BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ ỨNG DỤNG HỆ THỐNG TEMPORARY IMMERSION SYSTEM (TIS) NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN THẠCH HỘC TÍA (Dendrobium officinale Kimura et Migo) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2016 MỤC LỤC DANH SÁCH HÌNH i DANH SÁCH BẢNG ii PHẦN MỞ ĐẦU 1 Thông tin dự án Tính cấp thiết dự án Mục tiêu dự án Phạm vi thực dự án CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu lan Thạch hộc tía Tổng quan tình hình nghiên cứu CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 Địa điểm, thời gian vật liệu nghiên cứu 12 1.1 Địa điểm thời gian thực 12 1.2 Vật liệu, thiết bị 12 Nội dung nghiên cứu 12 2.1 Nội dung 1: Xác định mơi trường nhân chồi, dưỡng hồn chỉnh mơi trường ni cấy bán rắn, từ ứng dụng vào ni cấy hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời đối lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) 12 2.2 Nội dung 2: Xác định điều kiện ni cấy: tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy, thể tích mơi trường ni cấy chế độ ngập chìm lên khả nhân chồi dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 13 Xử lý số liệu 14 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 Nội dung 1: Xác định môi trường nhân chồi, dưỡng hồn chỉnh mơi trường ni cấy bán rắn, từ ứng dụng vào ni cấy hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời đối lan thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) 15 1.1 Ảnh hưởng loại mơi trường khống MS biến đổi kết hợp với nồng độ BA lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía mơi trường bán rắn 15 1.2 Ảnh hưởng hàm lượng dịch chiết khoai tây kết hợp với nước dừa lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía mơi trường bán rắn 17 1.3 Ảnh hưởng loại môi trường khoáng MS biến đổi kết hợp với nồng độ NAA lên khả dưỡng hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía mơi trường bán rắn 20 1.4 Ảnh hưởng hàm lượng dịch chiết khoai tây kết hợp với nước dừa lên khả dưỡng hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía mơi trường bán rắn 22 Nội dung 2: Xác định điều kiện ni cấy: tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy, thể tích mơi trường ni cấy chế độ ngập chìm lên khả nhân chồi dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời 24 2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy lên tốc độ nhân chồi lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời 24 2.2 Ảnh hưởng thể tích ni cấy lên tốc độ nhân chồi lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 26 2.3 Ảnh hưởng chế độ ngập chìm lên tốc độ nhân chồi lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời 29 2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy/thể tích lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 31 2.5 Ảnh hưởng thể tích ni cấy lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời 33 2.6 Ảnh hưởng chế độ ngập chìm lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 34 Sản phẩm dự án 36 Giá thành dự kiến 36 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 38 Kiến nghị 40 PHỤ LỤC I 41 PHỤ LỤC II 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Hệ thống ngập chìm tạm thời Doanh nghiệp tham gia ươm tạo Vina-Invitro chế tạo (Sơ đồ cấu tạo) Hình Hệ thống ngập chìm tạm thời Doanh nghiệp tham gia ươm tạo Vina-Invitro chế tạo (Hình thực tế) Hình 1.1 Cây lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Hình 1.2 Hoa lan Thạch hộc tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Hình 1.3 Sản phẩm thân thạch