Đánh giá khả năng bảo vệ của protein tái tổ hợp mbp vt2eb như là một vaccin trong phòng bệnh phù đẩu do vi khuẩn e coli gây ra trên heo sau cai sữa

SO KHOA HQC CƠNG NGHỆ TP HỊ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỊ CHÍ MINH BAO CAO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội Đông Nghiệm thu ngày 24/11/2005) TÊN ĐÈ TÀI: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2cB NHU LA MOT VACCIN TRONG PHONG BENH PHU DAU DO VI KHUAN E COLI GAY RA TREN HEO SAU CAI SUA CHU NHIEM DE TAI: TS NGUYEN NGOC HAI TP HCM THANG 11/2005 SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HO CHi MINH TP HO CHi MINH TEN DE TAI: DANH GIA KHA NANG BAO VE CUA PROTEIN TAI TO HOP MBP-VT2eB NHU LA MOT VACCIN TRONG PHONG BENH PHU ĐẦU DO VIKHUAN E COLI GAY RA TREN HEO SAU CAISUA Chủ nhiệm đề tài ˆ TS NGUYÊN NGỌC HẢI CO QUAN QUAN LY DE TAI CƠQUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI TS.TRINK TRUGNG GIANG TP HCM THANG 11/2005 LOT CAM ON Trn cam on Sở Khoa Học Cơng Nghệ Tp.HCM cấp kinh phí để thực đề tài PGS.TS Trần Đình Từ, PGS.TS Nguyễn Lê Trang góp nhiều ý kiến thực nghiên cứu báo cáo nghiệm thu TS Nguyễn TP.HCM Thị Tường Vân, Th§ Đỉnh Minh Hiệp Chuyên viên đồng nghiệp Sở KHCN giúp đỡ, động viên chúng tơi q trình thực đề tài Ban Giám Hiệu, Phịng Khoa Học, Phịng Kế Hoạch Tài Chính, Trung Tam Phan Tích Thí Nghiệm Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện để thực đề tài Phòng Miễn Dịch Phòng Kiểm Định Vac-xin Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ thực đề tài Công Ty NAVETCO hỗ trợ thực đề tài Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Bộ Môn Bệnh Lý Truyền Nhiễm Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện để thực đề tài Ban Giám Đốc, Trung Tâm Nghiên Cứu Chuyển Giao Công Nghệ Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM trợ thực để tài Gia đình Anh Vũ Lại Xuân Hiệp, Phường Trãng Dài, Tp Biên Hịa, Đồng Nai Gia đình Anh Trầm Quốc Thắng, Xã Tân Thạnh Đông, Cu Chi - Tp HCM hỗ trợ để thực để tài Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Ngọc Hải DANH SACH CAN BO THUC HIEN DE TAI Ste Ho va tén | T§ Nguyễn Ngọc Hải | PGS TS Trần Đình Từ | PGS TS Nguyễn Lê Trang | B§TY Nguyễn Thị Kim Loan | BSTY Nguyễn Thị Thanh Loan | ThS Đường Chỉ Mai 7_| ThS Trần Thị Bích Liên Chun Đơn vị cơng tác mơn Thú Y Thú Y Đại Học Nông Lâm Tp HCM Công Ty NAVETCO Thú Thi Thú Thú Đại Đại Đại Đại Miễn Dịch Y Y Y Y Viện Pasteur Tp HCM Học Học Học Học Nông Nông Nông Nông Lâm Lâm Lâm Lâm Tp Tp Tp Tp HCM HCM HCM HCM CAC CHU VIET TAT IPTG LB kDa MBP PCR SDS EDTA OD SDS-PAGE Isopropy!-B-D-thiogalactoside Luria-Bertani kilo Dalton Maltose Binding Protein Polymerase chain reaction sodium dodecyl sulfate Ethylenediaminetetracetic acid Optical Density sodium dodecyl] sulfate polyacrylamide gel DANH SÁCH CÁC HÌNH ÁNH Hình 4.! : Kết điện di kiểm tra chất lượng dòng vi khuẩn E coli DH5ơ mang plasmid tái tổ hợp Hình 4.2 Đường | biểu diễn sinh trưởng phát triển vi khuẩn Z cọi tái tổ hợp theo tỷ lệ nạp giống Hình 4.3 Kết điện di rên gel SDS-PAGE 12% khảo sát ảnh hưởng nỗng độ IPTG lên khả cảm ứng tạo sản phẩm protein MBP-VT2eB Hình 4.4 Kết điện di khảo sát ảnh hưởng thời gian gây cảm ứng IPTG lên kha nang tao san phẩm Hình 4.5 Đề thị sắc ký lực cột amylose với dịch chiết tế bào thu phương pháp phá vỡ tế bào siêu âm Hình 4.6 Đô thị sắc ký lực cột amylose với dịch chiết tế bảo thu phương pháp phá vỡ tế bào uré Hình 4.7 Kết điện di gel acrylamide 12% sản phẩm sắc ký thu phương pháp phá vỡ tê bào: urê siêu âm Hình 4.8 Kết phản ứng kết tủa khuếch tán thạch DANH SACH CAC BANG BIEU Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch heo đợt Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch heo đợt Bảng 4.1: Kết đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thỏ (phương pháp kết tủa khuếch tán thạch) Bảng 4.2 Tăng trọng heo thí nghiệm đợt l Bảng 4.3 Kết kiểm tra kháng thể trung hòa độc tố V'T2e môi trường tế bào 'Vero với huyết heo thí nghiệm đợt PHAN 1: DAT VAN DE Bệnh phù đầu vi khudn Escherichia coli 1a mét bệnh truyền nhiễm nguy hiểm xãy heo sau cai sữa Bệnh gây nên tổn thất to lớn cho ngành chăn nuôi heo đo khó khăn việc phịng chống bệnh Tỷ lệ bệnh lên đến 30-40% thường dẫn đến tử vong Tính chất dịch tể bệnh phức tạp, bệnh thường xuất đột ngột dự báo Việc phòng bệnh chủ yếu dựa vào liệu pháp kháng sinh Biện pháp vừa