Tạo chủng vi khuẩn escherichia coli biểu hiện đồng thời enzyme acyl thioesterase 2 alt2 và methylketone synthase 1 đột biến shmks1g129w có khả năng tổng hợp các 2 methylketone chuỗi carbon ngắn

THÀNH ĐỒN SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH VƢỜN ƢƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Escherichia coli BIỂU HIỆN ĐỒNG THỜI ENZYME ACYL THIOESTERASE (ALT2) VÀ METHYLKETONE SYNTHASE ĐỘT BIẾN (ShMKS1G129W) CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CÁC 2METHYLKETONE CHUỖI CARBON NGẮN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: KHUẤT LÊ UYÊN VY CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ THÀNH ĐỒN SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH VƢỜN ƢƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Escherichia coli BIỂU HIỆN ĐỒNG THỜI ENZYME ACYL THIOESTERASE (ALT2) VÀ METHYLKETONE SYNTHASE ĐỘT BIẾN (ShMKS1G129W) CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP CÁC 2METHYLKETONE CHUỖI CARBON NGẮN Thủ trƣởng Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên chữ ký) KHUẤT LÊ UYÊN VY MỤC LỤC TÓM TẮT i ABSTRACT i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG BIỂU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hợp chất methylketone 1.1.1 Định nghĩa hợp chất methylketone 1.1.2 Sự diện vai trò methylketone sinh giới 1.1.2.1 Sự diện vai trò methylketone thực vật 1.1.2.2 Sự diện vai trò methylketone động vật 1.1.2.3 Sự diện vai trò methylketone vi sinh vật 1.2 Ứng dụng hợp chất methylketone đời sống 1.2.1 Methylketone chất tạo hƣơng 1.2.2 Ứng dụng tiềm methylketone sản xuất nhiên liệu sinh học5 1.3 Con đƣờng sinh tổng hợp methylketone thực vật 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc 1.4.1 Các nghiên cứu gene mã hóa enzyme tham gia đƣờng sinh tổng hợp methylketone chuỗi ngắn 1.4.2 Các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật biến dƣỡng (metabolic engineering) để thiết kế cải tiến chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp methylketone 1.5 Các chủng vi khuẩn E coli đƣợc sử dụng đề tài 12 1.5.1 Chủng vi khuẩn E coli TOP10 12 1.5.2 Chủng vi khuẩn E coli C41 (DE3) 13 1.6 Hệ thống vector Duet pETDuet-1 13 Chƣơng 2-VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP 15 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 2.1.1 Thời gian 16 2.1.2 Địa điểm 16 2.2 Dụng cụ thiết bị 16 2.3 Vật liệu sinh học hóa chất 16 2.3.1 Vật liệu sinh học 16 2.3.2 Hóa chất – Mơi trƣờng 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Thiết kế đoạn gBlock ALT2-RBS-ShMKS1G129W 19 2.4.2 Thiết kế mồi cho phản ứng PCR nhân gene mục tiêu 21 2.4.3 Nhân đoạn gene mục tiêu kỹ thuật PCR 22 2.4.4 Phƣơng pháp chèn trình tự gene mục tiêu vào vùng tạo dòng MCS1 vector pETDuet1 23 2.4.4.1 Thu nhận đoạn gene mục tiêu có hai đầu so le 5’ NcoI 3’ BamHI 24 2.4.4.2 Cắt mở vòng vector pETDuet-1 với NcoI BamHI 25 2.4.4.3 Chèn gene mục tiêu (ALT2_optE ShMKS1G129W_optE ALT2-RBS-ShMKS1G129W) vào vector pETDuet-1 25 2.4.5 Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc 26 2.4.6 Kiểm tra tính xác plasmid mang