hộc tía khơ Hình 1.4 Thân thạch hộc tía tươi Hình 3.1 Ảnh hưởng mơi trường khống MS biến đổi kết hợp với nồng độ BA lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 16 Hình 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng dịch chiết khoai tây kết hợp với nước dừa lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 19 Hình 3.3 Ảnh hưởng mơi trường khống MS biến đổi kết hợp với nồng độ NAA lên khả dưỡng hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía 22 Hình 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng dịch chiết khoai tây kết hợp với nước dừa lên khả dưỡng hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía 24 Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 27 Hình 3.6 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 29 Hình 3.7 Ảnh hưởng chế độ ngập chìm lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 31 Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía 33 Hình 3.9 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả dưỡng hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía 35 Hình 3.10 Ảnh hưởng chế độ ngập chìm lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 36 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng mơi trường khống MS biến đổi kết hợp với nồng độ BA lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 15 Bảng 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng dịch chiết khoai tây kết hợp với nước dừa lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 18 Bảng 3.3 Ảnh hưởng mơi trường khống MS biến đổi kết hợp với nồng độ NAA lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía 20 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng dịch chiết khoai tây kết hợp với nước dừa lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía 23 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường nuôi cấy lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 26 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thể tích môi trường nuôi cấy lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 28 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chế độ ngập chìm lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 30 Bảng 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy lên khả dưỡng hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía 32 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thể tích mơi trường ni cấy lên khả dưỡng hồn chỉnh lan Thạch hộc tía 34 Bảng 3.10 Ảnh hưởng chế độ ngập chìm lên khả nhân chồi lan Thạch hộc tía 35 PHẦN MỞ ĐẦU Thơng tin chung dự án Chủ nhiệm dự án Họ tên: Nguyễn Cửu Thành Nhân Năm sinh: 19/01/1983 Nam/Nữ: Nam Học vị: Thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật Năm đạt học vị: 2010 Chức vụ (nếu có): Phó Trưởng phịng Hỗ trợ Cơng nghệ Tế bào Thực vật Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TPHCM Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: 12/25/9 Đông Hưng Thuận 31, Phường Tân Hưng Thuận, Quận 12, TPHCM Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 0989.639.007 E-mail: nhannguyenttut@gmail.com Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nơng nghiệp Cơng nghệ cao Cán phối hợp chính: Cơ quan Họ tên TT Chuyên ngành nhận tham gia (Học vị chức danh KH) công tác ThS Phan Thị Hồng Thủy Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NN CNC Công nghệ Sinh học Chữ ký xác đề tài CN Nguyễn Văn Tồn Cơng nghệ Sinh học Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NN CNC Tính cấp thiết dự án Cây lan Thạch hộc tía sinh sản