tốn lại vừa nguy hiểm cho sức khoẻ cộng đồng nguy hiểm tiém tang dư lượng thuốc kháng sinh tổn lưu thịt, nguy làm xuất dịng vi khuẩn có khả để kháng với nhiều loại kháng sinh Diéu làm cho việc phịng bệnh trở nên phức tạp hơn, khó khăn bị động đo nắm hoàn toàn đặc điểm kháng kháng sinh chủng vi khuẩn gây bệnh Do vậy, liệu pháp vac- xin phịng bệnh ln xem hướng chọn lựa thích hợp cho việc phịng chống bệnh truyền nhiễm có đặc điểm dịch tế phức tạp bệnh phù đầu vị khuẩn Escherichia coli gay trén heo sau cai sữa, Những nghiên cứu vac-xin phòng bệnh này, cần thiết, lĩnh vực ứng dụng thành tựu sinh học phân tử, cơng nghệ gien, cịn mẻ nhà khoa học Việt Nam Để tài “Đánh gía khả bảo vệ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB yac-xin phòng bệnh phù đầu vi khuẩn Escberichia coli gây heo sau cai sữa” tiến hành nhằm mục đích trước hết tìm hiểu khả sử dụng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB việc phòng bệnh phù đầu vi khuẩn Escherichia coli gay heo sau cai sữa, sau xây dựng sở thực tiễn ban đầu cho nghiên cứu ứng dụng khác lĩnh vực công nghệ protein phục vụ công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm khác thú y Đề tài thực với nội dung sau: - Diéu kiện thích hợp ni cấy dịng vi khuẩn tái tổ phạm vi thử nghiệm (dung tích ni cấy: - lít) -_ Điểu kiện thích hợp thu hoạch sản phẩm vaccin tái dịch chiết vi khuẩn tái tổ hợp) -_ Hiệu lực bảo vệ vaccin động vật mẫn cẩm nghiệm công độc nhân y hợp để thu sinh khối tổ hop (Img sinh phẩm/Iml (heo sau cai sữa) thí PHAN 2: LUGC DUYET CAC CONG TRINH 2.1, Vi khudn Escherichia coli gây phù heo sau cai sữa Những nghiên cứu giới nước cho thấy dòng E coii gây bệnh phù heo sau cai sữa phân lập xếp vào nhóm VTEC (verotoxigenic E coli) Những dòng E coi gây bệnh chủ yếu thuộc nhóm kháng nguyên O128, 0139 va O141 (Imberechts H va ctv., 1992; Parma va ctv., 2000) Viét Nam, bénh phù heo sau cai sữa gây E coli gây tổn thất to lớn cho người chăn nuôi heo khắp tỉnh thành phía Nam, đặc biệt trại chăn nuôi quy mô nho xấy trại chăn nuôi lớn Nguyễn Ngọc Hải, 1999 thành công việc phân lập dịng È coii thuộc nhóm kháng ngun 0138, 0139 O141 lần từ mẫu hạch màng treo ruột heo bệnh Những dòng E cøl¿ có khả sản xuất loại độc tố đặc trưng cho dòng E coli gây phù heo, độc tố vero VT2e Độc tố có tác dụng hủy hoại tế bào vero lại khơng có tác dụng tế bào HeLa Độc tố vero tiết dòng E coii gây phù nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh tích heo bệnh Bằng thực nghiệm, với việc tiêm độc tố vero VT2e vào bắp thịt heo sau cai sữa, gây nên triệu chứng bệnh tích heo bị tiêm giống heo mắc bệnh tự nhiên (Macleod ctv., 1991a), Ngoài việc tiết độc tố vero đặc trưng, dòng £ coli gay phù mang yếu tố đặc trưng khác, lơng bám F18 ( tên cũ F107) Yếu tố kết bám hoàn toàn khác với yếu tố kết bám trước (F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), E41 ) tìm thấy wén cdc dong E coli gay tiêu chảy heo, bò (Bertschinger ctv., 1990; Imberechts ctv., 1992), Người ta chứng tổ dòng Z coli có mang yếu tố bám đính F18 có khẩ nắng kết bám lên tế bào biểu mô ruột heo sau cai sữa, lại kết bám lên tế bào biểu mô ruột heo sơ sinh (Nagy B ctv., 1997), Đây lý giải thích bệnh phù E coii lại thường thấy heo sau cai sữa Những dòng É cøii gây phù heo điện phân heo lành heo bệnh Điều có nghĩa heo lành ln nguồn mang mam bénh (Gannon va ctv., 1988; Osek 1999; 2000, Nguyén Ngoc Hai va ctv., 2002) Những heo điều kiện chăm sóc ni dưỡng khơng phù hợp phát triển thành bệnh cách đột ngột thường dẫn đến tử vong Độc tô verotoxin vỉ khuẩn £ coli gây phù heo loại độc tô thuộc nhóm Shiga-like toxin, đanh pháp thức độc tơ SLT-Ile VT2e dé phan biét với loại độc tố Shiga-like toxin dòng E coli khác sản xuất (nhóm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli) người, Độc tô VT2e loại độc tô Shiga-like toxin cầu tạo bởi2 tha tiêu phân A (Active) có tác dụng độc tiểu phần B (Binding) giữ vai trị giúp độc tơ vero gắn lên tế bào mẫn cảm, tạo điều kiện cho tiêu phần A xâm nhập vào tế bào, gây độc làm chết tế bào Về mặt lý thuyết độc tố khơng gắn lên tế bào độc | tố khơng có tác dụng gây độc tế bào, có nghĩa thể thú có kháng thể chống lại tiểu phần B thi khang thé sé két hop đặc hiệu với tiểu phần B, ngăn cản kết bám độc tố lên tế bao vật chủ giúp thú chống lại bệnh vị khuẩn £ coli san sinh độc tô gây 2.2 Miễn dịch E coli gây bệnh phù heo 2.2.1 