Đánh giá khả năng bảo vệ của protein tái tổ hợp mbp vt2eb như là một vaccin trong phòng bệnh phù đẩu do vi khuẩn e coli gây ra trên heo sau cai sữa 2

ei OS THANH PHO HO CHi MINH SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG * ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÁNH GÍA KHẢ NĂNG BẢO VỆ CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB NHƯ LÀ MỘT VACCIN TRONG PHÒNG BỆNH, PHÙ ĐẦU DO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GAY RA TRÊN HEO SAU CAI SỮA Chủ nhiém dé tai: TS NGUYEN NGOC HAI Khoa Chăn Nuôi - Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM - 2003- .* THUYẾT MINH ĐỀ TÀI oe NGHIÊN CUU KHOA HOC NAM 2003 - 2004 ( Cho để tài khoa học tự nhiên khoa học xã hội) Tên để tài: Đánh giá khả bảo vệ protein tái | Mã số tổ hợp MBP-VT2eB vaccin phòng bệnh phù đầu vi khuẩn Escherichia coli gây heo sau _ | Số đăng ký cai sữa Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ tháng 01/2003 đến 12/2004) Chỉ số phân loại Cấp quản lý: TP ñ Nghành U Q.H a Thuộc chương trình (nếu có) § Thuộc hướng ưu tiên - Cơ quan quần lý: Sở Khoa học, Công nghệ Mơi trường Tp Hồ Chí Minh - Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh - Địa chỉ: Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh - Điện thoại: 8966780 — 8961709 - Chủ nhiệm để tài: Nguyễn Ngọc Hải - Học vị: Tiến sỹ Ngành chuyên môn: Thú y - Địa chỉ: 27/10 C Dương văn Cam, Phường Linh Tây, Quận Thủ Đức, Tp Hỗ Chí Minh - Điện thoại: 8961709 (cq), 7200985 (m) - Cơ quan phối hợp chính: - Trung tâm Thuốc Thú y TW2 (NAVETCO) ¡ _ - Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh PHIẾU ĐĂNG KÝ ĐỀ TÀI Tên để tài: Đánh gía khả bảo vệ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB vaccin phòng bệnh phù đầu vi khuẩn Escherichia coli gầy heo sau cai sữa Chủ nhiệm để tài: TS NGUYEN NGOC HAI Giảng viên Khoa Chăn nuôi ~ Thú Y, Trường Đại Học Nông Số đăng ký Mã số đề tài Lâm Chỉ số phân loại Cơ quan chủ ta để tài: Trường Đại Học Nông Lâm ~ Thủ Đức — Tp Hỗ Chí Minh Địa chỉ: Thủ Đức — Tp Hỗ Chí Minh Số ĐT: 8966780 Số tài khoản: Cơ quan quản lý đề tài: Sở Khoa Học Công Nghệ Môi Trường Tp Hồ Chi Minh Số ĐT: 8201425 Bia chỉ: Điện Biên Phủ, Quận 1, Tp Hồ Chí Minh Dự kiến kinh phí (đồng):197.300.000 đồng Nguôn cấp: Nhà Nước Thời gian nghiên cứu: 24 tháng Bắt đầu từ : 1/2003 Dự kiến kết thúc : 12/2004 Loại hình nghiên cứu Nghiên cứu | Nghiên cứu | Ci ứng dụng m Triển khai ' thực nghiệm | ¬ Cơ quan ứng dụng kết nghiên cứu: Lĩnh vực khoa học Tự Ngày ký: Y nhiên | cơng nghệ | nghiệp | hoc ¬¬ Xí nghiệp chăn ni heo, Xí nghiệp thuốc thú y Số hợp đồng (hoặc công văn yêu cầu): Kỹ thuật | Nơng | ¬ = ¬ Xã hội nhân văn ¬ “Tóm tắt nội dung nghiên cứu: - Cơ sở tiến hành nghiên cứu: ¢ Bénh pha dau vi khuẩn Escherichia coli bệnh truyễn nhiễm nguy hiểm xãy heo sau cai sữa Tý lệ bệnh lên đến 30-40% thường dẫn đến tử vong Tính chất dịch tế bệnh phức tạp, bệnh thường xuất đột ngột |' khơng thể dự báo Việc phịng bệnh chủ yếu dựa vào liệu pháp kháng sinh Điều làm cho việc phịng bệnh trở nên phức tạp hơn, khó