tự nhiên chậm, bên cạnh với việc khai thác khơng kiểm sốt người nhu cầu nguồn nguyên liệu khai thác gỗ rừng làm cho lan Thạch hộc tía ngày khan hiếm, môi trường sống bị thu hẹp, nhu cầu tìm kiếm nguồn ngun liệu thay cấp bách Những nỗ lực nhân giống lan Thạch hộc tía thơng qua ni cấy in vitro trước chưa có hiệu cao, cụ thể hệ số nhân thấp, tỷ lệ rễ thấp chất lượng chưa tốt chi phí sản xuất cao (Bihua Chen, 2014) Với phát triển Cơng nghệ Sinh học nói chung Việt Nam nói riêng, việc ứng dụng hệ thống ni cấy, hệ thống bình phản ứng sinh học ngày rộng lớn ưu điểm mang lại như: khả tự động hóa, khơng phụ thuộc vào tự nhiên kiểm sốt yếu tố khác tốc độ sinh trưởng, sâu bệnh,… Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời doanh nghiệp tham gia ươm tạo Vina Invitro chế tạo ứng dụng vào việc sản xuất sinh khối chồi loại hoa lan, kiểng dược liệu có giá trị kinh tế cao Đối với việc nhân chồi lan Dendrobium, Công ty TNHH SX TM DV giống trồng nâng cao hiệu suất xứ dụng môi trường nuôi cấy lên lần, giảm số lần cấy chuyền từ lần xuống lần, thời gian cấy chuyền nhân nhanh cụm chồi 1/20 so với cấy môi trường bán rắn Ưu điểm hệ thống môi trường cung cấp dinh dưỡng cho mẫu, môi trường thừa chảy bên ngăn chứa, hạn chế tối đa mẫu cấy tiếp xúc với nước hạn chế tượng thủy tinh thể Đối với nuôi cấy môi trường bán rắn, sau thời gian nuôi cấy phải cấy chuyền sang mơi trường hệ thống ngập chìm tạm thời, mơi trường hết dinh dưỡng, tiến hành bổ sung dinh dưỡng dạng dung dịch mẹ để cần nguồn dinh dưỡng ban đầu Kích thước hệ thống ngập chìm tạm thời: D 300 x R 200 x C 120 (mm) Hệ thống chia thành ngăn, ngăn bên chứa môi trường nuôi cấy, ngăn bên chứa mẫu Cách thức vận hành: Môi trường nuôi cấy cung cấp cho mẫu bơm khí nén đẩy qua ống dẫn khí (2) vào ngăn chứa mơi trường (4) bên dưới, lực khí nén đẩy mơi trường lên ngăn chứa mẫu cung cấp môi trường cho mẫu cấy ngăn chứa mẫu phía thơng qua khe dẫn mơi trường (6), sau bơm khí nén tắt, áp suất trở bình thường, mơi trường theo lực trọng trường chảy ngăn bên thông qua khe dẫn (6) (1): Mặt kính thu nhận ánh sáng; (2): Ống dẫn khí nén (3): Màn lọc khí vơ trùng; (4): Ngăn chứa môi trường nuôi cấy (5): Vách ngăn kính; (6): Khe dẫn mơi trường lên xuống Hình Hệ thống ngập chìm tạm thời Doanh nghiệp tham gia ươm tạo Vina-Invitro chế tạo (Sơ đồ cấu tạo) Hình Hệ thống ngập chìm tạm thời Doanh nghiệp tham gia ươm tạo VinaInvitro chế tạo (Hình thực tế) Trọng lượng chồi trung bình cao (107.0 g) tỷ lệ tăng sinh chồi cao (7.1 lần) - Thí nghiệm 1.8: Ở thí nghiệm 1.8, khơng thu nhận kết tạo hồn chỉnh lan Thạch hộc tía hệ thống ni cấy ngập chìm, nhiên q trình ni cấy phát sinh nhân chồi Kết thu nhận nghiệm thức có tỷ lệ mẫu cấy 15 g/l cho kết trọng lượng chồi trung bình cao (66.7 g) tỷ lên tăng sinh chồi cao (4.5 lần) thấp so với thí nghiệm 1.5 1.67 lần - Thí nghiệm 1.9: Ở thí nghiệm 1.9, khơng thu nhận kết tạo hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía hệ thống ni cấy ngập chìm, nhiên q trình ni cấy phát sinh nhân chồi Kết thu nhận nghiệm thức tích mơi trường ni cấy 1.000 ml cho kết trọng lượng chồi trung bình cao (67.8 g) tỷ lên tăng sinh chồi cao (4.5 lần) thấp so với thí nghiệm 1.6 1.58 lần - Thí nghiệm 1.10: Ở thí nghiệm 1.10, khơng thu nhận kết tạo hoàn chỉnh lan Thạch hộc tía hệ thống ni cấy ngập chìm, nhiên q trình ni cấy phát sinh nhân chồi Kết thu nhận nghiệm thức có chế độ ngập chìm lần/ngày (15 phút/lần) cho kết trọng lượng chồi trung bình cao (80.5 g) tỷ lên tăng sinh chồi cao (5.4 lần) thấp so với thí