Miễn dịch bị động: Miễn dịch chống bệnh phù E coli có qua việc sử dụng kháng thể kháng yếu tố kết bám F18 kháng độc tố VT2e Người ta ghi nhận heo cho ăn lòng đỏ trứng gà từ đàn gà gây miễn dịch với yếu tố lơng bám F18 bảo hộ chống lại nhiễm bệnh dòng vi khuẩn E coi có kiểu kháng nguyên (Juniga A ctv., 1997) Kháng thể bị động thu trường bop ngăn cần kết bám dong vi khuẩn E coli cé kiểu kháng nguyên lên niêm mạc ruột, lại không ngăn kết bám dịng E coli khơng kiểu kháng nguyên (Juniga A va ctv., 1997; Imberechts H va ctv., 1997), Theo Noliet ctv., 1999, bột huyết tương máu heo để kháng với kết bám đòng E coii mang yếu tố kết bám F18 làm giảm phát triển vi khuẩn E coli gây bệnh heo cho ăn loại bột Mặt khác, MacLeod D L ctv., 1991 chứng tổ việc tạo nên miễn dịch thụ động với kháng thể kháng độc tố VT2e bảo vệ heo bị cơng cường độc theo đường tiêm tĩnh mạch với liễu gây chết Việc bảo vệ heo khỏi xâm nhiễm vi khuẩn E coli sinh độc tố VT2e đạt nhờ vào việc sử dụng kháng thể kháng độc tố VT2e thu nhận từ ngựa đựoc gây đáp ứng miễn địch với độc tế VT2e vô hoạt Gohansen M., 2000) Tuy nhiên việc bảo hộ heo miễn dịch thụ động phụ thuộc hoàn toàn vào liều kháng thể sử dụng (Matise I., 2001) 2.2.2 Miễn dịch chủ động: Việc bảo vệ heo chống lại bệnh phù E coii gây thực với việc tiêm ngừa chủng E, coli không độc lực có mang yếu tố bám F18 Thử nghiệm cho thấy làm giảm đáng kể tỷ lệ chết heo sau cai sữa (Alexa P., 1995) Cicuta M E ctv., 1999 chứng việc tiêm chủng vi khuẩn E coli sinh độc tố VT2e vô hoạt formol bảo vệ 85% chuột bị thử thách độc tố VT2e Các dòng vi khugn E coli mang yéu t6 két bám F18 tạo nên đáp ứng miễn dịch, hình thành kháng thể IgA máu ruột kháng lại yếu tố bám F18 Theo Gordon V M va ctv., 1992; MacLeod D L va ctv., 1991 heo tiêm độc tố VT2e vô hoạt formaldehyde tạo nên kháng thể trung hòa với hiệu giá kháng thể từ I:128 đến 1:512 ngày thứ 28 sau tiêm Tuy nhiên độc tố vơ hoạt khơng hồn tồn tính độc làm giẩm tăng trọng gây nên bệnh tích bệnh phù số heo tiêm Thí nghiệm Johansen M ctv., 1997 cho thấy việc tiêm phòng cho heo độc tố VT2e vô hoạt glutaraldehyde tuần tuổi thú thứ ba, cai sữa tuần tuổi thứ tư tạo nên hiệu giá kháng thể mức ¿ao không ảnh hưởng đến tăng trưởng heo tiêm, đồng thời bảo vệ hoàn toàn heo tiêm vac-xin khỏi tác động gây chết bệnh phù Dù vậy, độc tố vô hoạt khơng hồn tồn vơ hại, nhiều nhà khoa học triển khai nghiên cứu gây đột biến nhằm tạo nên độc tố it déc hon Gordon V M va ctv., 1992; Bosworth B T va ctv., 1996, thành công việc tạo độc tố VT2e yếu nhờ gây đột biến Loại độc tố tạo nên kháng thể trung hịa heo tiêm thí nghiệm với hiệu giá kháng thể khoảng I: 152 vào ngày thứ 21 sau tiêm hồn tồn khơng có phân ứng phụ Makino S I Và ctv., 2001 chứng minh chủng vi khuẩn có mang gien độc tố VT2e làm yếu cách gây đột biến tiểu phần A độc tố VT2e sử dụng làm vac-xin nhược độc để phòng bệnh E coli gây phù heo Độc tố VT2e yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli bệnh Độc tố VT2e hấp thu từ ruột vào máu, gây tổn thương thành mạch máu dẫn đến tượng phù heo bệnh Một chế miễn dịch bảo vệ heo khỏi bị bệnh làm trung hòa độc tố VT2e độc tố diện máu Sylvia F ctv., 1995 thành công việc thu nhận protein dung hợp tiểu phần B độc tố VT2e sử dụng protein nghiên cứu dịch tễ thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch Trong nghiên cứu Mukherjee J ctv., 2002 cho thấy kháng dòng kháng tiểu phần B tố VT2 Như mặt độc tố VT2e để gây đáp phi E coli gay thể đơn dòng độc tố VT2 nguyên tắc có ứng miễn dịch kháng tiểu phần A kháng thể đơn bảo vệ heo khối tác động độc thể sử dụng protein dung hợp tiểu phần B heo bảo vệ chúng chống lại bệnh PHAN 3: NOI DUNG VA PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Nội dung nghiên cứu: - Điều kiện thích hợp ni cấy địng vi khuẩn tái tổ hợp để thu sinh khối phạm vi thử nghiệm (dung tích ni cấy: — lít) -_ Điểu kiện thích hợp thu hoạch sẩn phẩm vaccin tái tổ hợp (Img sinh phẩm/1ml -_ Hiệu lực bảo vệ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB dịch chiết vi khuẩn tái tổ hợp) sau cai sữa) thí nghiệm cơng độc động vật mẫn cảm (heo 3.2 Phương pháp thí nghiệm: 3.2.1 Điều kiện thích hợp ni cấy dịng vi khuẩn tái tổ hợp để thu sinh khối phạm nghiệm * Thí nghiệm 1: Kiểm tra chất lượng đòng vi khuẩn E.cof tái tổ hợp: Chủng vi khuẩn £ cøii nuôi cấy mơi trường canh LB, ni cấy lắc 150 vịng/phút, 37°C, Sau