khăn bị động khơng thể nắm hồn toàn đặc điểm kháng kháng sinh chủng vi khuẩn gây bệnh Do vậy, liệu pháp vaccin phòng bệnh ln xem Hì hướng chọn lựa thích hợp cho việc phịng chống bệnh truyền nhiễm có đặc điểm dịch tế phức tạp | bệnh phù đầu vi khuẩn Escherichia coli gay heo sau cai sữa Mặc dù có nghiên cứu vaccin phòng bệnh này, tại, giới Việt Nam chưa có vaccin thức áp dụng, tất cịn giai đoạn tầm tòi thử nghiệm Những nghiên cứu bước đầu cho thấy tạo kháng thể chống lại vi khuẩn gây bệnh thú nhờ vào việc sử dụng vi khuẩn bất hoạt, độc tố vero bị vơ hoạt hóa chất Nhưng liệu pháp gây tác động bất lợi sinh trưởng phát triễn thú tiêm chích Bệnh phù heo sau cai sữa gây độc tố vero (verotoxine: VT2e) dịng Z coli nhóm VTEC (verotoxinogene # col) Độc tố cấu tạo tiểu phân A có hoạt tính enzyme #ây chết tế bào tiểu phần B có vai trị giúp cho độc tố gắn lên thụ thể màng tế bào nội mô, tạo điều kiện để tiểu phần Á xâm nhập vào tế bào, ngăn cần trình tổng hợp protein tế bào làm chết tế bào Các nghiên cứu ban đầu cho thấy tiểu phân B kích thích thể thú tạo miễn dịch trung hòa độc tố vero dòng E coli gây phù sinh Việc tạo kháng thể đặc hiệu kháng tiểu phân B ngăn cần không cho độc tố gắn lên tế bào vậy, theo nguyên tắc trung hòa độc tố, độc tố tác dụng độc tế bào Kết thú bảo hộ chống lại bệnh Sử dụng protein tái tổ hợp tiểu phần B độc tố vero (protein MBP-VT2cB) cho phép tạo vaccin chống lại bệnh phù £, coli không phụ thuộc vào type kháng nguyên vi khuẩn E coi gây bệnh Những dịng E coli tái tổ hợp có mang đoạn gien tiểu phân B độc tố VT2e tạo nên lưu giữ dễ dàng thuận lợi Điểu cho phép việc triễn khai nghiên cứu - - Nội dung: Để tài tiến hành gồm nội dụng Sẵn xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB va tinh chế độc tố vero wv tái tổ Đánh giá khả dap ting miễn dịch tạo thú thí nghiệm protein hợp MBP-VT2eB + Đánh giá khả bảo hộ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB phù đầu E cølí gây heo sau cai sữa việc phòng bệnh Các bước tiến hành: vỉ Kiểm tra đánh giá sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB cia | số dòng khuẩn tái tổ hợp để lựa chọn dòng điểu kiện tối ưu cho việc sẩn xuất| protein tái tổ hợp Sử dụng cột sắc ký lực Amylose (Affinry Chromatography) để thui ị nhận protein tái tổ hợp tỉnh khiết - - -_ Khảo sát đáp ứng miễn dịch thú protein tái tổ hợp MBP-VT2eB lượng Đánh vero sử dụng đánh giá giá hiệu dong | | i | theo liểu| khác để lựa chọn liều sử dụng thích hợp Hàm lượng kháng thể sinhra| phần ứng trung hòa độc tố dòng tế bào vero bảo vệ protein tái tổ hợp chống lại việc công cường độc độc tố E coli gay phù sinh heo sau cai sữa Độc tế vero thu nhận, tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli gay phù tiêm cho heo theo duGng tinh | : mạch với liễu LD50 3ng/kg thể trọng | ! | i ị ị | | i | - Sản phẩm tạo tiêu kinh tế (Xã hội): (Thời gian triển khai vào sản xuất, hiệu kinh tế xã hội, dự kiến) « — Quy trình sẵn xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB dùng chế vaccin phòng bệnh £ coli gây phù heo sau cai sữa 