nghiệm 1.7 1.32 lần Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời chứng minh hiệu nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía cách tối ưu thơng số ni cấy như: tỷ lệ mẫu cấy/thể tích ni cấy; thể tích ni cấy chế độ ngập chìm Tuy nhiên, việc ni cấy tạo hồn chỉnh hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời chưa cho kết tốt so với hệ thống nuôi cấy bán rắn với lý mẫu cấy môi trường cung cấp dinh dưỡng làm cho mẫu cấy bị đảo trộn * Quy trình vi nhân giống theo Bihua Chen (2014) [4]: Gieo hạt → Nhân nhanh chồi → Tạo hồn chỉnh Mơi trường gieo hạt: Mơi trường khoáng MS + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Mơi trường nhân chồi: Mơi trường khống MS + 2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose + 5,5 g/l carrageenan, pH = 5,8 38 Mơi trường tạo hồn chỉnh: 1/2MS + 0,2 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA + 15 g/l sucrose + 5,5 g/l carrageenan, pH = 5,8 * Quy trình nhân giống lan Thạch hộc (Nguyễn Thi Sơn, 2014 [2]): Gieo hạt → Nhân nhanh chồi → Tạo hồn chỉnh Vơ mẫu đốt thân → Nhân nhanh cụm chồi → Tạo hồn chỉnh Mơi trường gieo hạt: mơi trường khống VW+ 10 g/l sucrose + g/l agar + 100 ml/l nước dừa, pH = 5,8 Mơi trường nhân nhanh cụm chồi: mơi trường khống MS + 100ml ND + 20 g/l sucrose + g/l agar + 60 g/l dịch chiết chuối chín Mơi trường vô mẫu cảm ứng chồi từ mắt ngủ: môi trường khoáng MS + 20 g/l sucrose + 10% nước dừa + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA + 6g agar/l Mơi trường tạo hồn chỉnh: mơi trường khoáng RE + 0,5 mg/l NAA + 10 g/l sucrose + g/l agar + 0,3 g than hoạt tính Từ kết thí nghiệm dự án, nhóm tác giả đề xuất quy trình vi nhân giống lan Thạch hộc tía từ vật liệu ban đầu chồi sau: Bước 1: Chuẩn bị bình chồi lan Thạch hộc tía tháng tuổi ni cấy môi trường bán rắn Cấy chuyền nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời Mơi trường ni cấy: mơi trường khoáng 1/2MS +2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA + 50 ml/l nước dừa + 80 g/l dịch chiết khoai tây + 8,5 g/l agar, pH = 5,8 Bước 2: Ni cấy tạo hồn chỉnh lan Thạch hộc tía từ sinh khối chồi thu nhận từ hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời Mơi trường ni cấy tạo hồn chỉnh: mơi trường khống 1/2MS + 0,1 mg/l NAA + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 8,5 g/l agar, pH = 5,8 Điểm khác biệt quy trình vi nhân giống dự án kết công bố trước ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời để nhân nhanh chồi lan Thạch hộc tía Ưu điểm việc ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời để nhân nhanh lan Thạch hộc tía tăng hệ số nhân chồi từ 4.27 lần nuôi cấy môi trường bán rắn lên 7.1 lần hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, ngồi ra, ứng dụng hệ thống ni cấy ngập 39 chìm tạm thời cịn giảm chi phí nhân cơng cấy chuyền mẫu chi phí điện thắp sang nhờ giảm diện tích sử dụng đèn Theo bảng tính kinh phí sản xuất cho 1.000 lan Thạch hộc tía, việc ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời làm giảm chi phí sản xuất lan Thạch hộc tía từ 1.200.000 đ/1.000 (trên mơi trường ni cấy bán rắn) xuống cịn 850.000 đ/1.000 (trên hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời SO SÁNH ƯU NHƯỢC ĐIỂM CỦA CÁC HỆ THỐNG NI CẤY Ưu điểm Hệ thống ni cấy Hệ thống ni cấy bán Chi phí đầu tư thấp, dễ Hệ số nhân giống thấp, tốn nhân công lao động thao tác rắn Nhược điểm Hệ thống nuôi cấy ngập Hệ số nhân giống cao, sử Chi phí đầu tư cao, thao chìm tạm Rita/Platima thời dụng mơi trường ni tác phức tạp hệ thống cấy hiệu quả, tốn cơng có nhiều chi tiết kèm lao động Hệ thống ni cấy ngập Chi phí đầu tư thấp, hệ Khối lượng hệ thống lớn, chìm dự án thống thiết kế đơn giản, di chuyển khó sử dụng môi trường nuôi cấy hiệu quả, thao tác đơn giản, hệ số nhân giống cao 6.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát tỷ lệ mẫu cấy/thể tích mơi trường ni cấy, thể tích mơi trường ni cấy chế độ ngập chìm khác nhằm tăng hệ số nhân chồi lan Thạch hộc tía hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời để giảm chi phí sản xuất giống - Cải tiến hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, sử dụng giá đỡ cố định để tiến hành ni cấy tạo hồn chỉnh, giúp khơng bị đảo trộn q trình cung cấp dinh dưỡng 40 PHỤ LỤC I QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY LAN THẠCH HỘC Chồi lan Thạch hộc tía in vitro B1 Ni cấy nhân chồi hệ thống TIS B2 Tạo hoàn chỉnh môi trường nuôi cấy bán rắn Cây lan Thạch hộc tía hồn chỉnh 41 PHỤ LỤC II Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.1 Yếu tố Khống MS Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 30 Error Mean Square Number of Means Critical Range 0.002038 04346 04567 04711 04813 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N A A 3.27000 A 3.25889 A 3.25667 B 3.20333 B 3.19889 Yếu tố nồng độ BA Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.002038 Number of Means Critical Range 30 03366 03538 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N B A 3.52267 15 B 3.10000 15 B 3.09000 15 Yếu tố khoáng MS kết hợp với nồng độ BA Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 30 0.002038 R-Square Coeff Var Root MSE TL Mean 0.981031 1.394316 0.045142 3.237556 42 Number of Means 13 14 15 10 11 12 Critical Range 1014 1057 1086 1108 1124 1138 1149 1159 1167 1174 1180 1186 1191 1195 -Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N AB A 3.97000 3 B 3.54000 3 C 3.42667 3 C 3.42667 D 3.28000 D 3.25000 D 3.25000 E D 3.19000 E F 3.13000 3 E F 3.11000 E F 3.10000 3 G F 3.07000 G 2.98000 1 G 2.98000 2 2.86000 H Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.2 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 30 0.002038 R-Square Coeff Var Root MSE TL Mean 0.981031 1.394316 0.045142 3.237556 -7 Number of Means Critical Range 08575 08659 Number of Means 14 15 07527 07911 08159 08336 08470 10 11 12 13 43 Critical Range 08938 08963 08728 08785 08833 08874 08908 -Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N AB A 3.97000 3 B 3.54000 3 C 3.42667 3 C 3.42667 D 3.28000 E D 3.25000 E D 3.25000 E F 3.19000 G F 3.13000 3 G 3.11000 G 3.10000 3 G 3.07000 H 2.98000 1 H 2.98000 2 I 2.86000 3 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.3 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 30 0.000273 R-Square Coeff Var Root MSE TL Mean 0.991666 2.003705 0.016533 0.825111 -7 Number of Means Critical Range 03140 03171 Number of Means 14 15 Critical Range 03273 03283 02757 02897 02988 03053 03102 10 11 12 13 03197 03218 03235 03250 03263 44 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N AB A 1.11333 2 B 1.00000 B 0.97333 0.96000 3 D 0.90000 D 0.89333 1 E 0.85667 3 F 0.81333 F 0.80667 3 G 0.77333 H 0.71333 3 I H 0.69000 3 I J 0.68000 J 0.65333 3 K 0.55000 3 C C Bảng số liệu thí nghiệm 1.3 Cơng thức MS-NAA1 MS-NAA2 MS-NAA3 MS-NAA4 MS-NAA5 MS-NAA6 MS-NAA7 MS-NAA8 MS-NAA9 MS-NAA10 Số mẫu theo dõi Chiều cao trung bình (cm) Số trung bình (số lá) Chiều dài trung bình (cm) Số rễ trung bình (số rễ) Chiều dài rễ trung bình (cm) Trọng lượng tươi trung