bổ sung IPTG với nổng độ 0.3ug/ml Tiếp tục nuôi cấy thêm Sau li tâm 3500 vịng/phút, 20 phút để thu sinh khối tế bào Thực phá vỡ tế bào SDS-Giycerol, đun sôi 100°C Cho chạy điện di giá thach acrylamide 12% (SDS-PAGE, BioRad) d6i véi mau vi khudn đựơc cẩm ứng với IPTG, mẫu vi khuẩn không đựợc cảm ứng với IPTG thang trọng lượng phân tử protein Sau nhuộm gel dung dịch nhuộm xanh Coomassie (BioRađ) đọc kết * Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nạp giống lên tăng trưởng chủng : - Nhân giống cấp 1: Giống vi sinh vật cấy sang ống nghiệm chứa 2,5ml môi trường canh LB, nuôi cấy lắc 150 vòng / phút, 37°C, 24 - Nhân giống cấp 2: Cấy chuyển vi khuẩn ống nghiệm vào bình lít chứa 250ml mơi trường theo tỷ lệ 2%, 3% 4% Nuôi cấy lắc 150 vòng / phút, 37°C Đo ODạoo thời điểm cách 30 phút Lập đường cong tăng trưởng * Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nêng độ IPTG lên khả cảm ứng tạo sắn phẩm Chọn tỉ lệ nạp giống phù hợp thí nghiệm để thực thí nghiệm Giống sau nuôi cấy, bổ sung IPTG với nổng độ 0,3; 0,6 0,9 ug/ml Tiếp cấy thêm giờ, thu sinh khối, phá tế bào chạy điện di SDS-PAGE So sánh bảng điện di * Thí nghiệm + Khẩa e4t ảnh hưởng thời gian cẩm ứng IPTG tạo sản phẩm Lấy kết thí nghiệm thí nghiệm để thực thí nghiệm sát thời gian cảm ứng IPTG (phút) 80, 100, 120 140 phút tục nuôi kết lên khả Khảo Phién polystyren 96 giéng Máng nhựa tiệt trùng Kính hiển vị soi ngược IOD3 Buồng đếm hồng cầu GASSALEM 12 nner en PHAN KET QUA VA THAO LUAN 4.1, KET QUA 4.1.1 Kết kiểm tra chất lượng dòng vi khuẩn tái tổ hợp Ching vi khuẩn E eoli nuôi cấy mơi trường canh LB, ni cấy lắc 150 vịng/phút, 37°C, Sau bổ sung IPTG với néng độ 0,3Itg/ml Tiếp tục nuôi cấy thêm Sau l tâm 3500 vịng/phút, 20 phút để thu sinh khối tế bào Thực phá vỡ tế bào thu dịch chiết cho chạy điện di giá thạch acrylamide 12% (SDS-PAGE, BioRad) mẫu vi khuẩn đựơc cảm ứng với IPTG, mẫu vi khuẩn không đựơc cảm ứng với IPTG thang trọng lượng phân tử protein MBP-VT2eB -> kDa @ ‡ Hình 4.4 Kết điện di khảo sát ảnh hưởng thời gian gây cảm ứng IPTG lên khả tạo sản phẩm Giéng |: Protein MBP-VT2eB (khoang 47kDa) Giéng 2: Ching E coli tai tổ hợp không gây cảm ứng với [PTG Giéng3, 4, 5, 6: Chang E coli tai t6 hop gây cảm ứng với IPTG thời gian tương ứng 80 100, 120 140 phút Dựa hình 4.4 so sánh vạch protein tương ứng với MBP- VT2eB giếng 3, 4, 5, nhận thay protein tai tô hợp diện tất giếng, điều có nghĩa gien mã hóa cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB hoạt động bình thường tác động cảm ứng IPTG Tuy nhiên, giếng 6, tương ứng với thời gian gây cảm ứng 120 140 phút, độ đậm vạch biểu thị protein tái tơ hợp MBPVT2eB đậm nhiều so với giếng Hay nói khác hon thi protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, với nồng độ chất gây cảm ứng IPTG 0,6bg/ml, tổng hợp nhiều thời gian gây cảm ứng 120 phút 140 phút so với 80 100 phút Vì thời gian gây cảm ứng 120 phút chọn cho việc sản: xuất protein tái tổ hợp MBPVT2eB 15 4.1.2 Điều kiện thích hợp thu hoạch sẵn phẩm vaccin tái tổ hợp Khảo sát ảnh hưởng phương pháp phá vỡ tế bào lên hiệu suất thu hồi sản phẩm protein tái tổ hợp MBP- VT2eB : Thực phá vỡ tế bảo vi khuẩn thu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp có cảm ứng với IPTG ,6ug/ml thời gian 120 phút phương pháp khác nhau: phá vỡ tế bào urê sóng siêu âm Dịch chiết tế bảo sau cho chạy điện di thạch acrylamide 12% để đánh giá kết MA a) Dịch protein không bám cột amylose b) dich protein bám cột amylose Hình 4.5 Đồ thị sắc ky lực cột amylose với dịch chiết tế bào thu phương pháp phá vỡ tế bao bang siêu âm a) Dịch protein không bám cột amylose b) Dich protein bam trén c$t amylose Hình 4.6 Đồ thị sắc ký lực cột amylose với dịch chiết tế bào thu phương pháp phá vỡ tế bào urê Kết sắc ký lực cột amylose (New England Biolabs) cho thấy phương pháp phá vỡ tế bào: urê siêu âm, có thê thu protein mong muốn (protein gắn kết cột amylose), dé có protein tái tổ hep MBP-VT2eB (hình 4.5b hình 4.6b) Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford, kết ghỉ nhận: với thể tích địch ni khuẩn tái tổ hợp (250ml), tổng lượng protein bám cột amylose (phần lớn protein tái tổ hợp MBP-VT2eB) thu phương pháp phá vỡ tế bào urê 7,428 mg, trong phương pháp phá vỡ tê bào Siêu âm giá trị 11,578 mg Như phương pháp phá vỡ tê bảo bảng siêu âm me TT ne lee nn on ne 16 cho phép thu nhận lượng protein MBP-VT2eB