2S Ngày thing 42 năm 2002 Ngày Chủ nhiệm để tài tháng năm 2002 Chủ nhiệm chương trình so n a { TS Nguyễn Ngọc Hải tháng 25 Ngày 12 ae Cơ Quan chủ trì es eg An none ên đóng dấu) vi3 năm 2002 Ngày tháng năm Cơ Quan quản lý (ký tên đóng dấu) 2002 H R-D THUYET MINH DE TÀI NGHIÊN CỨU PHAT TRIEN Biểu 02— KHCN Mã số [1] Ten aé tài: vaccin phòng bệnh phù đầu vỉ khuẩn |4| Chỉ số phân loại Escherichia coli gay heo sau cai sữa El "Thời gian thực : 24 tháng Số đăng ký | 3| Đánh gía khả bảo vệ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB [6 (Từ tháng 1/2003 đến tháng 12/2004) Cấp quản lý TP Oo Ngành n QH n 7| Thuộc chương trình œ |8j Thuộc hướng tu tiên: Phát triển nơng thơn: Chí Minh Cơ quan quản lý để tài: Sở Khoa Học Công Nghệ Môi Trường Tp.Hồ Cơ quan chủ trì để tài : Trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Địa : Thủ Đức - Thành Phố Hồ Chí Minh Số ĐT: 8966780 Số tài khoắn: Ngân Hàng Công Thương nhánh Chủ nhiệm để tài : NGUYEN NGOC HAI Học vị : Tiến Sĩ Ngành chuyên môn: Chuyên ngành Thú Y Địa chỉ: Khoa Chăn nuôi - Thú Y, Trường Đại Học Nông Lâm Điện thoại: 8961709 - 7200985 Cơ quan phối hợp: - -_ Hề Chí Minh Trung tém phan tích thí nghiệm Trường Đại học Nơng Lâm Thú Đức Tp Xí nghiệp Thuốc Thú Y TW2 hol Tinh hinh nghién cứu ngồi nước s Tỷ lệ bệnh lên đến 30-40% thường dẫn đến tử vong Tính chất dịch tể bệnh phức tạp, bệnh thường xuất đột ngột khơng thể dự báo Việc phịng bệnh chủ: yếu dựa vào liệu pháp kháng sinh Những nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hải ctv (Tìm hiểu nguyên nhân hội chứng thần kinh ~ phù mắt ổ heo sau cai sữa, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 2000) ghi nhận tượng lờn thuốc kháng sinh nghiêm trọng dòng E, coli phân lập heo sau cai sữa Trong thời gian gần bệnh tiếp tục ghỉ nhận Thành phế Hỗ Chí Minh nhiễu địa phương s Những nghiên cứu bước đầu cho thấy tạo kháng thể chống lại vi khuẩn gây bệnh thú nhờ vào việc sử dụng ví khuẩn bất hoạt, độc tố vero bị vơ hoạt hóa chất Nhưng liệu pháp gây tác động bất lợi sinh trưởng phát triển thú tiém chich (Gordon V.M va ctv., 1992; MacLead D.L va clv., 1991; Johansen M va ctv., 1997) ¢ Bénh phi trén heo sau cai sifa géy déc t6 vero (verotoxine: VT2e) ctla cic dong £ coli nhóm VTEC (verotoxinogene E cofi) Độc tố cấu tạo tiểu phần A có, hoạt tính enzyme gây chết tế bào tiểu phần B có vai trị giúp cho độc tố gắn lên thụ thể màng tế bào nội mô, tạo điểu kiện để tiểu phân A xâm nhập vào tế bào, ngăn cần trình tổng hợp protein tế bào làm chết tế bào Các nghiên cứu ban đầu cho thấy tiểu phần B kích thích thể thú tạo miễn dịch trung hòa độc tố vero dòng E coli gay phi sinh (Sylvia F va ctv., 1995; Mukherjee J ctv., 2002) Việc tao kháng thể đặc hiệu kháng tiểu phần B ngăn cần không cho độc tố gắn lên tế bào vậy, theo nguyên tắc trung hòa độc tố, độc tố tác dụng độc tế” bào Kết thú bảo hộ chống lại bệnh fi] Mục tiêu để tài Xây dựng quy trình sắn xuất protcin tái tổ hợp MBP-VT2eB Xác định khả ứng dụng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB phù đầu E coli gay để