lực bảo vệ vắcxin i, TONG QUAN Bệnh tả xây nhiều nơi giới Theo số liệu Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 36 nước cịn có bệnh tả Bệnh tả, không điều trị kip thời cách, thưởng có tỷ lệ mắc/chết cao, khoảng 40% Mỗi năm ước tính có trung bình triệu trưởng hợp mắc bệnh tâ, số tử vong khoảng 200.000 Châu Phi khoảng 100.000 Cháu Á, Một phần ba số tử vong trẻ em tuổi, mệt phần tư trẻ øm từ tới 14 tuổi, số người lớn Hiện bệnh tả chủ yếu Vibrio cholera 01 thấy xuất tác nhân mới, Vibrio choterae 0189, gây nhiều vụ dịch lớn giới, đặc biệt nước khu vue A Châu (2) Việt nam vùng dịch tả lưu hành, bệnh tả gánh cho ngành y tế xã hội Gũng không loại trừ khả xẩy dịch lớn V.cholarae 0188 nước ta Từ lâu việc nghiên cứu để có vắcxin hiệu nghiệm phòng bệnh tả mối quan tâm y học giới Vắcxin tả có từ kỷ nay, sau Koch phát Vibrio cholerae 01 bệnh nguyên tä Vắcxin (còn gọi vắcxin "cổ điển") tiêm cho hàng nhiều triệu người giới, thật lâu sau, vào quãng nám 80, bắt đầu có nghiên cứu đánh giá hiệu lực vắcxin thực địa Những nghiên cứu 8angledesh Ấn Độ Philippin cho phép nhận định vắcxin "cổ điển" có hiệu lực hạn chế , bảo vệ thời gian ngắn (3-6 tháng), khả gây miễn dịch cho trẻ em thấp, đặc biệt têm vắoxin không hạn chế việc dao thai Vibrio cholerae qua phan Vi thé vắcxin"oổ điển" không coi phương tiện hiệu nghiêm để dự ohong bệnh lả, khơng cịn dùng Trong năn 70, Ấn Độ Inđơnésiä có thí nghiệm fiém vắcxin hấp phụ aluminium Vắcxin có hiệu lực bảo vệ cao dải vắcxin "cổ điển" Cũng tròng khoảng thỏi gian Bangladesh Philippin thứ tiệm giải độc tố (toxoid): loại vắcxin này, có gây đáp ứng kháng thể kHiáng độc tố, thực địa khơng có hiệu lực bảo vệ đáng kể Lúc Tố chúc Y tế Thế giới bắt đầu khuyến cáo không nân tiêm vắcxin tả iý sau đây: Vắcxin khơng có hiệu lực dự phịng khu vực lưu hành bánh tả, khơng có tác dụng chống vụ dịch tá khơng có ngăn chặn bệnh tả lan truyền khu vục giới, Ngoài ra, lý khiến cho người khơng cịn quan tâm tới thức vắcxin"cổ diễn" này: Việc điều tri bệnh lả có nhiều tiến đơn giản trước Phương pháp bù nước thực tế làm giảm tỷ lệ mắc/chết xuống tối thiểu (dưới 1%], điều trị rõ ràng có tác dụng cứu nhiều người tiêm phòng vắcxin toi, Sau tai họa lớn Rwanda, từ năm 1995, Tổ Chúc Y Tế Thế Giới thấy đổi quan niệm nhận thấy cần thiết phải dùng vắc xin tả kiểu để dự phòng dịch tả (13) Xuất phát từ quan niệm phòng vệ tự nhiên chống bệnh tả chủ yếu dựa vào kháng thể hình thành đường ruột, có khả chống vi khuẩn tả độc tố tả, từ năm 80 nhiều phịng thí nghiệm tập trung nghiên cứu väcxin tả uống, với hy vọng vắcxin uống kích thích đáp ứng miễn dịch đường ruột chống nguyên chủ yếu Vibrio cholerae 01 1.1 NHỮNG KHÁNG lại nhiều kháng NGUYEN CHU YEU CUA VIBRIO CHOLERAE 01 Qua nghiên cứu súc vật người thấy kháng nguyên lioopolysaccharid thành tế bào vi khuẩn (LPS) độc tố (CT) có khả tạo miễn dịch báo vệ -chống tâ, Những kháng thể đặc hiệu chống kháng nguyên Hình thành đưởng ruột, có tác dụng cộng lye, Mian dict kháng vi khuẩn chủ yếu LPS, kháng thể kháng protein khác sủa tế bào vi