cao nhiều so với phương pháp phá vỡ tế bào uré Sản phẩm sắc ký cho chạy điện di thạch acrylamide 12% để đánh giá kết (hình 4.7) MBP-VT2eB -> “Ẳẳ ST Sex - Hinh 4.7 Két qua dién di trén gel acrylamide 12% sản phẩm sắc ký thu phương pháp phá vỡ tế bào: urê siêu âm Giếng 1: Dịch chiết té bao vi khuẩn tái tổ hợp không gây cảm ứng với IPTG Giếng 2: Dịch chiết tế bào vi khuẩn tái tổ hợp gây cảm ứng với [PTG chưa qua sắc ký Giéng 3: Protein tinh ché thu với phương pháp phá vỡ tế bào siêu âm Giếng 4: Protein tỉnh chế thu phương pháp phá vỡ tế bảo uré Kết cho thấy protein MBP-VT2eB thu có độ tỉnh cao Với kết thu trên, kết luận chúng tơi tỉnh chế đựơc protein MBPVT2eB phương pháp sắc ký lực với độ tỉnh sử dụng cho nghiên cứu đáp ứng miễn dịch * Sản xuất độc tố Vero thô: Dịch nuôi cấy vi khuẩn dịch chiết vi khuẩn kết tủa bing ammonium sulfat va thẩm tích dung dịch PBS để thu dịch độc tố thô Nông độ protein dịch độc tố thô xác định phương pháp Bradford Dịch độc tế thơ có hàm lượng protein khoảng 0,8mg/ml Lượng dịch thu 20ml 4.1.3 Hiệu lực bảo vệ protein tái tổ hợp MBP-VT2eB động vật mẫn cảm (heo sau cai sữa) thí nghiệm công độc 4.1.3.1 Thử nghiệm gây đáp ứng miễn dịch thô Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2cB kỹ thuật kết tủa khuếch tán thạch Để đánh giá sơ diện kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, phản ứng kết tủa khuếch tán thạch tiên hành với mẫu kháng huyết thu từ thỏ từ lần tiêm nhắc thứ Kêt ghỉ nhận điện kháng thể đặc hiệu kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB kháng huyết 2/3 thỏ sau mũi tiêm nhắc thứ 3/3 thỏ thí nghiệm sau mũi tiêm nhắc thứ hai (bảng 4.1 hình 4.8) 17 Bảng 4.1: Kết đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thô (phương pháp kết tủa khuếch tán thạch) Thỏ Đôi chứng Mũi nhắc lại I - + + - - Mũi nhắc lại + + + a b € Hình 4.8 Kết phân ứng kết tủa khuếch tán thạch a, b, c: huyét thé I, 2, tương ứng Giếng 1, 2, 3, 4, 5, chứa 10 pl protein MBP-VT2eB pha lỗng từ nồng độ ban đầu đến nơng độ 1/32 Giếng chứa 10 wl kháng huyết Vạch kết tủa kháng thể kháng protein tái tổ hợp protein tái tổ hợp (mũi tên ) Hiệu giá kháng thể trung hòa Thử nghiệm trung hòa độc tố VT2e tiến hành tế bào vero với 3TCID¿o Hiệu giá kháng thê trung hịa tính mức pha lỗng kháng huyết ngăn cản 100% tác động hủy hoại tế bào vero độc tổ VT2e Từ số đo ODa¿o xác định nỗng độ kháng huyết trung hòa liều TCID¿o sau tiêm nhắc thứ tư 1⁄64, 1/64 1/128 thỏ khác ` liêu cao lần 4.1.3.2 Thứ nghiệm đáp ứng miễn dịch heo Thí nghiệm 1: i°u MBP-VT2eB: S0ng/heo 75ng/heo Phần ứng đị ứng: Toàn heo tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB khơng có phản ứng phụ nào, tất có biểu tình trạng sức khỏe bình thường giống heo tiêm chất bổ trợ Ai(OH); Tăng trọng heo thí nghiệm: thể qua bảng 4.2 Việc tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB liễu 50Hg/heo 75ùg/heo hồn tồn khơng ảnh hưởng đến sức khỏe tăng trọng heo Heo tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB liều nói có tăng trọng tương đương với heo tiêm chất bổ trợ AI(OH); Như nói protein tái tổ hợp MBP-VT2eB đáp ứng độ an toàn vac-xin Đáp ứng miễn dịch: kết kiểm tra kháng thể trung hòa độc tố VT2e môi trường tế bào Vero với huyết heo thí nghiệm đợt cho thấy khơng có kháng thể trung hòa độc tố VT2e liễu 10 TCIDạo kể liều 2TCIDạu Dana rane nenaneninarneeneera en sewer 18 Bằng 4.2 Tăng trọng heo thí nghiệm đợt Lo thinghiém | TLTB-14 ngày tuổi | TLTB 42 tuổi (kg) (kg) Lô 3,8+ 1/1 9,6+244 206 +55 162 3,6+1,1 8,741.6 184 +39 Lô 3,841,1 9,141.6 189 + 46 Lô 3,7 £0,9 9,741,9 213 +58 Lê (đối chứng) 3,8+1⁄2 9,241,9 193 £53 P > 0,05 > 0,05 > 0,05 TBTP: Tăng trọng trung bình tuyệt đối TLTB: Trọng lượng trung bình ¬ TTTBTĐ (g/ngay/con) Thí nghiệm 2: liều MBP-VT2eB: 300ug/heo 400ug/heo Phan ứng phụ heo (phản ứng dị ứng tăng trọng heo thí nghiệm): Tương tự thí nghiệm I, không ghỉ nhận biểu tác dụng phụ việc tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB heo thí nghiệm liễu 300ug/heo 400ug/heo Như nói protein tái tổ hợp MBP-VT2eB đáp ứng độ an toàn vac-xin Bảng 4.3 Kết kiểm tra kháng thể trung hịa độc tế VT2e mơi trường tế bào Yero với huyết heo thí nghiệm đợt Hiệu giá kháng thể trung hịa Lơ thí nghiệm 1TCIDs 10TCID¿, Lân Lần Lan | Lần - 1⁄2 - - - 1⁄2 - - - - - - - - - - - 1⁄2 - - - - - - Doi chitng (khong - - - ˆ tiêm MBP-VT2eB) — _ — - 300ug/heo 400ug/heo 19 Ghỉ chú: - Lần 1: huyết lấy 14 ngày tuổi (trước tiêm protein tái tổ hợp MBP- VT2eB lần L) - Lần 2: huyết lấy 35 ngày tuổi - Lần 3: huyết lấy 42 ngày tuổi Đáp ứng miễn dịch: kết kiểm tra kháng thể trung hịa độc tố VT2e mơi trường tế bào Vero với huyết heo thí nghiệm đợt trình bày qua bang 4.3 Kết ghi nhận có điện kháng thể trung hịa độc tố VT2e môi trường tế bào Vero ngày tuổi 35 (11 ngày sau tiêm protein tái tổ hợp MBPVT2eB lần 2) với liễu 1TCIDạ› với hiệu giá thấp lần kiểm tra tiếp theo, ngày tuổi 42 (18 ngày sau tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB lần 2) không phát thấy kháng thể trung hòa 4.2 Thảo luận: _, Trong sản xuất sản phẩm từ vi sinh vật, việc xác định tỷ lệ nạp giống yếu tổ cần khảo sát để qua xây dựng quy trình sân xuất phủ hợp: giảm đầu tư, phí sản xuất, đảm bảo hàm lượng sản phẩm cao Trong khảo sát chúng tôi, tỷ lệ nạp giống 2%, 3% 4% vớ thời gian nuôi cấy nghiên cứu Kết cho thấy với tỷ lệ nạp giống 2%, tốc độ sinh trưởng phát triển vi khuẩn tái tổ hợp có vẽ chậm so với tỷ lệ nạp giống 3% 4% (hình 1.1) thời điểm nuôi cấy, vi khuẩn tái tổ hợp đạt đỉnh sinh trưởng tất tỷ lệ nạp giống Tuy nhiên, tỷ lệ nạp giống 2% có kết định sinh trưởng vi khuẩn tái tổ hợp mức cao Thời gian nuôi cấy không dài, thuận tiện cho việc sản xúât protein tái tổ hợp sử dụng chất cảm img IPTG Mặt khác gây cảm ứng IPTG nồng độ 0,6g/ml để kích hoạt vi khuẩn sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thu kết hàm lượng protein tái tổ hợp đạt đỉnh cao với 120 phút gây cảm ứng dịch ví khuẩn ni cấy Như theo kết ghí nhận, lượng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thu đạt đỉnh cao tổng thời gian nuôi cấy khoảng (3giờ nuôi cấy bình thường gây cảm ứng với IPTG), Kết cho phép lựa chọn tỷ lệ nạp giống 2% thích hợp | Để chiết tách protein tái tổ hợp từ tế bào, phương pháp phá vỡ tế bào băng urê siêu âm sử dụng Với phương pháp phá vỡ tế bảo băng urê, lượng protein thu khoảng 30mg/] dich vi khuẩn, với phương pháp phá vỡ tế siêu âm lượng protein thu vào khoảng 46mg/I Sự khác biệt số lượng tất lớn, thé nghiên cứu thu nhận protein tái tổ hợp mức độ phịng thí nghiệm, quy mô nhỏ, việc sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào siêu âm hướng ưu tiên để lựa chọn Tuy nhiên cân lưu ý theo kết sắc ký, mức độ nhiễm tạp sản phẩm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tỉnh chế nhiều phương pháp phá vỡ tế bảo siêu âm so với phương pháp phá vỡ urê Chúng tơi cho có thê lỗi kỹ thuật đo khác biệt lớn hàm lượng protein địch chiết thê 20 tích cột sắc ký sử dụng nghiên cứu điều chỉnh để gia tăng độ tỉnh sản phẩm sắc ký Hơn nữa, phương pháp phá vỡ tế bào siêu âm, có hạn chế lớn khó triển khai sản xuất lượng lớn protein tái 16 hop lại có ưu điểm lớn đơn giản xử lý dịch chiết protein để chạy sắc ký tỉnh chế sản phẩm, đồng thời khơng làm biến tính protein tái tổ hợp Điều đâm bảo giữ nguyên tính chất protein tái tổ hợp đảm bảo giá trị sinh học chúng Kỹ thuật tạo dòng ngày cho phép sản xuất nhiều loại protein khác phục vụ nhiều lĩnh vực đời sông Vac-xin sử dụng protein tái tô hợp hướng nghiên cứu phát triển chiến lược kiêm soát bệnh truyền nhiễm Tuy dựa nguyên tác sinh học tự nhiên, loại protein sản xuất nhờ vào công nghệ di truyền đơi khơng đảm bảo đủ tính chất sinh học cần thiết Đối với sản phẩm dùng vac-xin, việc kiểm tra khả gây đáp ứng miễn dịch kháng nguyên khâu quan trọng Trong phản ứng kết tủa khuếch tán thạch, kết nghiên cứu ghỉ nhận vạch kết tủa đương tính hồn tồn tất mẫu kháng huyết thanh¡được thử Điều có nghĩa protein tái tổ hợp MBP-VT2eB gây kích ứng miễn dịch thỏ tạo kháng thể đặc hiệu protein tái tô hợp MBP-VT2eB Tuy nhiên protein tái tổ hợp cầu tạo thành phan: protein dung hop MBP (Maltose Binding Protein) va protein tiếu phần B độc tế VT2e nên không loại trừ khả kết dương tính thu phản ứng kết tủa khuếch tán thạch nói kết hợp đặc hiệu kháng thể kháng MBP MBP Trong trường hợp kháng thể tạo thành khơng có khả ngăn chặn tác động gây độc độc tố VT2e tế bào kết không bảo vệ thú khỏi tác động độc tố VT2e hay nói khác không bảo vệ thú chống lại vi khuẩn E co# gây phi heo dù tiêm vac-xin protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Khả bảo vệ thú có protein tái tơ hợp có khả tạo kháng thể trung hịa độc tố VT2e, cần tiến hành thử nghiệm xác định khả trung hòa kháng thể tạo độc VT2e Trong diéu kign in vitro, tiến hành thử nghiệm