chế vaccin phòng bệnh, i Nội dung phương pháp nghiên cứu - Nội dung: Khảo sát tính ổn Sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tỉnh chế độc tố vero (VT2e) định protein tái tổ hợp theo thời gian bảo quản nghiệm protein tái tổ hợp Đánh giá khẩ đáp ứng miễn dịch tạo thú thí MBP-VT2eB bệnh phù đầu E coli Đánh giá bảo hộ protein tái tổ hợp việc phòng gây heo sau cai sữa độc tố vero + Nội dung 1: Sẵn xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tỉnh chế sản xuất cao protein tái - Thí nghiệm ]: Xác định dịng vi khuẩn tái tổ hợp có khả tổ hợp MBP-VT2eB -_ xuất protein tái tổ hợp: Thời Thí nghiệm 2: Xác định điều kiện tối ưu việc sẵn theo thời gian bảo gian nuôi cấy, nồng độ chất xúc tác Tính ổn định protein tái tổ hợp quản gây phù để sử Thí nghiệm 3: Tình chế độc tố vero (VT2e) từ dịch nuôi cấy vi khuẩn E coli dung cho việc công độc thú thí nghiệm $ Nội dụng 2: nghiệm Đánh giá khả đáp ting mién dich tạo thú thí protein tái tổ hợp MBP-VT2eB © sinh heo sau cai Khảo sát hàm lượng kháng thể trung hòa độc tố vero (VT2e) nghiệm sữa việc tiêm protein tái tổ hợp với liều khác nhau: tổng cộng thí tiêm lần * Liểu 50ug protein tái tổ hợp/ml/con, gồm thí nghiệm: tiêm lân lần * Liêu 75g protein tái tổ hợp /ml/con, gồm thí nghiệm: tiêm l lần tiêm tiêm lần * Liễu 100ug protein tái tổ hợp /mL/con, gồm thí nghiệm: tiêm l lân Nội dụng B việc phòng 3:_ Đánh giá khả bảo hộ protein tái tổ hợp MBP-VT2e bệnh phù đầu E coli gây heo sau cai sửa Gém thi nghiệm: xác định - Thí nghiệm 1: Tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB theo liều quy trình bước cho heo thí nghiệm cho heo thí - Thí nghiệm 2: Tiêm độc tố vero (VT2e) với tiểu LD50 (3ng/kg thể trọng) nghiệm 12 Nhu céu thị trường (Xã hội): - Bảo vệ đàn heo thịt chống lại bệnh phù đầu Z, coli, phòng ngừa tượng lờn thuốc kháng sinh vi khuẩn Tên sở qui nô áp dụng kết nghi ên cứu triển khai; - Các xí nghiệp chăn ni heo, xí nghiệp Thú y 13| Căn thực đề tài: 14 Phương pháp chung tiếp cận thực hiện: - Theo tài liệu ml - Theomẫu - Khác = g O - Tự nghiên cứu mm ~ Theo licence O Mơ tả tóm tắt phương pháp so sánh với việc nhập cơng nghệ: Chưa có quy trình cơng nghệ 15 Hợp tác quốc tế: 16 | Dạng sẳn phẩm, kết tạo ra: ~_ Quy trình sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT 2eB dùng chế vaccin phòng bệnh phù đầu È coli gây heo sảu cai sữa 17 | Phương án sản phẩm STT lira STT Tên sản phẩm 17k | Tên sản phẩm Quy trinh sin xuất protein tái tổ hợp MBPVT2eB | Bang | Chú thích Đơn vị đo Cần đạt _ Mức chất lượng Mẫu tương tự Trong nước | Thế giới Hiéu qua kinh tế dễ dàng Bang Ghi Tiêm bắp ấp dụng Yêu cầu khoa học, kinh tế, xã hội với sản phẩm: |STT | Tên sản phẩm I Số lượng Yêu kỹ thuật, tiêu chất lượng sản phẩm (dạng 1) | Đơn vị Quy trinh san Yêu cầu cụ thể an toan, khéng gay phan ứng phu va hau xuất protein tái | xấu tăng trọn g heo thí nghiệm tổ hợp MBP- VT2eB Chú thích Giá giới hạn (tối đa) sản phẩm KHCN tạo (1.000 đồng) Tên sẵn phẩm Đơn vị đo Protein tái tổ Liêu (mg/ml) Ƒ hgp MBP- VT2eB phòng Giá thành Giá bán - Giá