gene mục tiêu 27 2.4.7 Phƣơng pháp khảo sát biểu protein ShMKS1G129W ALT2 số điều kiện cảm ứng khác 28 2.4.10.1 Phƣơng pháp nuôi cấy cảm ứng biểu protein ALT2 ShMKS1G129W 28 2.4.10.2 Phá vỡ tế bào sóng siêu âm 29 2.4.10.3 Kiểm tra biểu ALT2 ShMKS1G129W phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 29 2.4.8 Phƣơng pháp xác định thành phần methylketone đƣợc sinh E coli C41(DE3)/pETDuet-1-ALT2-RBS-ShMKS1G129W 30 Chƣơng - KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN 31 3.1 Thiết kế đoạn gBlock ALT2-RBS-ShMKS1G129W 32 3.2 Tạo dòng gene ALT2_optE ShMKS1G129W_optE ALT2-RBSShMKS1G129W vào vùng MCS1 vector pETDuet-1 35 3.2.1 PCR Nhân gene ALT2_optE ShMKS1G129W_optE kỹ thuật 35 3.2.2 Cắt mở vòng vector pETDuet-1 với tổ hợp hai enzyme cắt giới hạn NcoI BamHI 36 3.2.3 Chèn gene mục tiêu (ALT2_optE, ShMKS1G129W_optE ALT2RBS-ShMKS1G129W) vào vector pETDuet-1 sàng lọc khuẩn lạc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa gene mục tiêu 37 3.2.3.1 Sàng lọc dòng tế bào plasmid pETDuet-1-ALT2_optE phƣơng pháp PCR khuẩn lạc 37 3.2.3.2 Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid pETDuet-1-ShMKS1G129W_optE phƣơng pháp PCR khuẩn lạc 38 3.2.3.3 Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid pETDuet-1-ALT2-RBSShMKS1G129W phƣơng pháp PCR khuẩn lạc 39 3.2.3.4 Kiểm tra tính xác plasmid tái tổ hợp 40 3.3 Kiểm tra biểu protein ALT2_optE ShMKS1G129W_optE kỹ thuật SDS-PAGE 44 3.4 Phân tích biểu protein ALT2 ShMKS1 điều kiện cảm ứng khác phƣơng pháp SDS-PAGE 46 3.5 Xác định thành phần methylketone dịch nuôi cấy cảm ứng 49 Chƣơng - KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 55 4.1 Kết luận 56 4.2 Đề nghị 57 TÓM TẮT 2-Methylketone hợp chất hữu có chứa nhóm chức keto nguyên tử carbon thứ hai Nhóm hợp chất chất tạo hƣơng quan trọng ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Các nhà khoa học hƣớng tới việc ứng dụng methylketone để sản xuất nhiên liệu sinh học, nhiên, hỗn hợp methylketone chuỗi trung bình (C11 C13) có trị số kích nổ cetan cao nhƣng nhiệt độ nóng chảy tƣơng đối cao, điều gây bất lợi cho việc sản xuất nhiên liệu lạnh từ methylketone Hỗn hợp methylketones chuỗi ngắn (C7 C9) với điểm nóng chảy thấp phù hợp để pha trộn với dầu diesel Hƣớng tới tổng hợp methylketone chuỗi ngắn hồn tồn đƣờng chuyển hóa sinh học, nghiên cứu này, tạo chủng vi khuẩn E coli biểu đồng thời enzyme acyl thioesterase (ALT2) methylketone synthase đột biến (ShMKS1G129W) có khả tổng hợp 2-methylketone chuỗi carbon ngắn Enzyme ALT2 có khả thủy phân liên kết thioester 3-ketoacyl-ACP ngắn chuỗi – hợp chất trung gian sinh tổng hợp acid béo – thành 3-ketoacid chuỗi ngắn tƣơng ứng Enzyme ShMKS1G129W – phiên đột biến enzyme ShMKS1, đó, amino acid Glycine vị trí 129 đƣợc thay thành Tryptophan – khử carboxyl 3-ketoacid chuỗi ngắn thành 2- methylketone chuỗi ngắn Kết phân tích so sánh ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy cảm ứng đến biểu protein ShMKS1G129W ALT2 SDS-PAGE cho thấy protein biểu tốt pha tan đƣợc cảm ứng với IPTG 0.25 mM 18oC 16 Bằng kỹ thuật sắc ký khí với đầu dò FID (GC-FID), phần lớn methylketone sinh dịch môi trƣờng nuôi cấy chủng E coli biểu đồng thời hai enzyme ALT2 ShMKS1G129W đƣợc xác định 2-heptanone (C7) 2-nonanone (9C) ABSTRACT 2-Methylketones are organic compounds containing a keto functionality on the second carbon These compounds are of importance to the flavor and fragrance in the food industry and cosmetics Medium-chain methylketones (mix of C11 and C13 methylketones) have favorable cetane numbers but a relatively high melting i point, which is a disadvantage for cold-temperature fuel properties A mixture of short-chain methylketones (mix of C7 and C9 methylketones) with lower melting point will be more appropriate for blending with petroleum-based diesel Towards the synthesis of the short-chain methylketone at industrial scale, in this study, we cloned and coexpressed acyl thioesterase (ALT2) enzyme and mutant methylketone synthase (ShMKS1G129W) enzyme in Escherichia coli C41(DE3) cells for producing short-chain methylketones The ALT2 enzyme isolated from Arabidopsis thaliana could hydrolyze short-chain 3-ketoacyl-ACP intermediates in the fatty acid biosynthetic pathway into the corresponding short-chain 3-ketoacid ShMKS1G129W enzyme – a single amino acid substitution mutation at Glycine129 of ShMKS1 with Tryptophan – has a decarboxylase activity towards shortchain 3-ketoacid, resulting in the production of short-chain 2-methylketones Methylketones released in the growth medium of E coli coexpressing ALT2 and ShMKS1G129W were extracted by hexane and analyzed by gas chromatography with the flame ionization detector (GC-FID) The results showed that the E coli C41(DE3) cells coexpressing ALT2 and ShMKS1G129W recombinantly produced 2-heptanone (C7) and 2-nonanone (9C) in the spent medium when induced with 0.25 mM IPTG at 18oC for 16 hours ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACP Acyl Carrier Protein ALT Acyl-lipid Thioesterase DNA Deoxyribose Nucleic acid CoA Coenzyme A E coli Escherichia coli dNTP deoxyNucleotide Triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GC-FID Gas Chromatography - Flame Ionization Detector IDT Integrated DNA Technology IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside LB Luria Bertani MCS Multiple Cloning Site MKS Methylketone Synthase OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme SDS - PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TAE Tris-Acetate-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine Tm Melting temperature UV UltraViolet iii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Các mồi đƣợc thiết kế sử dụng cho việc nhân gene mục tiêu Nucleotide gạch chân đƣợc thêm vào để tăng hiệu cắt RE Nucleotide in đậm trình tự nhận biết RE (NcoI: CCATGG; BamHI: GGATCC) 22 Bảng 2 Thành phần phản ứng PCR sử dụng Phusion High-Fidelity DNA polymerase 22 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng Phusion High-Fidelity DNA polymerase 23 Bảng Chi tiết nhiệt độ bắt cặp thời gian kéo dài cho gene mục tiêu 23 Bảng Thành phần phản ứng cắt gene mục tiêu enzyme cắt giới hạn 