môi trường nuôi cấy tế bào vero Độc tơ VT2e có khả gây độc mạnh tế bào vero Tế bào vero xem môi trường thir nghiém in vitro phi hop để xác định độc lực độc tố VT2e Từ kết thu thử nghiệm trung hịa độc tố VT2e mơi trường té bao vero, ghỉ nhận khang huyết thu nhận từ thỏ gây miễn dịch protein tái tơ hợp MBP-VT2eB trung hịa hồn tồn tác động gây độc liều 3TCID so độc tố VT2e tế bào vero mức hiệu giá trung bình từ 1/64 đến 1/128 Kết cho thấy protein tái tổ hợp MBP-VT2eB tạo nghiên cứu chúng tơi hồn tồn có khả tạo kháng thể đặc hiệu trung hịa độc tơ VT2e, yếu tố gây bệnh phù heo vi khuẩn £ coi sản xuất độc tố VT2e Trong nghiên cứu Gordon V M va céng su nam 1992, hiệu giá kháng thê trung hòa độc tổ VT2e từ 1/128 đến 1/152, nhiên tác giả thực trung hòa liêu 2TCID¿o độc tố VT2e, thấp liều độc tố sử dụng nghiên cứu (3TCIDso) Hơn nữa, kháng nguyên mà tác giả sử dụng (độc tô VT2e vô hoạt độc tố biến đị nhược độc) gây nên tác dụng phụ heo gây đáp ứng miễn dịch (tăng trọng gây bệnh tích mơ ) Tuy hiệu giá kháng thể tung hịa độc tố vero mơi trường tế bảo Vero cao thỏ đối tượng c mà nghiên cứu mn hướng đến, thử nghiệm thăm dò khả gây miễn dịch protein tái tổ hợp MBP-VT2eB Thí 21 nghiệm heo tiến hành với liều tiêm quy trình tiêm khác Thử nghiệm tiêm protein tái tổ hợp MBP-VT2eB với liễu biến động từ 50ug/ heo 400ug/heo hồn tồn khơng gây phản ứng phụ heo tiêm Điều cho thay tính an tồn cao protein tái tổ hợp nghiên cứu Protein tái tô hợp không gây tác dụng phụ khơng có nguy tạo biến chúng xem giải pháp an tồn cho việc sản xuất vac-xin phịng bệnh truyền nhiễm Tuy nhiên khả gây đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp điều băn khoăn nhiều nhà nghiên cửu Trong nghiên cứu chúng tôi, protein tái tổ hợp MBP-VT2eB thể n khả gây đáp ứng miễn dịch tốt thỏ với liều tiêm thể, heo, protein tái tổ hợp không tạo kháng thể trung hòa độc tố VT2e mơi trường tế bao Vero Có thé cho liều sử dụng thí nghiệm chưa đủ để gây kích ứng miễn địch heo liễu tương đượng với liều thí nghiệm sử dụng độc tố vô hoạt Gordon V M ctv., 1992 Bosworth B T ctv., 1396 Thử nghiệm tăng liều tiến hành mức 300ug 400ug protein tái tổ hợp MBP-VT2eB cho heo Kết kiểm tra kháng thê trung hòa cho thay cé sw diện kháng thể trung hòa độc tố VT2e mức thấp, với mức hiệu giá trung hịa ITCIDạo 1⁄2 mơi trường tế bào Vero, lÌ ngày sau tiêm protein tái tơ hợp MBP-VT2eB lần Tuy nhiên kháng thẻ trung hòa phát 50% heo tiêm protein tái tổ hợp thí nghiệm Về mặt lý thuyết tiêm kháng nguyên vào thể thú, kháng nguyên có khả gây đáp ứng miễn dịch kích ứng thể thủ tạo nên kháng thể đặc hiệu khoảng đến 10 ngày sau thứ tiêm lần | kháng thẻ xuất sớm cao nhiều sau lần tiêm thử hai Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB gây chứng tỏ khả gây đáp ứng miễn dịch tốt thỏ, với mức hiệu giá kháng thể trung hòa liều 3TCID50 1/64 đến 1/128 Như vậy, mặt thực tế, protein tái tổ hợp MBP-VT2eB kháng ngun hồn tồn, nghĩa gây đáp ứng miễn dịch heo Tuy nhiên điều không xãy dự kiến MBP-VT2eB, kháng thể trung hòa thấy xuất Ở heo tiêm protein tái tổ hợp sau lan tiêm nhắc thứ hai có 50% thú tiêm với hiệu giá mức 1⁄2, thấp so với đáp ứng miễn dịch tho Két cho thay việc sử dụng protein tải tổ hợp MBP-VT2eB thí nghiệm chưa hồn tồn phù hợp Có thé chất bổ trợ sử dụng nghiên cứu Al(OH); khơng thích hợp để làm gia tăng đáp ứng miễn dịch heo protein tiếu phẫn tái tổ hợp, đường tiêm da heo đường tiêm phù hợp đề tạo nên đáp ứng miễn dịch cao heo protein tái tô hop MBP-VT2eB Việc gây đáp ứng miễn địch heo protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, thí nghiệm chưa đem lại kết mong muôn, rõ ràng protein tái tô hợp MBP-VT2eB chứng tỏ khả gây đáp ứng miễn dịch tốt thỏ Có thê yếu tơ thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch heo chưa hoàn toàn phù hợp, vậyviệc triên khai nghiên cứu nhằm tìm hiểu điều kiện gia tăng đáp ứng miễn dịch đôi với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, theo cân thiết 22 PHAN KET LUAN Tỷ lệ nạp giống để sản xuất protein tái tổ hợp MBP-VT2eB với hàm lượng cao khoảng 2%, với thời gian nuôi giờ, có gây cảm ứng IPTG nông độ 0,6ug/ml Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có thé tách chiết phương pháp sắc ký lực sử dụng cột amylose Protein tái tổ hợp MBP- 'VT2eB có khả nãng gây kích ứng miễn dịch thỏ tốt, tạo kháng thể trung hòa độc tế VT2e tế bào vero sau lần tiêm nhắc Hiệu