thị trườn, was wees An STT | Trong nước | Thế giới bệnh phù đầu heo 19 Kinh phí thực để tài: str | Nguồn Trong Tinh bing tién , % 1.000 SỐ đồng USD Lao Nguyên Thiết bị Xử lý động vật liệu máy số móc liệu KHKT I A Téng số 100° | 87.800 | 56.500 197.300 Khác „ 10 38.000 | 15.000 Trong từ: Ngân sách 100 Khkt TP Vốn tự có 3_ | Thu hổi bo Tỷ giá hối đoái: VNĐ/USD Kế hoạch sử đụng kinh phí Phân cho năm Tổng số 2003 Ngân sách Sở Khoa.Học Công Nghệ Trường Thành Phố HCM bị ta | | | |— STT Môi 197.300.000đ 100.000.000 đ Phân tích hiệu kinh tế sẵn phẩm (dự kiến ) Tên trêu Tổng kết đạt Tổng phí Lãi (1) - (2) Tỷ suất sinh lời (3)/2) Hiệu kinh tế khác Thanh tiền (t riệu đồng) * 2004 97.300.000 d Bảng6 Chú thích ba Hiệu xã hội: Ý nghĩa khoa học, kinh tế: Khả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để sản xuất vaccin phòng bệnh thú Bảo vệ đàn heo chống lại bệnh phù đầu E coli, gidm phí sản xuất kg tăng trọng heo Ý nghĩa xã hội: - _ Góp phân hạn chế ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng dư lượng thuốc kháng sinh thịt - _ Góp phân ngăn ngừa tượng kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh truyền lây người thú 23 Nội đung tiến độ thực STT | Nội dung bước Kết Thời gian | Người chủ trì đạt | thực Xây dựng hoàn thành để cương Sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tỉnh chế độc tố vero (VT2e) Nguyễn Ngọc Hải 01/2003 | Nguyễn Ngọc Hải đến Nguyễn Lê Trang 09/2003 | Trần Đình Từ Nguyễn Thị Kim Loan Bảng Chú thích DHNL ĐHNL V Pasteur TTYTW2 PHNL Nguyễn Thị Thanh Loan | DHNL Đường Chỉ Mai | Trần Thị Bích Liên Đánh giá khả đáp ứng 10/2003 | Nguyễn Ngọc Hải miễn dịch tạo thú thí nghiệm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB đến 02/2004 protein tái tổ hợp việc phòng bệnh phù đầu Trần Thị Bích Liên 03/2004 | Nguyễn Ngọc Hải đến Trần Đình Từ 09/2004 | Nguyễn Kim Loan E coli gây heo Sau cai sữa ĐHNL ĐHNL ĐHNL ĐHNL TTYTW2 ĐHNL Nguyễn Thị Thanh Loan | DHNL Đường Chỉ Mai ĐHNL Trần Thị Bích Liên ĐHNL Trần Đình Từ TTYTW2 ! Nguyễn Thị Kim Loan ĐHNL Nguyễn Thị Thanh Loan | ĐHNL Đường Chỉ Mai Đánh giá khả bảo hộ ĐHNL "Tổng kết số liệu viết báo 10/2004 - | Nguyễn Ngọc Hải cáo 12/2004 10 ĐHNL ĐHNL Danh sách người thực phối hợp chính: Ngành Học vị Hợ tên STT chuyên môn l TS Nguyễn Ngọc Hải Thú Y Giảng viên ĐHNL Thú y ĐHNL, Trần Đình Từ PGSTS | Thú Y Nguyễn Thị Kim Loan BSTY Nguyễn Thị Thanh Loan | BSTY Đường Chỉ Mai Trần Thị Bích Liên Ngày 45 tháng 42năm Chủ nhiệm để tài Đứữn vị công tác P Giám đốc TTThuốc Thú y TW2 Thú y ĐHNL Thú y Thạc sĩ | Thú y ĐHNL BSTY DHNL Ngày 2002 năm 2002 tháng Chú nhiệm chương trình ` TS Nguyễn Ngọc Hải tháng 12 năm Ngày 2002 tháng năm Cơ quan quản lý PöS.TS, BÙI CÁCH TUYẾN i 2002 Phụ lục Í DỰ TỐN KINH PHÍ ĐỀ TÀI (Mã số STT Nội dung khoản Thành tiền 1.000đ | Lao động KHKT 87.800 - Chỗ nhiệm để tài cố vấn USD 6.100 ~ Thuê khốn chun mơn 81.700 Ngun Nhiên, Vật liệu 56.500 ; Nguyên, Vật liệu Thiết bị, máy móc chuyên đùng 15.000 - Thiết bị, máy móc Chỉ khác 38.000 Tổng cộng | 197.300 GIẢI TRÌNH CÁC KHOẢN CHI (1.000Đ) Khoản 