25 Bảng Thành phần phản ứng cắt vector pETDuet-1bằng enzyme cắt giới hạn 25 Bảng Thành phần phản ứng nối đoạn genemục tiêu vào vector pETDuet-1 .26 Bảng Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc 26 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuẩn lạc 26 Bảng 10 Chi tiết nhiệt độ bắt cặp thời gian kéo dài cho gene mục tiêu chèn vào vector 27 Bảng 11 Thành phần phản ứng cắt kiểm tra kích thƣớc plasmid 27 Bảng Kết đo độ đậm vạch protein ALT2_optE ShMKS1G129W_optE gel SDS-PAGE điều kiện (1), (5), (3) (7) 47 Bảng Kết đo độ đậm vạch protein ALT2_optE ShMKS1G129W_optE gel SDS-PAGE điều kiện (1), (5), (3) (7) .48 Bảng 3.3 Hàm lƣợng 2-methylketone có dịch chiết hexan môi trƣờng nuôi cấy chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp methylketone…………53 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Một số dạng methylketone tự nhiên Hình Con đƣờng sinh tổng hợp methylketone thực vật [42] Hình Con đƣờng sinh tổng hợp acid béo thực vật [31] Hình Con đƣờng sinh tổng hợp methylketone tế bào E.coli siêu biểu hai gene ShMKS1 ShMKS2 từ chất ban đầu glucose 10 Hình Bản đồ vector pET-Duet1 14 Hình Thang DNA chuẩn 1kb 0.8% TAE gel agarose đƣợc nhuộm ethidium bromide 17 Hình 2 Hình thang prestained protein đƣợc nhuộm Coomassie Brilliant Blue 1% 18 Hình Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 19 Hình Tần suất ba mã hóa đƣợc sử dụng trình tự mã hóa protein (CDS) E coli a Bộ ba mã hóa có tần số sử dụng thấp đƣợc đánh dấu màu đỏ (tần số sử dụng nhỏ 5‰), màu tím (tần số sử dụng 5-10‰) xanh da trời (tần số sử dụng 10-12‰) [12] 20 Hình Cấu trúc đoạn gBlock“ALT2-RBS-ShMKS1G129W” 21 Hình Quy trình tạo dịng gene mục tiêu vào vector pETDuet-1 24 Hình Trình tự gene ALT2 tối ƣu hóa codon phù hợp với tế bào chủ E coli đƣợc trình bày so sánh với gene ALT2 từ Arabidopsis thaliana Bộ ba mã hóa có tần số sử dụng thấp đƣợc đánh dấu màu đỏ (tần số sử dụng nhỏ 5‰), màu tím (tần số sử dụng 5-10‰) xanh da trời (tần số sử dụng 10-12‰) 32 Hình Trình tự gene ShMKS1G129W tối ƣu hóa codon phù hợp với tế bào chủ E coli đƣợc trình bày so sánh với gene ShMKS1G129W từ Solanum harochaites Bộ ba mã hóa có tần số sử dụng thấp đƣợc đánh dấu màu đỏ (tần số sử dụng nhỏ 5‰), màu tím (tần số sử dụng 5-10‰) xanh da trời (tần số sử dụng 10-12‰) 33 Hình 3 Cấu tạo trình tự gBlock ALT2-RBS-ShMKS1G129W Đoạn ký tự in đỏ trình tự ALT2_optE Đoạn ký tự in xanh trình tự ShMKS1G129W_optE Cặp mồi F1 R1 dùng để nhân đoạn ALT2_optE từ gBlock ALT2-RBSShMKS1G129W Cặp mồi F2 R2 dùng để nhân đoạn ShMKS1G129W_optE từ gBlock ALT2-RBS-ShMKS1G129W 34 Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn ALT2_optE 35 Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn ShMKS1G129W_optE 36 Hình Kết điện di sản phẩm cắt vector pETDuet-1 37 Hình Kết sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10/pETDuet-1-ALT2_optE phản ứng PCR khuẩn lạc 38 Hình Kết sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10/pETDuet-1ShMKS1G129W_optE phản ứng PCR khuẩn lạc 39 v 40 Williams, C.G., On the constitution of the essential oil of