bình (g) 10 4.05 4.86 1.05 4.05 1.70 0.89 10 4.50 5.40 1.17 4.50 1.89 0.99 10 3.92 4.70 1.02 3.92 1.64 0.86 10 10 3.74 3.15 4.48 3.78 0.97 0.82 3.74 3.15 1.57 1.32 0.82 0.69 10 4.50 5.40 1.17 4.50 1.89 0.99 10 5.00 6.00 1.30 5.00 2.10 1.10 10 4.35 5.22 1.13 4.35 1.83 0.96 10 4.15 4.98 1.08 4.15 1.74 0.91 10 3.50 4.20 0.91 3.50 1.47 0.77 MS-NAA11 10 3.24 3.89 0.84 3.24 1.36 0.71 MS-NAA12 10 3.60 4.32 0.94 3.60 1.51 0.79 10 3.13 3.76 0.81 3.13 1.32 0.69 10 2.99 3.59 0.78 2.99 1.25 0.66 10 2.52 3.02 0.66 2.52 1.06 0.55 MS-NAA13 MS-NAA14 MS-NAA15 45 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.4 Chiều cao trung bình Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 24 0.048506 R-Square Coeff Var Root MSE CC Mean 0.875912 5.757484 0.220240 3.825278 -10 Number of Means 11 12 4310 Critical Range 4331 4349 3711 3898 4018 4103 4166 4215 4253 4285 -Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N AB A 5.0367 B 4.4000 C B 4.1167 3 C D 3.8533 3 C D 3.8000 2 C D 3.7600 1 D 3.6933 3 E D 3.6600 3 E D 3.5500 3 E D 3.5000 E 3.2800 E 3.2533 Trọng lượng trung bình Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 24 0.002125 R-Square Coeff Var Root MSE TL Mean 0.866570 6.047806 0.046098 0.762222 46 10 Number of Means 11 12 Critical Range 07768 08159 08410 08587 08719 08822 08903 08968 09022 09066 09102 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N AB A 1.00667 B 0.87667 C B 0.82000 3 C D 0.76667 3 C D 0.75667 2 C D 0.74667 1 C D E 0.73667 3 F D E 0.73000 3 F D E 0.71000 3 F D E 0.69667 E 0.65333 0.64667 F F Bảng số liệu thí nghiệm 1.4: Cơng thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 Chiều cao trung bình (cm) Số mẫu theo dõi Số trung bình (số lá) Chiều dài trung bình (cm) Số rễ trung bình (số rễ) Chiều dài rễ trung bình (cm) Trọng lượng tươi trung bình (g) 10 3.96 4.56 2.09 3.36 1.49 0.78 10 4.61 5.31 2.44 3.92 1.74 0.91 10 4.35 5.00 2.30 3.69 1.64 0.86 10 5.30 6.10 2.80 4.50 2.00 1.05 10 3.98 4.58 2.10 3.38 1.50 0.79 10 3.87 4.45 2.04 3.29 1.46 0.77 10 4.03 4.64 2.13 3.42 1.52 0.80 10 3.82 4.39 2.02 3.24 1.44 0.76 10 3.71 4.27 1.96 3.15 1.40 0.74 10 3.66 4.21 1.93 3.11 1.38 0.72 10 3.43 3.95 1.81 2.92 1.30 0.68 10 3.45 3.97 1.82 2.93 1.30 0.68 47 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.5 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.014778 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.2429 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.998973 3.501040 0.121564 3.472222 -Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 7.51667 CT3 B 2.90000 CT2 C 0.00000 CT1 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.6 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.025687 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.2916 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.368526 2.301196 0.160271 6.964667 -Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 7.0867 CT2 A 7.0767 CT5 A 6.9167 CT4 A 6.9100 CT3 A 6.8333 CT1 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.7 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 48 10 Error Mean Square 0.005867 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.1393 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.999510 2.701417 0.076594 2.835333 -Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 7.13000 CT5 B 5.01000 CT4 C 2.03667 CT3 D 0.00000 CT2 D 0.00000 CT1 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.8 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.009244 