1: Lao động KHKT TT 54.200 Nội dung Thành tiền 1.1 | Chủ nhiệm dé tai, cố vấn 6.100 1.2 | Th khốn chun mơn 81.700 Nội dung | 16.500 Nội dung 50.200, Nội dung 15.000 12 * Khoản : Nguyên, nhiên, vật liệu (x 1000) STT |Sốlượng | Đơn giá PVT Nội dung i Thành tiền 56.500 Nguyên vật liệu 1d Nội dung | 8.000 Nội dung 10.000 Nội dung 38.500 Khoản : Thiết bị, máy móc chuyên đùng Số lượng | Đơn giá DVT Nội dung [srr 3A Thiết bị công nghệ 3.2 Thiết bị thử nghiệm, Thành tiền 15.000 đo lường 3.3 Khấu hao thiết bị Khoản : Xây đựng bản, sửa chữa lớn STT Nội dung Thanh tiên | 4.1 Khối lượng xây dựng: m° 42 Chi phí xây dựng 43 Chỉ phí lắp đặt hệ thống điện 44 Chỉ phí lắp đặt hệ thống nước Khoản : Chí khác STT ' Nội dung Thành tiên 5.1 Chỉ phí xét duyệt, nghiệm thu, kiểm tra, giám định 6.000 5.2 Hội thảo, hội nghị 5.000 5.3 Văn phòng phẩm 2.000 5.4 Xử lý số liệu, viết in báo cáo 2.000 35 Thuê hội trường 500 5.6 Xây dựng để cương tổng quát 400 5.7 Xây dựng để cương tiết 600 3.8 Báo cáo nghiệm thu 5.9 Quần lý quan chủ quản 6.000 / năm x năm 5.10 Quần lý cấp sở Cộng 3.500 3.000./ năm x năm 12.000 6.000 38.000 THUYẾT MINH CHI TIET NOI DUNG Tên nội dung 1: Sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tỉnh chế độc tố vero Chủ trì: TS Nguyễn Ngọc Hải Cố vấn: PGS TS Nguyễn Lê Trang Thị Bích Cộng tác viên: Nguyễn Thị Thanh Loan, Nguyễn Thị Kim Loan, Đường Chi Mai, Trân Liên, kỹ thuật viên sinh viên Thời gian thực hiện: tháng Kinh Phi: 27.300.000đ nuôi Thú y Địa ban: Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường ĐHNL- Phịng vi sinh Khoa Chăn Đối tượng: Các đòng vi khuẩn E coli Mục dich : Lựa chọn đồng vi khuẩn tái tổ hợp có suất cao theo điều kiện xác định -_ để dùng vào Thu nhận độc tố vero (VT2e) tinh từ dòng £ coli phan lập từ heo bệnh - việc kiểm tra hiệu đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Nội dung: ~_ Khảo sát suất sẵn sinh protein tái tổ hợp MBP-VT2eB dịng khuẩn tái tổ hợp - Khảo sát tính ổn định protein tái tổ hợp theo thời gian báo quản & -20°C: 2, 4, 6, 8, 10 Khảo sát khả sản sinh độc tố vero (VT2e) đòng E coli phần lập từ heo bệnh -_ tuần Yếu tổ thí nghiệm: Các dịng vi khuẩn E, coii phân lập từ heo bệnh xác định gien quy định yếu tố VT2e -_ - Các dòng vi khuẩn E coli tái tổ hợp xác định gien quy định tiểu phần B độc tố -_ Nông độ chất xúc tác IPTG (từ 0,1 đến 1mM, nơng độ thí nghiệm chênh 0.1mM) VT2e - Thời gian xúc tác (2, 4, 6, giờ) Phương pháp thực hiện: -_ Protein tái tổ hợp thu nhận kỹ thuật sắc ký lực với cột sắc ký amylose Phương pháp sắc ký lực: Dịch vi khuẩn tái tổ hợp cho qua cột sic ky amylose Protein tai tổ hợp gắn vào hat amylose cột sắc ký Sau đó, cho qua cột dung dịch chứa ˆ ¡ 10mM Maltose Do lực protein tái tổ hợp MBP-VT2eB (MBP: Maltose Binding Protein) sang với Maltose cao nên protein tái tổ hợp bị tách khỏi hạt amylose chuyển gắn hạt maltose, trôi khỏi cột sắc ký amylose thu nhận lại sắc -_ Độc tố vero (VT2e) két tia bing sulphat ammonium va tinh chế phương pháp - ký cột Định lượng protein tái tổ hợp độc tố vero (VT2€) thu