rue Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1858 148: p 199-204 41 Williams, H.J., S.B Vinson, and G.W Frankie, Chemical content of the dorsal mesosomal gland of two Xylocopa species (Hymenoptera: Anthophoridae) from Costa Rica Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1987 86(2): p 311-312 42 Yu, G., et al., Enzymatic functions of wild tomato methylketone synthases and Plant physiology, 2010 154(1): p 67-77 43 Zhang, S., G Zubay, and E Goldman, Low-usage codons in Escherichia coli, yeast, fruit fly and primates Gene, 1991 105(1): p 61-72 PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CÁC PLASMID TÁI TỔ HỢP Kết giải trình tự plasmid pETDuet-1-ALT2 với mồi ngược DuetDOWN1 Kết giải trình tự plasmid pETDuet-1-ShMKS1G129W với mồi ngược DuetDOWN1 Kết giải trình tự plasmid pETDuet-1-ALT2-RBS- ShMKS1G129W với mồi xuôi Upstream PHỤ LỤC KẾT QUẢ SẮC KÝ GC-FID Kết chạy sắc ký GC-FID dịch nuôi cấy xử lý nhiệt tế bào E coli C41(DE3) biểu protein ALT2_optE Kết chạy sắc ký GC-FID dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt tế bào E coli C41(DE3) biểu đồng thời protein ALT2_optE ShMKS1G129W_optE Kết chạy sắc ký GC-FID chất chuẩn 2-methylketone Kết xác định hàm lượng 2-methylketone có dịch chiết hexan mơi trường ni cấy chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp methylketone SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI - Dạng kết nghiên cứu đề tài - QUY TRÌNH TẠO CHỦNG VI KHUẨN E coli MANG VECTOR pETDuet-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỒNG BIỂU HIỆN HAI PROTEIN KHÁC NHAU (Hai gene mã hóa protein nằm vùng tạo dòng (MCS1 MCS2) vector pETDuet-1) Nguyên tắc chọn cặp enzyme cắt giới hạn sử dụng qui trình tạo dịng gBlock vào vector pETDuet-1 Enzyme cắt giới hạn (RE) đƣợc sử dụng để cắt mở vòng vector pETDuet-1 cắt tạo đầu dính cho gBlock nhằm mục đích thực phản ứng nối gBlock vào vector pETDuet-1 Nguyên tắc chọn hai enzyme cắt giới hạn sử dụng qui trình tạo dòng gene mục tiêu vào vector pETDuet-1 nhƣ sau:  RE1 RE2 phải nằm vùng tạo dịng (MCS1 MCS2)  RE1 RE2 khơng diện trình tự gBlock  RE1 RE2 phải có hiệu suất cắt cao tốt dùng chung loại đệm ủ Sử dụng công cụ trực tuyến RestrictionMapper version (www.restrictionmapper.org) để chọn hai RE phù hợp với tiêu chí Thiết kế đoạn gBlock mang hai gene khác Đoạn gBlock đƣợc thiết kế nhƣ đƣợc mơ tả hình 1, đầu 3’ trình tự gene thứ nối với đầu 5’ gene thứ hai thông qua đoạn nối trình tự gắn ribosome (RBS- Ribosome Binding Site) vector pETDuet-1 (5’TTAAGAAGGAGATATAC 3’) Trình tự gắn ribosome có vai trò quan trọng việc biểu đồng thời hai protein dƣới điều khiển T7 promoter Ngoài ra, hai đầu đoạn gBlock đƣợc gắn thêm trình tự nhận biết vị trí cắt enzyme cắt giới hạn RE1 đầu 5’ RE2 đầu 3’ nhằm hỗ trợ cho việc tạo dịng trình tự gBlock vào vùng MCS1/MCS2 vector pETDuet-1 Trình tự gBlock sau đƣợc đặt hàng tổng hợp IDT (USA) Hình Cấu trúc đoạn gBlock Thu nhận đoạn gBlock có hai đầu dính 5’ RE1 3’ RE2 Đoạn gBlock có gắn trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn RE1 đầu 5’ RE2 đầu 3’ đƣợc cắt với tổ hợp hai