giá kháng thể trung hòa độc tố VT2e huyết thỏ tế bào vero liễu 3TCID¿¿ vào khoảng 1/64 đến 1/128 Protein tai t6 hợp MBP-VT2eB sử dụng liều 50ng, 75ug, 300uùg 400ug/heo với chất bổ trợ dung dịch Al(OH);, theo đường tiêm da không tạo đáp ứng miễn địch mạnh heo thí nghiệm 23 Tài liệu tham khảo: BOSWORTH, B.T., SAMUEL, J.E., MOON, H.W., O'BRIEN, A.D., GORDON, V.M et WHIPP, S.C Vaccination with genetically modified shigalike toxin Ile prevents edema disease in swine Infect Immun., 1996, 64, 55-60 FRANKE, S., GUNZER, F., WIELER, LH, BALJER, G ct KARCH, H Construction of recombinant shiga-like toxin-Ilv (SLT-IIv) and its use in monitoring the SLT-IIv antibody status of pigs Vet Microbiol., 1995, 43, 41-52, GORDON, V ;M., WHIPP, S C., MOON, disease of swine Infect Immun., 1992, 60, 485-490 GUNZER, F., et KARCH, H Expression of A and B subunits of Shiga-like toxin II as fusions with S-transferase and their potentital for use in IMBERECHTS, H., DE GREVE, H., HERNALSTEENS, SCHLICKER, BOUCHET, H., POHL, P., CHARLIER, G., BERTSCHINGER , H., WILD, VANDEKERCKHOVE, J„ VAN DAMME, J., VAN MONTAGU, M C., P., et P The role of adhesive FI07 and of SLT-Hv toxin pathogenesis of edema disease in pigs Zbl Bakt., 1993, 278, 445-450 JOHANSEN, M., ANDRESEN, L.O., THOMSEN, L.K., BUSCH, WACHMANN, glutathione seroepidemiology J Clin Microbiol., 1993, 31, 2604-2610 LINTERMANS, H.W., O'BRIEN, A.D et SAMUEL, J.E An enzymatic mutant of shiga-like toxin II variant is a vaccine candidate for edema H., JORSAL, S.E et GYLES, in the M.E., C.L Prevention of edema disease in pigs by passive immunization Can J Vet Res., 2000, 64, 9-14 MACLEOD, D.L et GYLES, C.L Immunization of pigs with a purified shiga-like toxin II variant toxoid Vet Microbiol 1991, 29, 309-318 KOBAYASHL, Genetically MAKINO, S.1, WATARA,I M., TABUCHI, H., SHIRAHATA, Y et TAKEDA, Y modified T., FURUOKA, Shiga toxin H., 2° (Stx2e) producing Escherichia coli is a vaccine candidate for porcine edema disease Micro d Pathog., 2001, 31, 1-8 MUKHERJEE, J., CHIOS, K., FISHWILD, D., HUDSON, D., O’DONNEL L, S., RICH, M.S., DONOHUE-ROLFE, A et TZIPORI, S Human Stx2specific monoclonal antibodies prevent systemic complications of Escherichia coli 0157 :H7 infection Infect Immun., 2002, 70, 612-619 10 NGUYÊN NGỌC HẢI, 1999 Phân lập vi khuẩn E coli gây phù heo sau cai sữa khảo sát khả nhạy cắm chúng số kháng sinh Luận văn Thạc sỹ Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh .NGUYEN NGOC HAI, 2002 Maladie de l'oedéme du pore au Vietnam; caractérisation des souches d'Escherichia coli responsables, facteurs de pathogénicité et vaccination Thése du doctorat INPT 12 SARRAZIN, E et BERTSCHINGER, H.U Role of Jimbriae F18 for active ly acquired immunity against porcine enterotoxigenic Escherichia coli Ver Microbiol 1997, $4, 133-44, 24 a PHU LUC QUY TRINH NHAN GIONG SAN XUAT PROTEIN TAI TO HOP MBP-VT2eB Ching vi khuẩn tái tổ hợp kiểm tra có khả sản xuất protein tái tổ hợp MBP- VT2eB (giữ -70°C) Hoạt hóa giống mơi trường LB (Luria-Bertani) 37°C/24 gio, nudi cdy máy lắc | Nhân giống cấp ¡ (tỉ lệ I%} môi trường LB 37°C/24 giờ, nuôi cấy máy lắc J Nhân giống cấp (tỉ lệ 1%) 37°C/24 giờ, nuôi cấy máy lắc hân giống sản xuất (tỉ lệ 2%) 37°C/5 giờ, nuôi cấy máy lắc | Gay cam img bang IPTG, nồng độ 6ug/ml, Ly tâm 5000 vòng / phút / 30 phút, thu sinh khối ' Tạo huyễn dịch sinh khối với dung dịch đệm sắc ký lực maltose (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, ImM EDTA, ImM PMSF, pH 7.4), ty 16 1/10 theo thé tich i‘ ị ! địch vi khuẩn nuôi cấy ' Phá hủy tế bào vi khuẩn sóng siêu âm 4Khz / lần /30 giây lần Ly tâm 5.000 vòng / phút/ 15 phút, thu dịch Chạy sắc ký lực để tách protein tái tổ hợp MBP-VT2eB 25 QUY TRINH CHAY SAC KY AI LUC THU PROTEIN TAI TO HOP MBP-VT2eB Dịch tế bào tái tổ hợp thu | Qua cột sắc ký lực amylose, tốc độ dòng chảy ImUphút | Rita cột sắc ký dung dịch đệm sắc ky khéng cd maltose (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, ImM EDTA, 1mM PMSE, pH 7.4), tốc độ dòng chẩy 2mYphut, thu dich tửa bỏ ! Rửa cột sac ky bang dung dich dém sdc ky c6 maltose (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, lmM EDTA, ImM PMSF, 10mM maltose, pH 7.4), tốc độ đòng chảy 1ml/phút, thụ dịch theo mức thể tích Iml/ống Dịch rửa chứa protein tái tổ hợp MBP-VT2eB, định lượng bảo quân -20%C để sử dụng Thời gian bảo quần 12 -18 tháng