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.1921 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.998145 4.134411 0.096148 2.325556 -Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 4.44667 CT3 B 2.53000 CT2 C 0.00000 CT1 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.9 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10 0.026473 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference R-Square Coeff Var 49 Root MSE 0.296 N Mean 0.300634 3.659062 0.162706 4.446667 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 4.5667 CT5 A 4.5200 CT3 A 4.4367 CT4 A 4.3800 CT2 A 4.3300 CT1 10 Phân tích thống kê SAS thí nghiệm 1.10 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.014167 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.2165 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.997441 4.020169 0.119024 2.960667 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 5.36667 CT5 B 4.24667 CT4 C 3.57667 CT3 D 1.61333 CT2 E 0.00000 CT1 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước [1] Cung Hoàng Phi Phượng (2007) Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời nhân giống lan Hồ điệp lai (Phalaenopsis hybrid) Báo cáo nghiệm thu đề tài [2] Nguyễn Thị Sơn (2014) Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1274-1282 [3] Vũ Ngọc Lan (2013) Nhân giống in vitro loài lan địa Dendrobium nobile Lindl Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 7: 917-925 Tài liệu nước [4] Bihua Chen (2014), Micropropagation of the Endangered Medicinal Orchid, Dendrobium officinale Life Science Journal 11(9) [5] Chen Zhao-gui, TAN Jun (2006) Effects of Different Hormone Proportions on Tissue Culture of Dendrobium Officinale Journal of Huizhou University 2006: 03 [6] Li Hong-lin,ZAN Yan-yan,YANG Bo (2012) Tissue Culture of Dendrobium officinale Kimura et Migo [7] Manuel L Robert, José Luis Herrera-Herrera, Gastón Herrera-Herrera, Miguel Ángel Herrera-Alamillo, and Pedro Fuentes-Carrillo A New Temporary Immersion Bioreactor System for Micropropagation Methods in Molecular Biology, vol 318: Plant Cell Culture Protocols, Second Edition Edited by: V M Loyola-Vargas and F Vázquez-Flota © Humana Press Inc., Totowa, NJ [8] Norazlina Noordin (2014), Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni through temporary immersion bioreactor system [9] Sondahl M P., Nakamicra F., Medincefilho M P., Carvollho A., Fazuou L C., and Caslo W M.,1989 Coffee Handbook of Plant Cell Culture Volumen III chapter 21 [10] Teisson, C and Alvard, D (1995) A new concept of plant in vitro cultivation liquid medium: temporary immersion, in Current Issues in Plant Molecular and [11] 51 Cellular Biology (Terzi, M., Cella, R., and Falavigna, A., eds.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 105–110 [12] Xia L, Liu X, Guo H, Zhang H, Zhu J, Ren F (2012) Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale (Tiepishihu) in vitro Journal of Functional Foods 2012;4:294-301 [13] Xiang L, Sze CWS, Ng TB, Tong Y, Shaw PC, Tang CWS, Zhang YBK (2013) Polysaccharides of Dendrobium officinale inhibit TNF-α-induced apoptosis in A-253 cell line Inflammation Research 2013;62:313-24 [14] Zheng Zhi-ren,ZHU Jian-hua,LI Xin-guo,LOU Yu-xia,LI Wan-kui (2008) Culture in vitro and rapid propagation of Dendrobium officinale Tài liệu internet www.thachhoc.net http://www.hcmbiotech.com.vn/vi/news/tin-khoa-hoc/buoc-dau-ung-dung-thanhcong-he-thong-nuoi-cay-ngap-chim-tam-thoi-trong-nhan-giong-cay-kieng-laspathiphyllum-sensation-68.html 52