enzyme cắt giới hạn RE1 RE2 Phản ứng cắt đƣợc thiết lập với thành phần nhƣ đƣợc mô tả bảng Bảng Thành phần phản ứng cắt gBlock enzyme cắt giới hạn Thành phần Thể tích (µl) Nƣớc loại nuclease Thêm vào cho đủ 15 µl 10X Buffer 1.5 gBlock x Nồng độ cuối 1X 0.5 – µg RE1 (10U/μl) 0.5 5U/μl RE2 (10U/μl) 0.5 5U/μl Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc ủ 37oC Phản ứng đƣợc dừng lại cách bất hoạt enzyme 80oC 10 phút Sản phẩm cắt đƣợc chạy điện di gel agarose % sau đƣợc đƣợc thu hồi kit GeneJET Gel Extraction (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Cắt mở vòng vector pETDuet-1 RE1 RE2 Để thu nhận vector pETDuet-1 mở vịng có hai đầu dính tƣơng ứng với RE1 RE2, vector pETDuet-1 đƣợc cắt với thai enzyme cắt giới hạn đƣợc cắt với tổ hợp hai enzyme cắt giới hạn RE1 RE2 Phản ứng cắt đƣợc thiết lập với thành phần nhƣ đƣợc mô tả bảng Bảng Thành phần phản ứng cắt vector pETDuet-1 enzyme cắt giới hạn Thành phần Nƣớc loại nuclease 10X Buffer vector pETDuet-1 RE1 (10U/μl) RE2 (10U/μl) Nồng độ cuối Thể tích (µl) Thêm vào cho đủ 30 µl 3.0 x 0.5 0.5 1X 0.5 – µg 5U/μl 5U/μl Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc ủ 37oC Phản ứng đƣợc dừng lại cách bất hoạt enzyme 80oC 10 phút Sản phẩm cắt đƣợc chạy điện di gel agarose % sau đƣợc đƣợc thu hồi kit GeneJET Gel Extraction (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Chèn gBlock vào vector pETDuet-1 Enzyme T4 DNA ligase xúc tác hình thành liên kết phosphodiester đầu 5’P đầu 3’OH hai đoạn DNA Phản ứng làm cho đoạn gBlock có hai đầu dính nối vào vector pETDuet-1 cắt mở vịng có hai đầu dính Bảng Thành phần phản ứng nối đoạn gBlock vào vector pETDuet-1 Nồng độ cuối Thành phần Thể tích (µl ) Nƣớc loại nuclease Thêm vào cho đủ 10 µl gBlock có hai đầu dính Y µl gBlock : vector (tỷ lệ mol) Vector pETDuet-1 cắt mở vịng X µl 20-100 ng 10X T4 DNA Ligase Buffer T4 DNA Ligase 5U/μl 1.0 µl 0.2 µl 1X 1U Hỗn hợp phản ứng nối đƣợc ủ 22oC Sau đó, hỗn hợp phản ứng nối đƣợc biến nạp vào tế bào E coli TOP10 khả nạp Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E coli TOP10 khả nạp Chuẩn bị tế bào E coli khả nạp: Tế bào E coli đƣợc trải đĩa môi trƣờng LB đƣợc nuôi ủ 37oC qua đêm Một khuẩn lạc đơn đƣợc chọn để chuyển vào ml môi trƣờng LB lỏng nuôi hoạt hóa qua đêm 37oC với tốc độ lắc 200 vịng/ phút Sau đó, 50 µl dịch ni cấy hoạt hóa đƣợc chuyển sang 50ml LB lỏng, đƣợc ni cấy lắc 37oC với tốc độ 200 vòng/phút đến OD600nm đạt 0.3-0.4 Ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 5000 vòng/phút 10 phút 4oC, thu sinh khối tế bào huyền phù sinh khối 10ml CaCl2 0.05mM đƣợc khử trùng giữ lạnh đá Dịch huyền phù tiếp tục đƣợc giữ lạnh đá Ly tâm dịch huyền phù với tốc độ 5000 vòng/ phút 10 phút 4oC để thu tế bào huyền phù tế bào lại tối đa 5ml CaCl2 0.05mM chứa 15% glycerol đƣợc khử trùng giữ lạnh Chia vào eppendorf 100 μl dịch tế bào khả nạp giữ đông -80oC Biến nạp plasmid vào tế bào E coli khả nạp: Cho μl hỗn hợp sản phẩm nối vào 50ul tế bào khả nạp, ủ đá 30 phút Thực song song mẫu đối chứng khơng bổ sung plasmid Sau đó, sốc nhiệt 42oC 90 giây ủ lại