theo phương pháp Bradford 18 Dự trù kinh phí nội dung (đơn vị tính x 1000) Th khốn chun mơn: —_ Chủ nhiệm chương trình : người x tháng x !00./tháng -_ Cố vấn: l người x thang x 200 / tháng * Thí nghiệm 1: 1.000 1.800 - Cơng kỹ thuật: 4.500 - Vật liệu hố chất: 2.000 * Thí nghiệm 2: - Cơng kỹ thuật: - Vật liệu hóa chất: * Thí nghiệm 3: 6.000 3.000 - Cơng kỹ thuật: 6.000 - Vật liệu hóa chất: 3.000 Tổng cộng 27.300 ii Ị THUYET MINH CHI TIET NOI DUNG 'Tên nội dung 2: Đánh giá khả đáp ứng niễn dịch tạo thú thí nghiệm bỗi protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Chủ trì: TS Nguyễn Ngọc Hải Cố vấn: PGS-TS Trần Đình Từ Cộng tác viên: BSTY Nguyễn Thị Thanh Loan, Nguyễn Kim Loan, Đường Chỉ Mai, Trần Thị Bích Liên Sinh viên thú y ĐHNL "Thời gian thực hiện: tháng Địa bàn: DHNL Kinh phí; Đối tượng: TW2, Phịng vi sinh Khoa Chăn ni Thú y Trại thực nghiệm Trung tâm Thuốc Thú 61.700.000 Heo sau cai sữa 21 ngày tuổi Mục đích: Xác định liễu protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thích hợp tạo đáp ứng miễn dịch tốt Xác định liệu trình tiêm tạo đáp ứng miễn dịch tốt -_ Nội dung: -_ Khảo sát hàm lượng kháng thể trung hòa độc tố vero sinh heo sau cai sữa việc tiêm protein tái tổ hợp với liễu khác nhau: tổng cộng thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm: ~-_ ~_ Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Địch bể trợ (Hydroxyde nhơm 2%) dùng hồ protein tái tổ hợp theo liêu: 50g, 75Hg ; 100ng/ml để làm dịch tiêm * Liễu 50ng protein tái tổ hợp/ml/con, gầm thí nghiệm: - Thí nghiệm I: Tiêm protein tái tổ hợp lần lúc 14 ngày tuổi - Thí nghiệm 2: Tiêm protein tái tổ hợp lần: lân liêm lúc heo 14 ngày tuổi tiêm nhắc lúc heo 24 ngày tuổi, * Liêu 75g protein tái tổ hợp /ml/con, gồm thí nghiệm: ~ Thí nghiêm 3; Tiêm protein tái tổ hợp lần lúc 14 ngày tuổi - Thí nghiệm 4: Tiêm protein tái tổ hợp lần: lần ltiêm lúc heo 14 ngày tuổi tiêm nhắc lúc heo 24 ngày tuổi * Liêu 100ng protein tái tổ hợp /ml/con, gồm thí nghiệm: - Thí nghiệm 5: Tiêm protein tái tổ hợp lân lúc 14 ngày tuổi - Thí nghiệm 6: Tiêm protein tái tổ hợp lần: lần Liêm lúc heo 14 ngày tuổi tiêm nhắc túc heỏ 24 ngày tuổi 17 Ị Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm triển khai lơ, lơ 10 heo cai sữa phân chia đông yếu tố trọng lượng, giới tính (và giống có thể) Thí nghiệm lặp lại lân - lồ đối chứng tiêm dịch bổ trợ: tiêm I lân tiêm lần - .2 lô tiêm với liễu 50ug protein tái tổ hợp/ml/con: tiêm lần tiêm lần -.2 lô tiêm với liều 75ug protein tái tổ hợp /ml/con: tiêm ! lần tiêm lần -_.2 lô tiêm với liễu 100ug protein tái tổ hợp /mi/con: tiêm lần tiêm lần, Lấy máu kiểm tra kháng thể kháng độc tố vero (VT2c) xác định phương pháp trung hòa độc tố.: -_ Thời điểm lấy máu: 'tuẫn sau tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB: 21 ngày tuổi heo tiêm lần 31 ngày tuổi heo tiêm lần -_ Khoảng cách lần lấy máu liên tiếp: ! tuần - _ Số lẫn lấy máu: tổng cộng lần Dự trù kinh phí nội đụng Th khốn chun mơn (1.000 4) - Chủ nhiệm chương trình: l người x thắng x 100./tháng = - Cố vấn: người