khuẩn tả có vai trị quan trọng Miễn dịch kháng độc tố có tác dụng chống lại tiểu đơn vị B độc tố tả Vibrio cholerae 01, muốn gây ía chảy, trước tiên cần phải định cư đường ruột Quá trình phức tạp, đơi hỏi có biểu nhịp nhàng chức hóa ứng động sau hình thành độc tố (CT) Như vậy, ngăn cản khơng cho V.cholerae 01 bám dính vào tổ chức ruột, chặn đứng trình sinh bệnh tử giai đoạn sớm Những nghiên cứu chuột đẻ người tình nguyện cho phép kết luận V.cholerae 01 (cả týp sinh học cổ điển týp sinh hoc Et Tor) phải cần có TCP định cư ruột TCP (viét tt ca toxin coregulated pilus = pilus dồng điều hòa độc tố) "lông" vi khuẩn tả, TCP biểu nhiều hay tùy theo ngoại cảnh, điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho TCP biểu nhiều (6) đồng thời thích hợp cho độc tố tả hinh thành nhiều Gen cấu trúc TCP, TepA, gen mã hóa tổng hợp độc tố, phần yếu tố điều hòa độc lực (toxR) Các kháng nguyên, gen nói mã hóa, có khả riêng kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại bệnh tả thực nghiệm Các kháng nguyên này, cộng lực, ngăn gen biểu Do vai trò quan trọng protơin tiết toxft điều hịa, dặc biệt TCP tiểu đơn vị B CT, coi kháng nguyên miễn dịch mạnh dùng phối hợp với LPS vắcxin ~ Trong thực nghiệm, kháng huyết thỏ đa-clơn kháng TCP có hiệu lực baové thụ động cho chuột đả, sau thừ thách gây bệnh V.cholerae 01 (ching Inaba chủng Ogawa) Nếu hấp phụ kháng huyết kháng TCP với chủng V.cholerae 01 hoang đại, khả bảo - vệ Nhưng hấp phụ với chủng V.cholarae 01 pilus-âm, khả bảo vẽ cịn nguyên vẹn, Như nghĩ khả bảo vệ ©ó liên quan chặt chẽ với kháng thể kháng -TCP Các gen TcpA cửa chủng V.cholerae 01, sinh týp cổ điển, Inaba Ogawa, giống hoàn tồn Các gen TopA khơng giống hẳn gen TepA cla V.cholerae sinh ~ typ Ef Tor, nhung có l có chung định kháng ngun : Ngồi gen tham gia vào q trình sinh tổng hợp TOP, cịn có gen mã hóa protêin mảng tế bào vi khuẩn, gen mã hóa tổng hợp yếu tổ phụ định cu (ACF - accessory colonization factor) Tat gen toxR điều hịa, Như vậy, TepA dùng anhư "chỉ điểm" cáo kháng nguyên mạnh khác bị điều hịa toxR, q trình sân xuất loại vắcxin toàn tế bảo (WC - whole cell) L2 CÁC VẮCXIN UỐNG DỰ TUYỂN Các vắcxin chết Các vắcxin WC đơn phối hợp với tiểu đơn vị B sủa GT thí nghiệm ° Vắcxin phổi hợp WC/BS gồm có tiểu đơn vị B tinh chế từ độc tố tả, vi khuẩn tả thuộc sinh-týp cổ điển va sinh-typ El Tor (Inaba va Ogaw a) Tiểu đơn vị B hoàn toàn khơng độc, có khả sinh kháng thể trung hịa độc tố tồn vạn, Tiểu đơn vị B có khả gắn vào mảng tế bào ruột, có tính sinh miễn địch, Tế bào vi khuẩn bất hoạt nhiệt cung cấp kháng nguyên LPS Inaba Ogawa, tế bao vi khuẩn bất hoạt formalin cung cấp kháng nguyên không kháng nhiệt Tiểu đơn vị B iä mệt penta mer dễ bị hủy axit, vị cho uống vắcxin cần phải dùng dung dich đệm gồm có natri bicarbonat axit citric Qua thí nghiệm thực địa đầu tién quy.mé (Bangladesh, Thụy Điển, Mỹ) thấy vắcxin WO/BS an tồn Tại Bangladesh có thí nghiệ m đánh giá để xem vắcxin có khả kích thích đáp ứng kháng thể niêm mạc kháng vi khuẩn kháng độc tố Kết qua thấy : uống hai liều (hoặc nhiều liều hơn) gây hinh thành kháng thé IgA kháng - LPS va kháng độc tố nước rửa ruột, với hiệu giá eao bệnh nhân tả Các đáp ứng kháng thể cao nhiều tồn lâu nhiề u, so sánh đáp ứng sau tiêm bắp thịt liều thứ vắcxin Đáp ứng kháng thể người Thụy Điển thấp so với đáp ứng người Bangladesh củng lứa tuổi Theo dõi lâu dài , thấy ký ức miễn dịch (lgA niêm mạc) tồn # 15 tháng người Bangladesh, năm người tình nguyện Thụy Điển Tại Hoa Kỳ, người tình nguyện uống liều vắcxin tỷ lệ bảo vệ 68%, dùng WC tỷ lệ bảo vệ 56%, thách gây bệnh tả với V.cholerae 01 El Tor Trong số nguyện Hoa Kỳ này, uống WO/BS thị khơng có bị la tình nguyện W/BS có sau thi người tình cháy nặng (nặng = bai tiết l/ngày), uống WC 44% bị la chày nặng Do thấy có kết đáng khích lệ nói trên, Trung Tâm Quốc tế Nghiên cứu Bệnh ìa chảy (CDDP/B) tai Bangladesh phối hợp với phủ Bangladesh Tổ chức Y tế Thế giới, tiến hành thực địa nghiên cứu hiệu lực vắcxìn tả uống Matlab từ năm 1985 Tất có 63.00 người (gồm trẻ em 2-15 tuổi pnự nữ 15 tuổi) uống liều liều cách tuần, theo nhóm sau: (a) vaexin WC/BS, (b) vaexin WC (ce) placebo gam co E.coli K12 bat hoạt Mỗi iều WC/B S gồm: 1mg BS cộng với 100 tỉ vi khuẩn V.cholerae Inaba cổ điển bất hoạt nhiệ t (Cairo 48), Ogawa cổ điến bất hoạt nhiệt (Cairo 50), lượng 'Vắcxin WC có cơng thức trên, khơng có tiểu đơn vị B Cả vắoxin đầu làm tăng hiệu giá kháng thể huyết diệt Vipiio (tăng khoảng bậc); riêng vắcxin WC/BS làm tăng hiệu giá kháng thể huyết IgG kháng độc tố tả (lắng 4-6 bậc) Theo dõi người uống vắoxin, khơng thấy có phản ứng xây Theo dõi hiệu lực bảo vệ vắcxin qua năm giám sát khu vực Matlab: Những số iiệu ghi lại kèm theo Sau năm theo đõi người uống liều vắcxin, thấy rang WC có tỷ lệ bảo vệ 82%, vắcxin WC/BS có tỷ lệ bảo vệ 80% Tỷ lệ bảo vệ có nghĩa dự phịng la chảy vi khuẩn tả gây (chứng minh nuôi cấy vi khuẩn) Cả hai loại vắcxIn có hiệu lực bảo vệ thấp đổi với trả em 2-5 tuổi: 31% Và 24% với WC, 98% 47% với WO/BS, năm thứ năm thứ hai Tới nấm thứ coi khơng cịn thấy hiệu lực bảo vệ lứa tuổi Trái lại, lứa từ tuổi trở lân, hiệu lực bảo vệ thời gian năm cao: 68% với WC, 68% với WC/BS Trong nhóm placebo 66% người mắc bệnh tả thuộc lứa tuổi từ tuổi trở tên Qua năm theo rõi, thấy trường hợp bệnh tâ có cà V,cholorag 01 týp sinh học cổ điển týp sinh học EI Tor, phần lớn chủng phân lập Ogawa Hiệu lực bảo vệ câ hai thứ V.cholerae cổ điển cao V.cholerae El Tor vắcxin 8o với WC WC/BS có hiệu lực bảo vệ cao tháng đầu WC/BS có tác dụng dự phịng la chảy cấp trẻ em ETEC, tác dụng ngắn hạn (khoảng tháng) Hiéu lye etta vaexin WC va WC/BS tai thyc dja Bangladesh Các nhóm tuổi thời gian theq dõi Hiệu lực vắcxin (%) wc WC/BS Năm thứ 23 Ge Năm thứ hai 87 SẼ Năm thứ ba aS 23 26 ae 63 se 50 Vi khuẩn tâ cổ điển 60 5B Vi khudn ta Et Tor 40 39 Tính năm: “Tính chung năm Lứa tuổi 2-§ năm Lứa tuổi 6năm Chung cáo lứa tuổi - Can nguyen Tuy thực địa không nhằm nghiên cứu xem uống vắcxin lăn tối ưu, thấy uống liều có tác dụng tốt uống liều Nhưng uống liều thị khơng có tác dụng bảo vệ (1)