đá phút Bổ sung thêm 1ml môi trƣờng LB lỏng nuôi phục hồi 37oC Dịch nuôi phục hồi đƣợc ly tâm 8000 vòng/phút phút để thu sinh khối, tái huyền phù sinh khối 100μl dịch ni cấy cịn lại nhẹ nhàng pipetman Dịch huyền phù tế bào đƣợc trải đĩa mơi trƣờng LB rắn có bổ sung kháng sinh ampicillin với nồng độ cuối 100μg/ml, nuôi ủ 37oC 14 - 16 Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp pETDuet-1-gBlock phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Dƣới tác dụng nhiệt độ cao, màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ plasmid đƣợc giải phóng làm khn cho phản ứng PCR Phản ứng PCR đƣợc thực với cặp mồi xuôi bắt cặp bổ sung gBlock mồi ngƣợc bắt cặp bổ sung vector pETDuet-1 (hoặc ngƣợc lại) Bảng Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ cuối Nƣớc loại nuclease 10X Standard Taq Buffer 10mM dNTPs 10µM Mồi xi 10µM Mồi ngƣợc Khuẩn lạc Taq DNA Polymerase 5UI/ml 9.90 1.25 0.25 0.50 0.50 1X 100 µM 0.2 µM 0.2 µM 0.10 µl 0.5 U Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuẩn lạc Giai đoạn Khởi đầu Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài mở rộng Nhiệt độ 95oC 95oC X oC 72oC 72oC 4oC Thời gian 30s 20s 20s 60s/1kb phút 15 phút Chu kì 35 Dịng tế bào E coli TOP10 đƣợc biến nạp thành công plasmid pETDuet-1gBlock đƣợc nuôi nhân sinh khối để tách chiết plasmid pETDuet-1-gBlock kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Kiểm tra tính xác plasmid pETDuet-1-gBlock Để dự đốn tính xác plasmid vừa tách chiết, plasmid pETDuet-1gBlock đƣợc cắt với enzyme cắt giới hạn RE1 RE2 Bảng Thành phần phản ứng cắt kiểm tra kích thƣớc plasmid Thành phần H2O cất hai lần Plasmid 1X Buffer NcoI (10U/μl) BamHI (10U/μl) Thể tích (µl) 10.5μl 2µl 1.5ul 0.5 ul 0.5 ul Nồng độ cuối 1X 5U/μl 5U/μl Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 37oC dừng phản ứng cách bất hoạt enzyme 80oC 10 phút Sản phẩm cắt đƣợc điện di gel agarose 1% so sánh với thang DNA chuẩn để kiểm tra kích thƣớc Ni cấy cảm ứng đồng biểu hai protein Plasmid pETDuet-1-gBlock cho sản phẩm cắt có kích thƣớc nhƣ dự đốn đƣợc gửi giải trình tự cơng ty Macrogen-Hàn quốc với mồi bắt cặp bổ sung với trình tự vector pETDuet-1 đƣợc đề xuất bời nhà sản xuất (Invitrogen) Plasmid pETDuet-1-gBlock xác sau đƣợc biến nạp vào tế bào biểu E coli C41(DE3) Những khuẩn lạc phát triển đƣợc mơi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 100µg/ml đƣợc chọn lọc để ni cấy cảm ứng biểu Khuẩn lạc đơn dòng tế bào E coli C41(DE3)/ pETDuet-1-gBlock đƣợc cấy vào ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ cuối 100 µg/ml đƣợc ni hoạt hóa qua đêm máy lắc ổn nhiệt 37˚C với tốc độ 200 vòng/phút Cấy chuyền 0,1 ml dịch ni cấy sang 30 ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ cuối 100 µg/ml tiếp tục nuôi cấy 37˚C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Khi giá trị OD 600 đạt 0,6-0.8, bổ sung IPTG để cảm ứng biểu hai protein, tiếp tục nuôi cấy với thời gian nhiệt độ phù hợp để biểu protein sinh tổng hợp sản phẩm SƠ ĐỒ TẠO DÒNG HAI GENE KHÁC NHAU TRÊN CÙNG MỘT VÙNG TẠO DÒNG (MCS1 HOẶC MCS2) CỦA VECTOR pETDuet-1