x tháng x 200./ tháng - Công kỹ thuật: 2,500 thí nghiệm x = thí nghiệm _ Tiển hỗ trợ sử dụng heo thí nghiệm trại chăn nuôi —_ (80 con) x 100./ Tổng cộng phí nội dung 15.000 = 50 /mẫu x 80 x 4x 2= 2, Nguyén vật liệu: (1.000 đ) ~ Vật liệu, ống tiêm 1000 = - Công lấy máu: / lần /heo x 80 heo x lần x lần lặp lại - Xét nghiệm mẫu: 500 3.200, = = 51.700 Tổng cộng Tổng cộng 32.000 = = 2.000 2.000 = 8.000, = 61.700 _ THUYẾT MINH CHI TIẾT NỘI DUNG Tên nội dụng 3: bệnh phù đầu Đánh giá khả bảo 'hộ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB việc phòng E coli gay trén heo sau cai sữa Chi tri thi nghiém: TS Nguyén Ngoc Hai Cố vấn: PGS-TS Trần Đình Từ, Chỉ Cộng tác viên: BSTY Nguyễn Kim Loan, BSTY, Nguyễn Thị Thanh Loan, BSTY Đường Mai, ThS Trần Thị Bích Liên, Kỹ thuật trại heo sinh viên thứ y thực tập tốt nghiệp Thời gian thực hiện: tháng Địa bàn: Trung tâm thực nghiệm Công ty Thuốc TW2, Trại thực nghiệm Trường ĐHNL Kinh phí: 54.100.000 — ˆ Mục đích: E coli gay - Xác định khả sử dụng protein tái tổ hợp việc phòng bệnh phù dau heo sau cai sữa Nội dung: - Thí nghiệm 1: Tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB + dịch bổ trợ hydroxyde nhơm 2% theo tiểu quy trình xác định nội dung cho heo thí nghiệm thí - Thí nghiệm 2: Tiêm độc tế vero (VT2e) với tiều LD50 (3ng/kg thể trọng) cho heo nghiệm - Theo dối triệu chứng Ghi nhận tỷ lệ bệnh, chết ~ Mổ khám ghi nhận bệnh tích đại thể, vi thể heo thí nghiệm - Theo đối tăng trọng Thí Việc công độc thực tuần sau tiêm protein tái tố hợp MBP-VT2eB lần cuối nghiệm lặp lại lần Thời gian theo dõi thú thí nghiệm: tuần Bố trí thí nghiệm: lặp lại lần Lô Heo (n) Lô 1: đối chứng âm: tiêm dịch bổ trợ hydroxyde nhôm 2% 1ml/con Lô 2: đối chứng dương: tiêm dịch bổ trợ hydroxyde nhôm 2% Iml/con + 3ng VT2e/kg 25 25 thé Lô 3: tiêm protein tái tố hợp MBP-VT2cB + dịch bổ trợ hydroxyde nhôm 2% + 3ng VT2e/kg thé 25 Dự trù kinh phí nội dung3 Th khốn chun mơn 71.300.000đ : (1.0008) - Chủ nhiệm chương trình: I người x tháng x 100.Ahdng = - Cố vấn: I người x tháng x 200 “tháng - Cơng kỹ thuật: 6.000 / thí nghiệm x thí nghiệm = - Xét nghiệm mẫu: mẫu / lô / lô x lần x 20 / mẫu - Kế tốn chương trình người x 100./tháng x 24 tháng 600 1.200 = = Tổng cộng Nguyên vật liệu: (1.000 đ) - Dụng cụ cẨm cột, tiêm chích, thuốc sát trùng Tổng cộng 12.000 600 2.400 = 16.800 = = 1.000 1.000 Tién tro sit dung heo thi nghigm : Khi công cường độc, gây bệnh thực nghiệm, heo phải bố trí ni nhốt riêng, khơng chung với heo trại Vì cần tính đến phí mua heo, thực phẩm cho heo Khoản 1: dự chỉ: - Tiền mua heo: 250./con x 75 x lần = 37.500 - Thực phẩm cho heo: 25Ồ ngày x 30 ngày x lần: Khoản 2: dự thu: = 15.000 - Bán heo cịn sống sau cơng độc: 150 x 50 x lần Khoản 3: Tiền hỗ trợ sử dụng heo thí nghiệm: 37.500 + 15.000 — 15.000 Tổng cộng phí nội dung Tổng kinh phi dé tai: * Chi phi ndi dung 1: 197.300.000 Bao gém: 27.300.000 đ * Chỉ phí nội đung : 61.700.000 đ * Chỉ phí nội dung 3: 55.300.000 đ * Thiết bị: * Chỉ phí khác 15.000.000 đ : 38.000.000 d 20 = 15.000 = 37.500 = 55.300